（作物遗传育种专业论文）水稻广亲和基因近等基因系代换片段长度检测及广亲和基因精细定位.pdf

叁堡 查堡 墨塑至里堑篓苎旦墨垡垫生垦丝竺塑墨 墨塑墨里堕塑塞壁 水稻广亲和基因近等基因系代换片段长度检测及广亲 和基因精细定位 研究生 余波 导师 陆驹飞 扬州大学农学院 江苏扬州2 2 5 0 0 9 摘要 通过连续多代回交将来自不同原始广亲和品种 0 2 4 2 8 d i l l 缸 花糯 窝爱嘎 c p s l o l 7 k e t a nn a n g k a 的水稻广亲和基因夥导入典型籼稻品种南京1 1 号和典型 粳稻品种巴利拉中 获得近等基因系 利用分子标记 对部分近等基因系的代换 片段长度进行检测 在代换片段长度检测的基础上 进一步将广亲和基因座确定 在分子标记j 1 3 j 2 6 之间 两标记问的物理距离为1 3 k b 同时 确定了色素原基因 的物理位置及其与广亲和基因之间的物理距离 对不同近等基因系阈描穗期 株 高等性状的差异所对应的代换片段差异进行了初步探讨 初步结果如下 1 检测结果表明 4 t i t 近等基因系 0 2 4 2 8 一n 1 1 d u l a r n 1 1 0 2 4 2 8 b a d u l a r b a 代换片段的平均长度分别为4 2 1 8 k b 5 0 0 5 k b 5 2 3 5 k b 5 1 0 3 k b 2 通过对部分近等基因系的分子检测 在分子标记j 1 3 j 2 6 范围内找到5 个重组体 将广亲和基因座确定在这两个标记之问 两标记间的物理距离为1 3 k b 用基因预测软件f g e n e s h 对该区段进行基因预测 在该区段内只有2 个开放阅 读框 1 个位于负链 1 个位于正链 负链上的基因编码一个功能未知的蛋白 正 链上的基因编码真核生物天氡氨酸蛋白酶 天氡氨酸蛋白酶基因最有可能是广亲 和基因的候选基因 此结果将对跗 的克隆以及分子标记辅助选择具有一定意义 扬州大学硕七学位论文 2 3 通过代换片段检测将色素原基因c 定位于标记r m l 9 5 5 6 与r m 2 5 3 之间 的1 8 8 k b 范围内 该位点与广亲和基因秽的物理距离大约为4 2 7 9 4 k b 4 在分子标记r m 2 0 0 1 2 与标记r m 2 0 0 1 7 2 之间的重组与株高相关 这2 个标记之间的物理距离大约为4 8 m b 可能在此区域内有与株高相关的基因存在 关键词 水稻 广亲和基因 代换片段 近等基因系 基因定位 余薮在望广差和基遏墨壁因墨垡壅苎垦篓堕丝曼墨 墨塑至望矍望塞竺三 l e n g t hd e t e c t i o no f s u b s t i t u t i v ef r a g m e n t si nr i c en i l s a n df i n em a p p i n gf o rw i d ec o m p a t i b i l i t yg e n es 手 a d v i s o r l uj u f e i a b s t r a c t r i c ew i d ec o m p a t i b i l i t y w c g e n e 秽f r o mv a r i o u so r i g i n a lw i d ec o m p a t i b i l i t y e u l t i v a r s 0 2 4 2 8 d u l a r h u a n u o w o a i g a c p s l 0 1 7 k e t a nn a n g k a w l r ei n t r o d u c e di n t o t y p i c a li n d i c ac u l t i v a rn a n j i n g 11a n dj a p o n i c ac u l t i v a rb a l i l l at oe s t a b l i s hn i l s m o l e c u l a rm a r k e r sw e r ee m p l o y e dt os u r v e yt h el e n g t ho fs u b s t i t u t i v ef r a g m e n t si n s o m en i l s b a s e do nt h es u r v e yr e s u l t s t h ew i d ec o m p a t i b i l i t yg e n es 于w a sf u r t h e r l o c a t e db e t w e e nm o l e c u l a rm a k e r s1 1 3a n dj 2 6 t h ep h y s i c a lp o s i t i o no fg e n e c c h r o m o g e nf o ra n t h o e y a n i n a n d i t s p h y s i c a ld i s t a n c e t os fw a sd e f i n i t e d a p r e l i m i n a r yd i s c u s s i o nw a st a k e n o nd i f f e r e n c e so f s u