（食品科学专业论文）耐高渗高糖酵母菌株的选育.pdf

i i 一 一 ， ， 摘要 浓醪发酵是酒精工业生产的新趋势，这种发酵工艺所生成的酒精浓度较高， 同时醪液中的糖度也高。这样发酵醪液的渗透压较高，引起细胞内水分活度、细 胞质组成发生显著变化，酵母的细胞膜和茵体内的酶受到破坏，从而抑制酵母的 生长和发酵。国内外已有很多选育耐高浓度酒精酵母菌的筛选，但耐高糖酵母菌 的筛选却少见。若要选育出耐高糖酵母菌，可以很好的为酒精工业的生产服务。 鉴于此，本文进行了以下研究：酵母菌的耐高糖驯化；对驯化出的优良菌株进行 原生质体菌悬液的制备研究，并做原生质体紫外诱变，以选育出耐高糖酵母菌株； 利用选育出的耐高糖酵母菌进行酒精发酵试验。 主要研究结果有： 1 利用逐步提高培养基糖浓度的方法对初始酵母菌进行耐高糖驯化。结果 表明，酵母菌驯化后，能在3 0 糖浓度的培养基中生长发酵良好。 2 驯化出的优良酵母菌株培养到对数期，经b 一巯基乙醇一e d t a p b 溶液预处 理，蜗牛酶溶液酶解后，生孢培养基双层平板培养，长出菌落后计数，计算原生 质体分离率和原生质体再生率。结果表明，原生质体分离率9 7 9 ：原生质体再 生率1 9 8 。 3 以驯化出的优良菌株为出发菌株，进行原生质体紫外诱变。对诱变时间 和诱变距离优化。结果表明，原生质体紫外诱变最佳条件为：诱变时间为1 8 s ， 诱变距离2 0 c m 。诱变后通过初筛和复筛后选育出的菌株y b 一2 3 在4 0 糖度下产气几 乎充满整个发酵杜氏小管，在6 5 糖浓度下仍能起酵。并且在发酵力、产酒精能 力、残留还原糖浓度等方面都优于出发菌株。菌落、细胞形态良好。稳定性试验 表明稳定性良好。 4 利用选育出的酵母菌进行酒精发酵试验，包括小瓶发酵单因素试验，正 交试验设计设计优化发酵工艺条件，i o l 发酵罐小试试验。结果表明：最佳发酵 工艺条件为：水料比1 5 ，初始p h 4 5 ，糖化酶用量1 2 0 u g ，酵母接种量1 4 。 发酵罐小试试验表明效果良好，发酵7 2 h 产酒精量为1 6 0 ( v v ) ，发酵性能明 显优于出发菌株。原始菌株发酵7 2 h 产酒精量为1 5 1 ( v v ) 。筛选出的菌株酒 精产量比原始菌株提高5 9 6 。 关键词：酵母菌，耐高糖，原生质体，紫外诱变，酒精发酵 a b s t r a c t h i g hg r a v i t yf e r m e n t a t i o ni st h en e wt r e n do fi n d u s t r i a lp r o d u c t i o no fa l c o h o l ，t h i s f e r m e n t a t i o np r o c e s sg e n e r a t e sah i g h e ra l c o h o lc o n c e n t r a t i o n ，a n dah i g h e rs u g a r c o n t e n ti nf e r m e n t a t i o nl i q u o nt h i sf e r m e n t e dm a s ho fh i g ho s m o t i cp r e s s u r e t h e r e w i l lb eas i g n i f i c a n tc h a n g ei nt h ei n t r a c e l l u l a rw a t e ra c t i v i t ya n dt h ec o m p o s i t i o no f t h ec y t o p l a s m t h ec e l lm e m b r a n ea n db o d ye n z y m eo fy e a s tw i l lb ed a m a g e d g r o w t ha n df e r m e n t a t i o no fy e a s tw i l la l s ob ei n h i b i t d t h e r ea r em a n yb r e e d i n g r e s i s t a n c et oh i g hc o n c e n t r a t i o n so fy e a s ta l c o h o ls c r e e n i n gi nc h i n aa n df o r e i g n ， h o w e v e r , b r e e d i n go fh i g h - s u g a r - t o l e r a n ty e a s tw a s r a r e i ti sv e r yb e