（光学专业论文）动态光散射技术在生物大分子测量上的应用.pdf

摘要 动态光散射技术是一- f l 新兴的实验技术，利用该方法能快速、准确地测定 溶液中大分子的平动扩散系数，从而得知其大小或流体力学半径及其分布。 本研究工作主要参与完善改进了一台本实验室自行研制的小型低强度激光 光子相关谱仪。与现有的同类型仪器相比，该仪器采用双层折射率样品匹配池 减少了杂散光的干扰；采用带梯度折射率透镜的单模光纤接收、传输散射光信 号提高了散射光的收集传输效率；用低强度的激光避免了对样品的辐射损伤， 同时可以使激光器和系统集成在一起，整个系统小型实用。 用标准的不同粒径的聚苯乙烯乳球定标了设计的系统，系统的测量范围从 几个纳米到一个微米都很精确。 提出了采用格雷码编码遗传算法对动态光散射测量的多粒径分布进行反演 运算，数字测试的结果和聚苯乙烯乳球的实验结果表明，该算法能够精确的反 演出各种分布的粒子分布图象。与标准遗传算法和反演蒙特卡诺算法相比，该 算法具有较高的搜索效率，能够用较少的迭代次数快速搜索到最优解。格雷码 编码遗传算法是一种更有效的多粒子随机反演算法。 使用该系统研究了人血清白蛋白分子的扩散系数在不同蛋白浓度和p h 值 条件下的扩散系数。实验和分析结果表明库仑力对蛋白质的扩散起主要作用， 在等电位点下( p h = 5 2 ) 库仑力的影响消失，蛋白质的扩散系数最小；在等电 位点测量出扩散系数随浓度的增加而线性减小，主要原因是蛋白质问的库仑排 斥力变小，引力得到相对增强：在浓度5 m g m l - 4 0 m g m l 内互扩散系数 d 。= d o 1 一( o 0 0 1 9 4 o 0 0 0 0 8 ) ( 7 】，d o = ( 6 7 4 o 0 1 ) x 1 0 7c m 2 山为外推至零浓 度下2 3 时蛋白质的扩散系数，这里c 为蛋白质浓度，实验测得人血清白蛋白 的半径为3 4 4 _ + 0 o l n m 。这项研究有助于推动诊断肾脏病的早期发现。 利用动态光散射技术研究了牛血清白蛋白分子的扩散系数在不同强度离子 溶液中随着蛋白分子浓度变化的规律。结果表明在低离子强度环境中蛋白的扩 散系数随蛋白的浓度增加而增加，随着离子强度的逐步增大，蛋白分子的扩散 系数随其浓度的增加而减小。利用平均势场理论的两体硬球相互作用模型解释 了蛋白分子的相互作用变化规律：随着离子强度的增加，离子氛厚度减小，蛋 摘要 白分子间的相互作用由排斥变为吸引，蛋白开始聚集。根据扩散系数随蛋白浓 度变化的斜率与离子浓度变化的相关性，回归出了蛋白相互作用参数，蛋白所 带的有效电荷z 产一9 o e 、h a k e r 常量= 2 8 k b t 。这项工作说明了动态光散射是 研究蛋白分子相互作用的一种有效技术。 关键词：动态光散射；扩散系数；粒径：遗传算法；多粒子反演；人血清白蛋 白；蛋白相互作用 a b s t r a c t a b s t r a c t d y n a m i cl i g h ts c a t t e r i n g ( d l s ) i san e we x p e r i m e n t a lt e c h n i q u e i tc a n m e a s u r e d i f f u s i o nc o e f f i c i e n to fm a c r o m o l e c u l ei ns o l u t i o n sr a p i d l ya n de x a c t l y , a n dt h es i z e o rd y n a m i cr a d i u so fm a c r o m o l e c u l ec a nb eo b t a i n e d t h em a i nc o n t e n to ft h ew o r ka r ea s f o l l o w s ：d e v e l o p i n gac o m p a c td y n a m i c l i g h ts c a t t e r i n gi n s t r u m e n tw i t hl o wp o w e rl a s e r c o m p a r e dw i t hc u r r e n ti n s t r u m e n t s ， t h e s e t u p c a l ld e c r e a s ed i s t u r b a n c eo fd i s o r d e rr a d i a t i o n b yu s i n gd o u b l el a y e r r e f r a c t i v ei n d e x s a m p l e m a t c h i n gv e s s e l ，a n d i tc a ni n c r e a s e c o l l e c t i n g a n d t r a n s m i t t i n ge f f i c i e n c y o fr a d i a t i o n b ya d o p t i n gs i n g l em o d ef i b e rw i t hg r a d i e n t r