（食品科学专业论文）耐热β半乳糖苷酶的克隆与表达研究.pdf

摘要耐热1 3 i 半乳糖苷酶的克隆表达研究学科、专业：工科、食品科学入学时间：2 0 0 7 年9 月1 日硕士研究生姓名：王霁昀答辩时间：2 0 0 9 年1 2 月1 3 日指导教师：陈卫教授授予学位时间：摘要p 半乳糖苷酶( e c 3 2 1 2 3 ) 俗称乳糖酶，该酶能水解p 1 ，4 糖苷键在乳品加工中常用于水解牛奶中的乳糖制备低乳糖奶，可有效缓解人体乳糖不耐症，促进乳品工业的发展。耐热p 半乳糖苷酶，或称高温乳糖酶，以其良好的热稳定性和较高温度下的水解特性使之具有常温乳糖酶无法比拟的优越性。近年来，高温乳糖酶尤其是细菌来源的中性、耐热乳糖酶成为研究的热点。本文围绕一种来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热d 半乳糖苷酶( b g a b ) ，从基因克隆、表达及分泌等方面进行了较为深入的研究。枯草芽孢杆菌是一种食品级微生物，在食品生产中有很好的应用前景。本文选用实验室己构建的含有不同信号肽的枯草芽孢杆菌质粒，将b g a b 基因插入到四种质粒表达单元中进行重组表达，其中重组菌株w b 6 0 0 p m a w p r a b g a b 摇瓶发酵的最高酶活达到0 3 7u m l ，实现了b g a b 在枯草芽孢杆菌中的表达。本文尝试了b g a b 在毕赤酵母中的表达。构建p p i c 9 k 。b g a b 重组质粒，电转化到毕赤酵母g s l l 5 中构建重组转化子，用含g 4 1 8 的y p d 平板筛选多拷贝转化子，并验证重组转化子的正确性后，用甲醇诱导发酵表达目的基因。结果在发酵后的菌液破壁上清液中检测到耐热乳糖酶的酶活，最高活性为0 2 6u m l ，s d s p a g e 电泳也在7 0k d 处检测到目的条带，表明b g a b 基因在毕赤酵母中得到了表达。乳酸克鲁维酵母表达系统也是近年来研究的热点，本文构建重组质粒p k l a c l b g a b ，电转化到乳酸克鲁维酵母g g 7 9 9 中构建重组转化子，验证重组转化子正确性后进行发酵表达。结果在发酵后的菌液破壁上清液中检测到耐热乳糖酶的酶活，最高活性为0 0 6 8u m l ，s d s p a g e 电泳也在7 0k d 处检测到目的条带，表明b g a b 基因在乳酸克鲁维酵母中得到了表达。本文研究了b g a b 基因在三种不同表达系统中的表达情况，结果表明b g a b 基因在枯草芽孢杆菌中的表达效果要优于真核表达系统，达到了0 3 7 1u m l ，并首次实现了b g a b基因在真核表达系统中的表达。达关键词：耐热p 半乳糖苷酶；枯草芽孢杆菌；毕赤酵母；乳酸克鲁维酵母；重组表a b s t r a c ta b s t r a c t1 3 - g a l a c t o s i d a s e ( e c 3 2 1 2 3 ) ，a l s oc a l l e dl a c t a s ew h i c hc a l lh y d r o l y z ep l ，4 一d - g a l a c t o s i d i cl i n k a g e ，a r ei n d u s t r i a l l yi m p o r t a n tf o rt h e i ra p p l i c a t i o n si np r o d u c i n gl a c t o s e f r e em i l kw h i c hc a ne l i m i n a t et h el a c t o s e i n t o l e r a n c eo fh u m a nb e i n g s c o m p a r e dt ot h em e s o p h i l i ce n z y m ef r o mk l u y v e r o m y c e sl a c t i s ，t h e r m o s t a b l e1 3 - g a l a c t o s i d a s e sf r o mb a c t e r i u mw i t ho p t i m u mp hv a l u en e a rn e u t r a la r ep r e f e r a b l ew i t ht h e i rg o o dt h e r m o p h i l i c i t ya n dt h e r m o s t a b i l i t yi np r a c t i c et op r e v e n tm i c r o b i a lc o n t a m i n a t i o n ，t os a v ee n e r g ya n de q u i p m e n ta n d ，t om a k eo p e r a t i o n sw i t h i no n es h i f t i nt h i sp a p e r t h eg e n eb g a bf r o mb a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u se n c o d i n gt h et h