（生物医学工程专业论文）660nm弱激光照射兔红细胞溶血效应研究.pdf

垒! 堕型 一一j 亟主坠：l | - a b s t r a c t b i o e f f e c t so fl o wi n t e n s i t yl a s e rr a d i a t i o na r ei n t e r d i s c i p l i n a r yr e s e a r c hf i e l d s ， w h i c hi so fi m p o r t a n tp r o s p e c ta n dw i d ea t t e n t i o n t h eh e m o l y s i so fr a b b i t s e r y t h r o c y t e i nv i t r ou n d e ri r r a d i a t i o no f6 6 0 n m s e m i c o n d u c t o rl a s e rw a si n v e s t i g a t e d u n d e rc e r t a i nc o n d i t i o n s ，t h er e s u l t ss h o w e dt h e h e m o l y t i cr a t ei si n c r e a s e d i ts u g g e s t e dt h a te r y t h r o c y t ei st h et a r g e tc e l la n ds e n s i t i v e t o l o wi n t e n s i t y6 6 0 n ml a s e r , w h i c hp r o d u c e dn o t a b l eb i o - e f f e c t s t h er a b b i t sf r e s he r y t h r o c y t es u s p e n s i o nw a s h e db yp h y s i o l o g i c a ls a l i n ei st h eo b j e c tt o b eo b s e r v e d ，s o d i u mh e p a r i ns o l u t i o ni st h ea n t i c o a g u l a n t t h er a t i oo fe r y t h r o c y t e h e m o l y t i cr a t eo fi r r a d i a t i o ng r o u pa n dc o n t r o lg r o u pw i l lb ei n v e s t i g a t e d e x p e r i m e n t a lr e s u l ti n d i c a t e dt h a tl o w - i n t e n s i t y s e m i c o n d u c t o rl a s e ri r r a d i a t i o n e n h a n c e st h er a t i oo fe r y t h r o e y t eh e m o l y s i s ；t h ee f f e c ti st i m e d e l a y e d ( t h e r ew a sn o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h et e s ta n dc o n t r o lg r o u p sw h e nt e s t e di nt w oh o u r s ，b u t a f t e r2 4h o u r st h eh e m o l y s i so fc o n t r o lg r o u pi sp r o m i n e n t ) h e m o l y s i si sp o s i t i v e c o r r e l a t i o nw i t hl a s e rp o w e r ；p o l a r i z e dl i g h th a sn os i g n i f i c a n te f f e c to nh e m o l y t i cr a t e w h e nt h el a s e rp o w e ri ss i m i l a r , t h eh e m o l y t i cr a t eo f6 6 0 n ms e m i c o n d u c t o rl a s e ri s s i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a n6 3 2 8 m h e - n el a s e r i nt h e s a l l ec o n d i t i o n , h e m o l y t i cr a t e m a r k e di n d i v i d u a ld i f f e r e n c e e r y t h r o c y t es u s p e n