（农产品加工及贮藏工程专业论文）鸭胚蛋中激素检测方法的研究.pdf

中文摘要 近年来，保健食品特殊功能作用的开发以及保健食品原料外源性污染 对人体产生的不良影响，特别是以动物性原料生产的保健食品中含有天然 的内源性激素，引起人们的高度关注。食用动物养殖过程中滥用激素，以 及动物体自身含有的内源性激素，造成肉类制品非细菌性食物中毒及其他 健康影响，使消费者对此类食品产生一定的恐慌。因此，食品中激素的残 留污染问题得到各国政府和国际组织的广泛重视。 本文研究确立了樱桃谷s m 3 型鸭胚蛋中的内源性激素1 7 b 雌二醇、 丙酸睾酮的i - i p l c 测定方法。用甲醇提取鸭胚蛋匀浆液中的1 7 1 3 雌二醇、 丙酸睾酮，再经高效液相色谱仪( 如，l c ) 进行定性、定量分析。该方法 线性范围为0 0 5 3 5 0 g m l ，标准曲线线性关系良好，其回归方程和相关 系数分别为，1 7 1 3 雌二醇y = 2 2 7 8 8 x + 3 1 4 6 ，r 2 = 0 9 9 9 9 ，丙酸睾酮 y = 9 2 5 3 2 x - 1 4 8 1 2 ，r z = o 9 9 9 6 ；最低检测限为1 7b 一雌二醇2 7 n g g ，丙酸 睾酮3 4 n g g ；回收率在8 9 1 9 4 6 之间，相对标准偏差小于2 3 。该 方法操作简便快捷，有较好的回收率和准确度，适合检测大量胚胎类保健 食品中的内源性激素。 本研究还确立了测定樱桃谷s m 3 型肉鸭胚蛋中外源性激素己烯雌 酚、丙酸睾酮激素残留的h p l c 分析方法。样品经甲醇超声波提取、离心， 提取液浓缩后经0 4 5 t t m f h 滤膜过滤，进h p l c 分析。该方法线性范围为 o 0 2 5 3 o p g m l ，标准曲线线性关系良好，其回归方程和相关系数分别为 己烯雌酚y = 4 1 4 0 1 2 x + 5 7 2 8 5 ，r 2 = 0 9 9 9 6 ，丙酸睾酮y = 2 3 7 1 7 5 x + 9 2 3 5 1 ， r 2 = 0 9 9 9 6 ，最低检测限为己烯雌酚2 1 n g g ，丙酸睾酮3 2 n g g ，回收率在 8 9 ，7 9 2 8 之问，相对标准偏差小于1 9 * 6 。该方法操作简便快捷，有较 好的回收率和准确度，适合检测大量胚胎类保健食品中性激素的残留。 通过放射免疫法测出1 4 七4 日胚龄的鸭胚蛋血清中的1 0 种激素的含 量。 以上的研究结果，为了解以樱桃谷s m 3 型鸭胚蛋为原料的保健食品 中激素的功能和作用，以及探讨该保健食品中激素对人体健康的影响奠定 基础。 关键词：17b 一雌二醇；己烯雌酚：丙酸睾圉：高效液相色谱；放射免疫： 鸭胚蛋 a b s t r a c t r e c e n t l y ，p e o p l et o o kag r e a ta t t e n t i o nt ot h ee f f e c t so fh o r m o n e sw h i c h w a sl i e di nt h eh e a l t h yf o o d e s p e c i a l l y , t h em a t e r i a l so ft h eh e a l t h yf o o d w h i c hw e r ep o l l u t e db yt h em a n m a d e h o r m o n e sa f f e c t e dp e o p l e sh e a l t h y ma n i n l a l $ w e r ef e dw i t hm a n m a d e - h o r m o n e sb yt h ep e o p l e 5 0 m e h o r m o n e sc a m ef r o mt h ea n i n a l st h e m s e l v e s a l lt h ed i f f e r e n th o r m o n e sc o u l d m a k ef o o dp o i s o n i n ga n do t h e re f f e c t st ot h ep e o p l e ，i tm a k ee o n s l n l e rs c a r e s ot h e g o v e r n m e n t s o fd i f f e r e n tc o u n t r i e sa n dt h ei n t e r n a t i o n a l o r g a n i z a t i o n sa t t a c hi m p o r t a n t t 0t h ep o l l u t e dp r o b l e m sw h i c hw e r ec a u s e db y t h eh o r m o n e s a ne f f i c i e n tm e t h o df o ra n a l y z i n gt h es e x u a lh o r m o n e so f1 7 1 3 一e s t r a d