（食品科学专业论文）大豆蛋白肽的制备和应用研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了 谢意。 研究生签名：旅j 编 时凤砷年月加 导师签名 维寿z 。 时间： 妒7 年月，。日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文 的内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 珊监辄琵鹕 嗍：硼年石月。日 导师签名：结寿扛 时间：弦7 年弘目 沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 我国大豆肽处于研制的高潮阶段，然而肽的工业化生产尚处于起步时期。影响大豆 肽广泛生产应用的主要问题是缺乏综合性生产指导方案，在酶解过程中会生成苦味物质 影响终端产品的口味。本文意在探索条制备大豆蛋白肽的生产途径。 试验采用中性蛋白酶和枯草杆菌发酵酶解大豆蛋白，制备低苦味、含纳豆激酶的大 豆蛋白肽产品，并对大豆蛋白肽的精制工艺进行研究，根据产品性质研制大豆蛋白肽营 养饮料的配方。主要的试验结果如下： 1 中性蛋白酶水解大豆蛋白的热处理条件为：9 0 。c 、l o m i n 。通过单因素分析以及 正交试验，得到了中性蛋白酶水解大豆蛋白的最适条件为：底物浓度4 ，加酶量6 ， p h 8 5 ，5 0 。c 下反应4 h ，水解度为2 1 4 6 。 2 枯草杆菌发酵的最佳条件为：种龄1 8 h ；以2 的蔗糖作为碳源；初始p h 7 o i 接种量在8 ；摇瓶装液量5 0 m l 2 5 0 m l ，转速为1 6 0 r m i n ；3 0 。c 下发酵3 6 h 。发酵液的 水解度可达3 8 8 2 。 3 活性炭脱色的最佳条件：活性炭用量为2 ，p h 为3 5 ，5 0 。c 下吸附2 h ，脱色 率可达8 5 6 ，蛋白质回收率为8 2 4 。 4 阴阳离子交换树脂脱盐的最佳条件为：水解物流速为1 0 倍柱体积h ，此时蛋白 回收率为8 8 2 ，脱盐率为9 0 3 。 5 葡聚糖凝胶过滤层析结果表明：水解物的分子量呈连续分布，大多数的分子量 在1 0 0 0 d a 以下。纳豆激酶的相对活力为4 8 i u i i l l 发酵液。 6 大豆蛋白肽营养饮料产品最佳配方为：蔗糖1 0 ，浓缩橙汁5 ，酸浓度0 3 8 ， 大豆蛋白肽为1 2 ，稳定剂用量为0 4 5 ：影响感官评定的主要因素依次为：酸的浓 度 大豆蛋白肽添加量 稳定剂；最佳杀菌条件：1 0 0 。c 、2 0 m i n 。营养饮料保质期：常 温下6 个月。 关键词：大豆分离蛋白；中性蛋白酶；枯草杆菌：大豆蛋白肽；纳豆激酶 a b s t r a c t n o w ，t h er e s e a r c ho fs o y b e a np o l y p e p t i d e si sb o o m i n g o t h e r w i s e ，t h eb i t t e rs u b s t a n c e si nh y d r o l y s a t e w o u l da f f e c tt h et a s t eo ff i n a lp r o d u c t s a n dt h et e c h n i q u eo fs e p a r a t i o ni sn o tg o o d t h ep u r p o s eo ft h e p a p e ri st os e e ka f t e rt h ea p p r o a c ho fl o wb i t t e ra n df u n c t i o n a ls o yp e p t i d e , w h i c hh a sn a t t o k i n a s e p r e p a r el o wb i t t e ra n df u n c t i o n a ls o yp e p t i d ep r o d u c tw h i c hh a sn a t t o k i n a s e ，, u s i n gc o m p o s i t et h e e n z y m a t i ch y d r o l y s i sb yn e u t r a lp r o t e i n a s ea n db a c i l l u ss u b t i h i so ns o y b e a np r o t e i n f u r t h e r m o r e ，i th a ss t u d i e dr e f i n i n g t e c h n i c sa n dn u t r i t i o u sb e v e r a g ec o n t a i n i n gf u n c t i o n a ls o y b e a np e p t i d e a c c o r d i n gt op r o d u c ep r o p e r t i e s t h er e s u l t sa c h i e v e dw e r ea st h ef o l l o w s ： 1 t h eh e a tt r e a t m e n tc o n d i t i o no fe n z y m a t i ch y d r o l y s i sb yn e u t r a lp r o t e i n a s eo ns o y b e a np r o t e i na r e t e m p e r a t u r e ：9 0 。