毕业设计（论文）-中心组合设计优化酶解蓝圆鲹制备降血压肽.doc

XX大学学士学位论文 中心组合设计优化酶解蓝圆鲹制备降血压肽教学单位 学生学号 XXX大学（学院）毕 业 设 计 (论文)题 目： 年 级： 学 号： 姓 名： 专 业： 指导教师： 2011 年 6 月 19 日中心组合设计优化酶解蓝圆鲹制备降血压肽摘 要高血压是引发心血管疾病，如心力衰竭、中风、冠心病和心肌梗塞等的重要危险因子，在世界范围内已成为严重的社会公共卫生问题。血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)是目前用于预防治疗高血压的重要药物之一，但化学合成的ACEI易引起恶心、呕吐、腹泻等副作用。因此，具有安全性高、副作用小、易吸收等优点的食源性ACEI尤其引人注目，已成为生物活性肽研究领域的热点之一。蛋白酶水解法是一种新兴的水解蛋白质的方法。它和化学水解法相比，具有很多的优点，如条件温和，易控制，水解效率高，其在营养成分保持方面更是具有其独特的优点。目前人们利用酶工程技术已经从鸡肉、罗非鱼、玉米蛋白、鸡蛋蛋白等食物原料中制取降血压肽。蛋白酶的催化能力不但与本身的性质有关，而且还和它所处的环境有较大关系，如催化环境的温度、pH值、底物蛋白的性质等。本实验以蓝圆鲹鱼肉蛋白为原料，用木瓜蛋白酶酶解制备降压肽。在单因素实验的基础上，结合三因素五水平的Central Composite模型响应面设计，通过Design-Expert软件处理，建立木瓜蛋白酶酶解蓝圆鲹蛋白制备降血压肽的三元二次回归正交模型。最终求得模型方程的最大值点为酶解温度52.55、pH7.97、E/S 0.03371。在此条件下，预测的水解度为24.32，这与验证实验值存在可接受的误差。结果表明：中心组合设计是优化酶解蓝圆鲹制备降血压肽的有效途径。 关键词：酶解 蓝圆鲹 血管紧张素转化酶抑制剂 中心组合Optimization of prepareing antihypertensive peptides from decapterus maruadsi by central composite design process ABSTRACTHypertension is an important risk factor of triggering cardiovascular diseases such as heart failure,stroke,coronary heart diseases,myocardial infarction and so on.It had become a worldwide serious social problem of public health. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory (ACEI) is one kind of important drugs for prevention and treatment of hypertension, but chemical synthesis of ACEI is extremely easy to cause queasiness, vomit, diarrhea and other side effects. Therefore, ACEI peptides from food protein are especially noticeable because of its advantages which includeing safty,little side effects, easily absorbed, and so on, and become one of the focuses in the bioactive peptides research fields.Hydrolyzing with proteolytic enzyme is a new method of protein hydrolysis. It has many advantages, compared with chemical hydrolysis , such as mild reactive conditions , fine control, hydrolysis of high efficiency, besides,in terms of nutrients to maintain, it has a unique advantage. At present,preparing of antihypertensive peptides from food-stuff,such as ingredients the chicken, tilapia, corn protein, egg protein and so on, by