i o l a n dt e s t o s t e r o n ep r o p d o n a t et h a tw e r ed i s s o c i a t e di nh e a l t h yf o o db a s e do n c h e r r yv a l ed u c ke m b r y ob yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yw a s d e v e l o p e d s e x u a lh o r m o n e s ( s u c ha s 1 7 1 3 一e s t r a d i o l a n dt e s t o s t e r o n e p r o p r i o n a t e ) w e r ee x w d g t e df r o mh o m o g e n i z e ds a m p l ew i t hm e t h a n o l ，a n d t h e na n a l y z e db yh p l c 1 1 1 el i n ea r r a n g eo ft h em e t h o dw a so 0 5 - 3 5 i _ t g m l , t h es t a n d a r dg u l v el i n e a r i t yr e l a t i o nw a sf m e 1 1 嵋l i n e a re q u a t i o no f 1 7 i - e s t r a d i o lw a sy = 2 2 7 9 8 x + 3 1 4 6 ，w i t hc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t0 9 9 9 9 n 圮 l i n e a re q u a t i o no ft e s t o s t e r o n e p r o p r i o u a t e w a sy = 9 2 5 3 2 x - 1 4 8 1 2 ，w i t h c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t0 9 9 9 6 1 1 坞l i m i t so fd e t e c t i o n , 1 7 1 3 e s t r a d i o lw a s 2 7 n g ga n dt e s t o s t e r o n ep r o p r i o n a t ew a s3 4 n g g 1 1 1 ea v e r a g er e c o v e r i e s r a n g e df r o m8 9 1 - , 9 4 6 t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a ss m a l l e rt h a n 2 3 a b o v ea 1 1 t h i sm e t h o dw a sc o n v e n i e n ta n dr a p i d 谢mt h ef a i r l yg o o d c o e f f i c i e n to fr e c o v e r ya n da c c u r a t ed e g r e e s o ，i tw a ss u i t a b l et oa n a l y z et h e s e x u a lh o r m o n e st h a tw e r ed i s s o c i a t e di nh e a l t h y 南o db a s e do ne m b r y o a ne f f i c i e n tm e t h o df o r a n a l y z i n g r e s i d u a ls e xh o r m o n e so f d i e t h y l s t i l b e s t r o la n dt e s t o s t e r o n ep r o p r i o n a t ei nc h e r r yv a l ed u c ke m b r y o ，b y r e s v e r s e d - p h a s eh i g hp e r f o m m c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yw a sd e v e l o p e d s e x u a lh o r m o n e sw e r ee x t r a c t e df r o mh o m o g e n i z e ds a m p l ew i t hm e t h a n o l ， a n dt h e n a n a l y z e db yh p l c 1 1 璩l i n ea r r a n g e o ft h em e t h o dw a s 0 0 5 - 3 5 p g m l 。