液体活检在胰腺癌中的应用.pptx

液体活检在胰腺癌中的应用 袁周上海交通大学附属第六人民医院普外科 1 胰腺癌流行病学 胰腺癌发病率和死亡率逐年升高 2008年世界癌症死亡统计 2012年世界癌症死亡统计 CACANCERJCLIN2011 61 69 90CACANCERJCLIN2015 65 87 108 2 2011年中国胰腺癌流行病学研究 近年来上海市胰腺癌流行学研究 11 13 10万 17 28 10万 9 91 10万 14 04 10万 中国肿瘤 2015 24 1 1 10CancerLetters346 2014 273 277 3 液体活检 胰腺癌诊疗新思路 1 CancerDiscov 6 5 1 13DOI 10 1158 2159 8290 CD 15 14832 OncolRep2016 35 3 1237 44 4 肿瘤筛查和早期诊断 实时监控治疗反应 评估转移复发及预后 指导靶向治疗 指导治疗干预措施 CTC和ctDNA Exosomes 胰腺癌CTC研究 5 预后判断 治疗监测 胰腺癌诊断 CTCcluster 转移机制 耐药性 IntJCancer2014 1 134 1 1 8 CTC 胰腺癌诊断 6 1 Nature 2010Oct28 467 7319 1114 72 Cell2012 148 1 2 349 613 Gastroenterology2014 146 647 514 PLoSOne 2014Oct31 9 10 e111597 CTC 胰腺癌治疗监测 7 动物实验表明 药物有效治疗后CTC数量显著降低 胰腺癌患者术后CTC先下降后上升 可能是因为潜伏的disseminatedtumorcells再次被激活 PLoSOne 2014Feb19 9 2 e89474IntJCancer 2015Mar1 136 5 1228 33 CTC 胰腺癌预后 8 CTC阳性患者 总生存时间较差 HR 1 23 无进展生存期更短 HR 1 89 TumorBiol 2014 35 2473 2480 CellSearch检测CTC判断预后 9 16名 b期PC患者 8名检出CTCCTC阳性MST 52 5天CTC阴性MST 308 3天 JHepatobiliaryPancreatSurg 2008 15 189 195Annalsofoncology 2013 24 8 2057 2061 79名局部晚期PC 9名患者在基线或治疗后2月检测出CTC 检出率11 CTC阳性OS较差 P 0 01 CellSearch联合表面分子标记物更准确判断预后 10 经典的CellSearch检测CTC对转移性PC的预后价值判断有限结合MUC 1更好的对患者进行危险分层 Pancreas 2016Mar10DOI 10 1097 MPA 0000000000000619 CellSearch检测CTC评估肿瘤转移 在PC患者术后2 3年 术中门静脉CTC阳性提示较高的较高肝转移发生率 53vs 8 p 0 038 CTC的数量变化辅助判断不同手术方式效果 术前两组门静脉CTC无差异 术后标准手术组CTC升高而非接触术式组CTC不变 11 Medicine95 16 e3407 TumorBiol 2015 36 991 996Medicine Baltimore 2016Apr 95 16 e3407 doi 10 1097 MD 0000000000003407JAMASurg 2014May 149 5 482 5 胰腺癌CTC检测 CellSearch 12 CTC检出率较低晚期PC检出率5 42 检出数量较少1 10个 7 5ml无法进行后续培养 在EMT过程中CK EpCAM等上皮标记物表达减少或消失 上皮表型细胞减少 间质表型细胞增多 胰腺癌为乏血供组织 血流量较正常胰腺组织减少约60 CTC通过门静脉系统在肝脏内被清除 基于大小的胰腺癌CTC检测 13 优势 检出率高 检出数量多 细胞完整性好 不受细胞表面标记物影响 可检出CTM 可进行后续分析不足 不易检出小于8 m的肿瘤细胞胰腺癌 ISET ScreenCell等 ISET 结合多种表面标记物确定CTC 根据肿瘤细胞形态学确定的CTC对PFS P 0 85 和OS P 0 36 无判断作用利用表面标记物研究CTCEpithelialCTC CK CD45 15 m 78 提示预后不良MesenchymalCTC CK Vim CD45 15 m 52 提示术后复发更多标记物值得去探究 如EMT过程中表达不下调的Plastin3 14 BritishJournalofCancer 2012 106 508 516AnnSurg 2016Jan7 DOI 10 1097 SLA 0000000000001600CancerRes 2013Apr1 73 7 2059 69 ScreenCell 结合KRAS突变鉴别CTC 15 联合细胞形态和KRAS突变检测胰腺癌CTC