c ；o p e r a t i n gt i m e ：l o m i n , t h o u g ho d df a c t o rt e s t sa n da no r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，t h e o p t i m u mc o n d i t i o n so f e n z y m a t i c h y d r o l y s i sa r es u b s t a n c ec o n c e n t r a t i o n ：4 ，e n z y m ec o n c e n t r a t i o n ：6 ， t e m p e r a t u r e ：5 0 * c ，o p e r a t i n g t i m e 4 b ，p i t ：8 5 ，t h e d hc a na c h i e v e2 1 4 6 2 t h em a h i o rs t u d i e dt h ef e r m e u t a t i o nc o n d i t i i o i t so fb a , c i l m ss u b t i l l i s t i h eb e s tf e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sa r et h a tt h es e e sa g eo fb a c i l l u ss u b t i l l i si s1 8 h ；c a r b o nr e s o u r c ei ss u g f o s e ，, c o n c e n t r a t i o ni s2 ； i n i t i a lp hi s7 0 ：s h a k i n gi n3 0 。ca t1 6 0 r m i uf o r3 6 h ；v o l u m eo f 2 5 0 m l h a s5 0 m l ；i n o c u l u ma m o u n ti s 8 t h ed hc a na c h i e v e3 8 8 2 a f t e ro p t i m i z e df e r m e n t a t i o nb yb a c i l l u ss u b t i l l i s 3 a c t i v a t e dc a r b o nh a sb e e nc h o s e na sd i s c o l o r i n ga g e n to fh y d r o , l y s a t e so fs o y b e a np r o t e i n , t h e r e s u l ts h o w e dt h a th i g hd e g r e eo fd i s c o l o r a t i o nc o u l db eo b t a i n e du n d e rt h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：p hv a l u e 3 5 ，a c t i v a t e dc a r b o nc o n c e n t r a t i o n2 ，t e m p e r a t u r e5 0 。c ，t i m e2 h ，d i s c o l o u r a t i o nr a t ew a s8 5 6 a n d p r o t e i nr e c o v e r yr a t ei s8 2 4 4 s a l tc o u l db er e m o v e dw i t hi o ne x c h a n g er e s i n s u n d e rt h ec o n d i t i o no ft h ef l o wr a t eo fl o v o l h ， t h e p r o t e i nr e c o v e r yr a t e i s8 8 2 a n dr a t eo f d e s a l i n i z a t i o n i s9 0 3 5 t h e e x p e r i m e n t s t u d i e dt h ed i s t r i b u t i o no fm o l e c u l a r w e i g h o ft h e h y d r o l y s a t e s o f s o y b e a np r o t e i nb yg l u c a ng e lc h r o m a t o g r a p h y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em