b s t i t u t i v ef r a g m e n t sc o r r e s p o n d i n g t oh e a d i n gs t a g ea n dp l a n th e i g h ta m o n gn i l s a n dt h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s 1 t h ea v e r a g el e n g t h s o fs u b s t i t u t i v e f r a g m e n t s i n n i l s 0 2 4 2 8 n 1 1 d u l a r n 1 1 0 2 4 2 8 b a d u l a r b a w e r e4 2 1 8 k b 5 0 0 5 k b 5 2 3 5 k b 5 1 0 3 k b r e s p e c t i v e l y 2 f i v er e c o m b i n e dn i l sb e t w e e nm o l e c u l a rm a r k e r sj 1 3t oj 2 6w e r ef o u n d n e d i s t a n c eo f t h e2m a r k e r si s1 3k b w cg e n el o c u sw a sl i m i t e di nt h i sr e g i o n f u r t h e r l y g e n ep r e d i c t i o nw a st a k e ni nt h i sr e g i o nb yf g e n e s h a n do n l yt w oo r f s o p e n r e a d i n gf r a m e w e r ed e t e c t e do ne a c hc h a i n r e s p e c t i v e l y t h eg e n eo i ln e g a t i v ec h a i n e n c o d e dap u t a t i v ep r o t e i n w h i l et h eo t h e re n c o d e de u k a r y o t ea s p a r t a t ep r o t e i n a s e a s p t h el a t t e rw a so fg r e a tp o s s i b i l i t yt ob et h ec a n d i d a t eg e n ef o rw cg e n e t h er e s u l tw a s 堑塑盔兰堡主兰篁丝苎 一4 h e l p f u lt oc l o n es s a n dm a s o f f i c e 3 a c c o r d i n gt ot h ed e t e c t i o nr e s u l t so fs u b s t i t u t i v ef r a g m e n t s cg e n ew a sl i m i t e d b e t w e e nr m l 9 5 5 6a n dr m 2 5 3 a1 8 8 k br e g i o n w h i c hw a s4 2 7 9 4 k bd i s t a n t 矗o m s 4 t h er e c o m b i n a t i o nb e t w e e nr m 2 0 0 1 2a n dr m 2 0 0 1 7 2w a sr e l a t e dt od l a n t h e i g h t a n dt h ed i s t a n c eb e t w e e nt h e mw a sa b o u t4 s m b s o m eg e n e sr e l a t e dt op l a n t h e i g h tm i g h tl i ei nt h i sr e g i o n k e yw o r d s r i c e w i d ec o m p a t i b i l i t yg e n e w c g s u b s t i t u t i v ef r a g m e n t i s o g e n i c i n b r e dl i n e s n i l s g e n em a p p i n g 叁塾查翌 童翌至堕望量墨望至垡墨竺垦苎堡堡曼墨塑苎堕堕塑塞篁兰 文献综述 目前 用作基因定位研究的分离群体大致可以分为初级群体 p r i m a r y p o p u l a t i o n s 和次级群体 s e c o n d a r yp o p u l a t i o n s 两大类 初级群体是指由两个遗传差 异很大的原始亲本相互杂交而建立的分离群体 其特点是全基因组均发生分离 这类群体包括f 2 f 3 b c l d h d o u b l eh a p l o i d 和r i l s r e c o m b i n a n ti n b r e dl i n e s 等 次级群体是指在初级群体的基础上选育得到的分离群体 如近等基因系 导 入系或染色体片段代换系 