e r m o s t a b l e1 3 - g a l a c t o s i d a s ew a sc l o n e da n de x p r e s s e di ns e v e r a ls y s t e m s t h ee n z y m ep r o p e r t i e sa n dt h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h er e c o m b i n a n ts t r a i n sw e r ea l s od i s c u s s e di nd e t a i l s b a c i l l i u ss u b t i l & i saf o o dg r a d ee x p r e s s i o ns y s t e m b g a bg e n ew a si n s e r t e di n t ot h ef o u rd i f f e r e n ts h u t t l ee x p r e s s i o nv e c t o r sa n dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r et r a n s f o r m e di n t ob a c i l l i u ss u b t i l i sw b 6 0 0b ye l e c t r o p o r a t i o n r e c o m b i n a n ts t r a i n sw e r eo b t a i n e dt h r o u g hl bp l a t es c r e e n i n gw i t hk a n a r n y c i n t h ee n z y m ea c t i v i t yo ft h er e c o m b i n a n ts t r a i nw b 6 0 0p m a w p r a b g a br e a c h e dt o0 3 7u m l ，a n dt h es d s p a g es h o w e dt h a tt h em o l e c u l a rw e i g h tw a sa b o u t7 0k d a i nt h i sw o r k ，b g a bg e n ew a si n s e r t e di n t ot h es h u t t l ee x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 kt oc o n s t r u c tr e c o m b i n a n tp l a s m i dp p i c 9 k b g a b t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t op i c h i ap a s t o r i sg s115b ye l e c t r o p o r a t i o n t r a n s f o r m a n t sw e r eo b t a i n e dt h r o u g hm dp l a t ea n dg 418p l a t es c r e e n i n g a f t e rt h ei n d u c t i o no fm e t h a n o l ，t h ee n z y m ea c t i v i t yo fr e c o m b i n a n tp i c h i ap a s t o r i ss t r a i nr e a c h e dt oo 2 6u m l ，a n dt h es d s p a g es h o w e dt h a tt h em o l e c u l a rw e i g h tw a sa b o u t7 0k d a b g a bg e n ew a si n s e r t e di n t ot h es h u t t l ee x p r e s s i o nv e c t o rp k l a c1t oc o n s t r u c tr e c o m b i n a n tp l a s m i dp k l a c1 - b g a b n l er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t ok l u y v e r o m y c e sl a c t i sg g 7 9 9b ye l e c t r o p o r a t i o n t r a n s f o r m a n t sw e r es c r e e n e d a f t e rf e r m e n t a t i o n ，t h ee n z y m ea c t i v i t yo fr e c o m b i n a n tk l u y v e r o m y c e sl a c t i ss t r a i nr e a c h e dt o0 0 6 8u m l ，a n dt h es d s p a