t h e s t a n d a r dc u r v el i n e a r i t yr e l a t i o ni sf i n e t h er e t u r n e q u a t i o no fd i e t h y l s t i l b e s t r o l i s y - - 4 1 4 0 1 2 x + 5 7 2 8 ，5 ， w i t hc o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n ti s0 9 9 9 6 1 1 1 cl t u r ne q u a 矗o no ft e s t o s t e r o n ep r o p d o n a t ei s v = 2 3 7 1 7 5 x + 9 2 3 。5l ，w i t hc o r r e h t i o nc o e f f i c i e n ti s0 9 9 9 6 t h el i m i t so f d e t e c t i o n ，d i e t h y l s t i l b e s l r o lw a s2 1 n g ，t e s t o s t e r o n ep r o p r i o n a t ew a s3 2 n g n 嵋a v e r a g er e c o v e r i e sr a n g e df r o m8 9 7 9 2 8 ，n l cr e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o n sw a ss m a l l e rt h a n1 9 t h a tm e t l l o do p e r a t i o nw a ss i m p l ea n d c o n v e n i e n tr a p i d , 谢mt h ef a i r l yg o o dc o e f f i c i e n to fr e c o v e r ya n da c c u r a t e d e g r e e i tw a ss u i t a b l et o t h e l a r g ea m o u n to fc h e c k i n ge m b r y o k i n d h e a l t h - c a r ef o o ds e x u a lh o r m o n e s w eu s e dt h em e t h o do fr i at oa n a l y z et e nk i n d so fh o r m o n e sw h i c h w e r ei nt h eb l o o ds e r u m o f e m b r y o t i no r d e rt ou n d e r s t a n dt a k i n gt h ec h e r r yv a l l e ys m 3d u c ke m b r y oe g ga s i nt h er a wm a t e r i a lh e a l t hf o o d st h eh o r m o n ef u n c t i o n ，a sw e l la sd i s c u s s e di n t h i sh e a l t hf o o d st h eh o r m o n et o 埘t h ef o u n d a t i o nt ot h eh u m a nb o d yh e a l t h i n f l u e n c e k e y w o r d s ：1 7 p - e s t r a d i o l ；d i e t h y l s t i l b e s t r o l ；t e s t o s t e r o n ep r o p r i o n a t e ； h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ；r i a ；d u c ke m b r y o 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：盟 导师签名：獐极 日期：燮、7 0 山东农业大学硕士学位论文 1 前言 随着人们膳食结构的不断改善和对食品安全需求的不断增加，食品中 激素残留的问题越来越成为人们关注的焦点。在动物养殖过程中滥用激 素，及动物体自身含有的内源性激素，是造成肉类制品非细菌性食物中毒 及其他健康影响的重要原因，这也使消费者对此类食品产生一定的恐慌。 食品中激素的残留污染问题得到各国政府和国际组织的广泛关注。 1 1 食品中激素的概况 激素( h o r m o n e s ) - - 词在1 9 0 4 年首先由b a y l i s s w 及s t a r i i a g e 提出， 它是指生物体内特殊组织或腺体产生的，并直接分泌到体液中( 若是动物， 则指血液、淋巴液、脑脊液、肠液) ，通过体液运送到特定作用部位，从 而引起特殊激动效应( 调节控制各种物质代谢或生理功能) 的一群微量的 有机化合物。