w o ft h eh y d r - o l y s a t e sm o s t l yi sb e l o w1 0 0 0 d a t h ee n z y m a t i ca c t i v i t yo fn a t t o k i n a s ei s4 8 1 u m l 6 n u t r i t i o u sb e v e r a g ec o n t a i n i n gf u n c t i o n a ls o y b e a np e p t i d ew a sp r o d u c e dt h r o u g ht h r e ef a c t o r sa n d t h r e el e v e l se x p e r i m e n td e s i g n ，i ts h o w e dt h a tt h em a i nf a c t o rt h a ti n f l u e n c et h es e n s eo r g a n sa s s e s s i n gw a s i nt u r na s ：a c i dc o n c e n t r a t i o n 3 p o l yp e p t i d e so fs o y b e a nc o n c e n t r a t i o n ： s t a b i l i z e r t h eb e s tf o r m u l ao f p r o d u c ti s ：s u c r o s e1 0 ，c o n c e n t r a t e do r a n g e5 ，a c i d0 3 8 ，s c , y b e a np o l y p e p t i d e1 2 ，s t a b i l i z e r 0 4 5 t h eo p t i m u ms t e r i l i z a t i o nt i m ew a s2 0 r a i na tl o f f c t h en u t r i t i o u sb e v e r a g ec a nb e s ts t o r e df o r6 m o n t h sw i t hn or a t i n gp h e n o m e n o n ， k e y w o r d s ：s o y b e a np r o t e i ni s o l a t e ；n e u t r a lp r o t e i n a s e ；b a c i l l u ss u b t i l l i s ；f u n c t i o n a ls o y b e a np e p t i d e ； n a t t o l k i n a s e 沈阳农业大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 大豆蛋白的营养价值 大豆蛋白是国际上公认的较理想的植物蛋白质，其氨基酸组成与动物蛋白相近( 见 表i 1 ) 。特别是与其他植物蛋白质相比较，大豆中赖氨酸含量较高，是其它植物蛋白不 可比的( 石彦国，2 0 0 0 ) 。 襄1 1 大豆与动物蛋白质中氨基酸比较( 单位：g l o o s ) t a b l 1 1t h ea m i n oa c i dc o l n l p a l * $ o fs o y b e a na n da n i m ip r a t e i l l ( u n i t ：g 1 0 0 9 ) 大豆蛋白质的必需氨基酸模式接近f a o w h o 建议模式，与动物蛋白的氨基酸模式接 近，是一种较为完善的人类植物膳食蛋白质。有研究表明( m a e n om ，1 9 9 6 ) ，大豆蛋白 可以降低对人体不利的低密度脂类( l d l ) 胆固醇的数量，从而对防治心血管疾病有益。 可以克服其它动物蛋白质对人的不良影响。 大豆分离蛋白在所有的大豆蛋白制品中是纯度最高的一种，其蛋白质含量在9 0 以 上( 黄惠华等，1 9 9 9 ) ，营养价值极高，l k g 大豆蛋白所含蛋白质相当于2 k g 牛肉或4 5 k g 猪肉( 傅艳华，2 0 0 1 ) 。而且大豆蛋白几乎是完全蛋白质，富含氨基酸并平衡良好( 丛 建民等，2 0 0 3 ) 。最近人们越来越重视大豆分离蛋白的营养价值，将之用作蛋白质的强 化或者用以替换蛋白质食品的一部分，进而用其作为人造肉的主要原料。在日本大豆分 离蛋白的生产量急剧增长，年产量已达5 0 0 0 吨以上；美国等发达国家也特别重视对大 豆蛋白和植物蛋白的开发利用，将大豆蛋白用于强化食品、快餐食品及仿生模拟食品等； 香港也已立法，要求在成品粮小麦粉中必须加入大豆蛋白并标出添加量( 骆承痒与韩光 第一章前言 烈，1 9 8 3 ) 。 我国大豆资源丰富，其价格相对较低，如能将大豆中蕴藏的营养充分利用，则可大 大提高人民的生活水平( 朱秀清等，2 0 0 1 ) 。但由于大豆蛋白质分子结构复杂，8 0 的 蛋白质分子量在l o 万以上，大多数分子内部呈反行s h e l i x 非有序结构，分子结构高 度压缩、折叠，从而使得大豆蛋白质溶解性较差，消化率和生物效价远不及牛乳蛋白和 鸡蛋蛋白等动物蛋白质( 阎隆飞，1 9 8 8 ) 。