e f r a c t i v ei n d e xl e n s w i t hal o wp o w e rl a s e r , t h es a m p l eh a sal o ws c a t h e ，a n dt h e l a s e ra n dt h em e a s u r e m e n t s y s t e m c a nb ei n t e g r a t e dc o n v e n i e n t l y t h e s e t u pw a s c a l i b r a t e dw i t hd i f f e r e n td i a m e t e rl a t e x ，a n dt h em e a s u r a b l e r a n g e o f t h e s e t u pi sf r o m s e v e r a ln a n o m e t e r st oo n em i c r o n as t o c h a s t i ci n v e r s et e c h n i q u eb a s e do ng r a y c o d eg e n e t i ca l g o r i t h m ( g g a ) t o i n v e r tp a r t i c l es i z ed i s t r i b u t i o nf r o md y n a m i c l i g h ts c a t t e r i n g ( d l s ) d a t ai sp r o p o s e d n u m e r i e a lt e s t sa n dl a t e x e x p e r i m e n t sf o ri n v e r t i n gd y n a m i cl i g h ts c a t t e r i n gd a t a s h o w e dt h a tt h ea l g o r i t h mc o u l db es u c c e s s f u l l ya p p l i e dt oi n v e r s ep r o b l e mo fd l s w i t hh i g h s t a b i l i t y t ot h ed i f f e r e n t t y p eo fd i s t r i b u t i o n s c o m p a r e dw i t hs t a n d a r d g e n e t i ca l g o r i t h m sa n di n v e r s em o n t ec a r l om e t h o d s ，i th a sb e e ns h o w nt h a tt h eg g a h a s h i g hs e a r c h i n ge f f i c i e n t ，a n di tc a n b er a p i d l yo b t a i n e do p t i m u mr e s u l t sw i t haf e w g e n e r a t i o n s g g ai sam o r e e f f i c i e n ts t o c h a s t i ci n v e r s em e t h o d t h ed i f f u s i o nc o e 币c i e n to fh s a ( h u m a ns e r u m a l b u m ) w a sm e a s u r e d a t d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sa n dp hb ym e a n so ft h es e t u p e x p e r i m e n t a la n d a n a l y t i c r e s u l t si n d i c a t et h a tc o u l o m bi n t e r a c t i o n sb e t w e e nt h ec h a r g e dp r o t e i n sa c t e da sm a i n c o n t r i b u t i o nt ot h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t ；t h ee f f e c t o fc o u l o m bv a n i s h e d a tt h e i s o e l e c t r i c ( 5 2 ) ，a n dt h ed i f f u s i o nc o e f f i c i e n to fp r o t e i nc l o s e dt om i n i m a l a tt h e i s o e l e c t r i c ，t h ed i f f u s i o nc o e f f i c i e n td e c r e a s e dl i n e a r l yw i t ht h ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e 3 a b s l j r a c t t h em a i nr e a s o nw a st h a tt h ec o u l o m bi n t e r a c t i o n sb e t w e e np r o t e i n sb e c o m e d e c r e a s e a n dt h ea t t r a c t i v e p o t e n t i a l i n c r e a s e d r e l a t i v e l y i n t h ec o n c e n t r a t i o n r a n g e o f 5 m g m l 一4 0 m g m l ， w h e n5 3 2 n m l i g h t w a s u s e d ，i t w a sf o u n dt h a t 见= d o i l 一( o 0 0 1 9 4 0 0 0 0 0 8 ) ( ? 】， w h e r e d 。= ( 6 7 4 0 0 1 ) 1 0 。c m 2 厶 e x t r a p o l a t e dt oz e r oc o n c e n t r a t i o na t2 3 。c a n dci si nu n i t so fm g m 1 t h em e a s u r e d d i a m e t e ro f h s ai s3 4 4 0 0 1 r i m t h ei n v e s t i g a t i o ni sh e l pt oc h e c k i n gn e p h r o p a t h y e a r l y t h ed i f f u s i o nc o e f f i c i e n to fb o v i n es e r u n 2a l b u m i n ( b s a ) w a ss t u d i e d b y d y n a m i cl i g h ts c a t t e r i n gi nd i f f e r e n ti o n i cs t r e n g t hs o l u t i o n s t h er e s u l ts h o w e dt h a t t h ed i f f u s i o nc o e f f i c i e n to fp r o t e i ni n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n gp r o t e i nc o n c e n t r a t i o n ， a n dt h a tw h e nt h ei o n i c s t r e n g t h i n c r e a s e d g r a d u a l l y , t h e d i f f u s i o nc o e f f i c i e n t d e c r e a s e dw i t h i n c r e a s i n gp r o t e i nc o n c e n t r a t i o n t h ec o n c e n t r a t i o nd e p e n d e n c eo f b s a a p p a r e n td i f f u s i o nc o e f f i c i e n t sw a si n t e r p r e t e d i nt h ec o n t e x to fat w o - b o a y p o t e n t i a lo f m e a n f o r c et h a ti n c l u d e sr e p u l s i v eh a r d s p h e r ea n dc o u l o r n b i ci n t e r a c t i o n s a n da t t r a c t i v ed i s p e r s i o n ：w i t hi n c r e a s i n gi o n i cs t r e n g t h ，d e b y es c r e e n i n gd e c r e a s e d ， a n dp r o t e i ni n t e r a c t i o nc h a n g e df r o mr e p u l s i o nt oa t t r a c t i o n ，a n dp r o t e i na g g r e g a t i o n s w a so n s e t f r o mt h ec o n c e n t r a t i o nd e p e n d e n c eo fb s a a p p a r e n td i f f u s i o nc o e f f i c i e n t s ， p r o t e i ni n t e r a c t i o np a r a m e t e r sh a v eb e e nr e g r e s s