enzyme engineering technology, has been reported.The capability of catalysis by protease not only depends on the the very nature of itself, but also relates with its environment where the catalytic reaction takes place. It must not be disregarded the temperature of environment for catalytic reaction,pH, nature of the substrate protein etc.Decapterus maruadsi proteins were hydrolyzed by papain to prepare antihypertensive peptides. The effects of four crucial factors on the degree of hydrolysis (DH) of blue scad proteins were analyzed by single-factor method. Subsequently, a three-factor/five-level Central Composite experimental design combining with response surface methodology (RSM) and quadratic pro-gramming (QP) was employed for maximizing the papain-catalyzed hydrolysis of decapterus maruadsi proteins and a quadratic regression model was obtained using the Design-Expert software.Basing on the maximum point obtained by the model equations, the hydrolysis conditions were determined as follows: temperature 52.55, pH 7.97, and E/S 0.03371.Under such conditions, the predicted hydrolytic of degree(HD) was 24.32, which had acceptable error with the experimental values. These results indicated that the Central Composite Design(CCD) were efficient approaches for optimization of prepareing antihypertensive peptides from decapterus maruadsi.Keyword: Hydrolysis;Decapterus maruadsi;Angiotensin-converting enzyme inhibitor;Central Composite Design目 录摘 要IABSTRACTII目 录IV第一章 绪论11.1 高血压及其危害11.2 食品源降血压肽的研究与制备11.3 降血压肽的作用机理21.4 酶法制备降血压肽31.5 研究目的、意义及主要内容4第二章 实验部分52.1 实验材料52.2 仪器设备52.3 脱脂蓝圆鲹鱼粉的制备52.4 蛋白质含量的测定62.5 酶解蓝圆鲹鱼肉蛋白82.5.1 酶解工艺82.5.2 水解度的测定92.6 酶解条件优化10第三章 实验结果与分析113.1 蓝圆鲹鱼粉的蛋白质含量113.2 响应面实验优化酶解工艺条件113.2.1 响应面实验分析与回归方程的建立113.2.2 响应曲面的分析133.3 验证实验16第四章 结论与展望174.1结论174.1.1 蓝圆鲹的蛋白质含量174.1.2 酶解蓝圆鲹鱼肉蛋白174.1.3 中心组合优化设计174.2 展望17参考文献18附录（一）英文文献原文21附录（二）英文翻译36致 谢47V XX大学学士学位论文 中心组合设计优化酶解蓝圆鲹制备降血压肽第一章 绪论1.1 高血压及其危害 高血压病是最常见的心血管疾病，它不仅患病率高，而且是引起冠心病、心肌梗塞、脑卒中、心脏病及肾功能衰竭的最主要的发病因素。其根据起病和病情进展的缓急及病程的长短可分为两型，缓进型（chronic type）和急进型（accellerated type）高血压，前者又称良性高血压，绝大部分患者属此型，后者又称恶性高血压，仅占高血压病患者的1%5%。