而蛋白质的酶解是改善蛋白质特性的一种很 好的方式，大豆蛋白经酶解后，易于被人体消化吸收，因而可以说是大豆蛋白的最佳营 养方式。同时，大豆蛋白水解生成的多肽，具有多种生物功能( 牟光庆等，1 9 9 9 ) 。所 以近年来通过酶法水解大豆蛋自来生产大豆肽改善消化吸收性能，从而提高大豆蛋白的 营养保健价值，并改进其加工特性已成为热点研究课题( 李哲敏，2 0 0 0 ) 。在欧美等国 大豆蛋白水解物的补莉、饮料已成为时尚，在我国大豆蛋白经蛋白酶水解后产生的短肽 的生产及其理化特性和营养功能也已逐步得到认识( 饶平凡等，1 9 9 6 ) 。 1 2 大豆肽的研究 1 2 1 肽的基本概述 所有生物的蛋白质都是由2 0 种蛋白质氨基酸组成，氨基酸彼此以肽胺键( 也称肽 键) 相互连接成为“肽”，它们与氨基酸一起构成了千姿百态的蛋白质世界。一般少于 1 0 个氨基酸的肽被称为寡肽，超过l o 个氨基酸的称为多肽，但两者术语的介定并不严 格。氨基酸为5 0 多个以上的多肽称为蛋白质。多肽和蛋白质只有肽链长短之别，二者 间没有严格区分( 齐葳等，2 0 0 1 ) 。 肽具有许多独特的理化特性与生物活性，如起泡性、粘度、胶凝性、乳化性等功能。 随着新型加工技术的应用及人们对“肽”的认识进一步加深，肽的研究成为近十年来的 熟点( 曲水洵，1 9 9 6 ) 。 1 2 2 大豆肽的化学组成 大豆肽是指大豆蛋白质经蛋白酶作用后，再经分离、精制等过程而获得的蛋白质水 解产物，它由大豆蛋白水解后的多种肽混合物共同组成，其中还含有少量游离氨基酸、 糖类和无机盐等成分。大豆肽的蛋白质含量为8 5 左右，其氨基酸组成几乎完全与大豆 蛋白质一样，必需氨基酸的平衡良好，含量也丰富。大豆肽分子量通常在1 0 0 0 0 以下， 一些功能性低聚肽分子量较小，由3 6 个氨基酸组成，其分子量分布以低于1 0 0 0 的为 主，主要出峰位置在分子量3 0 0 7 0 0 的范围内( 葛文光，1 9 9 6 ) 。 1 2 3 大豆蛋白水解的研究 大豆肽的生产主要是将大豆蛋白质进行控制性的水解，再分离精制而成。 水解大豆蛋白的方法有三种，酸法、碱法和酶法。酸碱法是用酸、碱等化学试剂在 一定温度下促使蛋白质分子的肽链断裂形成小分子物质。但由于碱法水解使氨基酸大多 4 沈阳农业大学硕士学位论文 消旋，无生物利用价值，因此不宜采用；而酸法多采用盐酸、硫酸等强酸在高温下反应， 反应强烈，设备腐蚀严重，水解彻底，生成氨基酸混合物，同时在高温下色氨酸完全被 破坏，目前已渐被淘汰。 目前生物活性肽的生产主要采用酶水解法。酶法水解可以在不降低营养价值的前提 下改善蛋白质的理化和功能性质，扩展在食品加工中的应用范围。而且酶解法生产活性 肽安全性极高、价格低廉、易于推广。有关酶法有限水解制得肽类的研究在近十多年内 受到广泛重视。较之酸水解和碱水解，酶法水解蛋白质具有多种优点：蛋白质的酶解是 一种不完全、不彻底的水解，其产物主要是肽而不是氨基酸；反应条件温和，反应时问 短，效率高，不产生消旋作用，也不破坏氨基酸；产品纯度高，产物易分离，成本低廉 等( l z a w an ，e t a l ，1 9 9 7 ) 。 在生产过程中，正确选择使用蛋白酶是生产大豆肽的关键，往往根据不同的目的而 采用不同的酶，来获得所需产物。尤其对于活性肤而言，其特定的氨基酸序列以及肽链 的末端氨基酸组成，将直接影响肽与作用底物的结合能力，从而影响其活性的发挥。 蛋白水解酶按作用位点而言，可分为内切酶与外切酶。制备功能性多肽时，多以内 切酶为主，辅以一定量的外肽酶，才能最大程度地获得功能肽。如根据酶的来源可分为 动物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶。植物蛋白酶，如菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶等 都属于内切酶，成本较高，水解位点较广泛，水解度通常并不很高，不适于直接水解大 分子蛋白；木瓜蛋白酶是一种巯基蛋白酶，也属特异性内切酶，作用的底物较广泛，但 水解能力不强。在食品工业上，木瓜蛋白酶主要应用于肉的嫩化、啤酒澄清等方面。试 验表明：选用木瓜蛋白酶水解s p i ，酶解液的溶解度、乳化能力、发泡能力大大提高， 但乳化及发泡稳定性下降、粘度下降。酶解s p i 产物苦味增加。国外多采用菠萝蛋白酶 和木瓜蛋白酶在低热环境下改性蛋白，以提高蛋白溶解度，用于饮料生产，而且这两种 酶的功能较好。尤其是菠萝蛋白酶，水解度控制在2 0 3 5 m 0 1 1 0 5 9 的氨基酸含量时， 可获得分散性和吸水性良好的蛋白产品。 动物蛋白酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶等也属于内肽酶，优点是它们与人体消化系统 内相似，故水解产物可能更适于人体吸收，缺点是价格昂贵，来源有限，较难以推广应 用；胰蛋白酶、胃蛋白酶均是特异性内切酶，胃蛋白酶优先切断苯丙氨酸、亮氨酸和谷 氨酸得肽段；由于大豆蛋白中存在胰蛋白酶抑制剂，所以一般不采用胰蛋白酶来制备大 豆肽( 郭红莲，2 0 0 5 ) 。 