组织RNA提取.doc

RNA提取方法步骤实验前：离心机预冷（4）。锡箔纸包着的干烤过的研钵和杵。实验主要在铺着报纸的桌上进行，不要在空调口等空气流动很快的地方。操作要求戴口罩，手套要求新的，枪头，EP管全部无酶。实验原理：细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在。trizol含有异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体解离，即分离RNA和与之结合的蛋白质，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿的时候，它可抽提酸性苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可以形成水相层和有机层。其中水相层在上，有机层在下，中间层是DNA和蛋白质。就是说会有三层，而RNA在水相层内，即上层中。异丙醇的作用是沉淀RNA。乙醇的作用是洗掉异丙醇。一、从组织中提取总RNA 1)液氮研磨（磨的时候小心组织样品飞掉，如果飞掉，我们一般是用镊子夹回来的），组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软（最好不要等组织变软（实际证明软一次没关系。乘它软的时候，把它压薄，然后加液氮后变硬很容易研磨，其实加液氮不仅防止RNA降解而且更利于研磨），变软后RNA容易降解，若液氮挥发完要迅速补充液氮，一直让样品保持冻着的状态。研磨这步很重要，研磨既要充分又不能让RNA降解），再加少量液氮，再研磨，如此三次（肯定超过三次的），按50-100mg 组织/ml Trizol 加入Trizol（一般1000ml，加Trizol前聚组织于一堆，这样方便吸），转入离心管进行第2 步操作。2) 匀浆（组织用研钵研磨时要研磨充分，之后就不需要再匀浆了。）：组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol。另外，组织体积不能超过Trizol 体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2 分钟。二、从细胞中提取总RNA 1) 培养贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml比例加入。2) 悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。三、操作步骤1、细胞或组织加Trizol 后，室温放置10min（一般会超过这个时间，因为液氮冷冻掉了），使其充分裂解，然后吸入1.5ml无酶的Ep中注：天热需在冰上放置，此时可放入-80长期保持。2、12,000rpm 离心5min，弃沉淀。注:提取细胞RNA时，此步骤可以省略。（我们是省略的）3、按200ul 氯仿/ml Trizol 加入氯仿，剧烈振荡30s（这步混匀一定要充分，可适当增加混匀时间，是否混匀充分对蛋白质去除效果影响很大，这是个关键步骤），室温放置15min（5min）。注：需要时可在冰上放置，禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA 断裂。4、4 12,000g 离心15min。5、吸上清于另一个Ep管中，重复步骤3和4一次(注意加氯仿后吹打混匀)。（为了尽量去掉蛋白质，得到高质量的RNA，要至少再重复一次氯仿抽提的步骤，如果组织中的蛋白含量比较多，就要再多抽提几次。）6、吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面（宁愿少吸一点上清液也不能吸到中间层，其实RNA有一点就够用了，做这步时切忌不要贪心。）；若同时提取DNA 和蛋白质，则保留下层酚相存于4冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。7、按0.5ml 异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀（加入与所吸上清液等体积的异丙醇，一般为500ul），室温放置5-10min（-20 ，30min以上，所以做到这步可以先吃饭）。注：RNA量过少可以在-20 放置过夜。8、4 12,000g 离心10min（15-20mim），弃上清，RNA 沉于管底。9、按1ml 75%乙醇/ml Trizol 加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。10、 4 8,000g 离心5min，尽量弃上清。注：应用枪尽量吸干净，减少干燥时间。11、室温晾干或真空干燥5-10min（倒扣于滤纸上，EP管的盖子打开）。注：RNA 样品不要过于干燥，否则很难溶解。12、可用10-30ul（我们用的是10ul）的DEPC水溶解沉淀，由R