这两种高血压都对人类健康构成了严重的威胁。在世界范围内，每年有760万的过早死亡（约占全球总量的13.5）和92万的伤残调整损失寿命年(DALYs)（约占全球总量的6.0）是由高血压引起的，全球约54的中风和47的缺血性心脏病也是缘于高血压1。随着我国经济的飞速发展，人民生活水平的提高，人民平均寿命的延长，我国将步入老龄化社会，患病率将明显上升。在过去的几十年中，中国高血压的患病率和绝对数正在快速增长。例如，中国成年人中估计的高血压人数已经从1960年的3000万增加到1980年的5900万，1991年又增加到9400万，2002年我国高血压的患病率更是达到了27.2，人口数已达1.3 亿2。这种升高的势头仍在持续，并且高血压大大增加了冠心病、心力衰竭、脑卒中的危险，形势十分严峻，直至发生临床迹象如心脏病发作、脑血管破裂等导致死亡，因此高血压被称为“无声杀手”，高血压的这种高发病率、高并发症、高致残率严重影响了人体健康，其己成为成为全球性的重大公共卫生问题。治疗和预防高血压对提高人类的健康水平，延长寿命有着重要的意义。因此，在日常生活中控制高血压的发展进程具有特殊的意义。1.2 食品源降血压肽的研究与制备天然食品中的降血压肽通常是由蛋白质水解酶在温和条件下水解蛋白质而获得的一类多肽，食用安全性高，且它们共同的突出优点是对高血压患者可以起到降压作用，且对血压正常的人无降压作用，同时还具有免疫、促进减肥及消化吸收等生理功能3。因此，对其的研究发展非常迅速。Oshima3等于1979年首次报道了利用细菌胶原酶水解凝胶并从其水解物中分离出了 6种降血压肽。此后 ,研究者相继成功地从大豆、酪蛋白、玉米、酒糟等众多食物蛋白质中获得了ACE抑制肽。日本是研究ACE抑制肽最多的国家，主要从乳源蛋白质中提取，其次是鱼蛋白，其中已有一部分实现工业化生产。我国在这方面的研究尚属起步阶段。但是我国具有丰富廉价的动植物蛋白资源。如何合理利用好现有的资源加工制备高活性ACE 抑制肽是今后研究方向之一。这些研究的进展将促进具有良好的市场前景和社会效益的ACE抑制肽的开发应用。目前，酶解蛋白制备降血压肽的研究从来源上主要集中在植物蛋白（包括大豆蛋白、玉米蛋白和其他一些植物蛋白资源），动物蛋白（包括陆地动物蛋白源、海洋蛋白源）。鱼类蛋白是一种优质动物蛋白，不仅蛋白质含量高，氨基酸模式更接近人体需要。酶水解法条件温和，氨基酸不被破坏，构型不发生变化。在各类多肽的生产中，酶解法是目前研究得最多的一种方法。自从发现蛋白质经酶解处理可以释放出具有各种活性多肽以后，酶解法处理蛋白质就引起了人们的广泛关注。它是目前生产生物活性肽主要采用的方法。如果能够通过酶法加工鱼类蛋白获得抑制ACE 的活性肽，对充分利用我国的蛋白质资源、促进人们生活质量的提高将会收到很好的经济效益和社会效益。其中蓝圆鲹因为价格低廉，富含蛋白质，而具有较高的研究价值4。蓝圆鲹，鲈形目鲹科圆鲹属的一种。又称池鱼，巴浪鱼。暖水性中上层鱼类，分布于中国海南省到日本南部；在东海主要分布于中国福建沿岸；南海密集区在中国台湾浅滩南部、粤东碣石湾外近海、珠江口、海陵岛及海南省东北部近海。蓝圆鲹为南海经济鱼类之一，广西的产量也很大，其资源密度在2000-2001年度为22.1kg/km，达到总渔获比例的1.75。蓝圆鲹肉质坚实，口感普通，为低值鱼，但是蛋白含量高，以蓝圆鲹为研究对象具有高附加值。1.3 降血压肽的作用机理血管紧张素转化酶(ACE)是一种膜结合的二肽羧基肽酶(Dipeptidly carbonoxypeptidase)，广泛存在于体内，在肺毛细管内皮细胞的含量最为丰富。(ACE)是多功能酶，在体内肾素血管紧张素系统(Renin angiotensin system，RAS)和激肽释放酶激肽系统(Kallikreinkinin system，KKS)中，对血压的调节起着重要的作用，见图 11。RAS和KKS在血压调节方面是一对相互拮抗的体系，其平衡协调对维持正常血压有重要作用。ACE在两者系统中对血压调节起重要作用，ACE活力升高破坏了正常体液中升压和降压体系的平衡，导致血管紧张素生成过多，而体系中扩血管物质激肽和前列腺素合成减少，此三种因素共同存在使血压升高。抑制ACE活性对降低血压有积极的影响，因而寻找更有效的抑制剂一起引起人们极大的兴趣。图 11 ACE作用机制Fig.11 Mechanism of ACE降血压肽指的是一类具有抑制ACE活性的多肽物质 ,这些多肽的氨基酸序列和肽链长度各有不同，但都具有类似的功能。ACE拥有两个具有活性的作用位置，分别为N区和C区，它们具有几乎相同的功能，只是对不同底物的亲和力不同。ACE抑制肽是对活性区域亲和力较强的竞争性抑制剂，它们与ACE的亲和力比血管紧张素I或舒缓激肽更强，而且也较不易从ACE结合区释放，从而阻碍ACE催化水解血管紧张素I成为血管紧张素II，以及催化水解舒缓激肽成为失活片段的两种生化反应过程，起降血压作用6。