微生物蛋白酶，如枯草杆菌1 3 9 8 、放线菌1 6 6 、栖土曲霉3 9 4 2 ，黑曲霉3 3 5 0 和地衣型芽孢丁菌2 7 0 9 等，具有较好特异性，水解度较高，价格低廉，适用于工业化 生产。中性蛋白酶a s l 3 9 8 和碱性蛋白酶2 7 0 9 均是内切酶，作用底物较广，在工业生 产中应用较广。 5 第一章前言 此外较常用于水解s p i 的蛋白酶还有风味复合酶f l a v o u r z y m e ，a l c a l a s e 等。风味 复合酶f l a v o u r z y m e 是一种内外肽混合酶，作用位点广泛，反应迅速。a l c a l a s e 是一种 异性碱性内切酶，主要作用于含疏水性羧基( 如酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸) 的肷键， 主要催化部位是丝氨酸，反应速度极快。因此，s p i 经该酶作用后，水解产物中亲水性 和疏水性侧链基团的存在状态及分布会出现变化，从而影响其乳化性能。但这些酶目前 均属于进口酶，成本高，推广应用困难。 目前应用于实际生产中的酶有碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶， 其中碱性蛋白酶水解效果较好( 李书国，1 9 9 7 ) 。 1 2 4 大豆肽的加工特性 1 。2 4 1 高溶解度和低粘度 大豆肽作为食品原料的适应性在于其低粘度和高溶解性。大豆蛋白的粘度随着浓度 的增加而急剧升高，这是因为大豆蛋白溶液在浓度为1 0 以上经高温处理时，易产生疏 水键结合和二硫键结合形成网状聚合物，使得大豆蛋白溶液粘度达9 p a s ，造成后续操 作的困难，从而限制了大豆分离蛋白在流质食品中的添加使用。而大豆肽溶液在浓度达 到6 5 以上时粘度只有2 2 p a s ，且溶解度高达9 9 以上，流动性良好，而且大豆肽 的溶解度对温度不敏感，在冷水中即可溶解。加热也不易凝固，故可开发成高蛋白食品。 1 2 4 2 酸溶性 大豆蛋白在其等电点( p h 4 3 ) 附近会发生蛋白质变性沉淀现象，而大豆肽的溶解 性不受p h 变化的影响，为开发酸性蛋白饮料和食品提供了有利条件( b a u t i s t aj ，1 9 9 6 ) 。 1 2 4 3 独特的凝胶软化性能 当鱼肉、畜肉以及大豆蛋白质加热形成凝胶或面粉形成面团时，添加百分之几的大 豆肽可使凝胶软化。虽然对其机制尚未明了，已证实大豆肽具有抑制蛋白质，凝胶形成 的性能可以利用这种性能来调整蛋白质食品的硬度和改良口感，如可用于生产抑制凝固 的豆腐以及具柔软感的畜肉制品( 张学忠，2 0 0 0 ) 。 1 2 4 4 吸湿性和保湿性 由于大豆肽具有良好的吸湿性和保湿性，在焙烤食品，如面包、蛋糕中添加大豆肽 可以防止这些食品变干并延长货架期。在化妆品行业中，大豆肽可作为胶原蛋白及乳蛋 白的替代品。用在护肤品中，其特点是高效、安全、无毒。另据研究，水解得到的低肽 可以与金属元素在一定条件下形成复合氨基酸络合物，用于护发有很好的光泽效果和高 效的保护作用，使头发免受环境条件和化学因素破坏( 龚树立，2 0 0 4 ) 。 1 2 5 大豆肽的营养特性 大豆蛋白质所含的氨基酸除蛋氨酸较少外，其他必需氨基酸的含量都较高，是植物 蛋白质中惟一能符合f a 0 w h 0 u n u 于1 9 8 5 年制定的标准、满足2 5 岁儿童必需氨基酸 6 沈阳农业大学硕士学位论文 需要的优质蛋白质。大豆肽是大豆蛋白的水解产物，同样具有很高的营养价值。大豆肽 的氨基酸结构几乎完全与大豆蛋白一样，必需氨基酸平衡良好，含量丰富。 1 2 6 大豆肽的生理特性 大豆肽的必需氨基酸组成与大豆蛋白质完全一致，含量平衡且丰富，而且多肽化合 物更容易被人体消化吸收，尤其是某些低分子的肽类，同时还具有防病、治病、调节人 体生理机能的功效，这些功效是原大豆蛋白质及其所组成的氨基酸所不具备的。因此可 以说，大豆肽克服了大豆蛋白质在营养学上的弱点，具有比大豆蛋白质更丰富的营养和 功能特性，是大豆蛋白质的最佳营养物质。 1 2 6 1 大豆肽的易消化和易吸收性 随着人们对蛋白质消化、吸收和蛋白质代谢研究的深入，发现机体摄入蛋白质后， 在消化道酶的作用后，并不一定完全以游离氨基酸形式吸收，更多的是以低肽( 二肽， 三肽) 形式吸收的。体内同位素标记试验表明，大豆肤消化吸收率比乳蛋白质及氨基酸 更高。由于大豆肽具有大豆蛋白质相同的必需氨基酸组成，而且其消化吸收率比蛋白质 及氨基酸更佳。因此，大豆肽可以作为肠道营养剂和流态食品应用于康复期病人、消化 功能衰退的老年人、以及消化功能未成熟的婴幼儿服用。大豆肽能帮助他们平衡营养状 态，而不必注射氨基酸。 1 2 6 2 大豆肽降低血压的作用 血管紧张素转换酶( a n g i o t e n s i n c o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e ) 对稳定血液循环和高 血压起着重要作用。由于血管中的a c e 能使血管紧张素x 转化成y ，后者能使末梢血管 收缩，血压升高。k a w a m u r a 研究发现，大豆1 1 s 球蛋白和7 s 球蛋白中含有3 个可抑制 a c e 活性的短肽，通过抑制a c e 活性，因而可以防止血管末梢收缩，达到降血压作用。 