因此，也可以把这类化学物质看作是生物体内的“化学讯息” ( 程治平，1 9 8 4 ) 。 根据日常的饮食活动来看，摄食食品中的主要激素有脑下垂体激素、 甲状腺激素、甲状旁腺激素、肾上腺激素、肾脏激素以及性激素。很显然， 这些激素都是来自动物性食品中的特殊组织。其中甲状腺激素、甲状旁腺 激素和肾上腺激素大多为人们对食品原料的处理不当而出现在食品中，肾 脏激素和性激素则是人们有意识的主动采选的食品原料中所含有的目标 成分( 杨洁斌，1 9 9 9 ) 。 激素在食用动物不同的器官和组织中含量不同，并且使用了激素的乳 牛可将其代谢产物通过泌乳过程而排到牛奶中；一般说来，各种畜禽、鱼 类的肌肉、脂肪组织、肝、肾、奶、蛋、蜂蜜等都可成为激素的污染对象。 1 1 1 激素进入食品的途径 ( 1 ) 预防和治疗畜禽疾病用使用的激素类药物 以治疗、预防或诊断为目的，给食用动物( 包括产肉或产奶的动物、 家禽、鱼或蜜蜂等) 口服、注射某些激素类药物，这些激素类药物可能残 留于动物体内进而污染食品。 ( 2 ) 促进生长、泌乳、甚至肌肉脂肪分配而使用的激素类药物 以促迸畜禽的生长、提高产肉量、产奶量或者瘦肉率等为目的而使用 鸭胚蛋中激素检测方法的研究 的激素，如促生长激素、甲状腺素、性激素、孕激素、蛋白同化激素等。 这些药物通过口服、注射等方法残留于动物体内而污染食品。 ( 3 ) 其他途径进入食品中的激素样物质 为使蔬菜、水果更快成熟而使用的植物生长调节剂，环境中也广泛存 在的内分泌干扰物，如洗涤剂、塑料和包装材料中的塑料粘合剂以及环境 雌激素等( 李佳圆，2 0 0 1 ) 。 1 1 2 激素污染的主要原因 ( 1 ) 不遵守休药期规定 休药期是指畜禽停止给药到其产品允许上市或制成为食品的间隔时 间。一些农户受经济利益驱使，将不到休药期的动物或动物产品送到市场， 从而使其激素类药物的残留量超过标准规定( 杨洁斌，1 9 9 9 ) 。 ( 2 ) 未正确使用激素类药物 使用激素类药物时，在用药剂量、给药途径、用药部位和用药动物的 种类等方面不符合用药规定，造成激素残留在体内，并使存留时间延长。 一些亚治疗水平的激素类药物被用来作为生长促进剂，使用量提高，从而 造成高水平的残留。 ( 3 ) 使用未经批准的激素类药物 农户为促进畜禽生长，提高产( 瘦) 肉率或产奶率，往往使用未经批 准或己禁止使用的激素类药物( 如己烯雌酚) ，造成食用动物的激素残留， 如为了使甲鱼和鳗鱼长得肥壮而使用己烯雌酚等。 1 1 3 食品中激素成分的作用 正常情况下，机体内的激素分泌和存在往往处于一种高度的平衡状 态。但是，当某些因素导致这种激素平衡失调时，就会产生相应的机体病 态。经常摄食含激素成分高的食品，或使用激素制品，就可能出现这种后 果。因为某些激素的生理效应，种属性不强，对于动物和人体都可以产生 相应的调节控制。所以，当人们食用含有内分泌腺体或未经过特殊处理的 动物性食品时，就会出现机体内某些有类似生理效应的激素含量增大的结 果( 程治平，1 9 8 4 ) 。 l 1 4 有激素残留的食品的健康危害 ( 1 ) 导致自身激素分泌失调 2 山东农业大学硕士学位论文 人长期摄入含激素残留的动物性食品，当浓度达到一定量后，就会对 人体产生负反馈作用，严重时还导致心力衰竭。当残留在食物中的性激素 进入人体后，使体内的含量迅速增加，超过人体正常水平时，通过负反馈 使下丘脑产生的促性腺释放激素、垂体前叶产生的卵泡刺激素和黄体生成 素减少，从而破坏机体的正常生理平衡而呈现不良后果( b r e n n e rd e 等， 1 9 9 4 ) 。 ( 2 ) 变态反应 经常食用一些含激素残留的食品能使易感的人群出现变态反应，这些 激素包括雌激素及雌激素类药物等。它们可以导致儿童性早熟、男性女性 化等严重症状( y a 腩k 等，1 9 9 8 ) 。 ( 3 ) 内分泌及其它影响 一些属于类甲状腺素药物的1 3 一受体激动素，如盐酸克伦特罗，可导 致嗜睡，心跳过速甚至强直性惊厥等不良反应。2 0 世纪后期，发现环境 中存在一些影响动物内分泌、免疫和神经系统功能的干扰物质，称为“环 境激素样物质( 或环境内分泌干扰物质) ”，这些物质通过食物链进入人体， 会产生一系列影响健康的效应，如导致内分泌相关肿瘤、生长发育障碍、 出生缺陷和生育缺陷等，给人体健康带来不良影响( 李佳圆，2 0 0 1 ) 。 1 1 5 国内外激素的使用管理 ( 1 ) 中国的管理现状 国务院颁布的兽药管理条例明确规定：凡用于防治动物疫病，促 进动物生长的激素类药物，必须经农业部批准，未经批准，不得生产和使 用。为加强激素使用的管理，农业部还于1 9 9 7 年和1 9 9 9 年先后下发了关 于严禁非法使用兽药的通知( 农牧发，1 9 9 7 ) 以及关于查处生产、使 用违禁药物的紧急通知( 农牧发，1 9 9 9 ) ，特别重申：禁止所有激素类及 有激素样作用的物质作为动物促生长剂使用( 农牧发，1 9 9 7 ) 。 目前，农业部严禁使用的促生长作用的激素包括：性激素，如己烯雌 酚；促性腺激素；同化激素；具有雌激素样作用的物质( 如玉米赤霉醇等) ( 农牧发，1 9 9 9 ) 。 