这些群体的特点是仅在目标性状基因所在的的染色体 区段发生分离 从而能有效地减少遗传背景差异对基因效应的干扰 一般认为 利用初级群体定位的精度较低 其结果有时与实际偏差较大 1 2 i 只有当性状的遗 传力较高 群体足够大时 定位结果才是准确的 3 1 初级群体内个体问不同的遗传 背景是造成定位偏差的主要原因之一1 4 5 一 1 近等基因系 n i l s 1 1 近等基因系 n i l s 的概念 近等基因系 n e a ri s o g e n i cl i n e s n i l 是一组遗传背景相同或相近 只在个别染 色体区段上存在差异的株系 是多代回交选育的产物m 在选育实践中 将带有标 记基因的供体亲本与轮回亲本杂交 f l 与轮回亲本回交 经多代回交 获得除目 标基因及其附近区段以外 其它遗传组成均与轮回亲本相同的株系 8 近年来 水 稻优良基因n i l 的研制及其利用已成为热点领域 扬州大学硕士学位论文6 1 2 植物近等基因系选育 培育植物近等基因系主要有下述几种方法例 1 连续回交法 两个亲本的fj 与轮回亲本回交 在回交群体中选择带有目标 性状的个体继续与轮回亲本回交 一般需回交6 代以上 才能使其遗传背景逐步接 近轮回亲本而只保留目标性状差异 从而构成近等基因系 该方法是培育近等基 因系最常用的方法 2 从天然变异及诱变群体中分离 如果在基因组中发生一个点突变 一般不 会引起其它位点基因的变异 突变体与原品种除突变位点存在差异外 其它位点 基本一致 突变体一旦从原群体中分离出来便成为近等基因系 3 利用分子标记辅助选择的连续回交选育法 有些性状检测困难 可以借助 于分子标记进行选择 一般先回交若干代 然后利用与目标性状连锁的分子标记 进行检测 选择携带目标标记基因型的个体继续回交 选育近等基因系 近等基因系的培育是一项细致和长期的工作 目标基因的近等基因系与它的 轮回亲本的遗传差异越小 越有利于基因的精细定位 图位克隆和功能分析 近 等性的好坏与双亲的遗传差异 基因的连锁 选育者的经验 采用的方法 回交 的代数 鉴定的环境等有很大的关系 采用形态标记 直接针对基因控制的性状 进行近等性鉴定 能够使近等性更具现实意义 但对于难以观察的性状 则不易 在近等基因系之间达到一致 而利用分子标记技术 直接针对d 1 q a 进行鉴定 可 使近等性鉴定不受环境影响 检测出常规方法难以观察到的差异 但分子标记不 等于基因本身 有可能分子标记和基因的多态性不一致 而且不同的分子标记检 测近等性的效率差异很大 选用遗传差异小的亲本 进行高世代回交 尽量种植 大的回交群体 在不同环境下 综合运用常规方法和现代分子标记技术进行鉴定 有利于获得高质量的近等基因系并做出客观的评价 叁篓垄塑 童翌至里丝兰薹塑墨垡墨苎垦篓垦丝塑垄 量塑茎里堑塑塞笪1 1 3 近等基因系与分子标记辅助选择 近等基因系的构建需要连续多次回交 而轮回亲本的选择成为近等基因系培 育的关键 近等基因系由杂交和多代回交分离而获得 除目标基因外 其余遗传 背景应与轮回亲本基本一致 利用近等基因系 n i l 寻找与目标基因连锁的分子标 记的基本策略是比较轮回亲本 n i l 及供体亲本三者的标记基因型 当n i l 与供体 亲本具有相同的标记基因型 但与轮回亲本的标记基因型不同时 表明该标记可 能与目标基因连锁 1 0 1 在目标基因所在的染色体区域 检测到d n a 标记的几率大 小取决于导入的染色体片段的长度及轮回亲本和供体亲本基因之间d n a 多态性的 程度 检测几率随培育n l l 中回交次数的增加而降低 轮回亲本和供体亲本的亲缘 关系越远 越有可能发现多态性的分子标记 相反 轮回亲本和供体亲本的亲缘 关系越密切 其多态性的分子标记就越少 1 4 近等基因系构建的研究意义 近等基因系在理论上可最大限度地降低遗传背景的干扰 避免基因互作的影 响 它在作物的遗传育种 生理生化 基因功能分析等方面具有重要作用 目前 人们已在农作物中构建了包括抗病性在内的许多性状的近等基因系 并将其运用 于相关领域的研究中 刖 生物体的大多数性状属于数量性状 准确鉴定和定位数量性状基因座是进行 数量性状基因分子标记辅助选择和克隆的基础 随着分子标记遗传图谱的发展 许多q t l 被鉴定和定位 但是传统的分析群体遗传背景复杂 很难对单个q r l 进行 准确鉴定和定位 为了精细定位q t l 必须使用含该目标q t l 的近等基因系 近等基因系是基因水平上开展遗传研究的理想材料 利用近等基因系 可较 准确地筛选到与目标性状连锁的分子标记 有利于构建分子遗传图谱 并可与传 统的遗传图谱对应整合 1 4 3 只要利用近等基因系 供体亲本和轮回亲本基因型 通过分子标记技术即可检测目的基因与分子标记间的连锁关系 近等基因系有助 于鉴别目标性状基因的染色体片段 并对目标基因进行精密定位 目标基因分子 扬朋大学硕士学位论文 8 定位是分子标记辅助选择育种的前提 因此 近等基因系的构建是分子遗传图谱 构建 数量性状基因定位及分子标记辅助育种的重要基础之一 具有重要的理论 意义和应用价值 1 5 水稻优良基因n l l s 的研究利用 1 5 1 抗病基因 病害尤其是白叶枯病 稻瘟病 是当前稻作育种与生产中国际性的重大问题 解决之关键在于优良基因的有效利用 n i l 是基因水平上研究抗性遗传机制的理想 材料 