n e f i c i a lf o rt h e e t h a n o li n d u s t r y sp r o d u c t i o ns e r v i c e s ，i fw eb r e e dh i g h - s u g a r - t o l e r a n ty e a s t s ot h i s p a p e rw a sm a d eas t u d yo ni t f i r s th i g h - s u g a r - t o l e r a n ty e a s tw a sd o m e s t i c a t d p r e p a r e p r o t o p l a s tw i t ht h ew e l ly e a s t ；t h ep r o t o p l a s tu vm u t a g e n e s i sm e t h o dc o m b i n i n g 、析t l ld o m e s t i c a t i o nw a su s e dt os c r e e n h i g h - s u g a r - t o l e r a n t y e a s t t h e h i g h - s u g a r - t o l e r a n ty e a s tw e r et h e na p p l i e dt of e r m e n ta l c o h 0 1 t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h ei n i t i a ly e a s tw a sd o m e s t i c a t do fh i g hs u g a rt o l e r a n c eu s i n gt h em e t h o do f g r a d u a l l yi n c r e a s et h ec o n c e n t r a t i o no fs u g a ri nc u l t u r em e d i u m t h er e s u l tw a sa s f o l l o w s ：t h ed o m e s t i c a t dy e a s tc a nf e r m e n t a t dw e l li nt h ec u l t u r em e d i u mo f3 0 s u g a rc o n c e n t r a t i o n 2 t h ed o m e s t i c a t i o ny e a s tw a sc u l t u r et o l o gp h a s e d e a l t h e m 、析m 1 3 - m e r c a p t o e t h a n o l e d t a p ba n de n z y m o l y s i sw i t l lh e l i c a s e c o u n tt h ey e a s tc o l o n y t oc o m p u t ef o r m a t i o nr a t ea n dr e g e n e r a t i o nf r e q u e n c yo fp r o t o p l a s t s t h er e s u l ti st h a t t h ef o r m a t i o nr a t ei s9 7 9 ，a n dt h er e g e n e r a t i o nf r e q u e n c yi s1 9 8 3 t h ep r o t o p l a s to fd o m e s t i c a t i o ny e a s tw a sm u t a g e n e s i s e db yu v t h eu v m u t a g e n e s i st i m ea n dd i s t a n c ew a so p t i m i z e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u m m u t a n tc o n d i t i o n s 、】i ，e r et h ei r r a d i a t i n gt i m eo f18sa n dt h ei 1 1 r a d i a t i n gd i s t a n c eo f2 0 c m t h ey e a s ty b 一2 3w a ss c r e e no u tb yi n i t i a la n df i n a lc h o o