1.4 酶法制备降血压肽目前，制备降血压肽采用的工艺主要有：酶解法、化学合成、直接从发酵食品中分离提取法、化学水解法、微生物发酵法7等。这些方法都有一定的适应范围和特点。其中酶法生产活性肽安全性极高、能在温和的条件下进行定位水解分裂产生特定的肽，且水解过程易控制，并且保存氨基酸的营养价值，近几年报道的活性肽的制备方法皆为酶解法。酶法水解所生产的多肽具有极强的活性和多样性，具有重要的生物学功能，最易被人体吸收，可参与人体生理过程，参与人体的神经、激素内分泌系统和循环系统，对人体健康起着奇特的作用8。考虑到酶法生产活性肽的安全性和成熟性等优点，本研究决定使用酶法制备降血压肽。1.5 研究目的、意义及主要内容广西南临北部湾。北部湾是南海西北部一个天然的半封闭海湾，这片海域区位优越、资源丰富。北部湾海域属热带海洋，适于各种鱼类繁殖生产，加之陆上河流携带大量的有机物及营养盐类到海洋中去，使北部湾成为中国高生物量的海区之一。广西鱼类资源以优质、无污染而在国内外市场享有声誉。鱼类总资源为75万吨，其中底栖鱼类资源量为35万吨，约占总资源量47%，总可捕量约为40万吨。但是海水鱼特别是低值鱼的加工利用率低，例如，传统的加工工艺就是把鱼体经过烟熏烘炸烤盐渍等初级加工后制成鱼糜鱼肠熏鱼鱼干等产品，不仅原料得不到充分利用，加工所得产品附加值也低，科技含量也不高，因此，如何避免海水鱼原料的浪费、合理的开发利用鱼类优质蛋白使其增值成为低值鱼加工方面亟待解决的问题。我国临床常用的一线抗高血压药主要包括利尿药、肾上腺素受体阻断药、钙通道阻滞药和血管紧张素转化酶抑制药等。虽然这些药具有很好的降压效果，但都具有一定的副作用或不良反应。而来源于食品的降血压肽是一类能够降低人体血压的小分子肽的总称。由于其降血压效果明显且对正常血压无影响、无副作用等优点，已成为目前研究的热点。而基于酶法制备蛋白质的各种优异性，本实验将使用该法进行降血压肽的优化研究。酶解蛋白质，需要对蛋白质的原料的成分有充分的了解。而测定原料的蛋白质含量是最重要的一项成分测定。目前常用的蛋白质测定方法包括分光光度法、双缩脲法、凯氏定氮法、电泳分析法、质谱分析法等。凯氏定氮法是目前分析含氮化合物最常用的方法，适用样品范围广泛、 测试结果准确9。而且考虑到本实验室的设备条件，本实验决定使用凯氏定氮法。不同的蛋白质水解物的ACE抑制活性各不相同，而且达到最大抑制活性所需的水解时间也各不相同。酶解蛋白质制备高活性ACE抑制肽存在一个最佳的时间点或是水解度。酶的水解程度受多个方面的因素影响，其主要的影响酶解反应的四个因素：温度，时间，PH值和酶添加量。这几个因素影响可能是单独的或者相互的。在此可以用响应面模型描述因素间的组合获得对酶解的最优条件。响应面法(Response Surface Methodology,RSM)，是一种实验条件寻优的方法，适宜于解决非线性数据处理的相关问题。它囊括了实验设计、建模、检验模型的合适性、寻求最优组合条件等众多试验和统计技术；通过对过程的回归拟合和应曲面、等高线的绘制、可方便地求出相应于各因素水平的响应值。在各因素水平的响应值的基础上，可以找出预测的响应最优值以及相应的实验条件。响应面优化法，考虑了试验随机误差；同时，响应面法将复杂的未知的函数关系在小区域内用简单的一次或二次多项式模型来拟合，计算比较简便，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量、解决生产过程中的实际问题的一种有效方法。响应面优化法，将实验得出的数据结果，进行响应面分析，得到的预测模型，一般是个面，即所获得的预测模型是连续的。与正交实验相比，其优势是：在实验条件寻优过程中，以连续的对实验的各个水平进行分析，而正交实验只能对一个个孤立的实验点进行分析。在这里，将使用Central Composite Design-响应面优化分析10。Central Composite Design，简称CCD，即中心组合设计，有时也称为星点设计。其设计表是在两水平析因设计的基础上加上极值点和中心点构成的，通常实验表是以代码的形式编排的，实验时再转化为实际操作值，（一般水平取值为 0, 1, , 其中0为中值，为极值，=F*（1/ 4）；F 为析因设计部分实验次数, F = 2k或F = 2 k（1/ 2），其中 k为因素数，F = 2 k1/ 2 一般5因素以上采用，设计表有下面三个部分组成：(1) 2k或 2 k （1/ 2）析因设计。(2)极值点。由于两水平析因设计只能用作线性考察，需再加上第二部分极值点, 才适合于非线性拟合。 如果以坐标表示, 极值点在相应坐标轴上的位置称为轴点(axial point)或星点( star point)，表示为(,0, 0) , (0, , 0) , , (0, 0, )星点的组数与因素数相同。(3)一定数量的中心点重复试验。