可克服遗传背景不同品种问某性状基因型差异的困扰 日2 墨o g a w 掣1 5 1 1 9 9 3 选育出了携带有不同抗白叶枯病基因n i l s 用于鉴定 检测小种和抗性基因 亦可直接作为育种亲本 章琦等 1 6 1 1 9 9 6 选育出抗白叶 枯病基因 x a 3 x a 4 和 1 2 的粳稻n i l s c b b 3 c b b 4 c b b l 2 作为育种 计划 生物技术和生化实验的抗源 在建立我国水稻白叶枯病寄主与病源菌之间 的鉴别系统 检测新基因 基因定位等方面具有很好的利用价值 王春连等f 1 7 l 从 2 6 9 份普通野生稻中鉴定出一个高抗白叶枯病的新抗源 通过多菌系鉴定 抗谱分 析及与已知基因比较 证明该抗源含有一个新基因 删 通过杂交和回交建 立了该基因的n i l s 辜琼瑶等l l 聊对征集到的1 0 0 份材料进行了农艺性状的考察 稻 瘟病和白叶枯病的鉴定 筛选出了一批农艺性状优良 抗稻瘟病 白叶枯病或双 抗的资源 同时用籼型优质软米品种 云恢2 9 0 为受体材料 以这1 0 0 份材料为 供体 构建了2 5 1 0 份近等基因导入系 进行了抗稻瘟病 抗旱 耐寒和蒸煮食昧 品质方面的筛选鉴定 获得了一批有目标性状的近等基因导入系 为新基因的发 掘 新品种的选育提供了重要的基础材料 并选育了2 个新品种 其中有1 个已通 过品种审定 1 5 2 抗虫基因 刘光杰掣1 9 1 2 0 0 2 将r a t h uh e e n a t i m t t 的抗自背飞虱基因导入感虫早籼 余波水稻广亲和基因近等基因系代换片段长度检铡及广亲和基因精细定位 9 品种浙辐8 0 2 经过多次抗性筛选和感虫亲本回交 构建了与浙辐8 0 2 成对的近等 基因系材料 浙抗 并取得成功 1 5 3 矮杆基因 m u r a i 等0 9 9 5 用矮秆基因d 4 7 s d l 刃船和d 1 2 构建n i l s z o l 用籼稻矮秆 基因s d 1 的n i l 研究苗期性状的遗传效应 朱立宏等1 2 1 用控制中国籼稻矮秆品 种的s d i 或s d g t 基因研制的n i l s 研究株高 节间长 叶长宽及夹角等1 4 个性状 结果表明矮秆基因对这些性状具有明显的多效性 1 5 4 雄性不育性恢复基因 s h e n 等 1 9 9 6 1 用6 0 c o q 射线处理干种子获得 i 2 4 与亲本组成一对育性恢 复基因n i l 为细胞质雄性不育系分子遗传研究提供材料 姚焱 2 0 0 4 铡用 粳稻台中6 5 及其f l 花粉不育近等基因系作研究材料 表明f l 花粉不育基因与花 粉愈伤组织诱导能力性状无直接联系 但亲本与杂种间的花药裂药性存在显著差 异 并随着花粉败育率的提高花药开裂率不断下降 表明f l 花粉不育基因与花药 开裂性状有关 1 6 近等基因系建立过程中存在的问题及展望 目前报道的近等基因系建立过程中存在很多问题 建立的近等基因系群体大 部分仍含有多个代换片段 妨碍了进一步分析利用 用近等基因系作为遗传工具所获得的研究结果准确与否 同构建的近等基因 系的近等程度密切相关 准确地评价近等性是近等基因系成功运用的关键所在 回交代数和形态相似性是评价近等基因系的常规方法 但由于连锁遗传 即使经 过多代回交 仍会有相当长的供体亲本片段与目的基因连锁 加上有的基因差异 在某一环境下并不能显著表现 这就会造成近等性评价出现偏差 2 5 1 有必要从d n a 水平上进行鉴定 有些研究者用s s r 等分子标记技术对所获得的近等基因系进行检 扬州大学硕士学位论文1 0 测 同时还找到了与目标性状紧密连锁的分子标记 取得了良好的效果1 2 4 z g 通过鉴定近等基因系代换片段 明确了各近等基因系代换片段的数目和代换 片段的具体位置 利用分子标记辅助选择可以在由各近等基因系与轮回亲本回交 所构成的分离群体中选育出单片段代换系 为开展q t l 的鉴定和精细定位奠定了 基础 2 水稻的广亲和性 水稻广亲和性 w i d ec o m p a t i b i l i t y 的概念是由日本学者池桥宏d 叩1 1 等提出的 它是指一些水稻中间型材料与籼粳品种杂交f i 能正常结实 具有这一特性的品种 被称为广亲和品种 w i d ec o m p a t i b i l i t yv a r i e t y w c v 控制这一特性的遗传因子 称为广亲和基因 w i d ec o m p a t i b i l i t yg e n e w c g 水稻品种的广亲和性主要受控 于 5 座位上的一组复等位基因跗 影和彰的相互作用 其中s 为广亲和基因 3 2 自1 9 8 4 年以来 国内外许多学者经过大量的研究 证明了s 5 基因座的存在 并且不同来源的广亲和品种大多携带有广亲和基因s 4 8 广亲和品种及其广亲 和基因的发现 为克服亚种问不亲和性展示了美好的前景 使得籼粳亚种问杂种 优势的利用成为可能 袁隆平最早提出利用广亲和基因来克服杂交不亲和性 根据这一构想育种家 们选育了一批广亲和品种 籼粳亚种间杂种优势的利用已经取得了显著成就 克 隆广亲和基因s 无论是对其遗传效应 作用机理的研究还是对籼粳杂种优势利 用实践均具有十分重要的意义 3 本研究的目的 本实验室以n 1 1 和b a 作为轮回亲本 以0 2 4 2 8 d u l a r 