KRAS突变可以作为判定CTC分子学特征可在不同分期PC患者检测到 检出率较高 分别为73 86 67 73 的CTC检出KRAS突变KRAS突变CTC与预后有关 Pancreas2015 44 547 550TumourBiol2016 37 6 7547 54 SE iFISH方法检测CTC 16 SE iFISH 差相富集技术联合免疫荧光染色及染色体荧光原位杂交技术 CTC鉴定方法 CK是上皮细胞来源标记物 免疫染色为绿色CD45白细胞表面的共同抗原 免疫染色为红色DAPI用于标记细胞核 染色呈现蓝色8号染色体多倍性是胰腺癌一个重要特征 FISH染色为橙色CTC的表型 CK CD45 DAPI CEP8 2 CK CD45 DAPI CEP8 2 CK CD45 DAPI CEP8 2白细胞的表型为CK CD45 DAPI CEP8 2 未定性细胞表型为CK CD45 DAPI CEP8 2 17 典型细胞图像 白色箭头所示为CTC 红色箭头所示为白细胞 绿色箭头所示为未定性细胞 18 CTC计数诊断胰腺癌ROC曲线 ROC曲线下面积0 954当CTC计数临界值为2个 7 5ml 约登指数最大 为1 78CTC 2个 7 5ml定义为CTC阴性 CTC 2个 7 5ml定义为CTC阳性 19 CTC阳性率与临床病理学参数关系 20 联合CTC计数与CA19 9诊断胰腺癌 21 CTC计数与胰腺癌生存时间关系 本组患者中位时间生存时间为10 2月 3 9 21 6月 CTC 3个 7 5ml的患者中位生存时间15 2月 8 4 21 2月 CTC 3个 7 5ml的患者中位生存时间10 2月 3 9 16 4月 22 Cox比例风险回归模型 CTC 3个 7 5ml HR 4 547 P 0 016 和 期肿瘤 HR 2 742 P 0 012 是胰腺癌不良预后的独立判断因素 JExpClinCancerRes 2016Apr12 35 1 66 23 CTC 肿瘤耐药性 在NSCLC中 CDX小鼠模型 CTCderivedxenograft 对化疗药物反应类似提供CTC的患者 便于检测化疗耐药性在乳腺癌中 培养CTC细胞系 进行药敏试验 难治性肿瘤的提供新治疗药物 进行个性化治疗方案通过对接受和未接受AR androgenreceptor 抑制剂治疗的前列腺癌患者CTC 发现非经典Wnt信号通路激活 Wnt5a异常表达抑制药物疗效 24 1 NatMed 2014Aug 20 8 897 9032 Science 2014Jul11 345 6193 216 203 Science 2015Sep18 349 6254 1351 6 CTC在肿瘤转移发中的作用 25 Nature 2016Jan21 529 7586 298 306 CTC 肿瘤转移机制 在前列腺癌中 CTC全外显子组测序揭示70 的CTC突变与肿瘤组织一致在乳腺癌CTC中分离出MIC metastasis initiatingcells 证实EPCAM CD44 CD47 MET 类型细胞具有肿瘤干细胞特性在胰腺癌中 利用RAN Seq分析鉴定出非经典Wnt途径在胰腺癌中的作用 抑制Wnt2基因有可能抑制转移肿瘤可以通过CTC进行自我种植 self seeding 进而促进肿瘤增大 血管生成等 26 1 NatBiotechnol 2014May 32 5 479 842 NatBiotechnol 2013Jun 31 6 539 443 Nature 2012Jul26 487 7408 510 34 Cell 2009Dec24 139 7 1315 26 CTC 肿瘤转移机制 27 胰腺癌CTC的RNA Seq分析发现 CTC高度表达间质来源的胞外基质蛋白SPARC促进胰腺癌的转移 前列腺癌CTC的RNA Seq分析发现CTC中的相关信号通路 1 CellRep 2014Sep25 8 6 1905 182 Science 2015Sep18 349 6254 1351 6 CTCcluster 在乳腺癌中 CTCcluster转移能力大约是单个CTC的50倍 plakoglobin 斑珠蛋白 在形成中其关键作用 表达降低后肿瘤转移能力显著下降CTCcluster与血小板 白细胞 成纤维细胞及内皮细胞共同构成特有微环境 可以抑制失巢凋亡CTCcluster提示患者预后较差 28 1 Cell 2014Aug28 158 5 1110 222 TrendsinCancer 2015 1 1 44 52 ctDNA 临床应用前景广泛 29 早期诊断 检测残余病灶 动态监测治疗反应 指导靶向用药 判断预后 ClinChem 2015Jan 61 1 112 23 ctDNA 检测方法日新月异 30 数字PCR计数提高稀有突变检出率 提高检测的深度NGS计数可以性检测多个靶基因 尤其是靶向深度测序 提高检测广度 JClinOncol 2014Feb20 32 