s i o nw i t hb l o o dp r e s e r v a t i o ns o l u t i o nh a s l o w e rh e m o l y t i cr a t et h a nw h i c hw i t h o u ti t t 1 1 i sr e s e a r c hm a yo f f e rn e we x p e r i m e n t a ls u p p o r tf o r t h es t u d yo fb i o - e f f e c t so fl o w i n t e n s i t yl a s e rr a d i a t i o na n di t sm e c h a n i s m t h e ni m p a c tf a c t o ra n db i o l o g i c a ls i g n i f i c a n c e a l ea n a l y z e d t h en e wi d e at h a te r y t h r o c y t ee n d o g e n o u sp o r p h y r i nm a k e sp h o t o c h e m i c a lr e a c t i o n u n d e rl a s e ri r r a d i a t i o n sa n dl e a dt ob i o l o g i c a le 丘e c t si sp r o p o s e d t h er e s u l to ft h i sp a p e rw i l lp r o v i d ei m p o r t a n te x p e r i m e n t a ls u p p o r ta n dt h e o r e t i c a l g u i d a n c ef o rt h es t u d yo fm e c h a n i s ma b o u tp h o t o - b l o o di n t e r a c t i o n , l o w - i n t e n s i t yl a s e r b i o l o g i c a le f f e c ta n dl o w - i n t e n s i t yl a s e rt h e r a p y t h er e s e a r c hm e t h o do ft h i sp a p e rm a y p r o v i d ea n e ww a yt os t u d yt h el o w - i n t e n s i t yl a s e rb i o l o g i c a le f f e c t k e y w o r d s ：l o w - i n t e n s i t yl a s e r , e r y t h r o c y t e ，h e m o l y s i s ，b i o e f f e c t n 声明尸明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名：盘翌铆扩年f 月日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的全部或部分内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：盏窆 加二年f 月“日 硕士论文 6 6 0 h m 弱激光照射兔红细胞溶血效应研究 1 引言 1 1 光子生物医学介绍 光子学与生物学、医学相互交叉，相互渗透而发展成为了一门新兴学科一光子 生物学与光子医学。光子学在生命科学中的应用随着技术的发展而不断深入。 人类即将跨人崭新的世纪。有关学者预言，二十一世纪生命科学将成为世界科技 发展的焦点。科学技术的核心将是人与人类的发展问题，而生命科学研究 的核心是高等生命活体与人体自身的一些重大问题。作为光子学与生命科学交叉渗透 的新兴学科，光子生物学和光子医学，其主要研究内容将集中在以下几个方面。 1 1 1 激光生物医学 激光器是一种能产生高方向性、高单色性、高强度光束的器件。在光子生物学领 域，它们是最常用的光源。激光的产生和发展给生物医学技术的研究带来了新的机遇 和活力。多年来，在物理学、工程学和生物医学领域工作者的共同努力下，激光在生 物医学领域的研究与应用取得了举世瞩目的成就，也极大地推动了生物医学工程技术 的发展。一批批崭新的激光生物医学仪器被应用于生物医学研究的前沿，在生物学、 医学的检测和诊断方面发挥出前所未有的作用。激光临床医学更是得到迅猛的发展， 激光在临床医学领域的应用已渗透到医学的各个方面，成为治疗许多疾病不可代替的 手段。激光外科学、激光理疗学、激光眼科学、激光肿瘤治疗学等已组成了激光医学 学科。 1 1 2 光学生物成像 在人类健康诊断和疾病治疗方面，生物医学成像已经成为一种最可靠的方法之 一。医学成像的更新换代( 从放射性同位素成像、x 射线成像、计算机辅助层析成像 ( c a t 扫描) 、超声成像、核磁共振成像到今天) 已经使我们的社会健康质量有了革 命性的改进。