等6 个原产地不同的原始 广亲和品种作为广亲和基因的供体 建立了一批近等基因系 本研究利用分子标 记对部分近等基因系的代换片段长度进行检测 在代换片段长度检测的基础上 余波7 9 稻r 壅塑苎塑堑 墨堕墨垡堡墨垦墨堕塑塑墨 墨型茎里矍塑塞篁 卫 期望通过更进一步的精细定位将毋 限定在更小的区域内 同时 了解色素原基因 的物理位置及其与广亲和基因的物理距离 对不同近等基因系之间抽穗期 株高 等性状的差异所对应的代换片段差异进行初步探讨 扬州大学硕士学位论文 1 2 一材料与方法 1 1 试验材料 构建水稻广亲和基因近等基因系 n e a ri s o g e n i cl i n e s n i l s 共使用了6 个原始 广亲和品种0 2 4 2 8 d u l a r 花糯 w o a i g a c p s l o l 7 和k e t a nn a n g k a 作为广亲和基 因的供体 受体亲本分别为原产江苏的典型中籼品种南京l l n i l 和原产意大利 的典型粳稻品种巴利拉 b a 供体品种和受体品种的原产地列于表l 表1 供体 受体品种和原产地 以6 个广亲和品种为父本 2 个非广亲和品种为母本 分别配制8 个杂交组合 n 1 1 x 0 2 4 2 8 n i l x d u b a x 0 2 4 2 8 b a x d u b a x h n b a x w a g b a x c p 和b a k n 每一组合均以非广亲和品种为轮回亲本进行多代回交 将控制广亲和性的蹦 基因 从广亲和品种导入到非广亲和品种中去 对回交后代通过测交进行表现型鉴定时 以n l l 为轮回亲本的组合 以粳稻b a l i l l a 为测验品种 以b a l i l l a 为轮回亲本的组 合则以籼稻n l l 为测验种 通过分析测交后代的育性 选择带有广亲和性的植株 进一步回交 本文主要利用分子标记检测0 2 4 2 8 一n 1 1 d u n 1 1 0 2 4 2 8 一b a d u b a 这4 组近等基因系代换片段的长度 2 0 0 6 年 这4 组近等基因系共种植了4 0 6 个株系 见表2 根据稃尖色和亲 叁鍪查塑 董塑至里錾箜苎堕墨垡壅堕垦篓垦竺塑墨 量塑茎里堕塑塞鱼翌 和性表现 这些n i l 可以分为3 种类型 1 既有稃尖色又有广亲和性 有稃 尖色 没有广亲和性 1 1 1 有广亲和性 没有稃尖色 其中类型i 占所有等基因系 的绝大部分 而类型 和类型1 1 1 是在回交后的自交过程中由于c 与出座位之间 发生交换而产生的 对于在8 5 座位附近发生交换的重要株系 经过至少两年的田 间测交鉴定 确认其是否带有广亲和基因 表2 代换片段检测中所用的4 组主要近等基因系 1 2 试验方法 1 2 1 田问试验 2 0 0 6 年正季将4 组近等基因系种植于扬州大学试验农场 5 月中旬播种 6 月 中旬移栽 单本栽插 株行距1 6 c m x 2 5 c m 正常肥水管理 1 2 2 测交群体的小穗育性考察 抽穗后2 0 一2 5 天 每株取2 个穗子 计算可育小穗 凡子房膨大的小穗均视 为可育 占总小穗数的比例 以两穗平均值代表单株小穗育性 对于育性无明显 分离的群体 每组合考查l o 株 以l o 株的平均数代表该组合的小穗育性 对育 性有明显分离的测交群体考察所有植株 为尽量减少穗型大小 环境条件对基部 小穗育性的影响和减小工作量 只考察中上部的小穗 扬州大学硕士学位论文 1 4 1 2 3 抽穗期 株高 稃尖色考察 考察各近等基因系的抽穗期 并在齐穗后调查株高 稃尖色等性状 稃尖有 色的记为 t 无色的记为 f 并详细记录稃尖的色泽情况 1 3d n a 提取 d n a 的提取过程 取0 1 克幼嫩的新鲜水稻叶片 于液氮中用竹签研磨成粉末 在粉状叶片中加入7 0 0 p 1 的2 c t a b 提取液 混匀 6 5 2 水浴2 0 分钟 加入7 0 0 0 1 的氯仿 混匀 1 0 0 0 0 r p m 离心8 m i n 吸取上清夜 移到1 5 r i d 的e p p e n d o r f 管中 加入5 0 0 p 1 预冷的异丙醇 混匀 冰冻半小时 可见白色絮状沉淀 1 0 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 弃去上清液 管底的白色沉淀用7 0 的酒精清洗2 次 将酒精倒出 自然晾干 然后加入l o o i d 的双蒸水中溶解 溶解好的d n a 放于 2 0 冰箱中保存备用 1 4 分子标记 选用分布于水稻第6 条染色体上的1 0 1 个分子标记对亲本进行多态性检测 利 用有多态性的分子标记进行代换片段检测 其中 j 3 j 1 8 j 2 6 z 3 7 6 为本课题 组自己开发的标记 e 1 e 3 8 为本实验室严松等开发的标记 其他标记均为已经公开 发表或在互联网上公布的s s r 标记 1 5p o r 反应和扩增产物检测 p c r 反应体系为2 0 山 包括5 0 r i g 模板d n a 0 4 p 1 的l o m md n r p 1 ut a q 酶 2 pl l o 反应缓冲液 含m g 和o 4 h l m 左右引物 反应条件为 9 4 2 预变性5 n d n 9 4 1 2 变性5 0 s e e 5 5 2 退火5 