s e t h ey b 2 3c a ng r o w w e l lu n d e rh i g hs u g a r ( 4 0 ) c o n c e n t r a t i o nc o n d i t i o n a n di th a dt h ea b i l i t yt of e r m e n t g l u c o s eu n d e rt h eh i g hs u g a r ( 6 5 ) c o n c e n t r a t i o nc o n d i t i o n ，a n dy b - 2 3i ss u p e r i o r t o t h eo r i g i n a ls t r a i ni nt h ea s p e c to ff e r m e n t i n gp o w e r , e t h a n o lp r o d u c t i o na b i l i t y , r e s i d u a lr e d u c i n gs u g a rc o n c e n t r a t i o n t h ey e a s tc o l o n y , c e l la n ds t a b i l i t yw e r ev e r y g o o d 4 t h ey e a s ty b 一2 3w a su s e dt od oa l c o h o l i cf e r m e n t a t i o nt e s t t h i st e s tc o n t e n t i t s i n g l e f a c t o ra n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，w h i c hw a sc a r r yo u ti n10 lf e r m e n t e r t h e r e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ：n l eo p t i m u mt e c h n o l o g yo fh i g hg r a v i t yf e r m e n t a t i o nw e r e r a t i oo fm a t e r i a lt ow a t e r1 ：1 5 ，i n i t i a lp h4 5 ，g l u c o a m y l a s ea c t i v i t y15 0 u gc e d u l i s ， y e a s ti n o c u l u m s14 n 圮r e s u l tc a r r yo u ti nlo lf e r m e n t e rw a sv e r yw e l l 硼1 e e t h a n o lc o n v e r s i o nr a t e sr e a c ht o16 o ( v v ) a f t e rf e r m e n t i o nf o r7 2 h b u tt h ei n i f i a l y e a s to n l yc a nr e a c ht o 15 1 ( v v ) a f t e rf e r m e n t i o nf o r7 2 h b r e e d i n gy e a s to f a l c o h o lp r o d u c t i o ni n c r e a s e d5 9 6 t h a nt h eo r i g i n a ly e a s t k e yw o r d s ：y e a s t ，h i g h - s u g a r - t o l e r a n 4p r o t o p l a s t ，u vm u t a g e n e s i s ，a l c o h o l i c f e r m e n t a t i o n i i i 目录 摘要i 英文摘要 1 文献综述1 1 1 酵母菌概述1 1 1 1 酵母菌的定义分类1 1 1 2 酵母菌的形态1 1 1 3 酵母菌的生理特性。l 1 2 耐高渗酵母茵概述3 1 3 酵母菌的选育4 1 3 1 酵母菌的自然选育4 1 3 2 酵母菌的紫外诱变育种4 1 3 3 原生质体诱变育种6 1 4 酒精发酵研究现状7 2 引言1o 2 1 课题的立题背景及意义l o 2 2 本论文的主要研究内容1 0 3 材料与方法1 l 3 1 培养基1 1 3 2 相关溶液1 1 3 3 主要仪器及器皿。