e d i tb e a r san e te f f e c t i v ec h a r g eo f 一9 0a n dh a sah a m a k e rc o n s t a n to f2 8 k b t t h i sw o r kd e m o n s t r a t e dt h a td l sw a sa n e f f e c t i v et e c h n i q u eo f s t u d y i n gp r o t e i ni n t e r a c t i o n s k e y w o r d s ：d y n a m i cl i g h ts c a t t e r i n g ；d i f f u s i o nc o e f f i c i e n t ；p a n i c l es i z e ；g e n e t i c a l g o r i t h m ；i n v e r tp a r t i c l es i z ed i s t r i b u t i o n ；h u m a ns e r u ma l b u m ；p r o t e i ni n t e r a c t i o n 4 第一章绪论 第一章绪论 1 1 动态光散射技术与在生物学上的应用 动态光散射技术是在激光问世后发展起来的新兴测量技术，它通过测量溶液 中微粒的扩散系数，从而得知粒子的大小及其分布。测量尺寸范围从1 纳米到几 个微米。该技术能够对样品实时、无扰的快速测量，已经在生物、物理、化学、 医学等领域得n t 广泛的应用”。 在生物学的应用方面，黄耀熊小组建立了显微准弹性光散射系统，将动态光 散射技术与显微镜技术结合起来实现了对单个活细胞的无损在位实时测量，先后 对正常红细胞和血影细胞进行了显微准弹性测量，对正常年轻和年老红细胞内的 不同位置的动态信息进行了显微准弹性测量，对已经确诊的地贫疾病患者的红细 胞与正常红细胞进行了对照测量，表明了该系统适用于对单个活态细胞内不同位 置的动态特性扫描测量和在临床科学中的潜在应用价值 1 3 - 5 】。r b a r z i v 等人将 显微动态光散射技术和光镊技术结合起来，实现了对单个粒子的动态光散射测 量，装置的空间分辨率达到了几个纳米【l ”。 吕鹤书等人以溶菌酶为模型蛋白，应用动态光散射对其结晶性能进行了研 究，结果表明一定范围的蛋白质浓度不会影响蛋白质聚合性质，而起沉淀剂作用 的盐对多色散性的影响较大【”。有人也将该技术用来研究奇异果甜蛋白晶体的成 核和生长。 在蛋白相互作用方面，x u f e n g w u 等人用动态光散射技术对a t p 溶液中的平 滑肌浆球蛋白进行了研究，结果表明在o 1 5 0 3 mk c i 浓度范围内，单体蛋白的 构形由从折叠到展开变长发生了明显的变化。s e i i c h it a k a y a m a 用动态光散射 技术研究了m g ”和a t p 对竿状的合成肌纤维蛋白的影响，发现m 9 2 + 能够使蛋白 纤维变粗变长，a t p 使纤维变短变细，a t p 起到了解聚的作用1 2 0 。r a c z u r y l o 等人用动态光散射研究了钙调结合蛋白的流体力学特性，并建立了钙调结合蛋白 的椭球模型，有力的证明了动态光散射技术对生物材料结构的无损测定功能2 ”。 由于环境的变化，蛋白要发生聚集或者解聚，用动态光散射来研究蛋白的这 些变化有天然的优势，这方面的研究非常的广泛。黄耀熊等人应用该技术研究了 第一章绪论 形成白内障的人眼球晶体蛋白的聚集情况【2 2 l ，m b d a t i l e s 则开发出了适用于l 临 床诊断白内障的动态光散射医学设备2 ”。人们研究了淀粉样b 蛋白从单体到纤维 状多聚体的自发聚集的动力过程，试图弄清h u n t i n 百o n 疾病的产生机制。人们 也研究了加热引起的乳球蛋白聚集情况 2 5 】，研究了d n a 片段与阳离子聚乙烯电 解质的相互作用”i ，用该技术观察了右旋糖苷与人低密度脂蛋白的相互作用。 1 2 本工作面临的问题 虽然动态光散射技术能快速、准确地测定溶液中大分子或胶体质点的平动扩 散系数，从而得知其大小或流体力学半径及其分布，但是目前商用的实现动态光 散射测量的光子相关谱仪由于光源采用大功率的激光器，系统的体积庞大，调试 烦琐，仅适合实验室的使用2 。 动态光散射是一门非常重要的测量纳米颗粒粒径分布的技术，它通过测量散 射光的频移分布来反演出粒径分布。但是由于微粒粒径分布的反演计算在理论 上归结于第一类f r e d h o l m 积分方程的求解，是个典型的不适定问题，直接计算具 有相当大的困难【3 0 】。目前主要有累计法、拉普拉斯变换法、非负最小二乘法、 c o n t i n 技术等求解这类问题【3 1 - 3 4 】。但是这些算法都需要预先假定一些与分布有关 的信息，而且这些算法对分布的形式非常敏感，在出现噪声的时候稳定性低。 人血清白蛋白是一种球状蛋白，一般在血液中。正常情况下，人体尿液中不 含蛋白质，但是当人体尿液中的白蛋白急剧增加的时候，则人体患肾脏病的几率 会急剧增加。目前临床医学上通常采用生化试纸来检测尿样中的蛋白质含量，但 试纸灵敏度很低，而且检测者对试纸颜色判断的个人主观因素影响较大。