另外，农业部有关兽药管理文件中明确规定禁止所有激素类及有激素 样作用的物质作为动物促生长剂使用，而兽残标准中却规定了孕酮、 鸭胚蛋中激素检测方法的研究 丙酸睾酮以及雌二醇的残留限量值，并未说明该限量值是动物组织本底含 量还是外源性的，而c a c 和j e c f a 均不规定上述激素类物质的限量( 我 国的指标是等同采用美国标准) ( c x a f ，0 1 4 ，2 0 0 0 ) 。对于盐酸克伦特 罗，农业部在有关文件中也多次提出它是违禁药物，其生产与使用均属非 法行为。但兽残标准中却规定其在牛、马组织的残留限量，而且显然 不是最低检出限，这似乎与其管理文件有矛盾。 随着国家关于饲料和食品安全管理工作的加强，我国动物食品的安全 质量正在得到有效保障，但是目前工作仍然存在一些隐患，尚无统一的违 禁药品检测方法标准。目前违禁药品检测均使用国外和国际标准，由于方 法不一致、对比性差，所以亟需制定国家和行业标准。 ( 2 ) 美国的管理现状 美国食品药品管理局( f d a ) 中的兽医中心( c v m ) 负责食品中激 素的管理工作，每一种激素在使用前，均需经f d a 批准。联邦法规( c f r ) 第2 1 卷5 5 8 款中另列出了新批准的品种，特别应指出美国允许使用的品 种包含了我国和欧盟禁止使用的一些激素品种，如盐酸克伦特罗、重组牛 生长激素( r b s t ) 、r a c t o p a m i n e ( 1 3 一受体激动剂) 等；对于促生长激素， 美国目前允许在正确掌握使用方法的前提下使用规定的品种( c x ，a f ， o l 4 ，2 0 0 0 ) 。 ( 3 ) 欧盟的管理现状 欧洲委员会( e c ) 在修订2 0 0 0 年兽药法时，提出了兽药的分类表， 其中a 类为禁止使用的药物，包括；二苯乙烯类( 己烯雌酚) 、类固醇类 ( 去甲睾酮、强地松龙) 、二羟基苯甲酸内酯( 玉米赤霉醇) 、b 一受体激 动剂( 克伦特罗、沙丁胺醇) ，欧洲国家严格禁用促生长激素。欧盟的这 份分类表成为我国出入境检验检疫部门日常主要监控项目( c ) 劬蟠，0 1 4 ， 2 0 0 0 ) 。 ( 4 ) 食品法典委员会的规定 国际食品法典委员会对食用动物使用激素的管理规定是以标准的形 式公布的。目前c a c 制定的兽药残留限量标准有3 1 种，收编在食品法 典第3 卷中。对一些促生长激素的使用，国际上尚未达成统一意见，其 中某些物质的安全性评价及限量标准成为食品法典会议的争论焦点 4 山东农业大学硕士学位论文 ( c x 佾母，0 1 4 ，2 0 0 0 ) 。 i i 6 食品中激素的安全性评价 按照惯例，食品中激素的安全性评价主要从以下6 方面着手： i 人的可能摄入量 除一般人群的摄入量外，还应考虑特殊和敏感人群( 如儿童、孕妇及 高摄入量人群) 。 n 人体资料 由于存在着动物与人之间的种族差异，在将动物试验结果推论到人 时，应尽可能收集人群接触受试物后反应的资料，如职业性接触和意外事 故接触等。志愿受试者体内的代谢资料对于将动物试验结果推论到人具有 重要意义。在确保安全的条件下，可以考虑按照有关规定进行必要的人体 试食试验。 动物毒性试验和体外试验资料 各项动物毒性试验和体外试验系统虽然仍有待完善，却是目前水平下 所得到的最重要的资料，也是进行评价的主要依据。在试验得到阳性结果， 而且结果的判定涉及到受试物能否应用于食品时，需要考虑结果的重要性 和剂量反应关系。 安全系数 由动物毒性试验结果推论到人时，鉴于动物、人的种属和个体之间的 生物特性差异，一般采用安全系数的方法，以确保对人的安全性。安全系 数通常为1 0 0 倍，但可根据受试物的理化性质、毒性大小、代谢特点、接 触的人群范围、食品中的使用量及使用范围等因素，综合考虑增大或减小 安全系数。 v 代谢试验的资料 代谢研究是对化学物质进行毒理学评价的一个重要方面，因为不同化 学物质、剂量大小，在代谢方面的差别往往对毒性作用影响很大。在毒性 试验中，原则上应尽量使用与人具有相同代谢途径和模式的动物种系来进 行试验。研究受试物在实验动物和人体内吸收、分布、排泄和生物转化方 面的差别，对于将动物试验结果比较正确地推论到人具有重要意义。 ，综合评价 鸭胚蛋中激素检铡方法的研究 在进行最后评价时，必须在受试物可能对人体健康造成的危害以及其 可能的有益作用之间进行权衡。 评价的依据不仅是科学试验资料，而且与当时的科学水平、技术条件， 以及社会因素有关。因此，随着时间的推移，很可能结论也不同。随着情 况的不断改变，科学技术的进步和研究工作的不断进展，对已通过评价的 化学物质需迸行重新评价，作出新的结论( 郑建仙等，1 9 9 9 ) 。 1 2 鸭胚蛋中的激素 中华民族素来提倡养生之道，随着国民经济的发展和人们生活水平的 提高，人们的饮食不仅仅是为了饱腹，维持生存，还要求它有调节人体生 理活动的功能。保健食品的出现，是在解决了温饱问题后，对食品功能提 出的新的要求，也是人们对提高生命质量的追求。 保健食品非一般意义上的食品，不仅是以提供营养为目的，更重要的 是以调节生理功能为主，另一方面，保健食品功效成分一般都是具有一定 的量才能起到保健功能。