然而，这些技术仅集中在组织器官层面的结构和解剖学意义上，并且具 有有害健康的副作用、分辨力低等缺点。光学成像克服了这些缺点。一般对可见光而 言，皮肤不是透明的；与此不同，近红外光却可以深入到组织内部。光学成像利用了 生物中细胞、组织、器官或者整个活体的某些生物特性( 反射、散射、吸收和荧光) ， 能监控穿透，反射或者荧光的卒问变化来获得光学图像。利用微创内窥光纤传输系统 可以对很多器官和组织进成像。此外，光学成像以获取尽可能多的细胞和分子水平上 的信息为目标，这为如癌症这样的疾病的早期检测提供了可能性。 1 1 3 生物纳米光子学 l 引言硕士论文 生物纳米光子学是一个新兴领域，主要指的是涉及生物医学科学以及纳米光子学 的研究与应用。它主要研究纳米级光与物质的相互作用，这可以被表述为三个方面： ( 1 ) 以近场几何将光限制在纳米级内；( i i ) 以纳米颗粒及纳米区将物质限制在纳米 级；( i i i ) 纳米光学加工。就纳米光子学在生物医学研究及生物技术中的应用而言， 其范围从生物传感一直到光学诊断，以及光活性治疗。纳米颗粒提供了极其有用的平 台，可以用于细胞内光学诊断以及靶向治疗。纳米颗粒在药物导入中的应用已经有了 明显的增长。生物纳米光子学未来的任务包括：发展新的纳米颗粒，上转换纳米团在 光动力治疗中的应用，以纳米颗粒为基础的活体研究，可以取代当前微阵列的纳米阵 列的发展，塑料生物纳米电子机械设备( b i o n e m s ) 的制造。 i i 4 在微阵列技术中的应用 微阵列技术利用生物传感捕获标记物的微型阵列对大量的d n a 、蛋白质、细胞 和组织片段进行快速同步探测。它为高产、快速的分析大量样本提供了一个强有力的 工具。这种能力在提高基因组学、蛋白质组学和生物信息学这些领域有很重要的价值， 这些领域都是现代结构生物学、疾病分子描述和药物发明的最前沿。生物光子学在微 阵列技术的发展中发挥了很重要的作用，因为光学方法一直都用作检测和读出微阵 列。 1 1 5 光活化治疗：光动力疗法 生物光子学的一个重要研究领域就是利用光来进行医疗。光动力疗法( p d t ) 作 为一种利用光来激发某种外部化学物质，称为光敏剂( 也称p d t 药物) ，来治疗癌症 等疾病的有效疗法而出现。这种药物一般会注射在静脉内或者患病的恶变组织表面， 比如某些皮肤癌的表面。然后用一种特定波长的、能被光敏剂吸收的光进行照射， p d t 药物吸收光子，并产生活性氧原子来灭杀肿瘤细胞。 当p d t 药物注射入人体后，正常细胞和恶变细胞都会吸收这些药物。但经过几个 小时甚至几天的等待以后，正常细胞内p d t 药物的浓度会显著降低。最近的研究表明， 在p d t 药物上附着一些肿瘤靶向基团能使这一等待期减少到几个小时。相反的，那些 恶变细胞依然结合着这些药物，从而使p d t 药物在恶变组织中形成了一个个特定的滞 留区域。在这种情况下，通过正确波长的光源激发p d t 药物，从而利用光化学效应( 非 热能的，即没有明显的局部过热) 有选择性的杀灭恶变组织。对于那些内部器官组织 ( 比如肺部) 的癌症，光是通过一根低损伤的柔韧光纤携带的内窥镜系统导入的；而 对于那些表面皮肤癌症，可以使用直接照射的方法。由于对光的相干性质并不做要求， 日光灯或者激光束等都可以作为光源。 光子学与生物学、医学的结合，大大提高了医疗质量，促进了生物学、医学的发 展。特别是近年来人们对光子学越来越关注，各国投入了大量的人力、物力和财力进 蔓 硕士论文 6 6 0 n m 弱激光照射兔红细胞溶血效应研究 行光子生物学和光子医学的研究，因此在很大程度上推动了光子生物学与光子医学的 发展。在今后，随着技术的不断更新进步，光子生物学与光子医学在社会上的应用将 会越来越广泛。 1 2 研究背景 低强度激光用于临床诊治时所使用的激光器主要为h e - n e 激光器和半导体激光 器，采用的波长范围一般在5 0 0 - - 8 9 0n n a ，功率一般为几毫瓦到几十毫瓦，照射方式 主要有： 体表低强度激光疗法【l 】：包括激光理疗、激光针炙； 低强度激光内照射疗法【2 3 ，4 】：包括血管内照射、内脏表面照射、血液体外照射、 内镜激光腔内照射； 基础研究和大量临床应用表明，低强度激光对生物组织有多方面的刺激作用。能促进 免疫反应，增强巨噬细胞吞噬功能，改善全身状况；能对神经电生理活动和神经损伤 后再生过程发生影响；能促进软组织和骨组织愈合i s ；能改善血液流变学性质，促进 组织微循环。临床上已采用低强度激光以多种照射方式、针对多种疾病进行治疗并在 许多情况下收效良好。低强度激光的生刺激作用可以调节机体的免疫、神经、血液循 环等系统和组织代谢【6 】功能，还可在一定程度上促进软骨细胞 7 1 、造血细胞【8 1 、表皮 细胞及血管内皮细胞【9 j 等的增生。 由于低能量激光血管内照射所产生的生物能量是通过血液循环流动到全身的，因 此对血液及循环系统的影响较多，主要有：降低血粘度、促进红细胞变形、增强血红 素活性、提高抗氧化能力【l 们、舒张血管、调节机体免疫功能、提高酶的活性等作用。 