g es h o w e dt h a tt h em o l e c u l a rw e i g h tw a sa b o u t7 0k d a i nt h i sw o r k ，t h ee x p r e s s i o no fb g a bw a ss t u d i e di nt h r e ed i f f e r e n te x p r e s s i o ns y s t e m s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fb g a bi nb a c i l l u ss u b t i t l e ss y s t e mw a sb e t t e rt h a ne u k a r y o t i ce x p r e s s i n gs y s t e m ，t h ee n z y m ea c t i v i t yr e a c h e dt oo 3 71u m l ，a n dt h i sw o r kr e a l i z e dt h ee x p r e s s i o no fb g a bi ne u k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e mf o rt h ef i r s tt i m e k e y w o r d s ：t h e r m o s t a b l eb e t a - g a l a c t o s i d a s e ，b a c i l l u ss u b t i t l e s ，k l u y v e r o m y c e sl a c t i s ；p i c h i ap a s t o r i s ，r e c o m b i n a n te x p r e s s i o ni i独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。签名：日期：塑2 垒! 关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。签名：晦鱼导师签名：日期：型乞! 鱼堑绪论绪论1 1b 半乳糖苷酶简介1 1 11 3 - 半乳糖苷酶p 一半乳糖苷酶( 1 3 一g a l a c t o s i d a s e ) ，也称为p d 半乳糖苷半乳糖水解酶( p - d - g a l a c t o s i d eg a l a c t oh y d r o l a s e ，e c 3 2 1 2 3 ) ，其商品名为乳糖酶( l a c t a s e ) ，是一种重要的糖苷水解酶，在食品工业中有很广泛的用途【i j 。1 1 2b 半乳糖苷酶的来源p 半乳糖苷酶来源十分丰富，其主要的来源有：动物的皮肤和肠道组织，如鼠、小牛等【2 3 】，另外，植物的茎叶和种子中也有这种酶h 7 】；无论是动物中还是植物中的d 半乳糖苷酶，其数量和类型都不如微生物来源的半乳糖苷酶丰富，能合成d 半乳糖苷酶的微生物非常多，细菌、酵母菌和霉菌中许多属种都能合成。表1 1 列出一些d 半乳糖苷酶的主要来源【引。表1 - 13 - 半乳糖苷酶的主要来源t a b l e1 - 1m a i ns o u r c eo fp g a l a c t o s i d a s es o u r c es o u r c ep l a n t ：p e a c hy e a s t ：k l u y v e r o m y c e sl a c t i sa p r i c o tk l u y v e r o m y c e sl a c t i sf r a g i l i sa i m o n dc a n d i d ap s e u d o t r o p i c a l i sk e f i rg r a i n sb r e u a n o m y c e sa n o m a l u sa l f a l f as e e dw i n g e ar o b e r s t m ic o f f e eb e r r i e sa n i m a l ：i n t e s t i n eb a c t e r i a ：e s c h e r i c h i ac o l ib r a i nb a c i l l u sm e g a t e r i u ms k i nt i s s u et h e r m u sa q u a t i c u sf u n g u s ：n e u r o s p o r dc r a s s as t r e p t o c o c c u sl a c t i sa s p e r g i l l u s f o c u d u ss t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u sa s p e r g i l l u sn i g e rl a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u sa s p e r g i l l u s f l a