功效成分是保健食品起保健作用的所在，也是产 品质量的主要指标，国内外对保健食品的开发都十分重视功效成分的研 究。 鸭胚蛋营养丰富，味道鲜美，功效神奇，民间早有食用的习惯，并作 为营养进补和食疗的佳品，广为流传，由于鸭胚蛋在生长发育过程中吸收 私利用鸭蛋中酌营养物质进行一系歹1 j 的生物代谢和转化，使得其中各稗营 养成分发生较大的变化，营养成分不但没有受到破坏反而有所增强，另外 它含有类似于“人体胎盘”的某些成分，有改善胃肠的功能，增进食欲和 抗衰老的作用( 施强，1 9 9 3 ) 。 鸭胚蛋中含有多种激素且含量较高，激素在鸭胚蛋发育过程中起着极 其重要的作用，食用含有鸭胚蛋的食品可以弥补人体激素分泌的不足。激 素对人体的健康至关重要。它可以协同神经系统共同调节机体代谢和各种 功能活动。入体的激素如果分泌不足，会导致发育迟缓，身材矮小，严重 的会导致脏器发育不良或萎缩：但是如果激素分泌或摄入量过多就会导致 机体内分泌紊乱，代谢失调，严重的会导致机体病变，甚至会致癌、死亡， 所以激素是把双刃剑。因此对鸭胚蛋中的激素进行量效分析及安全性评价 6 山东农业大学硕士学位论文 十分必要，进而为以鸭胚蛋为原料的功能性食品的健康食用、工业化生产、 规模化经营及普及化消费提供可靠的科学依据。 1 2 1 与鸭胚蛋发育相关的激素 鸭胚蛋发育过程中起主要作用的激素有四种：生长激素、甲状腺激 素、胰岛素样生长因子和雌激素( 辛朝安等，2 0 0 0 ) 。 1 2 1 1 生长激素 生长激素( g r o w t hh o r m o n e ，g h ) 是垂体前叶分泌的一种肽类激素， 有种属特异性，它由1 9 0 个左右的氨基酸组成分子量为2 20 0 0 ，g h 呈脉 冲式分泌，每隔l 4 h 出现一次脉冲峰，夜晚达到最高分泌量。血中的生长 激素以游离型及结合型两种形式存在( b a u d e t , m l 等，2 0 0 4 ) 。 生长激素在鸭胚蛋发育过程中起着重要的作用，具有促进个体发育、 调节体内物质代谢等功能，其生物学效应为增加葡萄糖进入细胞的通透性 和氧化作用；对糖代谢有抗胰岛素的作用，促进糖原异生，使血糖升高； 促进脂解作用，使血浆游离脂肪升高；促进脱氧核糖核酸、核糖核酸及蛋 白质的合成；刺激软骨、骨骼、肌肉和淋巴细胞的增生，并加强垂体其他 激素的影响。随着胚龄的增加，生长激素细胞占垂体细胞总数的比率不断 增加，并持续到出壳前，在鸭胚蛋发育的后期，血浆中的生长激素的含量 也显著提高( b a u d e t m l 等，2 0 0 4 ) 。 1 2 1 2 甲状腺激素 甲状腺( t h y r o x i n e ，t ) 的作用是多样性的，可分为两大类：代谢作 用：促进生长和发育( 程治平，1 9 8 4 ) 。代谢作用包括热的生成，水和离 子转运的调控和对中间代谢的调节。对生长发育的作用是通过调节r n a 的基因控制和蛋白质的生物合成而实现的。甲状腺分泌的激素有两种：3 ， 5 ，3 ，5 一四碘甲腺原氨酸( 简称t 4 ) 和3 ，5 ，3 一三碘甲腺原氨酸( 简 称1 3 ) 。甲状腺激素区别于其他的激素的显著特点就是结构中有碘，甲状 腺素可以逆浓度差把碘离子从细胞外液捕入到腺体内，当甲状腺把碘离子 捕入到胶质后，可能在过氧化酶参与的反应中把碘离子氧化成碘原子，碘 原子经活化在碘化酶的作用下，酪氨酸碘化，生成一碘酪氨酸和二碘酪氨 酸，两个二碘酪氨酸分子结合生成甲状腺激素t 4 ，一个一碘酪氨酸分子 和一个二碘酪氨酸分子结合生成t 3 。在合成的甲状腺激素中，t 4 占主要 鸭胚蛋中激素检测方法的研究 部分( 程治平，1 9 8 4 ) 。 甲状腺激素可以调节细胞的通透性，使线粒体膜的通透性增加，以促 进氨基酸及葡萄糖向细胞内转运，使细胞膜上c a 2 + 外流加速，增加线粒 体氧化磷酸化，a t p 产生增加。还可以刺激细胞的分化，影响细胞的降解 率和肌肉细胞的死亡。神经系统尤其是大脑的发育是一个复杂的过程，甲 状腺激素在脑发育中起着关键的作用。甲状腺激素缺乏可造成所有器官的 发育异常，对于大脑的影响尤为严重，甲状腺激素调控的基因表达非常重 要( 何玉琴等，2 0 0 4 ) 。 甲状腺激素在代谢调节中起着重要的作用，对细胞、组织、能量、脂 肪、蛋白质都有代谢影响，所以甲状腺激素对动物体生长发育来说是必不 可少的。甲状腺激素的分泌受很多因素的影响，如品种、年龄、性别、季 节、光照、温度等( 何玉琴等，2 0 0 4 ) 。 1 2 1 3 雌激素 在禽类动物中，芳香化酶是雌激素( e s 仃a d i o l ，e 2 ) 合成中的一个关 键酶。雌激素是由芳香化酶催化雄激素转化而来。芳香化酶基因在性腺性 别分化期间只在雌性鸭胚蛋中表达，而在雄性鸭胚蛋中的表达量极低。雌 激素是由卵巢的卵泡和黄体分泌的，主要是雌二醇、雌酮和雌三醇，后两 者是前者的代谢产物，胎盘也分泌雌激素，以雌三醇为主。除卵巢外，肾 上腺皮质也分泌雌激素。雌激素在生殖细胞分化和发育中起着关键性的作 用，对中枢神经系统的发育也有重要的意义( 程治平，1 9 8 4 ：a n d r e a b 等， 1 9 9 8 ) 。 