（运动人体科学专业论文）运动性疲劳对大鼠骨骼肌蛋白质组表达谱影响的研究.pdf

摘要目的：分析运动疲劳对大鼠大腿骨骼肌蛋白组表达谱的影响，寻找新的与运动疲劳相关的蛋白质，以期对运动疲劳的产生机制作进一步的探讨。方法：本研究采用比较蛋白质组学方法，研究运动疲劳对大鼠后肢大腿骨骼肌蛋白质组表达谱的影响。以游泳方式建立大鼠运动疲劳模型，利用动物行为学和生物化学方法对模型的可信度进行验证。建模结束后，研磨法提取蛋白质，用l o w r y 法测定蛋白总量，进行二维电泳分离，通过计算机图像分析，寻找差异性蛋白质，将差异性蛋白质点分别进行质谱分析，经数据库查询，初步鉴定出这些差异蛋白。研究结果：1 利用动物行为学和生物化学方法对运动模型进行观察、检测。发现大鼠神情倦怠，双眼暗淡无光，皮毛蓬乱枯槁，片状脱落，食欲下降，对外界刺激反应迟钝，逃避和探究行为减少，运动能力下降，体重减轻，第7 天和第l o 天较对照组明显下降，存在显著性差异。大鼠血尿素含量即刻组和1 2 小时组与对照组相比增高，存在差异。结果提示：大鼠十天递增负荷游泳运动造成的动物疲劳状态与运动员生化指标变化基本相似，说明本实验提供的动物模型是可靠的。2 经二维电泳分离，以及计算机图像分析，发现：在实验组有1 2 个蛋白发生明显的变化( 蛋白质浓度相差3 倍以上) ，其中9 个蛋白质表达下调，3 个蛋白质表达上调。3 经质谱分析，数据库查询，初步鉴定出这些差异蛋白：( 1 ) 3 个表达上调的蛋白质中有两个是同一个蛋白质肌球蛋白巯解轻链，另一个是肌球蛋白轻链1 ，都属于肌球蛋白轻链；( 2 ) 9 个表达下调的蛋白质：三磷酸甘油醛脱氢酶，肛烯醇化酶，肌酸激酶m 链，a t p a m p 转化酶，肌球蛋白重链，肌动蛋白，快速骨骼肌型肌钙蛋白i ，快速骨骼肌型肌钙蛋白t ，未知蛋白r i k e n c d n a1 7 0 0 0 0 1 f 0 9 【m 岫m 岫训u s 。结论：l 、十天递增负荷游泳运动所建的运动疲劳模型，动物行为学特征和生化指标与运动员在运动中出现的运动疲劳状态时的特征相吻合，说明本实验所建立的运动疲劳模型是可靠的。2 、表达下调的蛋白质中，4 个酶( g a p d h ：m - c k ：b e t ae n o l a s e ：a t p - a m p转化酶) 与运动疲劳时骨骼肌能量代谢失衡，代谢产物堆积以及机体的调节失衡有关。4 个是骨骼肌收缩蛋白( m h c ；a c t i n ；f s t n l ；t n l l p ) ，可能是长时间剧烈运动导致骨骼肌蛋白质降解增加。另外一个是r i k e ne d n a l 7 0 0 0 0 1 f 0 9 是新蛋白，目前尚未报道。表达上调的蛋白质( m l c i 、d t n b ) ，可能与运动疲劳时机体酸性代谢产物增多，加l c i 、d t n b 不易解离有关。3 、b e t ae n o l a s e ，a t p - a m p 转化酶与运动疲劳的关系尚未报道，深入研究其与运动疲劳的关系，对于揭示运动疲劳的产生机制，检测运动疲劳可能有重要意义。4 、f s t n i ，t h r f ，有可能作为骨骼肌早期损伤的较为敏感的检测指标。5 、i u i 汪ne d n a1 7 0 0 0 0 1 f 0 9 是新发现的蛋白，目前尚未报道。可能与运动疲劳有关，是本研究的新亮点。关键词：运动性疲劳；骨骼肌；蛋白质组；大鼠a b s r r a c i 。a i ma n a l y s i st h ei n f l u e n c eo f p r o t e i nm a s ss p e c t r u m ( s k e l e t a lm u s c l eo fs dr a tt h i g h ) b ye x e r c i s e - i n d u c e df a t i g u ea n ds e a r c hn e wp r o t e i nc o r r e l a t i v ee x e r c i s e i n d u c e df a t i g u e ，i no r d e rt o 缸 t h e rd i s c u s st h em e c h a n i s ma b o u te x e r c i s e i n d u c e df a t i g u e m e 恤0 dt h i se x p e r i m e n tu s et h em e t h o dt oc o m p a r ep r o t e i n s , b u i l dt h em o d e lo fs dr a te x e r c i s e i n d u c e df a t i g u eb yt h ew a yo fs w i m m i n g , u t i l i z et h ek n o w l e d g ea b o u tb i o c h e m i c a la n da n i m a lb e h a v i o rt oo b s e r v et h em o d e lo ft e nd a y sl o a d i n gi n c r e a s i n gs w i m m i n ge x e r c i s ei no r d e rt oi n s u r et h ec r e d i b i l i t ya b o u ta n i m a lm o d e lo f t h ee x p e r i m e n t a f t e rt h em o d e 1 i n g a tt h el o wt e m p e r a t u r ec o n d i t i o ng e tt h es k e l e t a lm u s c l eo fs dr a tt h j | 曲t h e np r e s e r v ea t 一8 0 。