中心点的个数与CCD设计的特殊性质如正交(orthogonal)或均一精密(uniform precision)有关。本实验的目的是：以蓝圆鲹鱼粉为主要原料，用半微量凯氏定氮法测定蓝圆鲹的蛋白质含量；研究蓝圆鲹蛋白在木瓜蛋白酶催化条件下酶解的最优工艺参数，通过研究温度，时间，PH和加酶量四因素对水解度的影响，确定单因素试验的最优工艺条件；而后根据单因素试验结果设计CCD响应面，在底物浓度固定的条件下，优化温度、pH和加酶量对水解度的交互影响，从而确定交互影响的最优酶解工艺条件。48第二章 实验部分2.1 实验材料本实验所采用的主要材料和试剂：蓝圆鲹：采购于北海水产农贸市场，-18冷冻备用；木瓜蛋白酶：广州远天酶制剂厂；硫酸：分析纯，廉江市爱廉化试剂有限公司；盐酸: 分析纯，汕头市西陇化工厂有限公司；氢氧化钠：分析纯，成都市科龙化工试剂厂。2.2 仪器设备本实验所采用的主要仪器：AE2045电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；101C-2电热鼓风干燥箱：上海实验仪器厂有限公司；HH-S型恒温水浴锅：郑州长城科工贸有限公司；A-88型组织捣碎匀浆机：江苏省金坛市医疗仪器厂；凯氏定氮装置：实验室组装；BS 110S型电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；S212恒速搅拌器：上海申顺生物科技有限公司；Starer 3C实验室pH计：奥豪斯仪器（上海）有限公司；E-201-C型pH复合电极：上海精密科学仪器有限公司。2.3 脱脂蓝圆鲹鱼粉的制备鱼粉的细度、干燥方式和脱脂的效果对酶解实验具有重要意义18。烘干对酶解蛋白的色泽，澄清度影响很大，经过烘干处理的鱼粉能有效减少水分含量，增加保质期；脱脂鱼粉制备的酶解蛋白的风味、色泽，溶液澄清度较脱脂前有明显改善，其氨基酸含量，水解得率，及水解效果均高于脱脂前。因此，原料处理采用烘干干燥和脂肪抽提可生产出高质量的蛋白水解物，提高其附加值。本实验的鱼粉制备过程如下：自来水解冻备用蓝圆鲹 去头尾、去骨架 静置0.5h去掉大部分的水 置于80的干燥箱干燥24h 用A-88型组织捣碎匀浆机将鱼片粉碎成鱼粉 过20目筛 选用正己烷做溶剂，鱼粉和溶剂之比为1：3(v/w)，间歇震动1h 浆液过滤，固体洗涤使用布氏漏斗和正己烷 置于80的干燥箱干燥24h 将脱脂蓝圆鲹鱼粉置于冰柜备用2.4 蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法，凯氏定氮装置如下图 21所示： 图 21 凯氏定氮装置Fig.21 Equipment of Kjeldahl determination （1）试验原理 以硫酸铜为催化剂，用浓硫酸消化试样，使有机氮分解为氨，与硫酸生成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨逸出，用硼酸溶液吸收，再用盐酸标准溶液滴定。根据盐酸标准溶液滴定的消耗量计算蛋白质的含量。（2）试剂 400g/L氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠溶于适量蒸馏水中，冷却后，稀释至100mL。20g/L硼酸溶液：称取20g硼酸加蒸馏水中稀释至1000mL。混合指示剂：1 份甲基红乙醇溶液（1g/L）与 5 份溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）临用时混合。（3）方法步骤：a. 消 化 称取 0.5g左右蓝圆鲹鱼粉加入定氮瓶中，再向定氮瓶内加入0.2g硫酸铜、6g硫酸钾及20ml浓硫酸。加热电炉开始消化。经4小时后，溶液呈浅蓝绿色透明液且消化瓶底部没有黑色碳颗粒时，消化结束。冷却后，向定氮瓶中加入20ml蒸馏水，冷却后转入100m1容量瓶中定容。b. 加 样 打开夹子9，取下棒状玻塞6，用吸量管吸取10ml稀释好的消化液，加到反应室小玻杯的棒状玻塞6的下方。让反应液流入反应室7中，塞上棒状玻塞。取一只盛有硼酸-指示剂混合液的锥形瓶，放在冷凝器之下口，冷凝器下口必须浸没在硼酸液面之下。用量筒向小玻杯5加入10m1 40%的氢氧化钠溶液，加完轻轻地旋转着向上提起棒状玻塞，使碱液慢慢流入反应室7，在碱液尚未完全流入时，将玻塞盖紧，向小玻杯5中加入约5ml蒸馏水。再轻提玻塞，使一半蒸馏水流入反应室，另一半留在玻杯中作水封。夹紧夹子9，开始蒸馏，锥形瓶中硼酸-指示剂混合液吸收了氨，由紫色变为绿色，变色后，再蒸馏35分钟，将冷凝管口离开液面1分钟再取出锥形瓶。c. 滴定 用标准盐酸滴定各锥形瓶中收集的氨量。以硼酸液由蓝绿色变回灰色或灰紫色，且半分钟内不褪色为滴定终点，记下所用盐酸体积。本实验标准盐酸的浓度为：0.0101 mol/L（4）分析结果的表述 试样中蛋白质的含量按式（1）进行计算。 