相关文献报道中采用这一疗法治疗有效的病种达5 0 余种，主要有：脑梗塞、心 脏供血不足、急性心肌梗塞、心绞痛等缺血性心脑血管与外周血管疾病，感染性疾病， 免疫性及结缔组织疾患，神经一精神疾患，内分泌代谢疾病及急性胆囊炎，急、慢性 支气管炎和肺炎等疾病。其中对心脑血管疾病、感染性疾病和某些神经一精神疾病的 治疗效果最为显著，它们都论证了该治疗方法在临床治疗领域的多样性。 但是，也有相当一部分的研究【1 1 1 2 1 ，从细胞培养、临床应用、动物模型的角度， 发现低强度激光治疗并不存在确定的治疗作用；有的研究还指出许多疾病在没有任何 治疗的情况下，5 0 是可以自然痊愈的，所以认为低强度激光治疗方法同安慰剂的效 果很难区别。 这些争论的存在正是由于低强度激光治疗机制不明确，尚存在学术争议【1 3 】。较 早期的有前苏联i n y u s h i n1 9 7 2 年提出的生物电场设想、匈牙利m e s t e r1 9 7 7 年提出的 偏振刺激设想、前苏联np0x 0hi - iyk0b 1 9 8 0 年提出的细胞膜受体设想和fama 1 引言 硕士论文 r lek1 9 8 1 年提出的色素调节设想；近期的有周凌云1 9 9 3 年提出的孤子态一混沌态 假说、刘承宜等1 9 9 7 年提出的生物信息模型、w i l d e n 等1 9 9 8 年提出的引入电子辐 射现象的线粒体能量传递理论模型、c h i c h u k 等1 9 9 9 年提出的自由基机制假说等。 鉴于低强度激光生物效应的复杂性和多样性，存在争议的焦点主要是以下几个方 面的问题： 1 光与生物组织相互作用的立足点 光只有被吸收才能产生生物效应，这就是说，低强度激光生物效应的出发点是光 与物质相互作用；激光作用的对象是有生物活性的，并执行生物功能的活细胞及生物 大分子。生命物质对外界的反应不是被动的接受，而是能动的适应。 具体到激光的临床应用及激光对离体细胞效应的研究中，哪个环节才是激光作用 的关键点? 是否存在特异性的光受体? 是否存在初始的光受体? 光信号又是如何在 体内传导放大并且产生生物效应? 这些都是研究的热点问题。 2 激光的特性 在激光诸特性中，激光的高亮度和方向性与低强度激光生物效应无关。与低强度 激光生物效应最相关的是单色性，即波长。但激光生物效应的波长特异性究竟有多大， 目前还不是很清楚。理论上讲，特定波长的激光只能与特定的生物大分子相互作用， 引起特定的生物效应。而实际上，尽管低强度激光生物效应有一定的波长选择性，但 不同波长的激光生物效应有许多共同的表现。特别应当指出的是，包括c 射线、x 射线、紫外线、可见光以及红外线在内的各种电磁辐射在低强度时都对生物体具有某 些共同的兴奋效应【m 1 5 】，如调节细胞周期、促进d n a 辐射损伤的修复、清除自由基 和活性氧、刺激生长与增殖以及免疫兴奋效应等。激光的相干性与偏振性是否起作用 是很值得怀疑的，k a r u 等人对其持否定态度【1 6 1 。 3 照射功率( 照射剂量) 激光照射剂量较低时对生物体具有刺激作用，随着照射剂量增加则会对生物体产 生抑制、损伤、诱变甚至致死作用。但是照射剂量的高低界定因照射波长、照射对象 ( 细胞、组织、器官、物种) 及其生理状态的不同而不同。就细胞效应而言，波长较 短时产生刺激效应所需的照射量较低；对高等动物不产生诱变效应的照射量对植物或 低等动物则可能产生诱变效应。 4 时间效应 有研究认为，低强度激光刺激效应与低剂量( 电离) 辐射兴奋效应在许多方面有 相似之处，激光与电离辐射又同属电磁波，激光有着与电离辐射类似的作用时间表。 该时间表大致也可划分为三个阶段，即物理阶段( 1 0 _ 1 2 s ) 、化学阶段( 数分钟内) 和生物学阶段( 数小时到数十天) 。 物理阶段内，初始光受体吸收激光而被激发( 可见光和近红外光可引起分子振动 4 硕士论文 6 6 0 r i m 弱激光照射兔红细胞溶血效应研究 能级改变) ，或发生结构( 构象) 功能的改变，至于激光是否可以引起分子电离而产 生自由基，还不能下定论；化学阶段内，光受体吸收激光后或直接参与生化反应，如 在呼吸链中传递电子( 提供能量) ，或作用于信使分子，发生光信号的传导与放大( 光 子只是作为一种触发信号) ，或以光子的形式将能量重新释放出来( 激光诱发荧光) ， 或引起某些尚未知的生化过程；在生物学阶段则表现出各种生物学效应。以上只是一 个十分粗浅的轮廓，其中许多细节还很不清楚，但对于认识低强度激光生物效应的整 个过程及其有关机理有重要的指导作用。 5 全身效应 单纯从提供能量的角度根本无法解释低强度激光或者其它辐射的生物刺激效应， 特别是非特异性的“全身效应( s y s t e m i ce f f e c t s ) ，这已经被普遍认剐1 7 】。 杨在富等的研究认为：光子作为触发信号，生物体可以对光信号进行传导和放大 ( 包括神经系统的参与) ，进而产生生物效应，这是活的生物体对外界信号刺激的应 激与能动适应的结果。光信号能否被传导和放大以及能达到什么程度，取决于三个方 面：1 是否存在初始光受体；2 照射对象处于何种生理状态；3 光刺激的累积效应( 适 当的照射功率和累积时间) 。 