流式细胞仪原理及应用.ppt.ppt

流式细胞仪flowcytometer,原理及应用,基本原理,光源488nm兰绿色，15mw空冷，氩离子激光流路流动室(flowcell)鞘液sheath：(isotonii,iii)pbs无颗粒，无荧光本底无菌，稳定的ph样本流sample单细胞悬液5*1051*106个/ml放大部分光电倍增管pmthv放大电路gain增益线性：lin对数：log统计：计算机,flowcell,flowcytometry(fcm),滤片,带通滤片bandpass(bp)只允许某些波长的光通过二向色性滤片dichroicfilter一定波长以上通过，该波长以下折射,630nmbandpassfilter,transmittedlight,whitelightsource,620-640nmlight,dichroicfilter/mirrorat45deg,pmt,pmt,pmt,pmt4,dichroic,filters,bandpass,filters,flowcytometryprinciple,laser,1,2,3,4,flowcell,optics,信号,荧光信号fl1，fl2，fl3，fl4线性，对数散射光信号前向散射光(fs)：细胞大小侧向散射光(ss)：结构复杂程度,荧光染料的特性,激发波长(exciting)发射波长(emission),常用荧光染料的特性,荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途颜色fitc488525免疫荧光绿色pe(rd1)488575免疫荧光橙色ecd488620免疫荧光橙红pecy5488675免疫荧光深红pi488620dna染色橙红,epicsxl流式细胞分析仪,beckmancoulterflowcytometer-细胞分析领域中的ct实现快速、高灵敏度、多参数的细胞功能分析,细胞的特征与细胞功能,不同细胞的形态学特征不同细胞的蛋白表达其它细胞功能特征,immunophenotyping,cd2,cd4,90degreescatter,0,200,400,600,800,1000,8,15,20,30,40,50,100,200,1000,lymphocytes,monocytes,neutrophils,sidescatterprojection,lightscattergating,scale,logfitc,1000,100,10,1,.1,immunophenotypinghistogram单参数直方图,logfitcfluorescence(cd8),.1,1,10,100,1000,1,2,3,4,45%,2%,26%,双参数直方图dotplot,27%,cd分子(clusterofdifferentiation)-人类白细胞分化抗原1982年巴黎首届国际学术会议确定cd命名法已有200多个分化抗原群被鉴定和命名已得到who有关管理机关批准,cd抗原及其相关细胞群,细胞群cd抗原t细胞cd2cd3cd4cd5cd7cd8cd28cd38b细胞cd10cd19cd20-cd24cd37cd72-cd75髓系细胞cd13cd14cd15-cd17cd33cd34cd35nk细胞cd16cd56cd57cd94血小板cd31cd41cd42acd42bcd61cd62pcd63激活抗原cd26cd30cd69cd95-cd97粘附分子cd11a-ccd18cd29cd44cd49a-f内皮细胞cd105cd106cd109细胞因子受体cd25cd115cd117cd122cd126,流式细胞术的临床应用,临床免疫学临床血液学临床肿瘤学血栓与止血骨髓和器官移植基础医学研究,(一)fcm在临床免疫学中的应用1.评价机体的免疫功能(1)淋巴细胞亚群t细胞：cd3+cd4+(th/ti)cd8+(ts/tc)b细胞：cd19+nk细胞：cd3-cd16+cd56+,(2)淋巴细胞亚群细分t细胞：ts：cd8+cd28-tc：cd8+cd28+th：cd4+cd29+ti：cd4+cd45ra+b细胞：b1：cd5+cd19-b2：cd5+cd19+,(3)活化淋巴细胞亚群活化总t细胞：cd3+/hladr+静止总t细胞：cd3+/hladr-活化cd4+细胞：cd4+/hladr+活化cd8+细胞：cd8+/hladr+活化诱导分子：cd69白细胞介素2低亲和力受体：cd25cd25+/cd3+：活化t细胞cd25-/cd3+：静止t细胞,(4)型变态反应介导分子cd23：ige低亲和力受体膜结合：ige(5)hla类抗原hla-b7/b-27hla-drhla-dphla-dqhla-abc,(6)细胞因子受体il-2receptor(cd25)il-12receptoregf-receptortnf-receptortgf-receptorinsulin-receptor(7)t细胞受体库tgr/tgr/tcr变异体,(8)机体免疫功能监测的应用自身免疫性疾病hla-b27:强直性脊柱炎相关标志变态反应性疾病cd23:与变态反应严重程度呈正相关免疫缺陷性疾病感染性疾病(病毒、细菌、寄生虫感染)免疫治疗监测肿瘤免疫监测移植免疫监测,5例正常人cd4,cd8计数,编wbcly/wbclycd4/lycd4cd8/lycd8cd4/cd8号*109/l*100%*109/l*100%*109/l*100%*109/l18.133.1268138.3102725.46801.5126.735.0234543.2101426.06091.6638.036.5292038.0111027.07881.4145.436.0194443.584622.04281.9855.434.1184146.585625.54691.82,8例hiv/aids患者cd4,cd8计数,编wbcly/wbclycd4/lycd4cd8/lycd8cd4/cd8号*109/l*100%*109/l*100%*109/l*100%*109/l13.944.5173634.960648.08330.7321.832.05764.32561.83560.0733.648.3173916.428558.610190.2843.136.2112217.419559.26440.2955.139.920352.96074.715200.1164.735.8168323.840135.65990.6774.018.072010.37443.33120.2484.660.1276519.353458.616200.23,8例hiv/aids患者临床情况,编性测出抗hiv目前的诊断临床情况号别阳性的年龄年龄1女3030hiv感染无临床症状2男3435aidstb,pcp,面神经麻痹,hzv,隐球菌脑膜炎3女3034hiv感染无临床症状4女2326hiv感染乏力,体力差5男3233aidstb,pcp6女6263hiv感染无临床症状7男2930aidspcp8男3135hiv感染无临床症状,(二)fcm在临床血液学中的应用1.白血病的mic分型morphologyimmunologycytogenetics白血病分型是选择化疗方案和判断预后的重要依据。白血病免疫分型是mic分型的重要组成部分，也是对fab分型的补充，对白血病的诊断、治疗策略制定、预后判断及对白血病发病机制的研究都具有重要作用。,白血病免疫分型诊断标准(egil)标准,b淋巴系白血病pro-b-all(b型)：cd19+，或/和cd22+，或/和cd79a+commonall(b型)：cd19+，或/和cd22+，或/和cd79a+，cd10+pre-b-all(b型)：cd19+，或/和cd22+，或/和cd79a+，cyigm+成熟-b-all(b型)：cd19+，或/和cd22+，或/和cd79a+，kappa/lambda+,急性髓性白血病(aml),aml中，m0m6m7可以通过免疫分型确诊,aml与all免疫表型,cd19cd7cd33cd13hla-drtdtb-all+-+/-t-all-+-/+aml-/+/-,t-all表型特征,cd7cd5cd2cd3cd4cd8cd1ai+90%75%-ii+25%90%90%+iii+/-+/-,非t-all亚型,hla-drcd19cd10cd20cyusmigig重排i+-ii+-+iii+-+iv+-+v+-+vi+-+-+,aml免疫表型,m1m2m3m4m5m6m7hla-dr+-+/-+/-cd34+/-+/-+/-+/-cd33+/-+/-cd13+/-+/-cd11b-+/-+-/cd15-+/-+/-/cd14-+/-+-gpa-+-gp-+,能正确区别aml和all，并能进一步区别all中的t系和b系及亚型。能正确鉴别aml中的m0、m6、m7诊断双系或双表型白血病发现仅表达个别次要非本系列相关抗原的白血病诊断少见疑难白血病(如毛细胞性白血病),免疫分型的价值,2.白血病的耐药基因(mdr)检测mdr表达产物p糖蛋白(p-gp)p-gp的作用机理p-gp在白血病检测中的临床意义,成人急性白血病p-gp表达的临床意义p-gp+p-gp-缓解率（cr）20.5%78.5%aml6个月复发率66.7%8.7%151平均无病生存期5m13m缓解率（cr）66.7%80.0%all6个月复发率50.0%9.5%47平均无病生存期4m13m,李建勇clinjoncol1998,4:302,成人all多药耐药p-gp与形成学分型的关系分型例数p-gp+p-gp-p-pg阳性率l12532212%l240103025%l331233.3%,p0.05华东：中华血液学杂志，1998，19：371,p-gp表达与all免疫分型的关系免疫分型例数p-gp阳性例数阳性率(%)b38821.1t10110.0t/b4250.0难分类4250.0my-40410.0my+16956.3,my+all的p-gp阳性率明显增高,aml中免疫表型与p-gp表达的关系成人：p-gp的表达与cd7、cd14、cd42b、cd61、cd34等高度相关。