ca n dg e tt h ep r o t e i n u s i n gt h el o w r ym e t h o de l i m i n a t eg r o s so fp r o t e i na n dt h o u g ht w o - d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i st os e a r c ho t h e m e s sp r o t e i nb yc o m p u t e rm a pa n a l y s i s t a k eo t h e r n e s sp r o t e i nb ym a s ss p e c t r u ma n a l y s i sr e s p e c t i v e l ya n di n v e s t i g a t e db yd a t ab a s et oi d e n t i f yt h eo t h e m e s sp r o t e i n ，r e s u l t s1 a f t e rt e nd a y sl o a d i n gi n c r e a s i n gs w i m m i n ge x e r c i s e , t h er a t ss h o w e dt h ec o n d i t i o no ff a t i g u ea n do nt h e7 t ha n d1 0 t hd a yt h eb o d yw e i g h ti sd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y i nt h eo s ga n d1 2 s gt h eb ua r ei n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y b o t ht h eb e h a v i o ra n dc h e m i c a li n d e xs h o w e dt h a tt h er a t sa r ei nt h ec o n d i t i o no ff a t i g u e t h em o d e li ss u i t a b l ef o rt h eu s eo ft h ef o l l o w i n ge x p e r i m e n t s 2 t h o u g ht w o - d i m e n s i o n a lg e le l e c ( r o p h o r e s i s a n dc o m p u t e rm a pa n a l y s i s t h e r ea r e1 2p r o t e i nh a v es i g n i f i c a n tc h a n g e ( p r o t e i nc o n s i s t e n c ed i s c r e p a n t3t i m e s ) i nw h i c h9p r o t e i ne x p r e s sa r ed e c r e a s e da n d3p r o t e i ne x p r e s sa r ei n c r e a s e d3 t a k e1 2p r o t e i n sb yn l a s $ s p e c t r u ma n a l y s i sr e s p e c t i v e l ya n di n v e s t i g a t e db yd a t ab a s et oi d e n t i f yt h eo t h e r n e s sp r o t e i n u i( 1 ) 3p r o t e i n se x p r e s si n c r e a s e di nw h i c ht w oa r es a n l ep r o t e i n ( m y o s i nl 2 ，d t n b ) ，a n o t h e ri sm y o s i nl i g h tc h a i n1 ，a l lb e l o n gt om y o s i nl i g h tc h a i n( 2 ) 1 1 1 e9p r o t e i n se x p r e s sd e c r e a s e da r eg l y c e r a l d e h y d e 一3 p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s ，g a p d h ；b e t ae n o l a s e ：c r e a t i n ek i n a s emc h a i n ，h 扛c k ；a d e n y l a t ek i n a s ei s o e n z y m el ，a t p - a m pt r a n s p h o s p h o r y l a s e ，a k l ，m y o k i n a s e ；m y o s i nh e a v yc h a l l = l ，c ：a c t i n ；t r o p o n i ni , f a s ts k e l e t a lm u s c l e( t r o p o n i nif a s t - t w i t c hi s o f o r m ) ，f t i l i ) ；t r o p o n i nt f a s ts k e l e t a lm u s c l ei s o f o r m sb e t a a l p h a0 3 e t a a l p h at n t f ) ；r i k e ne d n a17 0 0 0 01 f 0 9 m u sm u s c u l u s 。t h e 4p r o t e i n s ( g a p d h ；b e t ae n o l a s e ；m - c k ；a t p - a m pt r a n s p h o s p h o r y l a s e ) i nw h i c h9p r o t e i n se x p r e s sd e c r e a s e db e l o n gt oe n z y m e a r er e l a t e dw i t he n e r g ym e t a b o l i s m ；o t h e r4p r o t e i n s ( 时c ：a c t i n ；蠡t m ：t n l f ) i nw h i c h9p r o t e i n sb e l o n gt os k e l e t a lm u s c l ef a b r i cp r o t e i n ；t h el a s to n ei sr i k e nc d n a1 7 0 0 0 0 1 f 0 9 m u sm u s c u l u s c o n c l u s i o nm o d e lo fe x e r c i s e - i n d u c e df a t i g u eb yt e nd a y sl o a d i n gi n c r e a s i n gs w i m m i n ge x e r c i s e ，b o t ht h eb e h a v i o ra n dc h e m i c a li n d e xa l ei n o s e u l a t ew i t i lt h ec h a n l c t e ro fa t h l e t ef a t i g u ea tt h em o v e m e n t t h ee x p e r i m e n ts h o et h em o d e lo fs p o r tf a t i g u ea r er e l i a b l e i nt h e1 2o t h e m e s sp r o t e i n , 4p r o t e i n ( g a p d h ： 缸c k ：b e t ae n o l a s e ：a t p 一伽) a r e l a t e dw i t he n z y m ea n de n e r g ym e t a b o l i s m e x p r e s sd e c r e a s ed u et ob r e a kb a l a n c eo f e n e r g ym e t a b o l i s mw i t h i ns k e l e t a lm u s c l ea tf a t i g u ea n dm e t a b o l i z eo u t c o m ea c c u m u l a t ea n dm o d u l e su n b a l a n c eo fb o d y 7p r o t e i nb e l o n gt os k e l e t a lm u s c l es h r i n kp r o t e i n 4p r o t e i n ( c ：a e t i n ；f t l l i ：t n 耶) e x p r e s sd e c r e a s ed u et ol o n gt i m ea c u t ee x e r c i s el e a dt os k e l e t a lm u s c l ep r o t e i ns e p a r a t i o n 3p r o t e i n ( m l c i ：d t n b ) e x p r e s si n c r e a s ed u et os p o r tf a t i g u em e t a b o l i z ea c i do u t c o m ei n c r e a