式中： X试样中蛋白质的含量，单位为克每百克（g/100 g） ； V1试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升（mL） ； V2试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升 （mL） ； V3吸取消化液的体积，单位为毫升（mL） ； c硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，单位为摩尔每升（mol/L） ； 0.01401.0 mL盐酸c (HCl) 1.000 mol/L标准滴定溶液相当的氮的质量，单位为克（g） ； m试样的质量，单位为克（g） ； F氮换算为蛋白质的系数，取 6.25。 2.5 酶解蓝圆鲹鱼肉蛋白 蛋白质水解物的生产方式分为化学降解法和酶降解法。化学法是用酸、碱等化学试剂在一定温度下促使蛋白质分子的肽链断裂形成小分子物质。酸法多采用盐酸、硫酸等强酸在高温下反应，反应强烈，设备腐蚀严重，水解 彻底，多生成氨基酸混合物，同时在高温下色氨酸完全被破坏，目前已渐被淘汰；碱法水解使氨基酸大多消旋，如使 L氨基酸形成D氨基酸，还能形成有毒物质11，无生物利用价值，因此不宜采用。而酶解法的效率较高，所需条件温和，营养成分的破坏较少，并能产生富含多肽的产物，而二肽和三肽更有利于人体的吸收12。因此，与酸法或碱法相比，酶解法有着不可比拟的优点。 蛋白酶的选择通常以专一性、酶活性、酶的作用条件、价格和风味等为标准，根据不同的需要采用不同专一性的蛋白酶，或采用双酶或多酶来达到所要的酶解效果。常用的蛋白酶通常有:胃蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶等。目前从各种文献来看，酶解蓝圆鲹采用的蛋白酶有胰蛋白酶、Alcalase2.4、复合蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶等几种，酸碱条件一般为中碱性。参考杨萍等的研究13，目前最适合酶解蓝圆鲹的普通酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，再结合本实验室先前的研究，本实验决定使用木瓜蛋白酶对蓝圆鲹鱼粉进行酶解。2.5.1 酶解工艺 精确称取含一定质量蛋白质的蓝圆鲹鱼粉，并且加150mL的去离子水混合均匀，置入三口烧瓶，煮沸15min后冷却至木瓜蛋白酶酶解所需的反应温度，将装有浆液的三口瓶置于已调节到所需温度的恒温水浴锅中，开动搅拌桨，调节酸碱度到所需的pH值后保持溶液体系平衡30min。此时加入木瓜蛋白酶启动反应，并且滴加NaOH溶液维持浆液的pH稳定，每隔一段时间记录相应的用碱量，从实验启动到结束，一般共计时4h。酶解过程结束后，取出三口瓶置于100沸水中加热10min灭活。酶解液置于冰柜中冷藏。 图 22 酶解装置Fig.22 Hydrolysis Equipment2.5.2 水解度的测定 水解度的测定采用pH-start滴定法，为了从宏观上表征整个酶促水解反应，Alder-Nissen引入了水解度（DH）14的概念，即蛋白水解中断裂的肽键数占肽键总数的百分比，其定义式为： （2）式（2）中： h-单位质量底物中已水解的肽键数目，mmol.g-1； ht-底物中蛋白质肽键总数，mmol.g-1； B-碱液体积，L； Cb -碱液的浓度，mol.L-1； -氨基的平均解离度； Mp-底物中蛋白质总量，g。其中，-氨基酸的平均解离度由下式计算： （3）上式中pK值受温度的影响很大，但与底物关系不大，可用下式计算： （4）2.6 酶解条件优化 在研究了底物浓度、酶浓度和pH值的单因素实验基础上，参考相关文献，选用CCD进行响应面设计优化提取工艺参数。在底物浓度，即所反应的蛋白质总量不变的前提下，实验设计以反应温度()、pH值、E/S(加酶量与蛋白质的质量比)为操作因素，分别用 A、B和C来表示 , 每个操作因素设置五个水平、并以+1.68、 + 1、0、-1、-1.68分别代表自变量从高到低的水平, 水解固定时间为4h，以水解度(DH)为响应值，建立二次多项式回归模型。实验的自变量因素水平见表 21。表21 自变量因素和水平编码 Table 2-1 Independent variable factors and level coding独立变量编码水平-1.68-10+1+1.68反应温度()A4547505355pHB6.686.87.07.27.34E/SC0.01440.01980.02770.03560.0410设该二次多项式回归模型是通过最小二乘法拟合的方程式为DH=X0+X1A+X2B+X3C+X12AB+X13AC+X23BC+X11A2+X22B2+X33C2 (5)式中：DH 预测响应值X0 截距X1、X2、X3 线性系数X12、X13、X23 交互项系数X11、X22、X33 二次项系数第三章 实验结果与分析3.1 蓝圆鲹鱼粉的蛋白质含量 实验取空白组一组、原料组两组，各进行23次平行定氮实验，分别取实验结果最靠近的两次数据，结果如下表31表31 凯氏定氮实验结果Table 3-1Experimental results of Kjeldahl determination鱼粉质量（g）盐酸滴加量（mL）空白组00.230.26鱼粉组一0.518923.3323.19鱼粉组二0.512722.2822.32将以上结果代入式（1），测得蓝圆鲹鱼粉的蛋白质含量为78.41，符合相关文献4的测量值。