v u sl a c t o b a c i l l u sh e l v e r i c u sa s p e r g i l l u so r y z a el a c t o b a c i l l u ss p o r o g e n e sa s p e r g i l l u sp h o e n i c i sb a c i l l u sc i r c u l a n sm u c o rp u c i l l u sb a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s草芽孢杆 葑( b a c i l l u ss u b t i l e ) 1l , 1 2 、巨大芽孢杆1 翥( b a c i l l u sm e g a t e r i u m ) 1 1 3 , 1 4 、乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s ) t 1 5 - 1 7 , 乳链球菌( 铆印幻c d c c 淞l a c t i s ) 1 8 1 9 1 、双歧杆菌( b 扩c 扬6 口c 纪，f ”所) 【2 0 - 2 4 1 、乳酸克鲁维酵母( k l u y v e r o m y c e sl a c t i s ) 2 5 - 2 8 、乳酸脆壁酵母( k l u y v e r o m y c e sl a c t i sf r a g i l i s ) 2 9 - 3 1 1 、黑曲霉( 4 印p 曙f 刀淞n i g e r ) 3 2 以】、米曲霉口印p ，g f 盯姗o r y z a e ) 1 3 5 1 3 6 1 等。江南大学硕士学位论文近年来，随着乳品工业对乳糖酶的需求越来越高，一些高温菌及中温性细菌乳糖酶的研究也日益引起重视，例如，硫磺矿硫化叶菌( 舰珈l o b u s 阳伽t a r & u s ) p7 。、凝结芽孢杆菌( b a c i l l u sc o a g u l a n s ) 3 8 】、嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) 3 9 】、嗜热脂肪芽孢杆菌( b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s ) t 4 0 1 、嗜热栖热菌( t h e r m u st h e r m o p h i l u s ) t 3 o l 、环状芽孢杆菌( b a c i l l u sc i r c u l a n s ) 1 4 4 等。1 1 3l i - 半乳糖苷酶的应用b 半乳糖苷酶具有较强的糖苷水解作用，在食品、医药和分析化学领域具有重要的用途。1 9 9 8 年，中国食品添加剂标准化委员会通过将p 半乳糖苷酶列为食品添加剂新品种的决定，这一决定为乳糖酶在我国食品工业中推广应用奠定了基础嘲j 。1 1 3 1b 半乳糖苷酶是解决乳糖不耐症的有效途径牛乳是食品工业中一种重要的食物资源，它含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物，还含有全部已知的维生素和多种矿物质。牛奶中的钙含量非常丰富，约为1 1 0 1 2 0m e , 1 0 0g ，更重要的是，牛奶中的钙磷比例适当，易被人体消化吸收，被誉为“近乎完善的食物”。但是，人群中的乳糖不耐症比例较高，由于其高发生率使得众多普通人不能长期摄入牛奶，乳糖不耐症的发病率白种人中比例约为1 0 ，印第安人5 0 ，非裔加勒人8 0 ，亚洲人约为7 0 【6 5 】。所谓乳糖不耐症，指的是由于人体小肠内缺乏分解乳糖的b 半乳糖苷酶，因而在饮用牛乳或食用含乳糖的食品后会引起对乳糖不耐受的非疾病性症状，这些症状主要表现为：消化不良、呕吐、急性腹痛、腹胀、肠鸣、甚至腹泻等畔j 。据额纪贤等( 1 9 8 7 ) 6 6 】报道，在我国，成年人饮用牛乳后乳糖吸收不良的发病率高达8 6 7 ，不耐受指数为0 9 。由上述数据可见，乳糖不耐症的高发率已严重影响了国人的体质以及乳品工业的快速发展。采用p 半乳糖苷酶能够有效地水解牛乳中的乳糖，从而生产低乳糖牛奶。另外，服用含特殊菌的牛奶，或在饮用牛奶的同时服用d 半乳糖苷酶片，也可以克服乳糖不耐症的问题1 6 。1 1 3 2 在乳清处理中的应用乳清中含有乳清蛋白、乳糖、矿物质和维生素等营养成分，是很重要的食品工业原料。乳清的世界年产量约为9 0 0 0 万吨，其中5 0 当作废水排放，对环境的污染比较严重。b 半乳糖苷酶可以将乳清中的乳糖水解，用水解乳糖后的乳清制作饲料可以提高乳清饲料的营养价值，另外，乳清浓缩时会产生乳糖结晶析出的现象，给饲料加工带来很大的不便，用d 半乳糖苷酶去除乳糖后可以大大改善这一现象。此外，用此乳糖酶水解后的产物还可以生产乳清饮料、糖浆、食品添加剂等1 6 引。1 1 3 3 在乳制品加工中的应用d 半乳糖苷酶应用于乳品加工业有很多用途，首先，可以提高- ? l 铜j 品的甜度。乳糖的甜度较低，只有蔗糖的1 6 。乳糖经过d 半乳糖苷酶水解后可以得到一分子葡萄糖和一分子半乳糖，这两种单糖的甜度都高于乳糖，所以可以明显提高乳制品的甜度，从而减少甜味剂的用量，同时还不增加食品的热量【6 9 】。