s e d ( m l c , 、d t t 惦) a r eu n e a s yt os e p a r a t i o n r i k e ne d n a1 7 0 0 0 0 1 f 0 9i sn e wd i s c o v e r e dp r o t e i na n di tm a yb eh a v er e l a t i o n s h i p 、i t l le x e r c i s ef a t i g u e ，m yr e s e a r c hw i l lc o n t i n u e i 、，b e r ne n o l a s e ：t h er e l a t i o n s h i po fa t p - a m p 奶t l ls p o r t sh a v en o tb e e n北p ( 删l u c u b r a l ei th a v ei m p o r t a n tm e a n i n gt os h o wt h ep r o d u c em e c h a n i s mo f s p o r t sf a t i g u ea n dt e s ts p o r t sf a t i g u e 6 t i l i ：t n t fw i l lb et h es e n s l l i v ec h e c ki n d e xo fp r o p h a s es k e l e t a lm r s c l ei n j u r yk e yw o r d s ：e x e r c i s e - i n d u c e df a t i g u e ；s k e l e t a lm u s c l e ；p r o t e o m i c s ；r a tv缩略词表英文缩写英文全称中文全称b ub l o o du r e a血尿素c a载体两性电解质c h a p s3 - ( 3 一胆酰胺丙基) 二乙胺】一丙磺酸c kc r e s t i n ep h o s p h o k i n a 肌酸激酶d 1 厂rd i t h i o t h r e 岫l二硫苏糖醇2 - d et w o - d i m e n s i o n a lg e le l e e t m p h o r e s i s 双向凝胶电泳g a p d hg l y c e r a l d e h y d e - 3 - p h o s p h a t e3 - 磷酸甘油醛脱氢酶d e h y d r o g e n a sh o u ri m m o b n i z e dp h 鲫i e n tm i n u t em y o s i nh e a v yc h a hm y o s i nu g h tc h a i n ,m e c h a n og r o w t hf a c t o rm a - s s p e c t r o m e t r yn i t r i co x i d es y m t h a s en i c o f i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o f i d e糖皮质激素受体糖皮质激素小时固相p h 梯度乳酸脱氢酶分钟肌球蛋白重链肌球蛋白轻链机械生长因子质谱鉴定肌红蛋白一氧化氮合成酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷氧化型尼克酰胺腺嘌呤二核苷还原型诱导型一氧化氮合酶内皮型一氧化氮合酶一氧化氮i s o e l e e t r i cp o i n t等电点p e p d a em a 器f m g m , r m t i n g肽质量指纹图谱p o l y a e r y la m i d eg e le l e c t r t r l p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳讯h蓦嘲蓦一眦肼懈胁|萋+盆一硼一mm s 印e r o x i d cd i s m u t a s c ，f a s ts k e l e t a lm u s c l et r o p o n i nic a r d i a ct r o p o n i nit r o p o n i nit r o p o n i ntm y o s i nl i g h tc h 2 t mm y o s i nh e a v yc h a i n十二烷基磺酸钠超氧化物歧化酶快速骨骼肌型肌钙蛋白i心肌型肌钙蛋白i肌钙蛋白i肌钙蛋白t丙氨酸氨基转移酶乳酸脱氢酶氧自由基丙二醛肌球蛋白轻链肌球蛋白重链哪渤伽：詈附w脚删呱枞眦眦承诺书本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师指导下独立完成的，学位论文的知识产权属于山西大学。如果今后以其他单位名义发表与在读期问学位论文相关的内容，将承担法律责任。除文中已经注明引用的文献资料外，本学位论文不包括任何其他个人或集体已经发表或撰写过的成果。