k a r u 等研究指出细胞受刺激的最早反应是细胞内c a 2 + 浓度的变化( h e - n e 激光 照射淋巴细胞引起胞内c a 显著增加) ，低强度激光照射可能是通过细胞内c a 2 + 直接 和间接调控多种细胞效应，如细胞的代谢、增殖等；也有人认为，光照后c g m p 的变 化早于c a ? ，是更早的信使分子。 微弱信号探测技术使人们认识到，细胞处于分裂期或氧化代谢旺盛的时候伴随有 微弱的光辐射，这种光辐射可以诱导空间上相隔离的细胞分裂或代谢活动，已有实验 支持同类细胞之间存在光通讯联系。 综上所述，极低的激光功率( 1 5m w ) 对生物组织的潜在作用自从被匈牙利的 外科医生m e s t e r 在6 0 年代末提出以来，它就成为一个有争论的课题，至今还没有形 成能为学术界普遍接受的理论，目前该领域比较认同的是认为低强度激光照射主要是 一种生物刺激效应，至于这种生物刺激该如何科学地给予定义? 刺激效应是如何产生 的? 如何作用的? 都是一直未解决的问题。激光辐射特性中的相干性、窄的带宽、偏 振，哪一个对生物刺激来说是首要的呢? 是否必须是激光，还是任何一个非相干光源 都行? 因此，生物刺激仍然是包括许多疑问的研究领域。在这个领域我们非常需要详 细的研究以及具有重现性的实验结果，从根本上阐明低强度激光与生物组织相互作用 的机理。这些研究理论上地位重要，实际中需求迫切。本文正是基于这个背景下探索 低强度激光与生物组织相互作用的机理研究。 1 3 弱激光临床治疗机理研究进展 5 l 引言硕士论文 众多的实验表明，低强度激光具有确定的细胞效应，但是这种效应产生的机制并 不明了。本文综述了低强度激光照射对离体细胞效应的研究进展，主要讨论了低强度 激光照射对造骨细胞，成纤维细胞，骨骼肌细胞，造血细胞的效应【1 8 】。 1 3 1 造骨细胞 c o o m b e 等人研究了连续波长的二极管激光照射来源于间叶细胞的造骨细胞的作 用。其中一个试验组在培养的第3d ，5d ，7d 用波长为6 9 0n l l l 的脉冲软激光照射造 骨细胞6 0s 。另一组为对照。在8d ，1 2d 和1 6d 后，用荧光四环素检测细胞的骨生 长情况。实验发现：1 6 天后，受激光照射后的细胞比没受过激光照射的细胞产生更 多的荧光骨沉淀。因此，作者认为脉冲软激光对造骨细胞有生物刺激作用。u e d a 等 人利用从胎鼠颅中分离出来的造骨细胞用低强度的g a a l a s 激光( 8 3 0n m ，5 0 0m w ) 照射，分两种照射方式：一种是连续照射( c d ，一种是用i i - - i z 的脉冲照射( p d 。他们 观察了细胞增殖、骨节结形成、碱性磷酸酶( a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，a l p ) 的活性和基因 表达。与不照射组比较，激光能极大地增强细胞增殖、骨节结的形成、a l p 活动和 a l p 基因表达。特别是与c i 对比，p i 能显著地刺激这些因素。因为1 h z 脉冲激光照 射能极大地增强骨形成，所以认为脉冲频率应该是低强度激光刺激骨形成的重要因 素。y a m a d a 等人用培养的造骨细胞通过激光照射研究它们的增殖率、分化和钙化， 使用的激光为h e - n e 激光，无性繁殖系的造骨细胞( m c 3 t 3 - - e 1 ) 被不同强度的激光照 射。在长期培养中，c a 寸的积累可以被1j c i n 2 的4 次激光照射所增强，比对照强4 6 ， 但是激光的照射不能提高碱性磷酸酶的活性，电子显微镜显示高尔基体在激光照射后 有增大的趋势。这些结果显示激光照射对造骨细胞有光刺激作用，能促进造骨细胞的 生长和钙化，从而增强骨的再生。 1 3 2 成纤维细胞 创伤愈合是以成纤维细胞的增殖、迁移、肉芽组织形成、胶原分泌、胶原化瘢痕 形成及改建为特点的过程，成纤维细胞参与了创伤愈合的全过程，其数量及功能变化 影响创伤愈合。在低强度激光治疗伤口的研究中，许多学者用培养的成纤维细胞为模 型，研究低强度激光对创伤愈合影响的机理。低强度激光信号能促进成纤维细胞增殖 已被实验证实。v a n b r e u g e l 用不同能量密度和照射时间的h e - n e 激光照射人单层成 纤维细胞，发现小于2 9 1m w 时可促进成纤维细胞的增殖，而大于5 9 8m w 时则无 效果。a l m e i d a 等用强度为2j c m 2 的6 7 0n n l 、7 8 0n n 、6 9 2n n l 和7 8 6 衄四种波长 低强度激光照射牙龈成纤维细胞，同样发现低强度激光能引起牙龈成纤维细胞的增 殖。h r n j a k 等发现单次照射，剂量为o 5j c i n 2 、1j c m 2 、1 5j c n l 2 、2j c n l 2 均有显著 6 硕士论文 6 6 0 r i m 弱激光照射兔红细胞溶血效应研究 的刺激作用，而次照射则无作用。飚p s h m z c 等人用h e - n e 激光从0 1j c | m 2 到6 3j c m 2 的照射强度照射成纤维细胞时发现在成纤维细胞中血管内皮生长因子( v e g f ) 的分泌 量是非照射组的1 6 倍，并且效应都是呈剂量依赖关系的。成纤维细胞用2 1j c m 2 激光照射时效应最为明显。并且他们还发现2 1j e r a 2 的激光照射能诱导成纤维细胞 的增殖。