其次，d 半乳糖苷酶可以防止乳制品在冷冻时发生结晶现象，这是因为乳糖的溶解度较低，只有蔗糖的1 0 ，在制作冷冻乳制品时，乳糖容易结晶析出，例如冰激凌的制造，这会大大影响产品质量。如果在加工2绪论中添加2 5 3 0 经乳糖水解后的水解乳，就可以有效的解决这类问题【7 0 1 。另外，d 半乳糖苷酶可以应用于酸乳的制作中，用乳糖酶水解乳制作酸乳比使用普通脱脂乳省时且节省蔗糖用量，而且能改善酸乳风味和口感，并延长酸奶的货架期。陈小真等( 1 9 9 8 ) 用酵母乳糖酶水解乳( 乳糖水解率7 0 左右) 制作酸奶，其研究表明，凝乳时间、产酸速度和p h 下降均比普通脱脂乳快，并且对乳酸菌的生长没有明显影响。1 1 3 4 用于低聚半乳糖的生产利用p 半乳糖苷酶的转糖苷作用，以牛乳或乳清中的乳糖为底物，可以生成低聚半乳糖( g a l a c t o o l i g o s a c c h a r i d e ) 。低聚半乳糖具有许多重要的生理功能，它可以抑制有害菌群、促进益生菌的生长，另外还有促进钙吸收，改善血清中的脂质等作用1 7 3 】。r o b e r t s等( 1 9 5 1 ) 7 2 j 首次报道了在用乳糖酶水解乳糖过程中低聚糖的存在。1 1 3 5 在医药工业中的应用b 半乳糖苷酶可以作为酶类药物，适用于治疗婴儿的各种消化不良症，例如由胃障碍及缺铁所致的幼儿慢性腹泻、先天性乳糖酶缺乏症、幼儿及新生儿腹泻以及由感冒和消化不良等引起的继发型腹泻。当它加入牛奶中则可防止乳糖不耐症【7 4 】。1 1 3 6 在生化分析中的应用将d 半乳糖苷酶和过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等联合使用可以分析各种乳制品中乳糖的含量。这种方法可以在不除去样品中蛋白质的情况下应用【7 5 l 。b 半乳糖苷酶还可以用于生化分析仪上，在临床化学实验室可以用于测定血清钠等1 7 6 】。1 1 3 7 在酶联免疫反应( e l i s a ) 中的应用b 半乳糖苷酶经戊二醛一步标记抗人i g g ，建立e l i s a 测定程序，已用于人i g g 、人群破伤风抗体、单克隆抗体检测，获得满意效果。同时还可用于孕酮、皮质醇半抗原标记，初步建立了该酶的液相竞争测定程序。近年来，又有此酶大分子底物合成的报道，因此d 半乳糖苷酶不仅可用作超微量荧光酶联分析，而且还可以在酶放大免疫测定( e m i t ) 和底物标记荧光分析( s l f i a ) 中应用【77 1 。表1 - 2 乳糖酶在食品加工中的用途t a b l e l - 2t h ea p p l i c a t i o n so f1 3 - g a l a c t o s i d a s ei nf o o di n d u s t r y产品应用低乳糖牛奶发酵乳制品乳清产品冰激凌奶粉奶酪低聚半乳糖克服乳糖不耐症，提高牛乳甜度和口感提高发酵速度和效率，改善风味和甜度节省蔗糖的用量，扩大其在食品行业中的应用，提高发酵速度抑制乳糖结品结霜，节省蔗糖用量改善牛奶的风味和水溶性改善奶酪质量低聚半乳糖的合成3江南大学硕士学位论文1 2 高温b 半乳糖苷酶的研究1 2 1 高温酶的应用高温微生物存在于相对极端的环境中，近年来逐渐成为研究的热点。由于细胞的节约机制与中温微生物不同，酶蛋白合成水平也较低，所以在应用高温酶时，通过传统的蛋白分离纯化手段得到目的产物比较困难。而基因克隆技术成为研究这类蛋白性质的一种重要手段。目前高温乳糖酶基因克隆研究多以文库筛选、产物纯化、序列报道和性质研究为主。1 2 2 嗜热脂肪芽孢杆菌b 半乳糖苷酶的基因嗜热脂肪芽孢杆菌d 半乳糖苷酶的基因b g a b 在g e n b a n k 中己有公开报道。其基因编码区全长2 0 1 6b p ，对应氨基酸个数为6 7 2 个，推算其分子量约为7 8 0 5 1 道尔顿。来自于嗜热脂肪芽孢杆菌的这种耐热乳糖酶，具有良好的热稳定性和适宜较高温度水解的特性，有常温乳糖酶无法比拟的优越性。b g a b 基因表达的乳糖酶属于糖苷酶g h 4 2 家族，其最适作用温度和最适作用p h 值均适合乳制品加工的最佳工艺条件，具有很好的工业应用前景。1 3 枯草芽孢杆菌表达系统及毕赤酵母表达系统1 3 1 枯草芽孢杆菌表达系统枯草芽孢杆菌是一种重要的工业微生物，其遗传学和生理学特性已得到深入研究，人们对其遗传背景和生理特性的了解仅次于大肠杆菌。从2 0 世纪8 0 年代以来，枯草芽孢杆菌作为一种遗传操作工具已经被深入的研究和应用，例如质粒载体p u b l l 0 和p c l 9 4 是两种应用较为广泛的枯草芽孢杆菌质粒。与大肠杆菌相比，枯草芽孢杆菌表达系统有明显的优势。首先，它是一种安全的表达系统，具有很强的蛋白质分泌功能，另外，枯草芽孢杆菌没有明显的密码子偏爱性，其发酵条件简单，产物易于分离纯化，是理想的表达系统。1 3 2 真核表达系统研究进展近年来，酵母表达系统引起了广泛的重视并逐渐被用于外源蛋白的表达。它既有像原核细胞系统生长快、便于基因操作和可大规模培养等优点，同时又有真核细胞具备的翻译后加工、糖基化修饰能力，能生产有生物活性的重组蛋白等诸多特点【_ 7 9 j 。