学位论文作者( 签章) ：缸钞币i 1p、2 0 07 年循，z e ti主要仪器及常用试剂1 主要仪器m a l d t - t o f - t o f 串联质谱仪4 7 0 0p r o t e o m i c sa n a l y z e r垂直板蛋白电泳槽一向等电聚焦仪凝胶图像分析仪t l l c 型台式高速冷冻离心机2 主要溶液的配制二维电泳相关溶液：美国b i o r a d 公司美国b i o r a d 公司美国b i o r a d 公司美国b i o r a d 公司北京四环科学仪器厂( 1 ) 水化上样缓冲液：尿素4 8 0 5 9 ，c h a p s 0 4 9 ，d t r 0 0 9 8 9 ( 现加) ，b i o - l y t e 5 0 t d ( 4 0 ) ，溴酚兰o 0 0 1 1 0 , j 0 ) ，m i l l i q 水定容至1 0 m l 。分装成1 0小管，每小管lm l ，- 2 0 保存。( 2 ) 胶条平衡缓冲液母液：尿素3 6 9 ，s d s 2 9 ，t r i s - h c l 2 5 m l ( 1 5 mp h 8 8 ) 甘油2 0 m l ，m i l l i q 水定容至1 0 0m l 。( 3 ) 胶条平衡缓冲液i ：胶条平衡缓冲液母液l om l ，d i t 0 2 9 ，充分混匀，用时现配。( 4 ) 胶条平衡缓冲液：胶条平衡缓冲液母液1 0m l ，碘乙酰胺o 2 5g ，充分混匀，用时现配。( 5 ) 银然相关溶液配方：固定液：无水乙醇2 5 0m l ，冰醋酸5 0m l ，d d h 2 02 0 0m l 。敏化液：无水乙醇1 5 0m l ，无水醋酸钠3 4g ，n a 2 s 0 3l g ，总体积5 0 0n d 。银染：硝酸银0 5 9 中加入5 0 0m l 蒸馏水，临用时加入l o o p l 甲醛。显色液：无水碳酸钠1 2 5 9 中加入5 0 0 m l 蒸馏水，临用前加入5 0 山甲醛。终止反应液：e d t a n a 27 3 9 溶于5 0 0 m l 蒸馏水中。问题的提出1 问题的提出运动性疲劳的发生规律及其机制的研究是运动医学界具有重要实际意义和挑战性的课题。随着现代竞技运动水平提高，比赛日益激烈，运动员在运动训练中承受的负荷越来越高，出现运动性疲劳的几率也更高。适当的运动疲劳和合理的恢复手段，可促进运动员机能水平提高；相反过度疲劳不仅影响训练效果，还可能引起各种机能障碍，以致损害运动员的身体健康。因此，了解运动性疲劳的产生机制，对加速消除运动性疲劳有积极意义。随着运动生理学的发展，国内外对于运动性疲劳产生机制的认识，已经从单纯的能量消耗或代谢产物堆积，向着多因素、多层次，多环节、综合作用的认识发展。尤其是分子生物学技术的发展，使得疲劳的研究发展到细胞水平、分子水平。在运动疲劳产生过程中存在着一个复杂的网络调控体系，即：神经一内分泌一免疫代谢调节网络( 链) 在这个网络调控体系中，许多蛋白质( 酶、受体、细胞因子、膜转运蛋白质等) 的表达发生变化。分析运动性疲劳产生过程中蛋白质表达谱的变化，将有可能发现新的与运动疲劳相关的蛋自质。本课题拟以游泳方式建立动物模型，采用比较蛋白质组学的方法，对运动疲劳后大鼠大腿骨骼肌蛋白组的表达谱进行分析，旨在寻找新的与运动疲劳相关的蛋白质，以期对运动疲劳的产生机制作进一步探讨。1 1 运动性疲劳的概念自1 8 8 0 年莫索( m o s s o ) 研究人类的疲劳开始，距今已有1 0 0 多年的历史了。1 9 8 2年召开的第5 届国际运动生物化学会议将疲劳定义为：运动性疲劳是机体生理过程不能继续机能在特定水平上进行和( 或) 不能维持预定的运动强度。它是运动本身引起的机体工作能力的暂时降低，经过适当时间的休息和调整可以恢复的生理现象，是一个极其复杂的身体交化的综合反应过程l ”。运动性疲劳早期主要出现一些主观感觉方面的不适感和心理变化：一般为自我感觉疲乏甚至疲惫不堪、食欲及睡眠欠佳、头晕跟花、迟钝、沮丧、缺乏兴趣和信心、敏感、易激动等。伴随着运动能力下降，疲劳感觉若未经调整而进步发展，可以出现一些客观指标的轻度变化。身体机能方面表现为：体重下降、头痛失眠、脉搏加快、血压升高、心脑电图异常、衄红蛋白下降、白细胞总数升高、出现蛋白尿及血尿。神经机能失调如反应迟钝、判断失误、注意力不集中等。运动能力方面表现为：运动素质下降，训练时极易疲劳且不易恢复，动作不协调、不准确，接受l运动性疲劳对大鼠骨骼肌蛋白质组表达谱影响的研究能力差，比赛时技术发挥不好，运动成绩下降等。目前，运动性疲劳的生化检测指标有如下几项：血清睾酮、血清皮质醇、肌酸激酶、乳酸脱氢酶、血清肌红蛋白、血乳酸、血尿素、尿蛋白等。运动性疲劳学说经历了几个阶段。目前，比较流行的说法是神经一内分泌一免疫一代谢网络学说。在这个复杂的网络调控体系中，蛋白质无疑扮演着重要的角色。1 2 运动性疲劳对蛋白质的影响蛋白质普遍存在于生物界，是生命活动的物质基础，是生物体的基本组成之一，也是生物体中含量最丰富的生物大分子。蛋白质结构和功能复杂，承担着完成生物体内各种生理功能的任务，在物质代谢、机体防御、血液凝固、肌肉收缩、细胞间信息传递、个体生长发育、组织修复等方面，蛋白质发挥着不可替代的重要作用。运动性疲劳不可避免地发生在运动训练与体育锻炼中，运动方式、运动强度、运动环境的变化均可引起血液【2 l 、肌肉【3 1 、器官【4 】、中枢神经体统 5 1 等蛋白质的表达发生变化。