0s 7 2 1 2 延伸 叁墼查塑 差翌苎堕望竺苎堕墨垡丝苎垦篓堡丝塑墨 墨塑苎型塑塑塞垡旦 l m i n 3 5 个循环 7 2 延伸1 0 m i n p c r 产物经凝胶电泳分离为大小不同的d n a 片段 根据扩增片段在两个亲本 中的差别大小采用不同的电泳方法 如果差别大于5 0 b p 则选用1 琼脂糖凝胶电 泳 用e b 染色 紫外灯下观察条带 如果差别小于5 0 b p 则选用6 的聚丙烯酰 胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳过程 p c r 产物9 4 变性3 分钟 并立即置于 冰上 取2 5 m 的变性产物与等体积的溴酚蓝混合 在1 2 0 0 伏电压下电泳3 小时 电泳结束后用0 1 的硝酸银溶液染色2 0 分钟 然后用n a c 0 3 n a o h 甲醛的混 合液显色l o 分钟 用扫描仪 m i c r o t e k 中国 扫描 记录电泳结果 1 6 数据收集 在近等基因系检测中 电泳条带和该组合的供体亲本相同的记为 l 与受体 亲本相同的记为 0 对于任意一个分子标记 都有3 种基因型 两种纯合类型 分别记为 0 0 和 1 1 一种为杂合类型 记为 0 1 根据标记基因型可以推 断某一个体中任一特定d n a 片段的来源 比如在某一特定个体中观察到接连几个 分子标记均表现为 1 1 可以推断这几个分子标记所覆盖的区段来源于供体亲本 同样 如果某一个体连续几个分子标记基因型均为 0 0 那么这些标记所覆盖的 d n a 区段应该来自于受体亲本 相应地 于供体亲本 另外一条来源于受体亲本 一连串的 o 1 就表示一条染色体来源 因此 对于任何一个近等基因系来说 目标基因所在区域的遗传组成 包括片段的来源以及大小均可以根据该区段内所 有分子标记的基因型推断出来 堑苎查兰堡圭兰竺丝苎堕 二结果与分析 2 1 亲本问分子标记的多态性 共选用分布于水稻第6 条染色体上的1 0 1 个分子标记对亲本进行多态性检测 4 1 个标记至少在一对亲本问具有多态性 表3 2 个供体亲本 0 2 4 2 8 d u l a r 与 2 个受体亲本 n il b a 之间标记多态性见表4 表3 亲本多态性检测中找到的可供利用的分子标记 标记类型 标记类型标记 类型 r m 5 0 8s s r e 3 5s t sz 6 c a p s r m 4 6 9 s s rr m l 9 5 5 6s s r j 1 7s t s r m 5 8 6s s rr m 2 5 3 s s rj 1 8 s t s r m 5 8 8s s r j 3s t s j 2 5s t s r m 5 8 7 s s rj 4s t s r m 2 7 6 s s r e 4 s t sj 7 s t se 1 9 s t s e 3s t sj 1 0 s t s e 2 5s t s e ls t s j 1 1s t s e 2 4s t s e 2 0s t sj 1 3 s t se l o s t s e 3 8s t sj 1 4 s t se l i s t s e 3 2s t s j 1 5s t s r m 2 0 0 1 2s s r e 3l s t sj 2 6 c a p sr m 2 0 1 7 2 s s r j is t sj 1 6 s t sr m 4 0 0 s s r r m 5 7 5 4s s r z 3c a p s 表4 供体与受体亲本之问的分子标记多态性 供体 受体 检测标记数多态标记数多态率 多态标记问平均距离 m b 0 2 4 2 8 n 111 0 12 3 2 2 8 d i l n l l 0 2 4 2 8 b a 1 0 1 1 0 1 2 0 2 l 1 9 8 2 0 8 1 a 1 6 1 5 d u b a1 0 12 4 2 3 81 3 叁鍪 堑堕堂薹里堕至望 燮苎垦篓堡丝 坚 童塑苎里堕塑塞篁旦 2 2 代换片段的长度检测 对每个近等基因系 以广亲和基因座母为起点检测各个分子标记的基因型 在 两侧逐步增加标记 直至检测到单株与受体之间无多态性的标记为止 以代换片 段末端有多态性的标记与无多态性的标记之间的中点为该末端的假定边界 按照 国际水稻基因组测序计划 i r g s p 公布的序列和标记位置计算代换片段的物理长 度 4 组近等基因系 0 2 4 2 8 一n 1 l d u n 1 1 0 2 4 2 5 一b a d u b a 代换片段的 平均长度分别为4 2 1 8 k b 5 0 0 5 k b 5 2 3 5 k b 5 1 0 3 k b 图1 图14 组近等基因系代换片段平均长度分布图 根据稃尖色和广亲和性的表型划分的3 类近等基因系代换片段平均长度差异 显著 类型i 代换片段的平均长度为5 6 3 9 k b 而类型i i 和类型1 1 1 分别为4 1 0 8 k b 1 5 3 8 k b 图2 扬州大学硕士学位论文 6 0 0 0 5 0 0 0 4 0 0 0 k b3 0 0 0 2 0 0 0 l 0 0 0 0 圈 圈 s 5 c c s 5 图2 3 种类型的代换片段平均长度分布图 不同近等基因系的代换片段长度相差非常大 最短的只有1 9 5 k b 最长的超 