1 2 3 4 相关指标测定方法1 3 3 5 酵母菌的驯化1 3 3 6 原生质体制备1 4 3 6 1 酵母菌亲株单倍体的制备1 4 3 6 2 酵母茵的预处理1 4 3 6 3 酵母菌酶解1 4 3 6 4 原生质体再生15 3 7 原生质体紫外诱变1 5 3 7 1 原生质体悬液的制备1 6 3 7 2 原生质体紫外线诱变1 6 3 7 2 1 诱变时间的确定1 6 3 7 2 2 诱变距离的确定1 6 3 7 2 3 致死率的确定1 6 i 3 7 2 4 稀释培养16 3 7 3 初筛1 6 3 7 4 复筛1 7 3 7 4 1 起酵时间的观察1 7 3 7 4 2 发酵力的测定，酒度的测定，残留还原糖浓度的综合筛选1 7 3 7 4 3 耐糖性实验。l7 3 7 5 遗传稳定性实验17 3 7 6 相关性能测定1 7 3 8 酒精发酵l8 3 8 1 小瓶发酵试验l8 3 8 2 工艺条件的优化18 3 8 2 1 单因素实验1 8 3 8 2 2 正交设计优化酒精发酵条件1 9 3 8 3 发酵罐验证试验l9 4 结果与分析2 1 4 1 酵母菌的驯化结果。2 1 4 2 原生质体制各结果2 1 4 2 1 酵母菌生长曲线绘制2 l 4 2 2 原生质体再生结果2 2 4 3 紫外诱变结果。2 3 4 3 1 诱变时间的研究2 3 4 3 2 诱变距离的研究2 4 4 3 3 酵母菌诱变后初筛结果2 4 4 3 4 酵母菌诱变后复筛结果2 5 4 3 5 耐糖性实验结果2 6 4 3 6 相关性能测定结果2 7 4 4 酒精发酵实验结果2 8 4 4 1 单因素试验结果2 8 4 4 1 1 水料比对酒精发酵的影响2 8 4 4 1 2 p h 对酒精发酵的影响2 9 4 4 1 3 糖化酶添加量对酒精发酵的影响。3 0 4 4 1 4 酵母接种量对酒精发酵的影响3 1 4 4 1 5 液化时间对酒精发酵的影响。3 1 4 4 2 正交试验结果3 2 n 4 4 3 发酵罐证实实验结果3 3 主要结论3 6 参考文献3 7 致谢4l 作者简介4 2 攻读硕士学位期间发表的论文4 2 i i i 0 1 文献综述 1 1 酵母菌概述 1 1 1 酵母菌的定义分类 酵母菌( y e a s t ) 不是分类学上的名称，它是一类以出芽繁殖为主的单细胞真 菌的统称。酵母菌不形成分枝菌丝体，一般以芽殖或裂殖进行无性繁殖，少数可 产生子囊孢子进行有性繁殖。现已知酵母菌的种类很多，包括有孢子酵母、产冬 孢子的类酵母、掷抱酵母和无孢子酵母等，含盖6 0 个属5 0 0 多个种【i 】。共有5 6 个 属，分属于子囊菌亚门、担子菌亚l - j 及半知菌亚门【2 j 。 酿酒酵母是酵母属中的典型种，也是重要的菌种。酿酒酵母被命名为 s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 。按生物在自然界的分类属于真菌门( e u m y e o p h y t a p h y l u m ) ，菌类亚门( f u n g is u b p h y l u m ) ，子囊菌纲( a s e o m y e e t e sc l a s s ) ，不整 子囊菌亚纲( p l e c t o m y c e t e ss u b e l a s s s ) ，不整子囊菌目( p l e c t o m y c e t e so r d e r ) ， 有孢子酵母科( e n d o m y c e t a c e af a m i l y ) ，酵母亚科( s a e c h a r o m y c o i d e a ss u b o r d e r ) ， 酵母属( s a c c h a r o m y e e sg e n u s ) ，酿酒酵母种( s a e c h a r o m y e e se e r e v i s i a es p p ) p j 。 酵母菌在自然界分布很广，主要生长在偏酸的含糖环境中，在水果、蜜饯的 表面和果园土壤中最为常见。由于不少酵母菌可以利用烃类物质，故在油田和炼 油厂附近的土层中也可以找到酵母菌1 4 。 1 1 2 酵母菌的形态 酵母菌细胞长度为l - l o p m ，宽1 5 岬，酿酒工业用酵母菌细胞的直径多 为4 6 肛m 限6 】。各种酵母菌有其一定的形状和大小，但也随菌龄及环境条件而变 化。 酵母菌的菌落表面光滑、粘稠，容易用接种针挑起。颜色均匀，质地均一。 有的酵母菌因培养时间较长菌落会有皱缩现象。大多数酵母菌菌落呈乳白色，不 透明，极少数为红色( 如红酵母与掷孢酵母等) 。菌落的色泽、质地、表面及边 缘等特征都是酵母菌菌种鉴定的依据。酿酒酵母在麦芽汁培养基上的菌落为乳白 色、有光泽、边缘整齐。在加盖片的玉米琼脂上培养，不生成假菌丝或者不典型 的假菌丝【2 】。 