在疲劳的产生过程中，无论是细胞内蛋白质分子( 如信号传导因子、连接蛋白、酶等) ，细胞膜蛋白质分子( 如受体、膜转运蛋白、酶等) ，还是细胞外蛋白质分子( 如转运蛋白、酶、免疫球蛋白、补体分子等) ，其表达均发生改变，有的蛋白质表达上调，有的蛋白质表达下调 6 1 。1 2 1 运动性疲劳对酶的影响新陈代谢是生命的基本特征。生物体内进行的代谢，实际上是许多化学反应的逻辑组合，表现出极高的有序性。代谢途径中的多数化学反应在极短的瞬间达到反应平衡。其原因是生物体内有一种蛋白质酶。酶是具有催化作用的蛋白质，具有高度的催化效率1 7 】。最早发现运动导致血清酶活性增高现象的是l o u 和h i s c h e r 。早在1 9 5 8 年他们让受试者做跑台运动，仅5 分钟后血清醛缩酶，乳酸脱氢酶，天冬氨酸氨基转移酶明显增高；a n d r e e i 等也报道了拳击运动员比赛后血清天冬氨酸氨基转移酶活性升高，1 9 6 0年r i c h t e r 和k n n i r t e 的研究表明：血清醛缩酶活性在无训练者运动1 5 分钟后出现升高现象。由此，开启了运动与酶关系研究的先河。1 2 1 i 运动性疲劳对肌酸激酶的影响肌酸激酶( c k ) 主要分布在骨骼肌、心肌、和脑中，肌酸激酶分子由两种多肽亚基m 和b 组成，m m 、m b 、b b 型同工酶分别由骨骼肌、心肌、和脑释放出来。肌酸激酶在骨骼肌中含量最多，是骨骼肌能量代谢的关键酶之一，其作用是催化三磷酸2问题的提出腺苷( 粥曙) 和磷酸肌酸( c p ) 之间高能磷酸键可逆性的转移；是评定骨骼肌承受刺激和了解骨骼肌细微损伤及其适应与恢复的重要而敏感的生化指标，它是短时间激烈运动时能量补充和运动后a r p 恢复反应的催化酶，与运动时、运动后能量平衡及转移有着密切的关系嗍。近年来，随着c k 指标在运动讲f 练实践中的应用，运动后血清c k 活性交化与骨貉肌损伤以及运动员对运动负荷的适应情况之间的关系受到教练员、运动员和研究人员的广泛关注。不同的运动方式、运动强度和持续时间几乎都可以引起血清c k 活性变化。o 盯k o n 等闭研究骨骼肌在采用等动、离心和向心三种不同的收缩方式后血清c k 活性变化，发现血清c k 活性在三种运动后均显著上升，且三种方式运动后血清c k 活性的增加没有显著性差异，血清c k 活性在运动后出现峰值的时间报道不一，从运动后即刻到几天均有。进一步的研究发现：血清c k 活性变化的大小及时间长短与运动中骨骼肌收缩方式有密切关系【l 川，而以大鼠为实验对象，采用离心至力竭的运动方式，则血清c k 活性出现在运动后即刻【l l 】1 1 。1 2 1 2 运动性疲劳对乳酸脱氢酶的影响乳酸脱氢酶( l d 田是催化乳酸和丙酮酸之间相互转化的酶。它在人体内共有5 种同工酶，其中，肌型乳酸脱氢酶( m l d h ) 主要分布在骨骼肌内，催化丙酮酸生成乳酸，这对保证肌肉在短暂缺氧时仍能获得a t p 是极为重要的，它是糖酵解系统的关键酶之一，是评定糖酵解系统供能能力的重要指标。一般情况下，血浆乳酸脱氢酶活性较低，只有在组织损伤或细胞膜通透性发生改变时，细胞内乳酸脱氢酶逸出，致使血浆乳酸脱氢酶升蒯1 2 1 。运动后血清乳酸脱氢酶活性的升高与运动负荷关系密切。研究表明散打赛前大运动量训练阶段l d h 的活性与准备阶段相比有显著性变化，大强度训练阶段l d h 、c k 、均有显著性变化，实战对抗阶段l d h 、c k 、c k - m b 与准备阶段相比有显著性差异【2 】。长跑运动至疲劳后，血清乳酸脱氢酶( l d h ) 及其同工酶、肌酸激酶( c k )及其同工酶和丙氨酸氨基转移酶( a l t ) 及其同工酶均有明显升高，2 4 d 时后逐渐恢复并接近正常水平【1 3 】。在运动训练中，l d h 作为评价运动员身体机能的指标之一硎。1 2 1 3 运动性疲劳对一氧化氮合酶的影响运动疲劳与一氧化氮( n o ) 或一氧化氮合酶的关系备受关注。n o 是一种非经典的信使分子，它对靶细胞的直接作用是活化一种可溶性鸟苷酸环化酶，从而升高运动性疲劳对大鼠骨骼肌蛋白质组表达谱影响的研究c g m p 水平，后者触发一系列生物效应。研究表明【习：一氧化氮合酶参与了运动疲劳的发生。急性耐力运动后即刻，大鼠端脑诱导型一氧化氮合酶( i n o s ) 活性显著提高和内皮型一氧化氮合酶( e n o s ) 活性显著降低，大脑端脑n o 水平显著提高。说明长时间运动可诱发i n o s 活性增加，促使n o 过量生成，过量的n o 具有神经毒性作用，可以引发运动疲劳的发生。因而，可以认为一氧化氮合酶活性增高参与了运动疲劳的发生。刘鸿宇掣1 4 】探讨运动性疲劳对大鼠杏仁体一氧化氮合酶表达的影响。研究结果表明运动疲劳作为一种应激刺激，使杏仁体神经元一氧化氮合酶( n o s )表达减少，参与了中枢运动疲劳的形成。武桂新i ”】等认为力竭运动后大鼠骨骼肌n o s活性显著下降，可能对机体起到一种保护作用。1 2 1 4 运动性疲劳对超氧化物歧化酶的影响机体处于代谢活跃的情况下，机体利用氧增加，氧代谢增加。其代谢产物如自由基、c 0 2 等必然增加，清除这些物质的酶活性一定增强。已经证实，氧自由基( o f r )的生成与线粒体的氧利用率呈正比。