甲醇诱导毕赤酵母表达系统和乳酸克鲁维酵母表达系统都是真核表达系统中优秀的代表，近年来陆续有学者使用它们表达外源蛋白并获得成功8 0 培2 1 。毕赤酵母用甲醇作为诱导剂，可以高水平表达外源蛋白；乳酸克鲁维酵母已长期用于工业生产，有超强的分泌能力和整合表达能力，并且是食品安全级表达系统，把它们作为宿主系统表达外源蛋白已显示出巨大的潜力。1 3 3 已经进行的研究嗜热脂肪芽孢杆菌耐热p 半乳糖苷酶的表达量低，为胞内产物，而且嗜热菌的培养条件也较为特殊，不适合工业化生产的要求，采用基因工程技术构建耐热p 半乳糖苷酶的高产菌株可以克服这些缺点。本实验室已经从一株嗜热脂肪芽孢杆菌中扩增得到了一段编码耐热半乳糖苷酶的基因b g a b ，并且已经实现了b g a b 基因在大肠杆菌和枯草芽孢4绪论杆菌中的表达 4 7 - 4 9 1 ，但是b g a b 的分泌表达一直没有很好的实现，并且从未在真核表达系统中表达b g a b 基因，本实验将对b g a b 基因进行进一步的克隆和表达研究。1 4 本文的立题背景主要研究内容1 4 1 课题的立题背景与意义基于前文的阐述，耐热p 半乳糖苷酶存在着巨大应用的潜力，然而嗜热脂肪芽孢杆菌耐热p 一半乳糖苷酶的表达量低，且为胞内产物，而且嗜热菌的培养条件也较为特殊，不适合工业化生产的要求，因而，如何大量获得耐热p 半乳糖苷酶是其走向工业化必须解决的问题。自从2 0 世纪6 0 年代后期发明了体外d n a 序列操作技术以来，通过重组d n a 技术可以获得大量的用常规蛋白分离技术无法得到的高价值的蛋白，酶学的基础研究和应用研究随之发生了革命性的变化。通过基因工程技术实现酶的大量生产是简便可行的，本实验室已经成功克隆出b g a b 基因，并在大肠杆菌中实现了表达。但是大肠杆菌不是食品工业合适的生产菌株，枯草芽孢杆菌和真核的酵母表达系统都在蛋白表达纯化方面获得了广泛的应用，为了实现b g a b 基因在工业生产上的应用，本课题将尝试在三种不同的表达系统中实现b g a b 基因的分泌表达。1 4 2 主要研究内容1 研究耐热p 。半乳糖苷酶基因在枯草芽孢杆菌表达系统中的表达，并使用四种不同的枯草芽孢杆菌信号肽，比较其表达效果。2 研究耐热b 半乳糖苷酶基因在真核系统中的表达，将b g a b 基因整合到毕赤酵母基因组上，诱导表达b g a b 基因。3 研究耐热d 半乳糖苷酶基因在食品安全级酵母菌乳酸克鲁维酵母表达系统中的表达。材料与方法材料与方法2 1 实验材料2 1 1 菌株和质粒本实验所用菌株和质粒见表2 1 。b g a b 基因来源于嗜热脂肪芽孢杆菌，其核酸序列和氨基酸序列见附表。表2 - 1 菌株与质粒t a b 2 - 1s t r a i n sa n dp l a s m i d s2 1 2p c r 引物表2 - 2 引物设计亿l b l e 2 2p r i m e r s名称序列b s1 ：5 - g c c g c c 鱼笪匹! a t g a a t g t g t l 盯c c t c a a - 3 b s 2 ：5 - g 硷q 丛c t a a a c c t t c c c g g c - 3 p p l ：5 g c c c g c q 塑选a t g aa t g t g ”r a t c c t c a a - 3 p p 2 ：5 - c g c g c g g c c g c a t g a t g a t g a t g a t g a t g c t a a a c c t t c c c g g - 3 k l l ：5 - c c g c c g 匹途鱼a a a a g a a t g a a t g l g n a l c t c a a t - 3 k l 2 ：5 - g g c c c q 丛1 1 f r r a a a c c l _ i c c g g c l l - 3 a o x l - 5 ：5 - g a c t g g t t c c a a t t g a c a a g c - 3 a o x l 3 ：5 - g c aaa t g g c a t l r c t g a c a t c c 3 p k l u ：5 - g a a g a a g c c t t g a t t g g a 一3 p k l d ：5 - g a t t g t c l v r g t g c g a l aa 3 z h l ：5 一1 a c c g a c g t d 蜩c a a g c c c a - 3 z h 2 ：5 - a t c a t c c l l - g t c a g c g a a a g c 一3 z h 3 ：5 。- c a g t g a t t a c a t g c a t a t t g t 3 注：下划线部分显示了引物中的限制性内切酶酶切位点。其中，引物b s l ，b s 2 用于枯草芽孢杆菌表达载体构建时b g a b 基因的p c r 扩增；引物p p l ，p p 2 用于毕赤酵母表达载体构建时b g a b 基因的p c r 扩增；引物k l l ，k l 27江南大学硕士学位论文用于乳酸克鲁维酵母表达载体构建时b g a b 基因的p c r 扩增；a o x l - 5 和a o x l 一3 用于检验毕赤酵母重组子；p k l u 和p k l d 用于检验乳酸克鲁维酵母重组子；z h l ，z h 2 ，z h 3 用于检验乳酸克鲁维酵母整合重组子。