但某些实验也有相反的结果，h a l l m a n 等发现h e - n e 激光对培养不同代数的 成纤维细胞的增殖均无促进作用。g u t k n e c h t 等用n d ：y a g 激光( 脉冲能量3 0m j 一 1 2 0m j ，脉冲速率2 0h z 一1 0 0h z ，能量输出1 5m w - - 3 0m w ，照射时间1 0s 一6 0s 照射l 一9 2 9 成纤维细胞，结果显示激光的照射能使细胞d n a 合成和细胞分裂受到 抑制。g l a s s b e r g 等人用5 7 7d i n 光泵蒲可调染料激光照射成纤维细胞，5j c m 2 1 2 j c m 2 的照射剂量能抑制成纤维细胞的增殖，大于1 2j c m 2 的照射剂量能抑制成纤维 细胞的蛋白质合成。5j c m 2 8 5j c m 2 的照射剂量对细胞活力无影响。j o y e e 等人早 先的试验已发现了低强度激光照射能诱导细胞对致电离辐射的适应性、保护性反应。 接着他们又研究了低强度激光照射对i n d i a n m u n t j a c 成纤维细胞对致电离辐射破坏作 用的适应性、保护性反应。11 5j c m 2 和2 3 0j c m 2 的6 6 0s i n 低强度激光照射能诱导 明显的适应性反应，表现为降低了辐射引起的染色体失常，但细胞存活量并没有增加。 进一步的分析表明：染色体失常率的改变是由于激光引起了g 2 期延迟的延长。所以 适应性反应是由于低强度激光对细胞周期的调节，在这一波长的激光不会由d n a 损 伤而引起细胞周期进程的改变。 1 3 3 骨骼肌细胞 s c h w a r t z 用h e - n o 激光照射骨骼肌培养物，发现照射后，肌管中有瞬间的胞内 c a 2 + 离子浓度的上升。肌管预孵光敏剂5 一a l a 或者血卟啉( h p ) 后，照射3 j c m 2 的 h e - n e 激光，检测到胞液的钙上升。另外，h e - n e 激光照射能提高n g fm r n a 的含 量5 倍。因而，作者认为光诱导的c a 2 + 的瞬间变化能使n g f 从肌管中释放出来。n g f 可能是低强度激光能起作用的原因。s h e f e r 的研究发现低强度激光能增强成肌细胞的 增殖，刺激进入细胞周期。低强度激光也能增强肌纤维和成肌细胞的存活。在实验中 发现抗衰老蛋白b c l 一2 的表达大大的增强了，但蛋白b a x 的表达降低。在实验中， p 5 3 和c d k ( c y c l i n - d e p e n d e n tk i i 粥e ，周期依赖性激酶) 的抑制子p 2 1 的表达降低。 这一实验表明低强度激光在一定稗度上能抗衰老，同时对损伤后的肌肉再修复有重要 的意义。s h e f e r 的另一研究还发现低强度激光能激活m a p k e r k 途径。所以通过激 活m a p k e r k 而不激活j n k 和p 3 8m a p k 酶，低强度激光能刺激骨骼肌卫星细胞 的增殖和延迟分化。 7 1 引言硕士论文 1 3 4 造血细胞 o 。k a n e 研究了低强度激光( 6 6 0n l ，1 2m w ，5 k h z ) 在两种造血细胞甩一6 0 和 u 9 3 7 中的作用，照射强度为1 0j c m 2 到1 1 5j c m 2 ，h l 一6 0 细胞在大于或等于5 8 j c m 2 时，被照射的细胞的3 h t d r 降低；在u 9 3 7 细胞中，5 8j e r a 2 ，7 2j c m 2 ，和 1 1 5j c m 2 的照射也使3 h t d r 降低了。l o g a n 研究了低强度激光( 6 6 0m ，1 2m w ， 5 1 d - i z ) 对哺乳动物细胞的细胞毒性和遗传毒性影响。结果发现低强度激光对细胞没有 细胞毒性和遗传毒性的损伤，这一实验表明低强度激光对细胞没有伤害作用。欧阳淹 等的研究结果表明，不同波长对造血细胞的作用效率不同。他们用激光照射人胎肝造 血细胞，造血细胞在波长5 4 0n i n 处有明显的吸收峰，而在4 8 8m 和6 3 2 8 衄处吸 收不明显。钱美华等采用3 组不同波长的低能量铜蒸汽激光，结果显示经5 1 0 6 衄 和5 7 8 2n l i l 激光照射两组脐带造血细胞，经体外培养，造血细胞集落( g mc f u c ) 较 对照组升高，而经这两种波长激光同时混合照射的脐带造血细胞培养后增殖不显著。 孙酬经等以铜蒸汽激光为光源，输出两种激光波长分别为5 1 0 6n l n 和5 7 8 2n l t l ，平 均输出功率为1m w ，照射人胎及亲生小鼠骨髓细胞，结果显示，两种波长对人胎、 小鼠骨髓造血细胞g mc f u e 均有明显的促增殖作用，不同能量对造血细胞作用效率 也不同。厉位阳报道了5 1 0 6r l l t l 激光对造血细胞的刺激作用，发现激光能促使颗粒 一巨噬细胞集落形成单位( g m - - c f u c ) 增多。 