3.2 响应面实验优化酶解工艺条件为了获得具有更好降血压效果的蓝圆鲹鱼粉蛋白酶解产物，在木瓜蛋白酶水解进行单因素实验的基础上，利用响应面优化法进行最适水解条件的优化，表32为响应面实验数据。3.2.1 响应面实验分析与回归方程的建立实验采用Design-Expert.V8.0.5软件对表32的20组实验数据根据方程（5）进行多元回归分析，建立响应面的回归模型，得到水解度(DH)对编码自变量A(酶解温度)、B(pH)及C(E/S)的标准回归方程为：DH = 16.08 - 0.064A - 2.45B + 2.00C + 0.13AB + 0.42AC - 0.41BC + 0.12A2 + 0.28B2 - 0.24C2 （6）转化为实际空间的方程为：DH = 520.69135 - 3.32395A - 114.61023B + 1409.28612C + 0.21458AB + 17.66878AC - 260.28481BC + 0.013111A2 + 7.05996B2 - 3915.97753C2 （7）该模型的方差分析及显著性试验见下表33，由表33的方差分析结果能够看出，本实验所选用的回归模型及其显著（PModel 0.0001），并且方程的失拟项不显著（P = 0.0714），说明方程的误差很小，这也说明各操作因素值与响应值DH之间可以通过该回归模型进行函数化。其中相关系数R2=0.9861，说明水解度的预测值和实验值之间具有很好的拟合度。模型的校正系数Radj=0.9736，这表明只有不到3的水解度的总变异不可以通过该方程模型进行解释。从三个操作因素对水解度DH的影响来分析，回归方程的一次项B(pH)和C(E/S)对水解度有非常显著的影响，而反应温度A的影响不明显，其影响顺序为BC A。交互项AC和BC较显著，而AB不显著。二次项只有B2的p值大于0.05。所以可以简化模型，得到方程（8）：DH =520.69135-114.61023B + 1409.28612C + 17.66878AC - 260.28481BC +7.05996B2 （8）表32 响应面实验结果Table 32 Results of response surfaces experiment序号ABCDH水解度153.00 6.80 0.0356 21.71 255.05 7.00 0.0277 16.20 350.00 7.00 0.0277 16.57 450.00 7.34 0.0277 12.78 547.00 6.80 0.0198 16.60 644.95 7.00 0.0277 16.81 750.00 7.00 0.0277 16.06 853.00 7.20 0.0198 11.78 950.00 7.00 0.0277 16.10 1047.00 7.20 0.0198 12.02 1150.00 7.00 0.0410 18.26 1250.00 7.00 0.0277 15.73 1350.00 6.66 0.0277 21.16 1453.00 7.20 0.0356 16.00 1553.00 6.80 0.0198 15.24 1650.00 7.00 0.0277 15.93 1747.00 7.20 0.0356 15.17 1847.00 6.80 0.0356 20.79 1950.00 7.00 0.0144 12.70 2050.00 7.00 0.0277 16.03 表 33 回归模型方差分析表1Table 33 Variance analysis of regression equation1变异来源平方和SS自由度DF均方MSF 值 FP 值 PrF显著性模型142.26915.8178.730.0001A0.05610.0560.280.6084B82.00182.00408.420.0001C54.90154.90273.430.0001AB0.1310.130.660.4353AC1.4011.406.990.0246BC1.3511.356.740.0267A20.2010.201.000.3410B21.1511.155.720.0378C20.8610.864.200.0652残差2.01100.20失拟项1.6250.324.180.0714误差项0.3950.078总和144.2719R2=0.9861Radj=0.97361、p值0.0001时极显著，p值0.0500时显著，p值0.1时不显著；极显著，显著。