过2 0 0 0 0 k b 大多数在1 0 0 0 k b 5 0 0 0 k b 之间 图3 1 4 薹 o i 置一 一i 一 嚣 0 代换片段长度 k b 图3 10 2 4 2 8 一n 1 l 代换片段长度分布图 0 1 0 0 01 0 0 0 2 0 0 0 一3 0 0 0 4 0 0 0 5 0 0 0 1 0 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 04 0 0 0 5 0 0 0 l 0 0 0 02 0 0 0 0 代换片段长度 k b 图3 2d u n ii 代换片段长度分布图 叁塾查塑 童塑量里堑 茎里墨垡垫苎垦墨垦竺塑墨 鲞塑苎堕苎塑塞些 旦 3 0 蓄 2 5 瑚1 5 崩i s 1 0 一 二 一 i 1 蓄 代换片段长度 k b 图3 30 2 4 2 8 b a 代换片段长度分布图 圆圆圈i 圈圈囝 代换片段长度 k b 图3 4d u b a 代换片段长度分布图 在4 组近等基因系中找到6 个代换片段比较小的n i l s 表5 其中3 个n i l s 还处于杂合状念 表5 几个小片段代换近等基因系的分子检测 株系号组合 塑坌堡望至旦型 代换片段人小上代缀合墓冈秘 儿l j 1 3 j 1 5 j 1 7 f 0 1 9 7 0 2 4 2 8 一n ii b l 2 f 60 0 1 10 03 5 5 杂合 f 0 2 0 2 f 0 3 2 9 f 0 3 3 8 f 0 3 5 3 0 2 4 2 8 一n 1i b l 2 f 5 d u l a r n 11 8 9 f 7 d u l 盯一n l l b 9 f 6 d u l a r n il b o f 9 o 内 i 1o m 乜t qq 乜 q fo 恕o no a 毽 毽i i1 i 3 5 1 9 5 5 3 5 3 杂合 杂合 杂合 纯合 f 0 4 3 9 0 2 4 2 8 一b a b l l f 7 0 0 0 1 0 10 05 3 杂合 糊妒暂 扬州大学硕士学位论文2 0 0 0 条带表现与非j 亲和亲本相同1 l 条带表现与广亲和亲本相同 o l 杂合的条带 其中一条和广亲和亲本相同 另外一条和非广亲和亲本相同 标记在两个亲本之间没有多态性 2 3 近等基因系的遗传背景检测 在理论上 近等基因系与其受体亲本之间 在表现型上只存在目标性状的差 异 在基因型上只存在代换片段长度的差异 近等基因系与受体亲本之间目标性 状的差异是与这个代换片段是密切相关的 但是 任何一个性状都不可能完全只 受一个基因的影响 其余遗传背景是否纯合一致 必须进行检测 分别在第6 染色体以外的其他ll 条染色体两条臂上选用在亲本问具有多态性 的标记 表6 进行背景纯度的检测 以了解近等基因系背景是否纯合 表6 背景检测所用的分子标记 按照张桂权等人的方法 4 9 1 进行背景检测 纯合艄一嵩 枷 余波水稻广亲租基因近等基因系代抉片段长度检测及广亲和基因精细定位 经检测 0 2 4 2 8 一n 1l d u l a r n ll 0 2 4 2 8 一b a 这3 组近等基因系的背景纯合 度分别为9 9 0 3 9 8 8 7 9 9 5 1 而d u l a r b a 组合近等基因系的背景纯合度稍 差 为9 5 0 5 表7 检测结果表明这些近等基因系的遗传背景已经符合基因分 析的要求 表7 近等基因系背景纯合度 近等基因系染色体背景纯合度 0 2 4 2 8 一n l d u l 缸一n 1l 0 2 4 2 8 一b a d u l 甜一b a 9 9 0 3 9 8 8 7 9 9 5 l 9 5 0 5 2 4 广亲和基因的进一步定位 对基因的精细定位是图位克隆基因的前提条件 根据本课题组已经发表的定 位结果f 5 0 已经将广亲和基因s 定位于分子标记j 1 3 与j 1 7 之间 两个标记之间 的物理距离为5 0 k b 共有6 个开放阅读框 如果没有更多的有用信息 很难确定 这6 个基因中哪一个是广亲和基因的候选基因 若对这6 个基因都进行功能互补 试验 工作量是非常大的 因此 进一步对广亲和基因进行精细定位 缩小候选 基因选择范围 有着很重要的意义 在已经定位的5 0 k b 范围内有7 个d n a 分子标记 j 1 3 j 1 5 j 2 6 2 3 j 1 6 z 6 j 1 7 要进一步缩小广亲和基因的选择范围 就必须找到在这些标记之间发生 重组的株系 在d u l a r n 1 1 近等基因系中 发现株系f 0 2 9 7 和f 0 3 2 7 都含有广亲 和基因 它们在j 1 3 j 1 5 之间发生过重组 表8 表明广亲和基因s 不会位于标 记j 1 3 的上游 证明原来确定的上游边界是正确的 d u l a r b a 的近等基因系中 发现不含有广亲和基因的株系f 0 5 0 4 f 0 5 0 5 f 0 5 1 7 f 0 5 2 0 和f 0 5 5 0 在标记j 1 5 和j 2 6 之间发生交换 表8 表明广亲和基因不会存在于j 2 6 下游 这就将广亲 和基因座位限制在标记j 1 3 j 2 6 之间 其间的物理距离为1 3 k b 图4 堑塑查兰塑主兰鱼丝塞 丝 表8 定位中重要个体的分子检测 类型 株系号 j l oj 1 1 j 1 