运动时，脑组织线粒体氧利用率增加，介导自由基产生增多：此外，长时间剧烈运动可以引起线粒体呼吸链酶活性下降，阻断了呼吸链电子传递，造成了电子链处于还原状态，使氧发生半还原反应，引发泛醌在电子传递过程中单电子还原生成o f r ，自由基增多，使脂质过氧化代谢产物丙二醛( m d a ) 增加。m d a 作为机体内脂质发生过氧化反应的重要代谢产物，对细胞具有严重的毒性作用，最终会引起疲劳的产生。机体运动性疲劳及运动损伤会产生相应反应以对抗或消除自由基的毒害作用。有研究表明【4 】：间歇性无氧运动对小鼠抗氧化能力和脂质过氧化损伤的影响存在明显差异，且与训练持续时间及运动密度有关。运动组骨骼肌超氧化物歧化酶( s o d ) 的活性和t - a o c 含量均较对照组增高，且出现了随训练时间延长而升高的特点。缩短间歇时间，增加运动密度的间歇训练，也引起了骨骼肌抗氧化能力的提高。1 2 2 运动性疲劳对骨骼肌收缩蛋白质的影响骨骼肌收缩蛋白质主要由肌球蛋白、肌动蛋白和肌钙蛋白组成。肌球蛋白是粗肌丝的主要成分，肌动蛋白是细肌丝的主要成分。细肌丝与粗肌丝循环接触与分离，使肌纤维缩短和产生张力。1 2 - 2 1 运动性疲劳对肌球蛋白及m h cm r n a 的影响肌球蛋白( m y o s i n ) 是构成肌肉肌原纤维粗肌丝的基本组成蛋白，是横纹肌表达最丰富的蛋白，约占其总蛋白库2 5 。肌球蛋白是一个六聚体的蛋白质大分子，由两条分子量约为2 2 0 k d 的重链( m y o s i nh e a v yc h u r lm i - i c ) 和两对分子量为1 6 - 2 7 k d4问鏖的提出的轻链( m y o s i nl i g h tc h a i nm l c ) 组成。每条重链包括一完整的球状头部( n 末端)及一长的纤维状的a 一螺旋尾部( c 末端) 。两条重链大部分以双股叶螺旋盘绕，形成长约1 5 0 0 a 的长棒状，其余部分则和轻链一起构成球形头，即粗丝侧旁突起的横桥，长约2 0 0 a ，直径约7 0 a 。头部与长棒部接触的部位变细，形成“矛状”结构。尽管含有大量的小螺旋，长捧部是可以弯曲的。球形头在头棒连接处也可以弯曲而且能相对于长棒进行转动。肌球蛋白不仅是骨骼肌重要的结构蛋白和收缩蛋白，而且还具有a t p 酶的活性，故通常也称之为肌球蛋白a t p 酶。肌肉收缩的直接能量来源是肌球蛋白对a t p 的水解。不同运动方式和运动负荷可导致m h c 发生不同转变。力竭运动导致m h c b型m r n a 所占百分比明显下降( p o 0 5 ) ，m h c h a 型m r n a 所占百分比则明显上升( p 如0 5 ) ，提示力竭运动可能刺激m h c m r n a 表达出现。由快到慢”的趋势【f 6 j 。连续2 周耐力训练后，股四头肌深层肌总m h c m r n a 的含量显著增加，快型m i - i c中的两种慢型c 异形体m h c 1 x 、枷h c h a 基因表达增加，但未引起快型m h c 一b和慢型m h c ! 基因表达的变化呻。1 2 2 2 运动性疲劳对肌动蛋白的影响肌动蛋白( a c - t i n ) 是真核细胞中一种重要蛋白质，它参与几乎所有形式的细胞及细胞器的运动，特别是作为一种收缩蛋白在骨骼肌的活动中发挥重要作用。目前至少已分离出6 种肌动蛋白，包括两种横纹肌型( 骨骼肌型伽a a 6 n 和心肌型c t - a c t t n ) 、两种平滑肌型( 内脏型或称小肠型、胃型和血管型或称主动脉型) 和两种非肌型肌动蛋白( p - a c t i n 和3 , - a c t i n ) 。肌动蛋白有两种存在形式：球状单体( g a c 6 n ) 和纤维状聚合体( f - a c t i n ) 。g a c 曲与f a c t t n 之间可相互转化，在肌节中，f - a 硎n 是细肌丝的主要成分。肌动蛋白在肌肉收缩过程中起到相当重要的作用。肌动蛋白激活肌球蛋白- m 9 2 + - a t p a s e ，使a 1 1 p 分解释放能量并沿肌球蛋白滑动引起肌肉收缩及其他非特异性细胞运动。肌动蛋白参与的运动都由g - t i n 、f - a c t i n 两种形式与各种结合蛋白相互作用控制。研究证实1 1 9 1 力竭性游泳后，大鼠股四头肌深层肌( 快收缩、易疲劳自肌)中的f - a c t i n 呈现逐渐升高的趋势，而g - a c t i n 呈下降趋势，6 h 后降到最低，1 2 h 后又有所回升。两者之和的t - 肌动蛋白表现为游泳后下降，1 2 h 后开始上升。弘肌动蛋白m r n a 在力竭性游泳后即刻已经开始上升，6 h 达最高，1 2 h 基本回降到安静水平。这一结果揭示了运动恢复期中a - a c t i n 基因表达的规律特点。从侧面反映了力竭性游泳引起a - a c t i n 的表达规律。5运动性疲劳对大鼠骨骼肌蛋白质组表达谱影响的研究1 2 2 3 运动性疲劳对肌钙蛋白的影响组成肌钙蛋白三元复合物( t n s ) 的3 个亚基在收缩调节中各自具有重要的作用，并因此分别被命名为t n c - - c a 2 + 结合亚基，具有c a 2 + 结合及调节位点：1 u 一抑制亚基，能抑制肌动蛋白和横桥头的结合，并能抑制a t p a s e 的激活，使力量、动作的产生受阻：t h t 一原肌球蛋白( t r o p o m y m i n ) 结合亚基，能结合到原肌球蛋白上刚。