1 1 3 酵母菌的生理特性 酵母属酵母也像高等真核微生物一样，具有特征的亚细胞结构和细胞器。它 们具有细胞核、内质网、高尔基体和分泌的液泡。线粒体也在细胞中存在。因为 它们的发酵性质，酵母细胞可以去除线粒体而存在，形成所谓呼吸缺陷型。呼吸 缺陷型菌株不能在非发酵基质( 例如乙醇、丙酮酸和乳酸) 上生长，但可以利用 发酵性糖而生长。在厌氧发酵中，线粒体活性受到抑制，电子传递链中的酶不能 合成。除了呼吸作用之外，许多氧化性反应是在线粒体中进行的，所以在发酵过 程中不起作用。这些氧化反应包括三羧酸( t c a ) 循环、脯氨酸氧化和脂肪酸合 成。另外酵母中的液泡是水解大分子物质和储存氨基酸、某些高能化合物和其他 细胞组分的地方，液泡还能调节细胞压力和维持离子平衡1 7 j 。 酿酒酵母不仅在啤酒、白酒、酒精、果酒及其他进料的酿造和面包的制造中 应用，而且也作为食用、药用以及饲料酵母( 因它含有丰富的蛋白质和维生素) ， 还可以提取核酸、麦角固醇、细胞色素c 、谷胱甘肽、辅酶a 以及三磷酸腺苷等。 酿酒工业酵母的最适生长温度为2 5 3 0 ，最适生长p h 为5 6 ，最适发 酵温度2 7 3 3 ，近年研究发现的耐高温酵母的发酵温度可高达4 0 ，p h 4 - - 一5 。 酵母菌是一种兼性厌氧微生物，在繁殖时需要大供给空气；在发酵时，不需要空 气。 酵母菌的繁殖方式有无性繁殖和有性繁殖两种，以无性繁殖为主。 酵母菌的无性繁殖方式主要是芽殖，少数为芽裂，个别为裂殖。芽殖是在成 熟的酵母细胞上长出一小芽，芽细胞长到一定程度脱离母细胞继续生长，再出芽 产生新个体，如此循环往复。不同酵母菌在母细胞上出芽的部位不同，有一端出 芽、两端出芽、多端出芽。当环境适宜，生长繁殖迅速时，酵母出芽形成的子细 胞尚未自母体细胞脱离前，又在子细胞上长出新芽，如此继续出芽，就会形成成 串的细胞，即假菌丝，如产朊假丝酵母。有的酵母菌在一端出芽，并在芽基处形 成隔膜，把母细胞与子细胞分开，子细胞成瓶状。这种在出芽的同时又产生横隔 膜的方式称为芽裂或半裂殖。少数种类的酵母菌像细菌一样，以细胞分裂方式繁 殖，叫裂殖。 凡能进行有性繁殖的酵母菌称为真酵母，尚未发现有性繁殖的称假酵母。真 酵母以形成子囊孢子( a s c o s p o r e ) 的方式进行有性繁殖。酵母菌形成子囊孢子需 要一定的条件。生长旺盛的幼龄细胞容易形成孢子，老龄细胞不易形成，还需要 适宜的培养基和良好的生长条件。酵母菌产生的子囊孢子的形状因菌种不同而 异，如球形、椭圆形、半球形、帽子形、柑桔形、柠檬形、肾形、镰刀形、针形 等。孢子表面有平滑的、刺状的，孢子的皮膜有单层的、有双层的。这些都是酵 母菌分类的重要依据。 酿酒酵母无性繁殖为芽殖，进行多边出芽，繁殖旺盛时能形成假菌丝。进行 有性繁殖时，由两个单倍体的营养细胞结合成接合子。接合子通常能出芽繁殖几 代，成为二倍体营养细胞。在适当的条件下，这种二倍体细胞的核进行减数分裂。 2 形成子囊孢子【2 1 。 1 2 耐高渗酵母菌概述 在自然繁殖或工业培养过程中，酵母常常会受到高盐、高糖等条件的影响， 所以细胞自身的渗透调节是其非常重要的生物学反应。发酵醪液的渗透压较高， 造成细胞质组成以及细胞内水分活度发生明显变化，破坏了酵母菌的细胞膜和菌 体内的酶，酵母菌的生长和发酵都会受到抑制嘲。p 破【9 】和m i k l o s 1 0 1 研究了酵母 菌的耐渗能力，证明酵母菌本身存在一套系统对渗透压进行调节。研究表明，酵 母菌在高渗环境下存在几种信号传导途径和分子应答机制i l ，由于酵母渗透压 调节系统的表达方式和强弱程度不同，对外界环境表现出的耐渗性也有明显差 异。在高浓度糖条件下发酵最早是由c 豁e ) r 【1 2 】和他的同事提出的，后来确定为在 每l o o g 发酵醪中含有1 8 9 以上的可溶固形物中发酵，普通酵母在乙醇浓度达1 1 左右时，发酵完全受到抑制i l 引。 利用玉米作为原料酒精发酵时，玉米醪中葡萄糖的含量就是影响糖代谢的因 素之一。如果葡萄糖的含量大于0 4 ( w v ) ，那么无论是不是有氧的存在，糖代 谢都通过糖酵解途径来进行。也就是通过发酵而不是通过呼吸代谢进行产生乙醇 和二氧化碳，这种现象便是葡萄糖效应或葡萄糖产物抑制作用。葡萄糖效应发生 时，三梭酸循环活性大大降低。因为此时三梭酸循环中的一些酶活性大大降低， 同时线粒体呼吸链系统失去正常功能。只能观察到不正常的线粒体，称为“类线 粒体 或“前线粒体 。只有当葡萄糖浓度小于0 4 ( w v ) 时，产物抑制作用才会 被消除，线粒体的功能才能恢复。葡萄糖产物抑制效应还影响麦芽糖和麦芽三糖 的有效利用，因为参与麦芽糖和麦芽三糖吸收的渗透酶和麦芽糖酶的合成受到抑 制。