激光散 射法在检测蛋白质含量的时候，通过对一定量的蛋白质加热使之变性，根据散射 光的强弱来确定蛋白质的含量。该法探测灵敏度较低，且对蛋白质的种类不能区 分【3 5 】。 长期以来水溶液中蛋白质的相互作用问题是人们研究的热点，而蛋白质的聚 集问题尤其引人注目【3 8 1 ，这是因为蛋白质的聚集跟晶体的制备和某些疾病的形 成有着密切联系。首先，高质量的蛋白质晶体对于晶体结构的分析是至关重要的， 而蛋白质晶体的制备关键是使溶液中蛋白质分子不断地聚集到形成的晶核卜，然 第章绪论 后从溶液中沉淀出来，但是聚集条件与很多因素有关，包括温度、p h 值、盐浓度、 蛋白浓度等，使得这一过程相当复杂【3 9 - 4 1 。目前许多生物大分子的品体培养工作 仍很网难，主要是摸索性和经验性的；病理上，几种严重危害人类身体健康的疾 病主要是由蛋白质的聚集造成的，例如白内障的产生是由于眼晶状体中的6 t 一晶 体蛋白聚集导致光的强烈散射造成的口”，镰刀状细胞贫血症是由于异常血红蛋白 聚集成纤维状使得红细胞变形破碎造成的。蛋白质的聚集过程是一个分子问相互 作用的过程，涉及到诸多因素，如盐的浓度、蛋白质性质和浓度、p h 值、温度等 等。因此，弄清楚蛋白质分子间的相互作用是如何依赖实验条件的变化，基于蛋 白质的基本特征提出具有预见性的蛋白质相互作用模型是非常有意义的。 1 3 本工作的目的和内容 设计改进小型实用的光子相关谱仪，使其适合生物大分子的快速准确测量； 提出用格雷码编码遗传算法反演动态光散射测量的多粒子分布问题；研究人血清 白蛋白分子在不同蛋白浓度和p h 值条件下的扩散系数，推动尿蛋白早期检测的 发展；研究蛋白分子在水溶液中的相互作用与实验条件变化的关系，推动寻找蛋 白结晶条件的发展。所以本工作包括以下内容： 1 、设计改进光子相关谱仪。本研究工作主要参与改进了一台本实验室自行研制 的小型实用低强度激光光子相关谱仪，与现有的同类型仪器相比，该仪器采 用双层折射率样品匹配池减少了杂散光的干扰；采用带梯度折射率透镜的单 模光纤接收、传输散射光信号提高了散射光的收集传输效率；用低强度的激 光避免了对样品的辐射损伤，同时可以使激光器和系统集成在一起，整个系 统小型实用。 2 、用标准聚苯乙烯乳球定标所设计的光子相关谱仪。用该系统分别测量了标称 为1 0 0 0 纳米和1 0 0 纳米的聚苯乙烯乳球，所测量的结果与标称的结果一致。 3 、提出了格雷码编码遗传算法对动态光散射测量的多粒径分布进行反演运算， 数字测试的结果和聚苯乙烯乳球的实验结果表明，该算法能够精确的反演出 各种分布的粒子分布图象。对适应度随迭代次数的研究结果表明该算法能够 用较少的迭代次数高效的搜索到最优解。 第一章绪论 4 、用该系统研究了人血清白蛋白分子的扩散系数在不同蛋白浓度和p h 值条件 下的扩散系数。实验和分析结果表明库仑力对蛋白质的扩散起主要作用，在 等电位点下( p h = 5 2 ) 库仑力的影响消失，蛋白质的扩散系数最小；在等电 位点测量出扩散系数随浓度的增加而线性减小，主要原因是蛋白质问的库仑 排斥力变小，引力得到相对增强；在浓度5 m g m l 一4 0 m g m l 内互扩散系数 d 。= d o l t 一( o 0 0 1 9 4 _ + 0 0 0 0 0 8 ) ( 7 】，d o = ( 6 7 4 _ + 0 0 0 x 1 0 2 止为外推至零 浓度下2 3 c 时蛋向质的扩散系数，这里c 为蛋白质浓度，实验测得人血清白 蛋白的半径为3 4 4 0 0 1f l m 。这项研究有助于推动诊断肾脏病的早期发现。 5 、利用动态光散射技术研究了牛血清白蛋白分子的扩散系数在不同强度离子溶 液中随着蛋白分子浓度变化的规律。结果表明在低离子强度环境中蛋白的扩 散系数随蛋白的浓度增加而增加，随着离子强度的逐步增大，蛋白分子的扩 散系数随其浓度的增加而减小。利用平均势场理论的两体硬球相互作用模型 解释了蛋白分子的相互作用变化规律：随着离子强度的增加，离子氛厚度减 小，蛋白分子问的相互作用由排斥变为吸引，蛋白开始聚集。根据扩散系数 随蛋白浓度变化的斜率与离子浓度变化的相关性，回归出了蛋白相互作用参 数，蛋白所带的有效电荷z ，= - 9 0 e 、h a m a k e r 常量= 2 8 k 。t 镱一j 章动态光散射原理 2 1 引言 第二章动态光散射原理 经典的瑞利散射( 静态光散射) 广泛用于大分子与胶体化学的研究中j 。基 于对体系平衡性质的测量，它可以给出分子量，均方半径和第二维里系数等重要 数据。激光器问世后，动态光散射这项新技术得到了迅速的发展口4 j ，它是探测 质点运动的重要手段，其主要应用是能快速准确的测定溶液中大分子或胶体质点 的平动扩散系数，从而得知其大小或流体力学半径。此法不仅具有不干扰不破坏 体系原有状态的优点，对于多分散体系还能提供关于质点大小分布的信息口】。与 静态光散射不同，动态光散射是研究与质点运动相关联的散射光强涨落过程，故 亦可用于测定非球形质点的转动扩散系数，研究分子的构象变化，分子链的柔性， 双分子反应的动力学过程等。此项技术适用的质点尺寸范围约1 n m 至lui l l ，运 动过程的时标范围约是tps 至1 s 【6 ，”。 