6 579 586 Kras基因为胰腺癌重要驱动基因 31 Trendsinbiochemicalsciences 2014 39 2 91 100 液体活检检测KRAS对PC预后有更强的判断能力 32 MedOncol 2016 33 61DOI10 1007 s12032 016 0777 1 ddPCR检测ctDNA 105例PDAC手术患者 肿瘤组织KRAS突变率82 ctDNA突变率33 与肿瘤在组织符合率100 肿瘤组织KRAS突变无判断预后作用 P 0 18 ctDNA的KRAS突变可判断预后 13 6月vs27 6月 P 0 001 不同KRAS突变亚型的患者OS无显著差别 33 BrJCancer 2016Jun28 115 1 59 65 ctDNA动态监测病情变化 ctDNA与CA19 9水平有很好的相关性 Spearman srho 0 786 P 0 021 ctDNA较影像学平均提前6 5月发现肿瘤进展 34 MolOncol 2016Apr 10 4 635 43NatCommun 2015Jul7 6 7686 ctDNA指导靶向用药 35 SciRep 2015Dec16 5 18425NatCommun 2015Jul7 6 7686 ctDNA反映胰腺癌突变基因类型 可使更多患者有可能得到靶向治疗大约三分之一患者有可用靶向药 胰腺癌靶向深度测序Panel 36 基于ctDNA的靶向用药结果 EGFR外显子19缺失与厄洛替尼敏感有关ctDNA提前检测到该突变 后经活检证实 予以厄洛替尼治疗结果CA19 9正常 肿瘤缩小 病情缓解 37 CancerDiscov 2015Oct 5 10 1040 8 基于ctDNA的靶向药物试验 BRAFV600E突变在胰腺癌中比例3 不与KRAS突变共存 是Vemurafenib批准用于治疗黑色素瘤的靶点取BRAFV600E突变患者肿瘤细胞进行培养 结果发现和黑素偶细胞系MNT 1对Vemurafenib有类似敏感性 而KRAS突变细胞系PL 45则无反应 38 NatCommun 2015Apr9 6 6744 世界范围内的精准医疗热潮 澳大利亚针对晚期胰腺癌患者进行TheIndividualizedMolecularPancreaticCancerTherapy IMPaCT 试验 帅选出HER2扩增 KRAS野生型 DNA修复通路基因突变 BRCA1 BRCA2 PALB2 ATM 患者进行靶向治疗 有可能通过液体活检辅助精准靶向治疗美国NCI正在组织进行MATCH MolecularAnalysisforTherapyChoice 试验 计划帅选3000名实体肿瘤患者 最终根据突变类型给予靶向药物治疗 39 ClinCancerRes 2015May1 21 9 2029 37SeminOncol 2014Jun 41 3 297 9 我们开展的研究 40 部分检测结果 41 Sanger法 ddPCR法 部分检测结果 42 ARMS法 外泌体组成 43 外泌体是一种直径为30 100nm的膜性小囊泡 可由机体中的多种细胞分泌 并广泛分布于唾液 血浆和乳汁等体液中 相关研究登记在http www exocarta org AnnuRevCellDevBiol 2014 30 255 89 外泌体分离方法 离心法 收集细胞培养液以后依次在300g 2000g 10000g离心去除细胞碎片和大分子蛋白质 最后100000g离心得到外泌体过滤离心 利用不同截留相对分子质量 MWCO 的超滤膜离心分离外泌体密度梯度离心 将样本和梯度材料一起超速离心 样品中的不同组分沉降到各自的等密度区 分为连续和不连续梯度离心法免疫磁珠 包被有单克隆抗体的球型磁性微粒 可特异性地与靶物质结合色谱法 利用根据凝胶孔隙的孔径大小与样品分子尺寸的相对关系而对溶质进行分离的分析的方法 44 胰腺癌外泌体研究Landmark 45 德克萨斯大学M D 安德森癌症中心 外泌体早期诊断 46 PKT小鼠模仿人类胰腺癌发展过程 4 5周时形成PanIN 8周时死于PDACGPC1 外泌体的比例随着肿瘤体积增大和组织学分化变差而不断升高外泌体的浓度与大小同样与病情进展相关系较差外泌体含有KRAS突变且在胰腺癌早期阶段升高 可以作为理想的胰腺癌早期诊断标记物 Nature 2015Jul9 523 7559 177 82 外泌体用于胰腺癌诊断 47 GPC1 外泌体比例在鉴别胰腺导管腺癌与胰腺良性疾病和正常人群的灵敏度和特异度为100 GPC1 外泌体比例对于不同分期 原位癌 和 期肿瘤的灵敏度和特异度均为100 外泌体浓度及大小无法有效鉴别 外泌体提示肿瘤负荷 48 28 29的PDAC和全部PCPL术后GPC1 外泌体均下降19 29的PDAC和0个PCLC患者术后CA19 9水平下降 外泌体变化判断胰腺癌预后 49 GPC1 外泌体下降大于中位水平的OS和disease specificsurvival水平高于低于中