有研究表明【2 l 】力竭运动后t n l 出现较c k 早，与c k 平行升高并在2 4 h 内达到峰值，而且至少在运动后一两天内仍保持抬升，且t n i 超过基础值的相对升高幅度比其他所测指标更大一些。因此，测定血中骨骼肌肌钙蛋白抑制亚基浓度，有利于较早发现骨骼肌的早期运动性损伤。1 2 3 运动性疲劳对受体的影响运动性疲劳的出现是整体运动能力和机能的反应，在运动疲劳产生过程中存在着一个复杂的网络调控体系，即神经一内分泌一免疫代谢调节网络( 链) 2 2 1 ( 图1 ) 。在这个网络中，组成它的细胞必须以协调的方式进行活动，比较复杂的协调方式是通过特殊的化学物质，作为一种信使分子，在不同的细胞之间进行信息传递，无论哪一种信使分子都需要与特定细胞上的专一性受体结合后才能发挥作用 7 1 。神经、免疫和内分泌细胞及各运动器官细胞的表面都存在细胞因子、激素、神经递质和神经肽类的受体，这些受体是神经一内分泌一免疫代谢调节网络( 链)的物质基础之一。受体是细胞膜上或细胞内能识别生物活性分子( 药物、激素、神图1 神经内分泌免疫系统和代谢调节的运动疲劳网络( 冯炜权，1 9 9 3 )经递质、毒素、抗原和细胞粘附分子等)并与之相结合的生物大分子。他们能将生物活性分子产生的信息传递到效应器从而引起相应的生物效应。受体的功能是具有识别和结合的功能、信号传导功能、产生相应的生物学效应1 7 。大鼠在递增负荷训练过程中，肝细胞糖皮质激素受体( g r )逐渐下降，至疲劳状态时g r 降至最低，与对照组相比有显著性差异。这种受体水平的糖皮质激素( g c ) 功能不全对运动疲劳的发生有着不可低估的作用 2 3 1 。一次性力竭运动后即刻及恢复过程中，大鼠脑皮质运动区谷氨酸受体n r 2 a 蛋白含量变化表6问题的提出现为下降，上升，再下降，表明运动过程中n r 2 a 蛋白含量变化具有较敏感的可调控性，力竭运动后即刻矾匕a 蛋白含量的下降可能是导致中枢抑制的一个因素【2 4 】。1 2 4 运动性疲劳对肌红蛋白的影响肌红蛋i 刍( m y o g l g b i n ，m b ) 是肌细胞中贮存和运输氧气的蛋白质正常人血清中含量极少。当剧烈运动引起肌细胞损伤时，由于m b 的分子量较小，更容易迅速逸出细胞膜，故m b 峰值较早。研究表明阅，力竭性运动后血清c k ，c k - m b 活性和肌红蛋白水平显著升高。其机制可能与肌细胞膜通透性的改变和损伤有关 2 q 男柔道运动员大负荷运动后血清m b 水平的峰值出现在运动后即刻，且显著高于女运动员的水平m 0 5 ) 。而男女柔道运动员安静时的血清m b 水平没有明显差异。因此，血清m b对判断肌细胞早期损伤的敏感性较好。1 2 5 运动性疲劳对热休克蛋白的影响热休克蛋白( n e a ts h o c kp r o t e i n , h s i ) 是应激后细胞内优先合成的一组蛋白质，又称为应激蛋白( s t r e s sp r o t e i n , s p ) 或分子伴侣( c h a p e r o n e s ) 。热休克蛋白在细胞生长、发育、分化，基因转录调节，蛋白质合成、折叠、运输、分解以及细胞骨架的功能，膜功能等多方面发挥重要作用，主要在于稳定细胞的结构，使细胞维待正常的生理功能，一些应激蛋白的高水平表达有助于增强受到致命损伤的细胞保护作用。不同的运动形式与运动强度都可能影响h s p 的表达水平。1 9 9 0 年l o c k e 等 2 7 1首次报道，一次力竭性运动可诱导大鼠淋巴细胞、脾细胞和比目鱼肌细胞内h s p 7 2和h s p 9 0 的合成，同时也观察到有h s p 6 5 和h s p l 0 0 的诱导合成，且h s p 7 2 和h s p 6 5的合成随运动强度和时间的延长进行性增加，而h s p l 0 0 及小分子h s p 只是在力竭或接近力竭时才被诱导表达。有人认为，h s p 的表达与局部血供状况、局部承受负荷状况、局部损伤程度密切相关嘲。人类对蛋白质的研究己逾百年，按以往的视角只是针对生命活动中某一种或某几种蛋白质，这样难以形成一种整体观，难以系统透彻地阐释运动疲劳的基本机制。因此，从蛋白质研究的自身发展而言，大规模、全方位的蛋白质组研究势在必行。1 3 蛋白质组与运动性疲劳p r o t e o m e s ( 蛋白质组) 一词是由m a r cw f l k i n s t 2 9 】于1 9 9 4 年在意大利s i e n a 的一次电泳会议上首次提出的蛋白质组概念的出现使人们能够从蛋白质层次上全面认识生命活动的本质p 0 1 。7运动性疲劳对大鼠骨骼肌蛋白质组表达谱影响的研究蛋白质组：一个基因组、一种生物或一种细胞组织所表达的全套蛋白质。它随着组织、细胞及环境的不同而改变。蛋白质组学( p r o t e o m i e s ) 是指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学。蛋白质组学的研究主要由双向凝胶电泳( t w o - d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s ，2 - d e ) 技术、质谱鉴定技术( m a s s p e c t r o m e t r y ，m s ) 及生物信息学等三大类技术组成。双向凝胶电泳与质谱鉴定技术是构成蛋白质组研究的支