而大豆肽对正常血压没有降压作用，所以它对有心血管疾病的患者有显著疗效，而对正 常人体又无害，且安全可靠。 1 2 6 3 大豆肽降低胆固醇的作用 大豆蛋白具有降低血清胆固醇的作用，而大豆肽不仅具有这样的功能，而且效果更 佳。给大鼠分别饲用大豆蛋白和大豆肽的试验结果表明，其血清胆固醇浓度( m g m l ) ： 大豆蛋白组为( 3 4 2 ) ，而大豆肽组则为( 9 9 0 6 6 ) ；其肝脏胆固醇含量( m g g ) 为： 大豆蛋白组为( 6 9 5 - - + 2 7 ) ，而大豆肽为( 7 7 0 0 9 7 ) ，这表明大豆肽能显著降低血清 及肝脏胆固醇含量。同时测定其粪便中胆固醇的含量，饲用大豆肽的老鼠粪便中胆固醇 含量明显高于大豆蛋白组，从而可以推论大豆肽降低胆固醇的作用机理，大豆肽能阻碍 肠道内的胆固醇的再吸收并促使其排出体外。对于其中的哪种成分有此效果的研究尚无 结果。但是日本学者营野等己通过试验发现，大豆蛋白质的胰蛋白酶分解物，相对分子 质量在5 0 0 0 以上的部分有降低胆固醇的效果，用微生物蛋白酶分解的未消化物也有同 7 第一章前言 样的效果。大豆肽降低胆固醇还有以下特殊的优点：( 1 ) 对于胆固醇正常的人没有降低 胆固醇的作用；( 2 ) 对于胆固醇高的人具有降低总胆固醇的功效；( 3 ) 胆固醇值正常的 人，在食用高胆固醇含量的蛋、肉、动物内脏等食品时，也有防止血清胆固醇升高的作 用：( 4 ) 大豆肽能降低血清中有害的胆固醇( l d l ) 水平，但不会使有益的( i d l ) 胆固 醇水平降低。故大豆肽可以用于生产降胆固醇，降血压，预防心血管疾病的保健食品。 1 2 6 4 促进脂肪代谢和抗肥胖作用 无论是动物肽或是植物肽，不但能阻碍脂肪的吸收，而且能促进“脂质代谢”， 因 此在保证足够肷摄入的基础上，将其余能量组分降至最低，则可以达到减肥的目的，且 保证减肥者的体质。摄取蛋白质比摄食脂肪，糖类更容易促进能量代谢，而大豆肽则具 有更强的促能量代谢的效果。科学家对大豆肽的营养效果进行的研究中，发现大豆肽比 其他蛋白质消除脂肪的效果明显，更能加速皮下脂肪的减少。 1 2 6 5 大豆肽有促进微生物发酵的作用 大豆肽有促进微生物生长发育和活跃代谢作用，如小肽对乳酸菌、双歧杆菌和酵母 菌等多种微生物的生长具有显著的促进作用。这一特性可用于生产酸乳、干酪、醋、酱 油、火腿和面包等食品，能提高生产效率，改善品质，增强风味和增加营养价值，有利 于食物营养的消化吸收。 1 2 6 6 大豆肽的低抗原性 大豆蛋自具有一定的抗原性，尤其是其中的7 s 和2 s 成分。通过酶解，大豆蛋自中 的抗原性成分大大减少。酶免疫测定方法研究发现：大豆肽的抗原性只有大豆蛋白的 0 1 。最新的研究表明，当蛋白质的分子质量3 4 0 0 以下时则不会引起过敏反应，而大 豆多肽的分子量在1 0 0 0 以下，足以满足要求。这一性质在临床上有实用价值，可以给 易引起食物过敏，如牛乳过敏、乳糖不耐症患者的人们提供一种比较安全的蛋白食品。 1 2 。6 7 增强运动员肌肉和消除疲劳作用 要是运动员的肌肉有所增加，必须要有适当的运动刺激和充分的蛋白质补充。通常， 刺激蛋白质合成的成长激素的分泌在运动1 5 3 0 m i n 之间以及睡眠后6 0 m i n 时达到顶 峰，若能在此期间提供消化吸收性良好的多肽作肌肉蛋白质原料则效果极佳。因此，运 动前、运动中及运动后蛋白质的增加或补充，均可以补充体内蛋白质消耗，且由于肽易 于吸收，能迅速利用，因此，抑制或缩短了体内“负氮平衡”的负作用，达到抗疲劳作 用( 程丽娟与赵树欣，2 0 0 4 ) 。 1 2 ，6 8 促进矿物质吸收的作用 大豆蛋白中含有植酸、草酸、纤维、单宁及其他一些多酚类物质，能抑制人体或动 物对c u 、c a 、m g 等的生物利用率，对于健康人来说，这种抑制作用没有任何有害作用。 而大豆肽。由于可溶性游离的低分子物质，可以随同渗透液一同去除，而成为低植酸含 8 沈阳农业大学硕士学位论文 量大豆蛋白质，同时与c u 、c a 、m g 等离子螯合形成可溶性络合物，有利于机体吸收。 1 2 6 9 调整血糖浓度 葡萄糖是运动中的首要能源，在剧烈运动过程中，机体必须保持一定葡萄糖含量。 小鼠游泳9 0m i n 后测葡萄糖含量，添加肽组与对照组相比差异显著，且肽摄入量越大， 血清中葡萄糖含量越高，因此肽可以作为稳定血糖的调节剂。陈晓光等( 2 0 0 0 ) 报道， 大豆肽对a 一葡萄糖苷酶有缓慢抑制作用，a 一葡萄糖苷酶主要分布于肠微绒毛上，它的 作用是迅速分解糖供体内葡萄糖，因此大豆肽同其他碳水化合物和糖类一起使用时，不 受胰岛素分泌量的影响，能起到抑制血糖急速上升的作用( 赵芳芳与张日俊，2 0 0 4 ) 。 1 3 大豆肽在食品中应用 1 3 1 普通食品 大豆肽具有较强吸湿和保温功能、将其应用于各种豆制品、高蛋白食品、焙烤食品、 火腿及人造肉等食品时，可起到软化食品、调整其硬度与改善口感和保持水分等作用。 1 3 2 发酵食品和冷饮食品 大豆具有促进微生物生长发育和代谢之功能，它能促进双歧杆菌的发酵，还能促进 乳酸菌、霉菌及其它茵类的增殖，也能促进面包酵母产气作用。