雌激素在中枢神经系统发育过程中，脑局部形成的雌激素影响着神经 结构的性别差异、调节神经内分泌功能与性行为，还进一步影响记忆与认 知功能 雌激素对胆碱能神经元有影响，同时对神经递质、递质受体进行水平 调节，此外雌激素对神经具有保护作用，还促进神经突触生长和重塑，有 抗氧化和抗自由基作用，还能维持胞内钙的平衡( d o d e lr c 等，1 9 9 9 ) 。 l 2 14 胰岛素样生长因子 胰岛素样生长因子( i n s u ll i k eg r o w t hf a t t e r ，i g f - 1 ) ，i g f 一1 由7 0 个氨基酸组成，分子量7 6 4 6 。恒温动物体内几乎所有的组织都有合成和 8 山东农业大学硕士学位论文 分泌的能力，但是分泌量甚微。i g f - 1 ，9 0 的来自动物肝脏主要以结 合蛋白的形式存在。i g f - 1 参与动物的胚胎发育，能促进创伤愈合，可以 和其它生长因子协同促进多种组织细胞的分化和成熟。 1 3 激素的分泌 激素是由内分泌腺分泌的，内分泌的发育直接影响着激素的分泌量， 因此，也决定了鸭胚蛋的发育情况。 鸭胚蛋中内分泌腺的发育及激素的分泌情况( 王民桢等，2 0 0 0 ) 。 1 3 1 胰腺 鸭胚蛋孵化第1 8 天开始出现胰岛素的分泌，第2 2 天达到高峰，在出 壳前下降。胰腺还能分泌高血糖素，通过肝脏中磷酸化酶的活动是糖原的 分解加强。 1 3 2 肾上腺 肾上腺包括两种来源不同的腺体细胞。皮质条细胞来自中层的胚胎腹 膜上皮；髓质条来自外胚层的交感神经干细胞。禽类肾上腺的皮质和髓质 的分界不如哺乳动物那样严格，但仍各自分泌不同激素，肾上腺皮质分泌 盐皮质类固醇和糖皮质类固醇，肾上腺髓质分泌肾上腺素和去甲肾上腺 素。鸭胚蛋孵化的第1 8 天到孵化末期，肾上腺的重量增加5 6 倍；孵化 第l o 天即可检出肾上腺素；1 6 1 8 天检出去甲肾上腺素，其后各种激素 的分泌量不断增加，期间亦有可能有少许波动。 1 3 3 甲状腺 鸭孵化约1 2 h ，在咽底部第一和第二咽囊之间出现甲状腺原基，随后 继续生长；到第1 2 天已成为明显甲状腺体，血管和结缔组织相继长入其 中；第1 4 天时，腺体分为数个由两层上皮细胞组成的细胞索，滤泡也在 此时出现；至孵化第2 0 天时，滤泡完全形成，腺体与成禽相似。 母体的甲状腺激素可以进入蛋内，满足胚胎本身产生此激素前的早期 发育之需。鸭胚蛋孵化第1 4 天，已能分泌甲状腺激素，促进胚胎的生长 发育。激素的分泌随着胚胎发育某阶段的特殊需要而增加。例如在孵化的 1 6 一1 9 天时配合软骨膜的加速骨化而分泌增加，直到出孵前夕才显著减 少分泌。 1 3 4 甲状旁腺 9 鸭胚蛋中激素检测方法的研究 甲状旁腺原基与甲状腺原基同时发生，生长到孵化第1 3 天时两者分 开，第1 4 天末甲状旁腺的的形态学分化已经很明显，并开始发挥其代谢 功能，胚胎期甲状旁腺的活动已与成禽相似，主要在于维持血液和淋巴中 钙的水平，调节机体的钙、磷代谢。 1 3 5 胸腺 胸腺原基于鸭胚蛋孵化第1 1 天由咽囊的上皮衍生而成，胸腺上皮向 颈部延伸；孵化第1 5 1 6 天形成胸腺小叶，第1 9 天开始分化为髓质和皮 质，胸腺的重量逐渐增加，在孵化的第1 4 天，造血干细胞进入胸腺，在 小叶的囊下增殖，形成胸腺的淋巴样结构，内含成淋巴细胞，孵化1 5 1 8 天衍化为淋巴细胞，具有一定的免疫能力，出壳时有较大的胸腺的雏 鸭对外界的环境巨变已有较大的承受力。 1 3 6 松果体 鸭胚蛋松果体原基在孵化4 8 小时出现，1 1 一1 8 天时生长最为迅速， 其相对体积增加近4 0 倍。 1 3 7 垂体 禽垂体分为前叶和后叶。前叶由腺细胞组成，称为腺垂体，后叶属 神经组织称为神经垂体：鸭胚蛋于孵化4 8 小时分别由位于间脑的两个原 基衍化而成，两种垂体各分泌多种激素，对禽的各种生理活动起着十分重 要的调节作用。鸭胚蛋的腺垂体于孵化第1 7 天时已有促甲状腺素，孵化 2 2 天开始分泌促肾上腺皮质激素。 1 4 激素提取的经典方法 激素的提取是个复杂过程，而且在分析过程中占有重要的地位，迄今 为止各种经典的提取方法多达几十种，用的较多的也有十几种。常用的有 液液萃取( l l e ) 、固相萃取( s p e ) 、固相微萃取( s p m e ) 、液膜萃取( l m 巳) 、 液相微萃取( l p m 匣) 、微波辅助提取( m a e ) 、加速溶剂提取( a s e ) 、 超临界流体萃取( s f e ) 和超声波提取等( u e ) 。 由于动物体内的激素大部分是脂溶性的，在有机溶剂中的溶解性好， 溶解度大，因此游离或残留在动物组织和血液中的激素一般采用有机溶剂 萃取法进行提取。 超声波提取的优点： i o 山东农业大学硕士学位论文 1 ) 独特的机械振动作用一媒质结构发生变化，促使有效成分进入溶剂 中。 2 ) 空化作用一液体内形成空化泡，破裂，能量释放，破坏细胞壁结 构，提高提出率。 3 ) 次级效应一热效应、乳化、扩散、击碎、化学效应、生物效应、 凝聚效应等。 利用超声波提取的优点，采用振荡加超声的提取方法可以使激素的提 取效率更高。 1 。5 食品中激素的检测方法 由于动物性食品中激素残留的量较小。