老年人：p-gp的表达与cd14、cd42b、cd61有相关性p-gp的表达与cd34高度相关。,3.白血病的其它检查(1)细胞凋亡的检查fas及faslapo27bcl-2p53annexincaspase(半胱氨酸蛋白酶)(2)细胞dna分析(3)白血病残留病灶检查(mrd),4.血液病的其他应用,aa，pnh鉴别诊断自身抗体检测paigg,paigm,paigarbc抗体粒细胞抗体,pnh红细胞表面cd59表达,(三)fcm在临床肿瘤学中的应用肿瘤患者的免疫功能检查肿瘤患者的粘附分子检查icam-1cd54icam-2cd102icam-3cd106cd62、cd63、cd42a/b、cd41/61、tsp,肿瘤标本的fcm检查耐药基因检查癌基因与抗癌基因在肿瘤细胞中的表达及与预后的关系粘附分子检查细胞凋亡检查细胞dna及细胞周期分析(癌前病变,恶性肿瘤预后评价)细胞增殖能力研究肿瘤细胞耐药性筛选肿瘤相关抗原，特异标志物激素受体与癌细胞生物行为有关的因子，如cd44,利用特殊的荧光染料(pi、eb、ao等)与细胞内dna碱基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与dna含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的dna含量,细胞dna分析原理,g2,m,g0,g1,s,0,200,400,600,800,1000,s,dnaanalysis,dnacontent,count,normalcellcycle,0,200,400,600,800,1000,pifluorescence,dnaanalysis,2n,4n,0,200,400,600,800,1000,pifluorescence,dnaanalysis,aneuploidpeak,1.出现非整倍体细胞峰，di1.1或di15%3.无明显的异倍体，但g0/1的cv10%，s期在10%-15%4.s+g2/g1/020%,dna诊断肿瘤病标准(kleinetal),dna的倍体和dna指数的关系,淋巴瘤组织学分级与dna倍体及s期细胞关系,histologydnaanalysiss期比值(%)low-gradediploid15intermediate-gradefrequentlyaneuploid515high-gradefrequentlydiploid15,异倍体癌前病例病变结果,组织类别异倍体(例数)癌变例数组织学分级123鼻咽137016口腔74004胃103003宫内膜96015宫颈62002总计4522220,各类癌前病变组织学分级与dna倍体关系(1),组织类别不典型增例数dna倍体(例数)生分级二倍体异倍体鼻咽粘膜11111022823531358口腔粘膜1101002660319127,各类癌前病变组织学分级与dna倍体关系(2),组织类别不典型增例数dna倍体(例数)生分级二倍体异倍体胃粘膜11818021413131468宫内膜11010021413131688宫颈粘膜19902161243532,辅助诊断肿瘤估计肿瘤的预后监测疗效,细胞dna分析的临床意义,尿液宫颈分泌物胸腹水肺泡灌洗液各种刺激液,脱落细胞的dna分析,(四)fcm在血栓与止血中的应用1.血小板糖蛋白血小板质膜糖蛋白gpa：cdw49bgpa：cd61gpb：cd42bgp：cd36gpc：cdw49fgp：cd42agpa：cd29gpb：cd41gpa：cd31血小板颗粒膜糖蛋白颗粒：cd62p(gmp140、padgem)gmp-33tsp颗粒：溶酶体完整膜糖蛋白cd63溶酶体相关膜糖蛋白-1lamp-1溶酶体相关膜糖蛋白-2lamp-2,血小板切面模式图,垂直切面,赤道切面,2.活化血小板检测cd62p，cd63gpb/a(cd41/61)gp(cd36)gp-ib(cd42a/cd42b)thrombospondin血小板内钙离子,3.遗传性血小板功能缺陷性疾病诊断巨血小板综合症(bss)gpib-(cd42a/cd42b)缺陷或缺乏血小板无力症(ct)gpb/a(cd41/61)缺陷或缺乏贮存池疾病-spd下降,活化血小板的概念循环血液中处于静息状态的血小板受到生物或物理因子刺激后,使血小板胞浆内颗粒膜糖蛋白释放与质膜融合,血小板膜表面糖蛋白发生数量重排和构象变