3j 1 5 j 2 6 7 3 j 1 67 6 j 1 7 i f 0 2 9 7 00 1 1 i f 0 3 2 7 f 0 5 0 4 p 0 5 0 5 f 0 5 1 7 f 0 5 2 0 f 0 5 5 0 0 l 0 0 o o o 1 说明 f 0 2 9 7 f 0 3 2 7 来自于d u l a r n t 的近等基因系 f 0 5 0 4 f 0 5 0 5 f 0 5 1 7 f 0 5 2 0 f 0 5 5 0 来自于d u l a r b a 的近等基因系 o 条带表现与非广亲和亲本相同 1 条带表现与广亲和亲本相同 标记在两个亲本之间没有多态性 d i e t 1 出 鼍 r h 口 2 8 0 0 1 2 o o 1 0 0 9 t 0 0 1 3 0 0 1 2 图4 第6 染色体短臀分子标记连锁图 l l t 1 i l l l l o o o o 1 墨堡 塑 童塑墨垦重苎墨里墨垡苎苎垦篓堕丝型垦 童塑苎里堕塑塞篁 竺 用软件f g e n e s h 对定位区段进行基因预测 在j 1 3 j 2 6 之间有2 个开放阅 读框 一个位于负链 一个位于正链 图5 负链的基因 c g 2 编码一个功能 未知的蛋白 正链的基因 c g l 编码产物与真核生物天氡氨酸蛋白酶 a s p 同 源性很高 该酶被认为参与种子发育与萌发的过程 在叶片中对病原物的入侵有 防御功能1 5 f 0 5 0 4 f 0 5 0 5 等几个n i l s 在j 1 5 与j 2 6 之间发生了交换 测交f l 表现均为半不育 说明该区域的交换重组与广亲和性密切相关 因此 该基因 c g l 应该是广亲和基因的第一候选基因 咒 一 苎 竺竺 了 1 2 i t s 01 0 a 1 0 5 t s 咒 芒 竺 竺 竺 苎 1 2 0 0 0u o1 3 0 u s 0 0 图5j l a j 2 6 区段内基因预铡 2 5 色素原基因与广亲和基因之间物理距离 水稻稃尖颜色受控于3 对显性基因彳 c p 的互补作用 根据已有的研究嗍 在稃尖色这一性状上 近等基因系的受体品种n i l b a l i u a 的基因型均为c c a a p p 供体品种0 2 4 2 8 的基因型为c c a a p p d u l a r 的稃尖里紫色 其基因型必为c c a a p p n 1 l b a l i l l a 与0 2 4 2 8 d u l a r 杂交所产生的f l 基因型为c c a 尸p 有色 表9 从表9 可以看出 本实验所用的4 组近等基因系在p 这个基因座位上均为显 性纯合体p p d u l a t n ll d u l a r b a 这2 套近等基因系在彳这个基因座上也必 为九t 稃尖色在群体中的分离主要是色素原基因c 所引起的 扬州大学硕士学位论文 表9 供试亲本及其单交f 1 的稃尖色及其基因型 说明 t 表示植株稃尖有色 f 表示植株稃尖无色 由于广亲和基因蹦 与色素原基因c 紧密连锁 因此稃尖色可以作为水稻广亲 和性的形态标记 这一标记具有简便直观 易于观察的优点 在构建近等基因系 的过程中就是以稃尖色作为田间辅助选择标记的 但紫稃尖是受相互独立的c 4 p 三对显性基因互补作用控制的 i k e h a s h ia n da r a k i 1 9 8 4 广亲和基因只与其中 之一的c 连锁 c 必须在a p 同时存在的情况下才能表现出来 刘蔼明等 3 1 1 9 9 2 以三交群体0 2 4 2 8 b a n 1 1 为材料 利用r f l p 标记对影 进行定位 结果表明蹦 与色素原c 基因间的重组值为1 0 3 郑康乐 1 等 1 9 9 2 用三交群体p e c o s n 1 1 秋光为材料 利用r f l p 标记对 s 进行定位 获得s 与色素原基因c 的重组值 为1 4 6 4 8 顾兴友 朝等得到的结论是岛 与c 重组值为4 8 3 9 2 陆 驹飞等 4 川 1 9 9 8 对云南稻广亲和品种花糯的广亲和性进行遗传分析 得到的结论是 i s 与色素原基因c 之间的重组率为2 0 6 7 不同的研究者使用不同的材料 得 到的s 与c 基因的遗传距离差异很大 了解这2 个基因座位之间的物理距离是一 件很有意义的事 已有的研究i j 认为色素原基因c 位于广亲和基因彰 的上游 根据对上述4 组 近等基因系代换片段的检测结果 我们对色素原基因的确切位置有了明确的认识 表1 0 余渡水稻广亲和基因近等基因系代换片段长度检测及广亲和基园精细定位 表1 0 1c 基因附近的分子标记检测结果 说髓 上表4 个株系均来自于0 2 4 2 8 一n i 的近等基因系 0 条带表现和非广亲和亲本相同 1 条带表现和广亲和亲本相同 表1 0 2c 基因附近的分子标记检测结果 f 0 2 5 4 f 0 2 5 7 f 0 2 6 2 f 0 2 7 l f 0 2 7 2 f 0 3 0 3 f 0 3 5 6 f 0 3 6 1 j l e 1 0 j i e 1 0 r m l 9 5 5 6 一r m 2 5 6 r m l 9 5 5 9 e 1 0 r m l 9 5 5 9 e l o e 4 r m 2 5 3 r m 2 5 3 e l o r m l 9 5 5 6 e 1 0 1 0 3