1 4 本文的研究内容 本文的研究目的就是以低强度激光与动物离体红细胞的相互作用为立足点，从实 验上来观察6 6 0 r i m 半导体激光和6 3 2 8 n m h e - n e 激光照射对离体红细胞的生物作用， 观察低强度激光对红细胞溶血率的影响，探究其是否会促进离体红细胞的溶血。促进 溶血的效应与哪些参数有关。进而从理论上研究低强度激光与生物组织相互作用的机 理。 具体做了以下几项工作： 1 6 6 0 r i m 半导体激光照射兔血溶血效应的研究：主要研究6 6 0 r i m 半导体激光照射 兔血产生溶血效应，不同的时间和不同的功率的溶血现象的研究，并找出相应的功率 阈值。 2 6 6 0 n m 半导体激光与6 3 2 8 n m 氦氖激光溶血效应的对比：主要研究不同波长的 激光对生物组织作用会产生怎样不同的效应。 3 保养液对弱激光照射兔红细胞溶血效应的影响的研究：主要研究以血液保养液 保存血样与以肝素直接抗凝对溶血效应产生的不同影响，进一步研究产生这种不同的 原因。 8 硕士论文6 6 0 h m 弱激光照射兔红细胞溶血效应研究 本文的研究结果表明在弱激光与血液的相互作用过程中，激光照射红细胞出现 的生物效应与激光照射血液出现的生物效应存在着关联，这些都需要更详尽的研究。 同时需要明确的是，本文的实验结果与已有大量文献所报道的关于低强度激光用于临 床治疗具有充分的安全性并不矛盾。 本文的研究结果对于研究光与血液相互作用的机理、研究低强度激光在治疗时产 生的生物效应、研究低强度激光的临床应用有一定的参考意义：本文的研究方法对于 低强度激光的生物效应研究构造了一种研究模型，亦提供了一种研究途径。 正是由于在激光照射后即刻观察未见有明确的损伤效应出现，从而有学者建议可 以适当的加大低强度激光照射治疗的功率及照射时间。但是，从本实验结果来看，在 不明确低强度激光与血液等生物组织作用的机理及破坏阈值的情况下，临床应用过程 中在选择激光治疗参数上存在着很大的随意性和不科学性，这也正是深入开展低强度 激光基础研究的目的所在。 9 36 6 0 r i m 半导体激光照射兔红细胞溶血效应研究硕士论文 2 弱激光与细胞相互作用的生理学基础 2 1 红细胞的结构及功能 血液( b l o o d ) 约占成年人体重的7 ，成人循环系统中血液总容量约5 l 。血液 由血浆( p l a s m a ) 和血细胞( b l o o dc e l l ) 组成【1 9 1 。从血管中抽取少量血液，并加入适 量抗凝剂( 如肝素或枸橼酸钠) ，血液的有形成分经自然沉降或离心沉淀后，可分出 三层：上层为淡黄色的血浆，下层为红细胞，中间的薄层为白细胞和血小板。 血浆相当于结缔组织的细胞间质，约占血液容积的5 5 ，其中9 0 是水，其余 为血浆蛋白( 白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原) 、脂蛋白、脂滴、无机盐、酶、激素、 维生素和各种代谢产物。血液流出血管后，溶解状态的纤维蛋白原转变为不溶解状态 的纤维蛋白，于是凝固成血块。血块静置后即析出淡黄色清明的液体，称为血清 ( s e r u m ) 。 血液保持一定的比重( 1 0 5 0 一1 0 6 0 ) ，p h ( 7 3 7 4 ) ，渗透压( 3 1 3m o s m ) ， 粘滞性和化学成分，以维持各种组织和细胞生理活动所需的适宜条件。 血细胞约占血液容积的4 5 ，包括红细胞、白细胞和血小板。在正常生理情况下， 血细胞和血小板有一定的形态结构，并有相对稳定的数量。血细胞形态结构的光镜观 察，通常采用w r i s t 或g i e m s a 染色的血涂片标本。血纽胞分类和计数的正常值如下： 厂红细胞3 5 0 - - 5 5 0 万个m广中性粒细胞5 0 一7 0 lr 有粒白细胞 嗜酸性粒细胞0 5 - - 3 li ( 粒白细胞)l 嗜碱性粒细胞。一1 血细胞白细胞4 0 0 0 - - 1 0 0 0 0 万个山弋 li，淋巴细胞2 0 - - 3 0 i无粒白细胞一 血小板1 0 - - 4 0 万个肛l ( m m 3 )l 单核细胞3 - - 8 红细胞( e r y t h r o c y t e ，r e db l o o dc e l l ) 直径7 8l a i n ，呈双凹圆盘状，中央较薄 ( 1 0 岬) ，周缘较厚( 2 0l a m ) ，故在血涂片标本中呈中央染色较浅、周缘较深。红 细胞的这种形态使它具有较大的表面积( 约1 4 0i t m 2 ) ，从而能最大限度地适应其功 能一携0 2 和c 0 2 。新鲜单个红细胞为黄绿色，大帚红细胞使血液呈猩红色，而且多 个红细胞常叠连一起呈串钱状，称红细胞缗线。红细胞有一定的弹性和可塑性，细胞 通过毛细血管时可改变形状。红细胞正常形态的保持需a t p 供给能量，由于红细胞 缺乏线粒体，a t p 由无氧酵解产生：一旦缺乏a t p 供能，则导致细胞膜结构改变， 细胞的形态也随之由圆盘状变为棘球状。这种形态改变一般是可逆的，可随着a t p 1 0 硕士论文6 6 0 a m 弱激光照射兔红细胞溶血效应研究 的供能状态的改善而恢复。成熟红细胞无细胞核，也无细胞器，胞质内充满血红蛋白 ( h e m o g l o b i n , h b ) ，血红蛋白是含铁的蛋白质，约占红细胞重量的3 3 ，它具有结 合与运输0 2 和c 0 2 的功能。 