葡萄糖浓度越高，这种作用就会越显著。只有当葡萄糖浓度下降到小于 0 4 ( w v ) 时，这两种糖的利用才开始。另外，果糖和蔗糖( 蔗糖迅速被胞外转化 酶分解) 也具有产物抑制作用。但由于麦汁中这两种糖含量低，因此其作用不如 葡萄糖显著【l2 。 浓醪发酵是酒精工业生产的新趋势，这种发酵工艺生成的酒精浓度较高，同 时醪液中的糖度也高。因此醪液中的渗透压也较高。酒精生产过程中，酒精度的 提高可以降低蒸馏时的能耗，发酵时应尽可能地提高成熟醪的酒精度。而酒精含 量对酵母菌的正常生长影响很大，普通酵母在乙醇浓度达1 1 左右时，发酵完全 受到抑制【1 3 】。不能在高糖条件下良好发酵( 即不能耐高渗透压) 的菌株，其产酒率 必然大受影响。所以有必要筛选出渗透压耐性相对较高的菌株，这样可以很好的 为酒精工业的生产服务。 目前耐高渗酵母菌株筛选的报道已有不少，但是大部分都是耐高浓度酒精酵 母菌株的选育，只查到一篇耐高温耐高糖酵母的筛选与驯化。 耐高渗酵母除了在酒精工业方面的应用，在食品工业以及生物工程方面的应 用也越来越广泛，其具体应用可以归结为以下几个方面：( 1 ) 生产甘油【i 引，渗 透压升高时酵母细胞内甘油的累积。当处于高渗环境中时，大多数种类的酵母细 胞在细胞内累积相容性溶质甘油以利于调节渗透压的平衡。( 2 ) 赤藓糖的生产u o 1 7 , 3 2 - 2 3 1 ，赤藓糖醇是一种适度的甜味增量剂，甜度为蔗糖的6 0 - - , 7 0 ，它具有防 止龋齿、适宜糖尿病患者食用、低能量值和高耐受量等特点，可作为功能性保健 食品开发。1 9 5 6 年，加拿大s p e n c e r j f t 等在研究高渗酵母产生甘油时，发现因 菌种生长速度、培养条件不同，可产生赤藓糖醇。8 0 年代，日本农水省食品综合 研究所与日研化学( 株) 共同研究开发成功赤藓糖醇生产技术，已有产品上市，目 前国内尚属空白。( 3 ) 固定化酵母生产乙醇f 2 4 2 5 1 。( 4 ) 避免生产过程中污染杂菌， 可以通过提高糖度来抑制杂菌，这就要求酵母菌耐高渗，耐高渗酵母菌可以满足 这一要求。 1 3 酵母菌的选育 1 3 1 酵母菌的自然选育 酵母菌在自然界中存在范围非常广泛，成熟水果的果皮、果梗、鲜榨果汁、 果园附近的土壤、空气、发酵醪中以及果酒加工厂的设备和环境中都能分离得到。 往往从自然界直接分离的菌种，一般而言其发酵活力都是比较低的。不能达到工 业生产的要求，因此要根据菌种的形态生理特点来改良菌种。 微生物菌种选育在发酵工业中占据极其重要的地位，是决定该发酵产品能否 具有工业化价值及发酵过程成败与否的关键【2 6 】。酵母菌种改良的方法一般包括 自然突变株的筛选、人工诱变、杂交、原生质体融合和基因工程等方法1 2 7 。 由于自然突变频率低，一般在1 0 币 1 0 9 间，变异程度较轻微，育种成功率相对 较低【2 8 l 。单纯依赖自然界存在的微生物群体来进行的自然选育无疑有很大局限 性。所以进行了菌种驯化和人工诱变选育，取得了很大效果。 进行菌种驯化时，根据所要达到的目标，设置特定的培养条件，反复培养分 离，直至达到预定的目标。工业上的菌种驯化工作主要是从克服环境的影响方面 来进行的，如温度、p h 、酸度、糖度等各种胁迫环境，使之适应工业发酵要求， 提高产酒率，促进发酵过程的顺畅，减少不必要的产物【2 9 3 们。宋安东等从耐 酒精度和糖度性能上对酵母菌进行了驯化，驯化后得到了可以耐3 5 高糖、耐 2 5 酒精的菌株。罗惠波等【3 2 】通过对酵母菌进行耐酸驯化，分离得到了兼性耐 酸性酵母菌，能在p h 4 的环境下继续表现出较强发酵能力。 1 3 2 酵母菌的紫外诱变育种 4 诱变育种是以人工诱变基因突变为基础的，过去是工业微生物育种的主要方 法，至今仍是世界各国行之有效的重要方法，尤其发酵工业中的各种优良高产菌 株绝大部分都是以诱变育种方法获得的。 凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化 学物质，成为诱变剂( m u t a g e n ) 。它们包括物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变 剂三大类【2 6 1 。酵母的选育有很多的新技术，如采用理化因素的诱变育种，原生 质体融合技术的育种，基因工程技术手段等。此外，其它学科的先进技术在育种 方面的应用，也提高了分离菌株的生产性能。通过用物理因素或化学因素获得诱 变菌株是较简单的直接改良酵母菌株的方法，应用广泛的物理手段有紫外线、x 射线、丫射线等，化学手段有硫酸二乙酯( d f s ) 、5 溴尿嘧啶( 5 b u ) 、氮芥( n m ) 、 亚硝基胍( n t g ) 等。 