2 2 原理 光传播时其交变的电磁场引起介质分子中电子作加速运动，振动着的电偶极 子是次波源向各个方向辐射电磁波，此即光散射的起因。当质点或分子的极化率 与周围介质的极化率不同时，便可观测到散射光。散射光的频率应与入射光的相 同。实际上，质点不停地作布朗运动。由多普勒效应知道，对处于静l 七参考系中 的观察者来说，质点辐射的次波频率与其运动的速度有关，质点运动有快有慢， 故频率有个分布范围。结果是散射光场以入射光频率为中心而展宽，故属于准弹 性光散射。单分散性体系的散射光场的谱密度j ，) 呈l o r e n t z 型，可以用下式表 示1 6 j ，图形如图1 示： 帕) - ( ，) 南 ( 2 一1 ) 式中( ) 为曲线下面积，代表积分散射光强，也是静态散射中所测的物理量。展 第二章动态光散射原理 宽用半高半宽表示，简称线宽r ，他和描述布朗运动强度的平动扩散系数d 有如 下的关系： r = 功2 ( 2 2 ) 图2 - 1l o r e n t z 型分布的谱密度图象 g 是散射矢量的大小，即g = ( 4 n a ) s i n 斜2 ) ，且是入射光在介质- 扣的波长，护为 散射角。以半径为3 o n m 的球形分子为例，2 0 。c 时在水中的d 值为7 2 1 0 。c m ”s1 ， 用h e - n e 激光器做光源在9 0 。处观测，自式( 2 - 2 ) 得到频率展宽仅为4 1 0 瑚z ， 远比原场频率u 。( = 6 1 0 ”h z ) 来得小，而且远低于现时最好的单色仪或干涉仪 的分辨极限。然而，利用光拍技术能够检测出这种微小的频移。在频谱分析中实 际测得的是光电流( 正比于散射光强) 的功率谱，采用自拍模式时信号项为 6 p + b ) 喇2 差爷 。， 可以看到通过光拍进行调制后，中心频率移到零频处，线宽增加一倍。图 2 - 2 是动态光散射的自拍技术原理图。 第二章动态光散射原理 图2 - 2 自拍技术原理图 太频谱仪 图2 - 3 计算两个粒子散射光强度的几何位置关系 从时域上来考察。图2 - 3 示悬浮液中某两个粒子被波长为旯的单色平面光照 射，它们的散射光在空间p 点处形成干涉。由于粒子在液体中做布朗运动，即每 个颗粒的位置随时间在不停的变化，从而引起该点处的干涉光强度的起伏。在实 际的测量时，测量区中有大量的散射颗粒，因此某一时刻在该点处的干涉光强度 是所有参与散射颗粒共同作用的结果。设散射颗粒为全同粒予，即单分散体系， 且粒子间没有相互作用力，在点p 处随时间起伏的光强为。( ，) ，则其归一化自相 关函数为： g 2 1 ( f ) = ( ，o ) ，( f + r ) ) 似。( r ) ) 2 ( 2 4 ) 式中，。( f ) 、l ( f + f ) 为在时刻f 和时刻f + r 所接收到的所测颗粒的散射光强信号。 f 为延迟时间，角括号表示对一段时间的平均。在自拍模式下，电场的归一化自 相关函数g ( o ( f ) 为： 一砼。 | 叩 缮嵫 “n j 一 波一r心z一厂 整 调豁 第二章动态光散射原理 9 0 1 ( r ) = ( e 。( f 减( f + r ) ) ，( r ) ( 2 - 5 ) e ( f ) 是散射光场。对于无限稀溶液，教射场服从高斯分布，e b s i e g e r t 关系” 有： g 2 ( f ) = 一d + 3 e x p ( - 2 r r ) ( 2 6 ) a 是基线常量，卢是空间相干因子，与仪器的探测面积大小有关。 i _ 是线宽，与扩散系数d 的关系为：r = d q 2 ( 2 7 ) g 为散射波矢的模：g 一4 n n 里s i n 昙( 2 - 8 ) l 式中为介质( 溶剂) 的折射率， 为光在真空中的波长。 根据s t o k e s e i n s t e i n 关系式可以求出球形粒子的半径r d ：坚( 2 - 9 ) 0 万，矿 式中k 是b o l t z m a n 常数，t 足绝对温度，r 足液体的粘稠系数 对于多分散性体系，归一化的光场自相关函数应该为所有散射粒子的贡献： ( f ) = f g ( r ) e x p ( - f f k 扩( 2 - l o ) 这里g ( r ) 为线宽分布函数。若对g 1 1 ( ) 进行l a p l a c e 反演可以得到g ( f ) 。若对 g o ) ( f ) 进行考虑分布后的单指数拟台，得到平均线宽f 。平均线宽的定义为： i = = f g ( r ) v x ( 2 - 1 1 ) 反映散射样品中各种动态因素对散射光强度自相关函数的协同联台贡献。 2 3 数据分析 在实际测量中得到散射光强度自相关函数后，需要对自相关函数进行分析， 数据分析的第一步是选择期望的相关函数的形式。该选择依赖于所考虑的实验的 目的，并且在某种程度上受实验结果的影响。对相关函数分析的方法有多种，具 体有累积矩法”、m s v d 1o 1 2 1 ( m u l t i e x p o n e n t i a l s i n g u l a r v a l u e 第- 章动态光散射原理 d e c o m p o s i t i o n ) 、r i l i e 1 1 , 1 2 ( r e g u l a r i z e di n v e r s i o no ft h el a p l a c ei n t e g r a l e a u a t i o n ) 、c o n t i n 技术等统计分析处理方法。