2 1 3 药品试剂各种限制性内切酶、t 4d n a 连接酶、t a qd n a 聚合酶均购自t a k a r a 公司；k o dp l u s高保真d n a 聚合酶购自t o y o b o 公司；d n a 琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；酵母基因组提取试剂盒、低分子量蛋白质标准购自北京天根生化科技有限公司；g e n e r u l e r1k bd n al a d d e r 相对分子质量标准购自f e r m e n t a s 公司，核酸染料g e l g r e e n 购自南京博飞生物有限公司。各种抗生素、琼脂糖、n ，n 甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、t r i s 、t e m e d 、s d s 、甘氨酸、组氨酸、e g t a 、溶菌酶、酵母氮源、乙酰胺、生物素、o n p g 等均购自上海生工公司；胰蛋白胨、酵母膏为o x o i d 公司产品；溶壁酶购自北京天根生化科技有限公司；其余试剂均为进口或国产分析纯。2 1 4 主要仪器设备名称型号生产厂家冷冻离心机r e m 5 2 dh e t t i c h可见分光光度计u v - 2 1 0 0尤尼柯( 上海) 仪器有限公司电热恒温培养箱p y x d h s上海一恒科技有限公司超净工作台s w - c j 1 f d苏州安泰空气技术公司气浴恒温振荡器s h z 8 2 a江苏金坛市荣华仪器制造有限公司高压蒸汽杀菌锅l s b 5 0 l上海医用核子厂超低温冰箱t h e r m 0 7 0 7r e v c o制冰机f a 7 0 a中国格兰特制冷公司电热恒温水槽d k 8 d 型上海精宏实验设备有限公司超级恒温水浴锅c o o lt e e h3 2 0t h e r m op c r 仪g s 0 0 0 01g e n et e c h n o l o g i e sl t d 凝胶成像系统g e l d o e2 0 0 0b i o r a dl a b o r a t o r i e s核酸电泳仪p o w e rp a eb i o r a dl a b o r a t o r i e s小型冷冻离心机r3 4ae p p e n d o r f电转化仪e l e c t r o p o r a t o r 2 510e p p e n d o r f2 1 5 培养墓大肠杆菌和枯草芽孢杆菌宿主菌培养采用l b ( l u r i a - b e r t a n i ) 培养基；毕赤酵母和乳酸克鲁维酵母宿主菌培养采用y p d ( y e a s te x t r a c tp e p t o n ed e x t r o s em e d i u m ) 培养基；重组质粒转化大肠杆菌所得重组菌的筛选采用添加氨苄青霉素( 1 0 0i - t g m l ) 的l b 培养基；重组质粒转化枯草芽孢杆菌所得重组菌的筛选采用添加卡纳霉素( 5 0j t g m l ) 的l b 培养基；整合质粒转化毕赤酵母g s l l 5 所得整合菌株转化子的筛选采用m d 培养基；整合质粒转化乳酸克鲁维酵母g g 7 9 9 所得整合菌株转化子的筛选采用含有5m m 乙酰8材料与方法胺的y c b 培养基；筛选毕赤酵母多拷贝整合菌株转化子采用添加不同浓度遗传霉素g 4 1 8 ( 0 2 5m g m l 、0 5m g m l 、0 7 5m g m l 、1 0m g m l 、1 5m g m l 、2 0m g m l ) 的y p d 培养基；诱导发酵毕赤酵母整合菌株采用b m g y 和b m m y 培养基。2 2 实验方法2 2 1 常规操作技术2 21l 基础操作技术质粒的抽提、纯化、酶切、连接、电泳等操作参考分子克隆实验指南( 第三版) 【5 1 】：s d s p a g e 凝胶电泳，按常规方法，参考分子克隆实验指南( 第三版) ，分离胶浓度为1 2 ；质粒中目的基因d n a 测序，双脱氧链终止法，参考分子克隆实验指南( 第三版) ，委托上海博尚生物技术有限公司测定。2 2 1 2 酶切片段的胶回收采用上海华舜公司的g e le x t r a c t i o nm i nk i t 试剂盒进行胶回收。2 213 酵母基因组提取方法采用上海天根公司的酵母基因组提取试剂盒进行提取。2 2 2b 半乳糖苷酶酶活检测按中性乳糖酶酶活检测方法( g i s t b r a e a d e s 法) 【5 2 】。以o n p g 为底物，一个中性乳糖酶单位定义为：在p h 6 5 条件下，每分钟水解产生ll x r n o l 的o n p 所需的酶量为一个中性乳糖酶活单位( n l u 或u ) 。对嗜热脂肪芽孢杆菌源酶及其重组酶，反应温度定为6 0 。2 2 3 感受态细胞的制备与电转化方法2 2 3 1 大肠杆菌感受态细胞的制备与电转化方法大肠杆菌感受态细胞的制备采用c a c l 2 法，参见文献【5 1 1 。大肠杆菌的热击转化方法参阅文献1 5 1 1 。