紫外线是一种使用最早、应用广泛、沿用最久、效果明显的物理诱变剂。紫 外线诱变的诱变频率较高，且不易回复突变。这种方法在工业微生物育种史上曾 经发挥过极其重要的作用，至今仍然是微生物育种中最常用和有效的诱变剂之 一。并且紫外线诱变育种具有方便、经济的特点【矧。 紫外线的光谱范围在4 0 - - 3 9 0 n m ，而d n a 可以吸收的紫外线光谱通常为 2 6 0 n m 。因此，诱发微生物突变的紫外线的有效波长范围是2 0 0 - 3 0 0 n m 。而最有 效的波长为2 5 3 7 n m ( 2 5 3 7 a ) 。这一波长的诱变效应相当于波长2 6 0 n m 的紫外线。 紫外线照射微生物细胞时，d n a 大量吸收2 6 0 n m 光谱，从而引起突变或杀伤作用。 用来灭菌消毒的3 0 w 紫外灯管，光谱分布范围广，较平均，因此诱变效率较差。 而1 5 w 紫外灯管，放射出来的紫外线大约有8 0 波长集中在2 5 3 7 a ，因此诱变效 应要比3 0 w 的好。 紫外线是一种非电离辐射，能使被照射物质的分子或原子中的内层电子提高 能级跃迁到能量高的外层轨道( 称为激发) ，导致分子的理化变化。d n a 分子上 的碱基对强烈吸收紫外线，而且嘧啶比嘌呤敏感1 0 0 倍。紫外线辐射能引起d n a 链的断裂、d n a 分子内和分子间的交联、核酸与蛋白质的交联，以及胞嘧啶和 尿嘧啶的水合作用等，但最主要的则是形成嘧啶二聚体，他会阻碍双链的解链和 复制，阻碍碱基的正常配对，从而导致基因突变。它的遗传效应主要是引起 g - c - - - - ，a t 的转换或移码突变。由于存在光复活作用，即白光照射能活化光激活酶， 并将嘧啶二聚体解开而使d n a 恢复正常，故辐照和处理后的培养应避免可见光 照射( 应在红光下操作) 3 4 _ 5 1 。 紫外诱变操作简单，且出现正突变的几率比较高，酵母菌株的诱变大多采用 这种方法1 3 6 1 。有关酵母菌紫外诱变的研究报道有很多。包括诱变条件的研究、 不同酵母菌株的诱变研究、不同目标酵母菌的诱变研究、紫外诱变和其他选育手 t 段相结合的研究等。张国华【3 7 】等对酵母菌紫外诱变时洗涤液与离心转速的选择 进行了研究。李国保【3 8 】等研究了产虾青素海洋酵母菌y s 1 8 5 原生质体制备与紫 外诱变，诱变出y s 1 8 5 1 9 突变株，其色素产量较出发菌株提高y 9 3 4 。范元发 【3 9 】通过对酵母菌株y s 5 的原生质体进行紫外诱变，选育出适合甘蔗汁发酵的高产 酒精酵母。 1 3 3 原生质体诱变育种 原生质体是指用酶学方法使细胞壁溶解后释放出来的那些只有半透性细胞 质膜包裹着的球状体。它们虽然没有细胞壁，但仍然具有和完整细胞基本相同的 生理、生化和遗传特性，并且在合适的条件下能再生细胞壁，回复成为一个完整 的细胞。原生质体技术包括原生质体诱变、原生质体融合、原生质体再生和原生 质体转化或转染等【埽】。 原生质体诱变是以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学处理，然后 分离到再生培养基中再生，最后从再生茵落中筛选高产突变菌株。它是一种行之 有效的育种新技术。 常规诱变育种为防止表型延迟和严重的遗传分离现象，一般采用单孢子为诱 变出发材料，以避免后代菌落不纯或突变基因隐性而被漏选。而孢子壁结构致密， 不利于诱变剂向核内渗透，而诱变剂作用却需要一定浓度的诱变剂内渗，直接与 核中d n a 分子接触、反应，这样才能达到目的；另一方面，诱变效果与细胞代 谢活跃程度关系极大，只有代谢活跃，d n a 处于复制状态才有利于诱变剂与d n a 分子作用，才能导致基因突变。孢子代谢缓慢，则会造成基因突变频率较低或因 表型延迟效应而漏筛。 利用去壁后的微生物原生质体作为诱变出发材料能弥补这两方面的不足，去 壁后的原生质体外层仅存细胞膜，在诱变过程中直接与诱变剂接触，诱变剂能够 迅速内渗并与核作用。而且通常选对数生长期的细胞作为制备原生质体的材料， 代谢旺盛，复制频繁，生活力强，可以提高对诱变剂的敏感性。原生质体是单个 细胞，与诱变剂接触面积大。同时，诱变后易于形成单个菌落，分离筛选方便； 其次，原生质体具有细胞壁再生能力，又保持细胞全能性，可按正常细胞诱变方 式进行诱变【2 6 】。 对于酵母菌细胞来讲，细胞壁较厚，常规的直接照射法不是很理想，这很 大程度上是由于细胞壁的辐射穿透性。所以我们直接对原生质体诱变，比用原生 质体融合方法育种更为简便，是一种酵母菌育种的好方法【4 l j 。紫外线辐射对细 胞壁穿透性较低，因此把两种方法结合起来就会大大提高突变率：紫外线处理酵 母菌原生质体。