3.2.2 响应曲面的分析响应曲面的分析主要是从响应面图形和回归模型方程进行分析。从图31看，在温度与pH交互影响中，等高线几乎与温度轴平行，在试验范围内，随着pH降低水解度上升，而温度的影响几乎没有，这与A和AB项的p值偏大造成的显著性极不明显相对应；同样，图32与图33的情况具有和图 31一定的类似性，只是由于E/S和pH对水解度的影响大于温度的影响，所以其等高线的平行性没有图31明显，曲面也有一定的弯折度，没有显著地表现出图31中曲面的平整性。从三个图分析，在温度53，E/S0.3，pH6.8的范围内，曲面有向极大值点延伸的趋势。但是这种趋势不明显，可能存在很大的偏差，因为试验范围取值较窄的缘故，不能从曲面图像上直观的估计极值点，这里仅能从回归模型方程进行分析。图 31 温度与pH交互作用图Fig.31 Interaction of temperature and pH图 32 温度与E/S交互影响图Fig.32 Interaction of temperature and E/S 图 33 pH与E/S交互影响图Fig.32 Interaction of pH and E/S假设存在这样的最优点（A,B,C）能获得水解度的极大值，则该点应使偏导数。通过计算，获得了这样的一个稳定点(stationary point)（52.55，7.97，0.03371）。稳定点可以是：（1）响应的最大值点，（2）响应的最小值点，（3）鞍点(saddle point)。要知道该点的真正意义，及所谓的相应曲面的刻画，最直接的方法就是去考察所拟合模型的等高线图，但在这里不具有可行性。此外还可以将该点代入模型方程（7），再和各实验值进行比较，这样算得该点的预测水解度DH=24.32，因为这样算出的水解度大于实验所测得的最大的水解度，这使该方程存在极大值的可能性，为能更好的说明问题，在此引进了更加规范化的正则分析28。首先将所拟合的二阶模型写成矩阵记号形式，即：然后利用坐标变换将模型放入一个新的坐标系，原点在稳定点Xs处，此时旋转坐标系直至它们与所拟合响应面的主轴平行为止。这样得到的拟合模型是 （10）其中i是变换后的自变量，i是常数且是矩阵 B 的特征值或特征根，DHs为稳定点处取得的响应值，而（10）式称为模型的正则形式。在本试验中，操作因素有3个，所以特征值i有3个取值，此时行列式B-I= 0,这个行列式可以进一步化简为相应的一元三次方程，该方程用盛金公式29求解，求得的三个不同的实根分别为1=-0.4032，2=-0.3497，3=-0.2135。因为i的三个解值都是负值，所以该稳定点为所拟合模型方程的最大值点28。当然该点已经超出了试验范围之外，为了验证该点所对应的优化条件下的水解度和模型方程的拟合度，在此还要进行验证试验以检测其可靠性。 通过对响应曲面的分析，虽然在pH=6.80附近，水解度的实验值有达到最大点的趋势，但是方程拟合出的pH值超出了取值范围，这可能是由于温度和E/S的影响；另一方面，温度对实验影响的显著性很低，仍需要扩大其取值范围；而E/S影响的显著性虽然是最大的，但是其引起的响应的变化一直有随酶用量增大而增大的趋势。所以要修正响应曲面的设计，可以扩大温度和E/S的水平取值的步长，这样可以实现实验考察的范围扩大，实验就可能获得更加精确和可靠的最优条件的确定。3.3 验证实验通过中心组合设计优化和对拟合模型方程的分析，获得了拟合方程的最大值点，即酶解温度52.55、pH=7.97、E/S =0.03371。为考察该点和实际值的差异，特别是是在pH7.34这样一种超出考察范围的条件下的拟合度，决定在该条件下，进行酶解蓝圆鲹鱼肉蛋白的验证性实验。验证实验除所求的三个条件不一样之外，其余条件，包括设备，和设计响应面的酶解实验均相同。实验所测得的水解度(DH)为21.78，这与24.32的预测值存在可接受的误差。实验表明，在本实验中，在实验考察范围之外的该点处，方程失去了一定的拟合度，但是该方程仍然可用，最优组合依然可靠。此外，本实验没有测定相应条件下，降血压肽的生物活性，这里仅从水解度最大值考虑最优点，这也是实验欠考虑的地方。第四章 结论与展望4.1结论4.1.1 蓝圆鲹的蛋白质含量 本次实验使用凯氏定氮法对蓝圆鲹鱼粉进行了蛋白质含量分析。结果表明蓝圆鲹干鱼粉的蛋白质含量高达78.41，是优质的蛋白质源，适合作为制备ACEIP的原料，具有较高的开发利用价值，同时也证明了凯氏定氮法是测量蛋白质含量的有效方法之一。4.1.2 酶解蓝圆鲹鱼肉蛋白本次实验，在单因素实验的基础上，引进了中心组合设计酶解蓝圆鲹蛋白工艺，并获得各组实验相应的水解度(DH)。通过模型分析，得到模型方程最优组合为酶解温度为52.55、pH为7.97、E/