2 2 3 2 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备与电转化方法枯草芽孢杆菌的化学转化法较为简单易行，但转化效率较低，因而采用了转化效率较高的电转化法【5 0 】，具体操作如下：接种w b 6 0 0 于3m l 的l b 培养基中，过夜培养；取2 6m l 过夜培养物接入4 0m l ( l b + 0 5m o l l 山梨醇) 中，3 7 。c ，2 0 0r m i n 培养至o d 6 0 0 = 0 8 5 0 9 5 ；将菌液冰水浴1 0m i n ，然后5 0 0 0r m i n ，4 。c 离心5m i n 收集菌体；用5 0m l 预冷的电转培养基( 0 5m o l l 山梨醇，0 5m o l l 甘露醇，1 0 甘油) ，重新吹悬菌体，5 0 0 0r m i n ，4 。c 离心5m i n ，弃去上清，如此漂洗4 次；将洗涤后的菌体吹悬于l m l 电转培养基中，每管分装1 5 0g l ；将6 0 此感受态细胞中加入5 0n g 构建好的重组质粒，冰水孵育2m i n ，加入预冷的1 咖电转杯中，电击转化，电击条件为2 0 k v ；电击完毕立即加入1m l 复苏培养基( l b + 0 5m 山梨醇+ o 3 8m 甘露醇) ，3 7 。c 条件下2 0 0r m i n 摇床培养，3h 后，涂布于含有卡那霉素的l b 平板上，过夜培养。9江南大学硕士学位论文2 2 3 3 毕赤酵母感受态细胞的制备与电转化方法将酵母接种于5m ly p d 培养基中3 0 培养过夜；取0 1 0 5m l 过夜培养的酵母接种于5 0 0m l y p d 培养基中，培养过夜至o d 6 0 0 = 1 3 1 6 ( 1 0 d = 5 x 1 0 7 札) ：4 ，1 5 0 0r r a i n 离心5m i n 后用5 0 0m l 冰冷的无菌水悬浮；4 c ，1 5 0 0r m i n 离心5m i n 后用2 5 0m l 冰冷的无菌水悬浮；4 c ，1 5 0 0r m i n 离心5m i n 后用2 0m llm 冰冷的山梨醇悬浮；4 c ，1 5 0 0r m i n 离心5m i n 后用1m l1m 冰冷的山梨醇悬浮菌体，最终体积为1 5m l 左右( 可冰冻保存，但转化效率会显著下降) 。取8 0p l 感受态细胞与5 2 0 “g 的纯化d n a 混合，移至一冰冷的4m m 电击转化杯中，冰上放置2m i n ；在点击转化仪中发电，电击条件条件为1 5k v ，5m s ；电击后，转化杯中立即加入1m l1m 冰冷的山梨醇，并移到一灭菌的离心管中；取2 0 0 4 0 0 此涂布于m d 平板上，3 0 培养2 4d 。2 2 3 4 乳酸克鲁维酵母感受态细胞的制备与电转化方法将酵母菌株g g 7 9 9 挑单菌落于5 m l y p d 培养基，3 0 过夜培养至饱和；接种2 0 皿过夜培养物至5 0 m ly p d 液体培养基，3 0 。c 过夜培养至o d 6 = 1 3 1 5 ( 细胞密度需达l 1 0 8c e l l s m l ) ；4 ，4 0 0 0r m i n 离心5m i n 收集细胞，用5m l 漂洗缓冲液( 1 0m md t t + 4 0m mp h 8 0h e p e s 的y p d 液体培养基) 重悬，需剧烈吹打沉淀使细胞完全分散，静置5m i r a4 c ，4 0 0 0r m i n 离心5m i n ，用5m l 电转缓冲液( 2 5m mt r i s h c l + l m mm g c l 2p h 8 0 ) 洗两次，最后用0 2 5m l 电转缓冲液重悬，冰浴1h 。将5l a ld n a ( 1p 虮l ) 加入到1 0 0 此感受态细胞中，吹吸混匀。将混合物转入预冷的4l n l l l 电击杯，冰浴5m i n ；擦去电转杯表面湿气，将电转杯放入电转化仪进行电击，电击的条件为：2 5 0 0v ，5m s ；电击后立即向电击杯中加入1m l 含有lm 山梨醇的y p d 液体培养基，置于3 0 保温1h ；离心3 0s ，用4 0 0 皿无菌水重悬，取部分涂选择性平板。2 2 4 多拷贝转化子的筛选与重组转化子的验证2 241 毕赤酵母多拷贝转化子的筛选和整合转化子的验证一些学者认为重组质粒整合到酵母染色体上的拷贝数决定了目的蛋白表达水平的高低，每一个重组质粒p p i c 9 k b g a b 中均含有一个g 4 1 8 抗性基因，重组酵母细胞对g 4 1 8抗性越高表示酵母细胞中重组质粒拷贝数越多，表达目的蛋白的水平越高m 】。为了筛选多拷贝转化子，采取以下方法：准备三套9 6 孔细胞培养板，第一套板每孔中加入2 0 0 此y p d 培养基，挑取m d 培养基上生长的单菌落悬浮于孔内，每孔一个单菌落，3 0 培养两天；1 0材料与方法第二套板每孔加入1 9 0 此y p d 培养基，1 0 此加入到对应的各孔中，3 0 。c 培养；第三套板每孔加入1 9 0 止y p d 培养基，1 0 此加入到对应的各孔中，3 0 4 c 培养：从第一套板培养了两天的菌液中每孔取出从第二套板培养了两天的菌液中每孔取出第三套板培养过夜后混匀细胞，每孔取出1 0 皿，分别在g 4 1