累积矩法的测定是比较基本和绝 对的，但不能提供粒子的分布形式。m s v d 用一组线性的单指数函数组合来近似线 宽的分布函数，得到非连续的粒径分布，能用于单模式的g ( f ) 。r i l i e 技术是借 合理的强制方法把稳定性强加于方程的解上，设法解出有关的方程，得到的是 g ( r ) 的连续分布函数【1 3 。c o n t i n “1 技术是功能更强的数据处理方法，能用于有 多峰的分布曲线的处理，采用强制规则化技术处理数据。在未知分布形式时，先 用c o n t i n 技术来考察其分布曲线，再根据分布特点选用合适的累积分析手段，这 样得到的结果就比较可靠。 对于分布较窄的样品，一般情况下累积矩法在该法中相关函数被展开成： 三1 n 陋( f ) 一丑b ) 】= c - 。t r + 去：r 2 一面1 鲍r 3 十 ( 2 1 2 ) a ，、玎：、玑为累积矩( c u m u l a n t s ) ，分别被解释为平均扩散常数项、扩散常数 分布宽度和分布的非对称性等。累积矩和衰减速率分布矩的关系是： 吼= ( f ) ( 2 - 1 3 ) 吁：= ( ( r 一( r ) ) 2 ) ( 2 1 4 ) = ( ( r 一( r ) ) 3 ) ( 2 - 1 5 ) 这里假定相关函数包含了很多衰减速率。 特别地，如果体系为二分散性体系，光强的自相关函数为双指数分布： g 2 ( r ) = b + 0 ，e x p ( - f ：r ) + 一，e x p ( - f , r ) ) 2 ( 2 1 6 ) 式中0 = d ，q 2 ，f 。= d ，q 2d ，是运动较快的散射体系的表观扩散系数，d ，是 运动较慢的散射体系的表观扩散系数。a ，、a ：分别是它们的散射谱系数，各自 反映散射光强度自相关函数随粒子运动的快慢的分布。f ，对应较快运动的 d o p p l e r 频移线宽，r 对应较慢运动的d o p p l e r 频移线宽 第一章动态光散射实验装置与标准粒子的测箍 第三章动态光散射实验装置与标准粒子的测量 3 1 引言 目前科研生产中的光子相关谱仪使用大功率的光源和笨重的水冷系统。5 j ， 不适用工业现场的检测，而且易造成资源的严重浪费。本实验室自行研制了一小 型实用的低强度激光准弹性光散射实验装置。该装置通过设计一双层折射率样品 匹配池减少了杂散光；用梯度折射率单模光纤代替针孔光阑极大地提高了散射光 的收集、传输效率。实验结果表明用低功率氦氖管测量的结果在误差范围内，该 装置能够实现工业现场的检测。 3 2 仪器装置 图3 - 1 是我们实验室自己组装建立的光子相关谱仪结构示意图。选用功率为 2 m w 的氦氖管做光源：样品池是自行设计的双层折射率样品匹配池，匹配池的中 间放置四面透光的石英皿盛放样品。散射光由具有梯度折射率探头的单模光纤收 集传输。自相关器是美国c o r r e a o r 公司开发的f 1 e x 9 9 r 一1 6 0 b 型数字相关器， 2 7 2 通道，多个采样时间。此光谱仪在9 0 。散射角和1 5 9 0 。c 温度进行光散射 测量。样品的用量为1 毫升。散射光经过单模光纤耦合进光电倍增管进行光放大， 由单光子计数系统可进行静态光散射测量；单光子计数器的信号经过自相关器处 全反射棱 样 及 图3 一l 光子相关谱仪结构示意图 第章动态光敞射实验装置与标难粒子的测量 理后可得到散射光强时间自相关函数。 在建立装置过程中，基丁实验的要求做了如下的设计安排。首先是光源的 选取。选用几个毫瓦的氦氖管做光源有几个方面的综合考虑：以水做溶剂的样晶 对此波长的光无吸收峰，也不受吸收产生荧光，在此波长下光电倍增管有较高的 量子效率；氦氖管输出的功率稳定，不会因为入射光强的涨落本身给线宽测量带 来误差；基横模t e b l 。光斑均匀，光束截面上光通量密度的分布为理想的高斯型、 光束截面上各点电场问无相移，是完全的空间相干光，光束的发散角最小，便于 聚焦成最小的光斑。 来自激光器的垂直偏振的单色光经平面镜和光阑孔后进入起偏器。入射光 束经透镜会聚于盛样品液的散射池的中心轴上。用透镜将光束聚焦时，焦点处光 斑面积最小，其直径的计算式是【6 】： d 。：坐( 3 - 1 ) 删 d 是进入透镜前激光束的直径，厂为透镜焦距。光束离开焦点向前传播时，光斑 直径随离焦点的距离增大而增大。 聚焦光路中透镜应该有适当的焦距，一般为3 5 0 5 0 0m 。焦距处光斑大小 直接影响散射体积的大小。小的散射体积可以提高入射光束的光通量密度和增大 相干角，对提高信噪比很有利。但光束的发散使入射光波矢的不确定度增大。从 而增大线宽的不确定度。因此，对这两方面应统筹兼顾。 其次是样品池的设计问题。本文设计了一个双层折射率样品匹配池，池的 外层内壁采用涂黑的金属铝吸收池内的杂散光及在池壁上的反射光；折射率匹配 液采用甘油，因为甘油和石英的折射率( 1 4 7 ) 最接近，这样可以有效的减少入 射光在石英壁上的反射；同时在池的底部加了一个循环水恒温装置，实验时保证 样品池中的温度变化控制在0 1 内，有效的防止了散射液的对流而影响相关函 数。 