一般的测定方法受到限制，较 常用的方法有：高效液相色谱法、放射免疫检测法、气相色谱法、薄层色 谱法、光谱法和波谱法、毛细管电泳法、超临界流体色谱法、g c m s 、 l c m s 等方法。最常用的为高效液相色谱法和放射免疫检测法。 1 5 1 高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法是现代高压技术与传统的液相色谱方法相结合，加上 高效柱填充物和高灵敏检测器所发展起来的新型分离分析技术，分离机制 是靠被分离组分的分子与流动相分子争夺吸附表面活性中心的吸附能力 差别而分离，是现代分离分析的重要手段( 邢亚东等，2 0 0 5 ) 。 ( 1 ) 分离效能高 由于新型高效微粒固定相填料的使用，液相色谱填充柱的柱效率可达 到2x1 0 3 5 1 0 4 块米理论塔板数，远远高于气相色谱填充柱1 0 3 块米 理论塔板数的柱效。 ( 2 ) 选择性高 由于液相色谱柱具有高效，并且流动相可以控制和改善分离过程的选 择性。因此，高效液相色谱法不仅可以分析不同类型的有机物及其同分异 构体，还可分析在性质上极为相似的旋光异构体。 ( 3 ) 检测灵敏度 在高效液相色谱法中使用的检测器大多数都具有较高的灵敏度。如广 泛使用的紫外吸收检测器，最小检出量可达1 0 9g ，用于痕量分析的荧光 检测器，最小检出量可达1 0 1 2 9 。 鸭胚蛋中激素检测方法的研究 ( 4 ) 分析速度快 由于高压输液泵的使用，相对于经典液相色谱，其分析时间大大缩短。 当输液压力增加时，流动相流速会加快，完成一个样品的分析时间仅需几 分钟到几十分钟。 高效液相色谱适于分析高沸点、不易挥发、受热不稳定、分子量大和 不同极性的有机物，尤其是生物活性物质的天然产物和高分子化合物等。 1 5 2 放射免疫法 采用放射免疫法测定激素的基本原理：先用放射性同位素如1 2 5 i 等标 记激素，然后将一定量的标记激素和未标记的激素以及一定的抗体放入同 一试管中，进行培养。此时，未标记的激素便与标记的激素竞争抗体。经 过一段时间的培养后，用电泳、色层分析等方法将已经与抗体结合的标记 激素与仍然游离的激素标记激素区分开。如果试管中待测的未标记的激素 越多，与标记激素竞争抗体的作用也越大，因而标记激素与抗体结合的量 越少，这样，结合的标记激素( b ) 与未结合的标记激素( f ) 的比值( b f ) 与待测的未标记激素的含量里反比关系，即未结合的标记激素越多，b f 比值数越小。根据这种关系，可以用一系列的已知浓度的激素作出标准曲 线。利用这条标准曲线，只要测得待测标本的b f 值，便能查出该激素在 血清中的浓度( 刘锐克等，1 9 9 4 ) 。 1 6 本课题研究韵目的、意义与内容 1 6 1 研究的目的 樱桃谷鸭是英国林肯郡樱桃谷公司( 樱桃谷农场) 经多年杂交培育成 的配套系优良种鸭，又名“快大鸭”、“超级鸭”，该品种生长速度快。瘦 肉多，肉质好，耗料少，适应性强，抗病性强，是国际国内市场上最受欢 迎的优质良种肉鸭。鸭的胚胎期是鸭生长的第一个关键时期，是新生命的 开始。胚胎的生长发育过程极为复杂，在这个过程中可能产生大量的新营 养物质移j 如多肽等，由于小分子量的多肽与大分子量的蛋白质相比可以更 好、更快的被人体吸收，因此可以利用鸭胚蛋来开发保健食品，增强人体 免疫力，延年益寿。 本实验最终目的是与企业合作开发鸭胚蛋保健食品，所研究的鸭胚蛋 山东农业大学硕士学位论文 品种是山东肥城永大食品有限公司引进并孵育的樱桃谷s m 3 型肉鸭。 本实验可以为了解以樱桃谷s m 3 型鸭胚蛋为原料的保健食品中激素 的功能和作用以及探讨该保健食品中激素对人体健康的影响奠定理论基 础。 1 6 2 研究的意义 动物性食品安全，是指动物性食品中不应含有可能损害和威胁人体健 康的因素，不应导致消费者急性或慢性毒害和感染疾病，或产生危及消费 者后代健康的隐患( 郑建仙等，1 9 9 9 ) 。 近年来，保健食品特殊功能作用的开发以及保健食品原料外源性污染 对人体产生的不良影响，特别是以动物性原料生产的保健食品中含有天然 的内源性激素，引起人们的高度关注。国内外学者和食品卫生组织对保健 食品中激素的检测研究较多，检测手段也丰富多样，但从保健食品源头即 原材料安全性方面着手的检测研究尚未见报道。本文采用高效液相色谱法 ( t - i p l c ) 对樱桃谷s m 3 型鸭胚蛋样品中的1 7 1 3 雌二醇和丙酸睾酮进行定 性、定量检测，为了解以樱桃谷s m 3 型鸭胚蛋为原料的保健食品中性激 素的功能和作用，以及探讨该保健食品中游离性激素对人体健康的影响奠 定了基础。 己烯雌酚是一种人工合成的雌性激素，医学上用来预防流产等，因其 具有促进蛋白质同化，加快增重和骨骼钙化的作用，不法养殖户常用其作 增长剂，以节省饲料的开支，牟取暴利，我国在1 9 7 9 年就开始控制养殖 业使用己烯雌酚，到1 9 9 9 年停止使用，其潜在的危害是给人类带来不良 的生理影响，例如：儿童性早熟，男性女性化，诱发女性卵巢癌、乳腺癌 等疾病。丙酸睾酮则是一种人工合成的雄性激素，促兴奋，也有沉积蛋白， 促进生长的作用，但是摄入过量会损