因此，大豆肽可用来生 产酸奶、干酪、醋、酱油和发酵火腿等发酵食品，从而提高生产效率，保持产品质量稳 定，改善食品风味等。因为大豆肽水溶性很高，溶液粘性低，且在酸性条件下也不产生 沉淀，并有较高发泡功能；所以它可用于生产酸性饮料、营养饮品、汽水、速溶固体饮 品和奶粉、啤酒、雪糕及冰淇淋等冷饮食品。 1 3 3 医疗食品 医疗食品即根据已知的已被医学证明的科学原理。旨在对有特殊营养要求的疾病或 状态，进行食物控制并在医生监督下配制的经肠消化或摄入的食品。由于严重病人生理 条件与健康人完全不同，具有高代谢性和对蛋白和能量的需求增加。在医院，大豆肽可 作肠吸收营养物，患者直接从口、胃送入这种营养物比非经口( 静脉) 的氨基酸更能迅 速恢复正常营养状态。由于大豆肽吸收率高，对于有些人群，特别是对牛乳蛋白或大豆 蛋白有过敏反应婴儿，据研究证明分子量在3 4 0 0 以下的肽不会引起过敏反应。因此肽 可满足这些人群( 婴儿) 对氨基酸的需要，保证其健康和成长。 。 1 3 4 老年食品 一股老年人由于疾病或衰老，摄取的蛋白量一般都低于需要量，这样更容易引起疾 病和衰老；同时，由于老年人因各种原因如孤独、压抑、体育活动减少等导致体质下降， 食欲下降，加上消化吸收功能衰退造成老年人营养严重不足。由于肽不经消化就可迅速 有效被吸收，因而可成为老年食品中理想的氮源强化剂。一些研究表明，大豆肽具有较 强抗氧化活性，荣建华等以大豆分离蛋白为原料，采用酵解等方法制备出分子量小于 9 第一章前言 1 0 0 0 0 大豆肽，从大豆还原能力、抗氧化能力等考察大豆肽抗氧化性能，并着重研究大 豆肽在f e n t o n 体系中对一0 h 清除效果。研究表明大豆肽具有较强抗氧化活性，在浓度 0 i m g m e 2 5 0 i i l g m l 范围内，对- o h 都有明显清除作用。沈培英制备抗氧化肽研究，为 开发老年人食品提供理论依据。 1 3 5 血压食品， 大豆肽能抑制血管紧张素转换酶( a n g i o t e n s mc o n v e n t i n g e n z y m e ，a c e ) 活性。由 于血管中a c e 能使血管紧张素x 转换成y ，后者能使末梢血管收缩，血压升高，大豆肽 抑制a c e 活性，从而可防止血管末梢收缩，达到降血压作用。但大豆肽对正常血压者没 有降压作用，所以它对心血管疾病患者有显著疗效，故而对正常人体并无害处，且安全 可靠。 1 3 6 运动员食品 在体育活动中一般消耗体内热量4 1 0 是由消耗蛋白质提供的，由于体内不贮存 蛋白质和不能合成必需氨基酸，所以必须及时从外部补充氨基酸，以免造成肌肉蛋白负 平衡。小分子肽则比蛋白质或氨基酸更容易被吸收，因而能迅速恢复和增强体力；故它 可用于制各运动员食品，其中包括运动员食用的粉、片和颗粒状食品、蛋白质强化食品 和能量补给饮品等。日本学者曾对大学柔道运动员进行大豆肽饮服试验，每天除常规饮 食外，再增加2 0 9 大豆肽，连续服5 个月，试验结果与没有服用大豆肽的对照群进行比 较，服用大豆肽者体能有明显增加。另外，大豆肽对加速肌肉恢复疲劳有明显效果，当 肌肉细胞破坏时，血液中的肌红蛋白就会增加，反之，当肌肉细胞复原时则肌红蛋白减 少。曾有学者给2 0 公里竞走运动员饮服含2 0 9 大豆肽的饮料，在运动前后分别测定血 液中肌红蛋白变化情况，经测定后发现，饮服大豆肽群其肌红蛋白值减少速度比未饮服 大豆肽的快。 1 3 ，7 减肥食品 传统减肥方法大多是通过低能膳食的摄入，并参加适量体育运动，可促进贮藏脂肪 消耗。但由此造成体重下降，致使许多肌肉组织也同时丧失，导致减肥者体质下降，为 此在减肥过程中，氮平衡的保证极为重要。所以，在保证摄入足够肽的基础上，将其余 能量组分降至最低，则可达到减肥目的，而且能保证减肥者体质。这对于从事对体重有 特别要求的运动，如拳击、举重、摔跤等运动员的体重保持具有特别重要的意义。近年 来研究表明，大豆肽具有很强促进脂肪代谢和能量代谢效果，大豆肽能与机体的胆碱结 合，具有降低人体血清胆固醇功能。若每日食用3 0 4 0 9 大豆肤，其胆固醇和甘油三酯 水平会明显降低( 孙群等，2 0 0 3 ) 。 1 0 沈阳农业大学硕士学位论文 1 4 国内外研究现状分析 1 4 1 世界大豆肽研究现状 美国和日本，无论在基础理论方面，还是在应用研究方面，均处于世界领先地位。 美国7 0 年代初研究的新型大豆深加工产品一大豆肽，d e l t o w ns p e c i a t i o n 公司建成了年 产5 0 0 0 吨食用蛋白肽的工厂。日本8 0 年代开展此方面的研究，不二制油公司、雪印、 森永等乳业公司在制油副产品和食品开发中也致力于大豆肽的研究，从产酶菌的选育， 到水解工艺的确定、水解产物的脱苦均取得了技术上的突破；而且均已成功地将大豆肽 应用于食品工业领域。不二制油生产的某系列产品，有p m ，s ，r ，d 四种，最先用的是 p m ，s 类，含2 3 个氨基酸残基( 吴建平，1 9 9 8 ) 。目前，大豆肽已经工业化大规模生 产，主要是根据所制得的大豆肽生理活性不同，将其制成药片、口服液或作为功能因子 添加到各种食品中，发挥各种生理功能。现已开发出婴幼儿食品、运动食品、发酵食品、 减肥食品、降压肽等一系列保健产品，取得了良好的经济效益和社会效益。 