以往的采集光路部分使用两个相距一定距离的针孔光阑直接收集、传输散射 光给p i d t ，这其中有个缺点，散射光的采集效率低下，不得不提高入射光的功率。 本文做了一个改进，用一根单模梯度折射率光纤来收集、传输散射光，极大地提 高了散射光的收集效率，因而用低功率的激光器也能测出很精确的白相关曲线。 光电倍增管是测量光路的核心。除了应该注意的一般因素如量子效率、光谱 第一：章动态光散射实验装置与标准粒子的测量 响应特性、增益时间特性和暗电流等外，做光子相关测量时对倍增管还有专门的 要求，主要是：无后脉冲；暗电流服从p o is s o n 分布；光阴极面积小和阳极输出 脉冲尽量窄( 小于2 0 n s ) 。这方面适用的倍增管有1 t tf w1 3 0 和e m i9 8 6 3 等。 讯号处理系统包括放大器、甑别器、计数器、相关仪和计算机。光电倍增管 阳极输出的是电荷量不等的一列脉冲，在时间轴上似呈无序分布，且夹带噪声脉 冲。脉冲的平均高度仅有几个m v ，在输入计数器或相关仪之前必须经过放大与 甑别。放大的作用是提高脉冲电平。通常采用宽带放大器，放大倍数约1 0 - 1 0 0 ， 信号弓噪声均得到放大。甑别器的作用是提高信噪比和对信号整形，其原理是对 脉冲电平规定某个阈值( 5 0 m y 一1 v ) ，对脉冲逐一加以甑别以筛去电平低于阅值的 噪声脉冲。正确选定此闽值很重要，过低则噪声未能去净，过高则信号受损引起 失真。 对相关器的选用注意以下几点： ( 1 ) 采用时间通常相关仪的采样时间f 的可调范围约自i s 至1us 或 l o o n s 。f 的上限越短，可观测越快的过程。为此目的，有些相关器的设计采用 单限幅技术，使相乘简化为相加，这样r 的上限可缩短至3 0 5 0 n s 。为了适合 于研究宽分布的多分散体系，有些相关器采用多个采样时间来测量相关函数。例 如，全部通道分成许多段，相邻两段的采用时间相差2 ”倍，n 是0 - 8 问的整数。 这样，测得的相关函数曲线包括了很宽的延迟时间范围。 ( 2 ) 通道数早期的相关仪通道数n 仅有2 4 4 8 ，现有2 0 0 5 0 0 ，实际上， n 2 6 0 8 0 已能满足一般的实验要求。增加通道数目可以增加实验点数，减少统计 误差并扩大延迟时间范围，不过相应的成本也随之增加。 ( 3 ) 相关函数基线的确定相关函数基线( fjm 时相关函数的值) 的准确 确定对随后的数据分析很重要。从采样时间内的光电子计数的平均值和采样的次 数，可以计算出基线值。在相关仪的线路设计中还可以将靠近末尾的某两个相邻 通道之间的延迟时间从正常值( = 1 a r ) 增大至5 1 2 a r 或更多。这样，最末 几个通道累计量的平均值即为基线的实验测量值。通常要求基线的测量值与计算 值相差在0 1 - 0 2 以内。 1 6 第三章动态光散射实验装置与标准粒子的测量 3 3 标准颗粒的测量 用本实验系统我们分别测量了德国s i g c l a 公司生产的标称为l o o n m 和1 0 0 0 n m 的标准聚苯乙烯球。 3 3 1 样品准备 取聚苯乙烯球乳液( 标称0 1 0 p m ，浓度1 0 ) 4 u1 ，自n - - - - 蒸水2 m l 稀释。 将稀释液用2 2 0 n m 孔径的聚脂纤维滤纸过滤，再将过滤夜离心( 1 0 0 0 0 9 ) 3 0 分 钟。轻取溶液的上面部分约l m l 放到预先准备好的干净比色皿中测量。比色皿要 预先用蒸馏水加洗洁净冲洗内外表面，不能有任何污点；然后用三蒸水反复冲洗 比色皿5 分钟，在洁净的地方自然晾干。 样品放入比色皿后，打开激光器( 波长6 3 2 8 n m ，功率2 m w ) 静待约5 分钟 让激光器稳定下来，然后打开光电倍增管开始测量，测量时间2 分钟。 3 3 2 实验结果 图3 2 是测量的标称l o o n m 聚苯乙烯球的光强一光强自相关曲线。由图可以 看出，所测量出的自相关曲线是标准的单指数衰减曲线。 由于采用的相关器具有多个采样时间，最初的采样时间足1 5 0 n s ，在这样短 的时间内采集一个光子的几率是很小的，因此光电倍增管内后脉冲的影响相对较 大，导致相关函数出现峰值，必须去掉前面的几个函数值。在去掉了最初的1 6 个通道点后，所取的延迟时间从4 8 微秒到0 8 毫秒。通过单指数衰减拟合，拟 合出的z2 值为1 8 8 1 4 8 e 一5 ，这说明拟合是非常成功的，也说明了仪器的测量非 常精确。 第五章动态光散射实验装置与标准粒子的测量 t ( m s ) 图3 - 2 标称1 0 0 n r l l 的聚苯乙烯乳球的光强自相关曲线，测量时问 t = - 3 0 0 s ，t = 3 0 0 k ，延迟时问t = 1 0 m s ，r = 0g s c p s ，p = 2m w f i = 3 - 2 t h ei n t e n s i t yc o r r e l a f t o nc u r v eo fl a t e xr 10 0 n m ) 单粒径分布粒