通过诱变时的对照实验，可以看到原生质体诱变正突变株大大高 于菌体细胞诱变。从其产量变化幅度来看，原生质体诱变的正突变幅度也大大高 6 一飞 于菌体细胞诱变，说明原生质体诱变较菌体细胞诱变效果好【4 2 】 早在二十年代初o i a j a 就开始了从细胞中除去细胞壁制备原生质体的工作。 五十年代n e o e s 阐明了原生质体能够再次合成细胞壁再生成原来的细胞【4 2 。k i m 等于1 9 8 3 年首先采用该法诱变玫瑰色小单孢菌( m i c r o m o n o s p o r am s a r i a ) 取得成 功以来，应用逐渐广泛，已在酶制剂、抗生素、有机酸及维生素等高产菌株的选 育中起到极其重要的作用。1 9 8 6 年，诸葛健将蛋白酶产生菌种间融合子f 1 2 6 2 株的菌体细胞与原生质体分别用紫外线照射诱变，结果表明产酶的正变幅度以原 生质体诱变者明显。并且从原生质体诱变处理后，筛选出一株产酶提高2 0 3 0 的f p u - 6 1 8 株。陶文沂在对钝齿棒杆菌a s i 5 4 2 原生质体紫外线和d e s 处理 时，原生质体正突变率高于菌体细胞，选出一株产量高于原菌株4 0 的菌株【4 3 1 。 酿酒工业一般要求所使用的酵母具有耐高温低温、耐酒精、耐s 0 2 ，高产酒 精、糖化能力强、嗜杀、产香、絮凝性好等优良的生产性状。生产不同产品所需 的酵母性状有所不同，但每一种产品的生产都需要具有多种优良性状的菌种，而 真正具有多种优良性状的菌株又寥寥无几。应用原生质体融合技术，实现多种优 良性状的整合，构建出理想的酵母菌株，将对酿酒工业的发展具有重要的意义。 而且，通过原生质体融合技术进行优良酵母菌选育的同时，还可以通过对融合子 的遗传分析，研究产量性状的表达机制，各种性状之间的影响以及各种代谢途径 中关键控制酶的作用，从而更加深入的研究酵母的发酵性能，提高生产效率。 1 4 酒精发酵研究现状 当前我国酒精行业面临的最大课题是原料、成本和污染3 个问题 4 4 j 。利用生 物技术选育能直接发酵纤维素、半纤维素的菌株，以及耐高温酵母m j 、抗杂菌 酒精发酵菌等 4 6 1 。解决发酵酒精原料的根本出路在于利用纤维原料代替粮食， 如秸秆、麦秆等【4 7 1 ；酒精生产与饲料生产相结合1 4 钔。节能应放在原料粉碎、蒸 煮、蒸馏等工序技术革新和改造上，发酵过程优化上。 目前，发酵生产工业酒精的菌种主要以酵母菌为主。通过糖酵解途径，酵母 菌将葡萄糖高效转化为乙醇和二氧化碳，生产的酒精占理论产量的9 0 - - - 9 5 。 酵母菌的种类很多，包括有孢子酵母、产冬孢子的类酵母、掷抱酵母和无孢子酵 母等，含盖6 0 个属5 0 0 多个种【1 1 。工业上常用的酒精发酵菌株有k 字酵母、南阳1 3 0 0 酵母、南阳1 3 0 8 酵母、拉斯2 号、拉斯1 2 号、古巴i 和古巴i i 等等，均属于酿酒 酵母( s c e r e v i s i a e ) 。酒精生产中对酵母菌菌株的生理特性有一定的要求 4 9 1 ：( 1 ) 发酵力强而且迅速，有较强的酒化酶；( 2 ) 繁殖速度快，有较强的增殖能力；( 3 ) 耐酒精能力强，能在较高浓度的酒精发酵醪中发酵；( 4 ) 耐温性能好，能在较高 温度下发酵；( 5 ) 抵抗杂菌能力强；( 6 ) 耐酸能力强；( 7 ) 生产性能稳定，变异性小， 7 发酵时产生泡沫小。 除此之外，生产燃料酒精的高浓度酒精发酵技术被定义为每升发酵醪含3 0 0 9 以上可溶性固形物。这里是指绝干的谷物在醪液中的百分比，若考虑玉米的平衡 水分为1 4 ，3 0 的可溶性固形物即料水比l ：1 8 5 左右，这样高浓度的醪液要求 用来发酵的酵母菌具备耐高糖的特性。 发酵工序改革和改造上，如边糖化边发酵( s s f ) ，p e e v a 5 0 】用已有的模型对 s s f 过程进行了模拟，计算结果与实验很吻合。集液化、糖化、发酵于一体的生 料发酵工艺。新的发酵技术还有固定化发酵1 5 1 - 5 4 】、真空发酵、萃取发酵、气提发 酵、膜分离技术、固态发酵【”】等。但目前制约、限制的因素很多，短期还难以 实现工业化。 发酵过程优化指的是在已经提供的菌种或基因工程构建基础上，在生物反应 器( 发酵罐) 中通过操作条件的研究，或发酵罐装备的选型改造，达到发酵产品 生产最优，即生产能力最大，成本消耗最低或产品质量最高。 1 9 9 0 年，t h o m a s 等人【5 6 】通过辅加酵母抽提物、酪蛋白水解物或一个单一氨 基酸如谷氨酸来刺激酵母生长和缩短发酵时间。发酵时间从8 d 减为3 d ，最终酒精 含量为1 7 1 。1 9 9 2 年，t h o m a s 等人【5 7 】通过增加接种量，