1 4 2 我国大豆肽研究现状 我国大豆肽的研究十分广泛，特别是近十年有突飞猛进之势。1 9 9 3 年盛国华报道了 大豆肽的功能及应用的研究。赵新淮利用蛋白水解酶制备大豆蛋白水解物，并用于生产 酸性饮料。1 9 9 7 年郭凯等发明并申请了大豆肽氨基酸口服液及其制备方法的专利。同年 张延坤等报道了大豆肽在食品工业中的应用研究，大豆肽的制备工艺中所用的菌种是目 前应用较广泛的，主要是枯草杆菌1 3 9 8 、放线菌1 6 6 、栖土曲霉3 9 4 2 和黑曲霉3 3 5 0 等。同年李书国报道了大豆肽食品的开发，其生产大豆肽的酶有胰蛋白酶、碱性蛋白酶、 中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，开发出的食品包括饮料、恢复营养食品、老年人保健食品、 运动员食品、新型发酵类食品。2 0 0 1 年张玲华等报道了大豆肽的制备工艺研究，采用的 水解酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶。同年张日俊等研究发现经微生物降解的大豆粉中含 有1 2 种小肽，其中包括谷胱甘肽( 生物防御作用) ，g l y - h i s - l y s ( 促生长，促进细胞 生长分化) 等具有生物活性的肽类。2 0 0 2 年孔庆学等报道了大豆低聚肽的功能性质及其 应用，指出大豆肽可用于制作酸奶、婴幼儿食品、运动员食品、老年食品及减肥食品配 料等。同年刘通讯等采用多酶协同作用对大豆分离蛋白进行水解生产大豆肽进行了研 究，最终选择多酶与f l a v o u r z y m e 酶采用分步加酶方式作为研制大豆肽饮料的酶解条件。 2 0 0 4 年吴建中等对采用a l c a l a s e 和f l a v o u r z y m e 酶双酶法分步酶解工艺来生产低苦味 大豆肽的方法进行了研究。最近，许多科学研究者正致力于生产低苦味的大豆低聚肽的 研究并将其应用到食品领域中；另外，也有人利用微生物所产的蛋白酶对大豆蛋白进行 酶解。 近几年，大豆肽的工业化生产也已在国内出现。黑龙江省的三乐源集团研制了“大 豆蛋白活性肽”武汉天天好生物制品有限公司在使用复合肽多级定向酶系统技术生产大 第一章前言 豆肽方面处于国内领先水平，同时掌握了大豆蛋白肽的性能指标测定、检测方法以及功 能评价等技术。国内专利报道，运用生物工程技术研制成大豆肽氨基酸口服液。并且在 2 0 0 5 年，由山东都庆股份有限公司、中国食品发酵工业研究院组建的注册资本5 0 0 0 万 元的中食都庆( 菏泽) 生物技术有限公司，共同投资建设了5 0 0 0 吨大豆多功能肽生产 线。该生产线的建成并一次试车成功，标志着我国大豆肽产业步入新的发展阶段，为我 国跻身大豆肽生产国际先进行列奠定了坚实的基础( 郭心义，2 0 0 4 ) 。 1 。5 大豆肽的前景展望 由于肽类易被人体吸收、有较好的酸热稳定性和水溶性等物理特性，不仅能提供人 体生长发育所需的能量，还具有防病治病、调节人体机能的优点，多肽成为当前食品学 科研究的热点之一。 近年来，多肽类的生理功能受到了越来越多的重视，随着许多活性肽的结构和生理 功能的明朗，科学界对活性肽的研究越来越深入。大豆的资源丰富、价格低廉、大豆蛋 白质的营养丰富和特殊的生理功能，以及大豆肽具有比大豆蛋白质更丰富的加工特性， 大豆肽的生产已经成为大豆及大豆蛋白质深加工的一个重要方向，同时也为油脂加工厂 的大宗副产物大豆粕的综合利用提供了一条有效途径。随着酶制剂工艺的发展和固定化 酶技术等研究的深入，大豆肽的降解条件及功能研究也进入了新的发展阶段。大豆肽能 有效地改善原料蛋白的各项理化特性( 无豆腥味、无蛋白变性、易溶于水、流动性好等) ， 同时还能赋予产品特殊生理活性的功能，因此在功能性食品开发方面展现出广阔前景。 在国内，肽类营养功能食品的开发已列入了食品工业的远景目标规划。随着人们对食品 功能性越来越强烈的要求，大豆肽的生产及应用前景必将非常广阔，市场潜力巨大( 蒋 文强与孙显慧，2 0 0 4 ) 。 1 6 纳豆激酶 1 ，6 1 纳豆激酶的生化性质 根据其基因的d n a 序列推测氨基酸的一级序列，可知是由2 7 5 个氨基酸残基组成的 单链多肽，准确分子量应为2 7 ，7 2 8 d a 。纳豆激酶在低于4 5 时活性相对稳定，高于6 0 c 逐渐失活，反复冻融5 次后，该酶仍能保持9 5 以上的活性。室温下，在p h 71 2 范围 内较为稳定，p h 7 9 范围内酶活性最为稳定，但低于p h 5 则性质不稳定。 1 6 2 纳豆激酶的研究进展 纳豆激酶从1 9 8 7 年须见洋行博士发现至今更为人们关注，关注的焦点是食用纳豆 激酶食品与人的健康长寿紧密相关( 须见洋行，1 9 9 1 ) 。据报道纳豆激酶制品具有很强 的溶解纤维蛋白作用，降低血液粘度、降血脂、降胆固醇、改善血液循环状况，维持血 细胞的j 下常状态和功能等多种生理功能。因此纳豆激酶制剂主要用于预防和治疗心脑血 沈阳农业大学硕士学位论文 栓、脑中风、老年痴呆症等。根据w h o 公布的统计数字，全世界现在患有各种血栓性疾 病的患者有1 5 0 0 万之多，其中每年约有3 0 0 万患者死亡，同时还发现这种状况向低年 龄化发展。开发纳豆激酶产品作为预防和治疗血栓性疾病、老年痴呆