正常成人每m 血液中红细胞数的平均值，男性约4 0 0 万- - 5 0 0 万个，女性约3 5 0 万- - 4 5 0 万个。每l o o m l 血液中血红蛋白含量，男性约1 2 一1 5g ，女性约1 0 5 1 3 5g 。 红细胞的渗透压与血浆相等，使出入红细胞的水分维持平衡。当血浆渗透压降 低时，过量水分进入细胞，细胞膨胀成球形，甚至破裂，血红蛋白逸出，称为溶血 ( h e m o l y s i s ) ，溶血后残留的红细胞膜囊称为血影( g h o s t ) 。反之，若血浆的渗透压 升高，可使红细胞内的水分析出过多，致使红细胞皱缩。凡能损害红细胞的因素，如 脂溶剂、蛇毒、溶血性细菌等均能引起溶血。 红细胞的平均寿命约1 2 0 天。衰老的红细胞虽无形态上的特殊性，但其活动机 能和理化性质都有变化，如酶活性降低，血红蛋白变性，细胞膜脆性增大，以及表面 电荷改变等，因而细胞与氧结合的能力降低且容易破碎。衰老的红细胞多在脾、骨髓 和肝等处被巨噬细胞吞噬，同时由红骨髓生成和释放同等数量红细胞进入外周血液， 维持红细胞数的相对恒定。老化红细胞的消亡途径大约有两个：一是老化细胞本身破 裂溶血；另外是被吞噬细胞吞噬。不论是自溶还是被吞噬都是由于细胞膜结构发生了 改变。 2 1 1 红细胞的老化、溶血的特点与机制 对红细胞老化问题的研究可以说已有5 0 多年的历史，1 9 4 6 年已经能测定红细胞 的寿命，发现人的红细胞成熟后，在血液循环中可存活1 2 0 天【2 0 2 1 1 。相继测定了兔、 猫及狗的红细胞寿命，兔及猫红细胞存活2 0 天，狗1 0 0 天，说明虽然都是红细胞， 在不同动物有不同的存活期。 红细胞成熟后细胞核即脱落，血液循环中的红细胞基本是成熟红细胞，少数为网 织红细胞。成熟的红细胞无核，自身无修复能力，所以老化过程的效应易被检测。另 外，红细胞膜易分离提纯，所以红细胞成为研究细胞老化机制的良好模型。红细胞存 活时间受许多因素的影响：如物理( 机械地受压、受挤) 、化学( 药物、代谢产物) 、 生化( 酶、活性物质) 及免疫( 免疫反应、补体反应) 等因素，这些因素之间关系错 综复杂，而且机体还受外界的许多影响，所以研究细胞老化是一个很复杂的问题。 老化红细胞的消亡途径大约有两个：一是老化细胞本身破裂溶血；另外是被吞噬 细胞吞噬。不论是自溶还是被吞噬都是由于细胞膜结构发生了改变，所以研究细胞老 化只有从膜结构的变化着手，才能较深入探讨老化机制。 老化红细胞的特点： 1 密度增高随着红细胞的老化，细胞密度逐渐增高。通过密度梯度离心法分离 年轻、年老红细胞已成为一种经典方法。 36 6 0 n m 半导体激光照射兔红细胞溶血效应研究 硕士论文 2 形态改变通过对血库不同存储时间的红细胞进行扫描电镜观察，可见随着存 储时间的延长( 即红细胞逐渐老化) ，细胞变为球状，体积也缩小。 3 变形性和稳定性降低老化红细胞比年轻红细胞变形性明显降低。 4 囊泡化红细胞的囊泡化被认为是红细胞老化的一个重要特征。囊泡形成的原 因可能是膜受到了一些因素的影响，如c 矗2 + 增多，a t p 减少、氧化损伤等，使膜变得 不稳定，为了维持一定的结构，膜需要重排，于是释放出囊泡。正常人的新鲜血中很 难找到囊泡，因为体内产生的囊泡能很快被脾脏吞噬。许多人采用体外诱导法使红细 胞产生囊泡，以建立衰老模型。 5 抗原性改变老化红细胞膜，特别是在存储过程中已经破溶的红细胞的膜结合 有大量的i g g ，主要位于带3 蛋白及其降解物部位，表明红细胞老化过程中膜带3 蛋 白降解使膜产生了新抗原，可结合i g g 。 红细胞的溶血( h e m o l y s i s ) 一般是血液循环中的红细胞寿命短于正常生存周期 ( 1 2 0 天) 而被溶解( 或破坏) 的一种病理现象。在生理情况下，红细胞寿命为1 2 0 天，其自然消亡与骨髓红细胞生成呈平衡状态，使红细胞总量保持稳定。而在病理状 态下，由于各种原因导致红细胞出现形态异常、破坏增多可导致红细胞的消亡；红细 胞主要在两种场所消亡：一是红细胞在循环中溶解破坏，称为血管内破坏，占正常红 细胞破坏的1 0 一2 0 ；二是红细胞在脾、肝和骨髓器官中被巨噬细胞吞噬而破坏， 称为血管外或细胞内破坏，占正常红细胞破坏的8 0 - - 9 0 。红细胞在两个场所破坏 明显增加而呈病理性时，则分别称为血管内溶血和血管外溶血。 导致红细胞破坏而出现溶血现象的最终机制都是红细胞膜的改变，常见的有以下 几种。 1 膜面积减少如球形红细胞和口形红细胞，由于细胞内钠潴留等，使红细胞破 坏。 2 膜脂质流动性减低这是造成红细胞变形性减低的原因，红细胞在通过微循环 血管时易被扣留和破坏，是重要的溶血机制。 3 膜的完整性遭到破坏如补体复合物、磷脂酶、氧化性损伤、机械损伤等。其 中氧化性损伤是多种病理性溶血( 特别是g 一6 p d 缺乏症和珠蛋白生成障碍性贫血) 伴有的病理改变。 4 膜的改变红细胞膜发生变化，易被巨噬细胞识别和清除。这种改变包括膜表 面的i g g 、i g m 和变性珠蛋白体的变化，是自身免疫性溶血性贫血的重要溶血机制。 2 1 2 红细胞膜的结构及功能 红细胞的多种重要