（遗传学专业论文）黄花蒿组织培养及培养物中青蒿素含量的研究.pdf

河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 中文摘要 本研究以开封产的黄花蒿( a r t e m i s i a 册 l ) 茎段、叶片、顶芽和花蕾为外植体，建立 了黄花蒿的组织培养体系。此外还对黄花蒿丛生芽合成青蒿素的影响因素进行了研究，确定 了最适的培养条件，为筛选高青蒿素含量的黄花蒿植株提供了科学依据。 实验结果表明： ( 1 ) 黄花蒿的茎段用0 1 的升汞消毒7 分钟效果最好，存活率可以达到6 3 1 。而叶片和花 蕾的最佳升汞消毒时间都是5 分钟，存活率分别为7 1 8 和7 6 7 。 ( 2 ) 叶片诱导愈伤组织最理想的培养基是m s + 2 ，4 - d2 0m g l ，诱导率可高达9 2 ，而 花蕾诱导愈伤组织的最适培养基是m s + 6 - b a 4 0m g l 1 + n a a 0 0 5m g l 1 ，诱导率也达 到了4 6 。锻。 ( 3 ) 以黄花蒿茎段为外植体在培养基m s + 6 - b a 0 3 m g l 1 + i b a l 0 m g l 1 + k t 2 0 m g l 1 上 最容易诱导丛生芽，诱导率为5 5 6 ，而从叶片和花营诱导的愈伤组织则很难分化出 丛生芽，愈伤组织在培养基m s + 6 - b a1 0m g l 1 上的丛生芽分化率最高，但也只有 3 0 4 ， ( 4 ) 在实验中发现，丛生芽增殖的最适培养基为m s + 6 - b a 0 5m 晷l 1 + n a a 0 0 5m g l 1 ，在 此培养条件下，增殖倍数为4 7 。 ( 5 ) 黄花蒿的初代培养和增殖培养过程中，丛生芽经常会出现玻璃化现象，m s 培养基附 加5 0 9 l 1 的蔗糖或者9 9 l - 的琼脂能有效的防止组织培养中出现的玻璃化现象。 ( 6 )试管茁试管内生根较好的培养基为：m s + n a a0 0 5m g 一或者m s + b a 0 3m g 一， 生根率可分别达到8 7 6 和8 2 5 。 7 ) 对影响黄花蒿丛生芽生长及青蘑素合成的条彳牛进行了研究，确定虽适的培莠条件为；蔗 糖浓度3 0g l 1 ；氮源浓度4 5m n l ；无机磷酸盐浓度2 0 0 唪l 1 ；铵态氮与硝态氮的比 ，r 值1 ：3 ：赤霉素浓度3 0m g l 1 。在此条件下，经2 5 天培养获得青蒿素产量为1 5 8 m g l l 。 关键词：黄花蒿；组织培养；丛生芽：青蒿素含量 黄花蒿组织培养及培养物中青蒿素含量的研究 a b s t r a c t t h es t e mf r a g m e n s ，l e a v e s ，a p i c a lb u d sa n df l o w e r e t so fa r t e m i m aa 7 l n u al w e r eu s e da s e x p l a n t si nt h i ss t u d yi no r d e rt oe s t a b l i s ht h ee f f e c t i v et i s s u ec u l t u r es y s t e mo faa m ，i n a d d i t i o nt h ef a c t o r si n f l u e n c i n ga r t e m i s i n i nb i o s y n t h e s i si nd ，a r h as h o o tc l u s t e rc u l t u r e sw e r ea l s o i n v e s t i g a t e di nt h i sp a p e rs oa st os e l e c tt h eo p i m u mc u l t u r a lc o n d i t i o n sa n dt h em o s ts u i t a b l e c o n d i t i o nh a db e e nd e t e r m i n e dt op r o v i d et h es c i e n t i f i cb a s i sf o rs c r e e n i n ga a n n u ap l a n tw i t hh i g l l a r t e m i s i n i nc o n t e n t ，t h er e s u l t sa l es h o w na sf o l l o w s ： ( 1 ) t h eb e s ts t e r i l i z i n ge f f e c to ns t e ms e g m e n t si s7m i n u t e sw i t ho 1 h g c l 2i nw h i c h c o n d i t i o n t h el i v i n gr a t ec a l lr e a c h6 6 3 w h i l ea sf o rt h el e a v e sa n df l o w e r e t s , i ti s5m i n u t e sa n dt h e l i v i n gr a t ec 锄r e a c h7 1 8 a n d7 6 8 s e p a r a t e l y ( 2 ) t h ef a v o r i t ec u l t u r em e d i u mf o rc a l l u si n d u c t i o nf r o ml e a v e si sm s + 2 ，4 - 1 32 0m g l - i ， i n d u c t i o nr a t ec a l lr e a c h 雒h i g ha s9 2 、b u tt h em o s ts u i t a b l ec u l t u r em e d i u mf o rc a l l u s i n d u c t i o nf r o mf l o w e r e t si sm s + 6 - b a4 0m g ，l - 1 + n a a0 0 5 r a g r 1 i n d u c t i o nr a t eh a sa l s o a c h i e v e d4 6 4 ( 3 ) i f w e t a k e t h e s t e n ls e g m e n t s 鹞e x p l a n t s , t h ec u l t u r e m e d i u m m s + 6 - b a 0 3 m g l 1 + i b a l 0 m g u l + k t 2 0m e 1 1w a s m o r ef l l a b l et oi n d u c es h o o tc l u s t e r sa n dt h ei n d u c t i o nr a t ei s 5 5 觎b u ti ti sd i f n c u l tt od i f f e r e n t i a t e ds h o o tc l u s t e r sf r o mt h ec a l l u si n d u c e df r o ml e a v e sa n d f l o w e r e t s 1 1 kb e s tc u l t u r em e d i u mi sm s + 6 - b a1 0m g 。l - 1 a n dt h ed i f f e r e n t i a t i n gr a t ei so n l y 3 0 4 ( 4 ) t h eo p t i m u mm e d i u mf o rm u l t i p l i c a t i n go f s h o o tc l u s t e ri sm s + 6 - b a0 5m g u 1 + n a a 0 0 5 m g l - l ，u n d e rt h i sc u l t u r ec o n d i t i o n ，t h em u l t i p l i c a t i o nt i m ei s4 7 ( 5 ) d u r i n gi n i t i a la n dm u l t i p l i c a t i o nc u l t u r e , s h o o tc l u s t e r sf r e q u e n t l ya p p e a rv i t r i f i c a t i o n t h em s c u l m x em e d i u ma t t a c h i n gt h e5 0 9 l - is u c r o s eo rt h e9 9 l - ia g a lc a l le f f e c t i v l yp r e v e n ts h o o t c l u s t e rf r o mv i t r i f i c a t i o n ( 6 ) t h ec u l t u r e m e d i u ms u i t a b l e t or o o t f o r s h o o t i s m s + n a a 0 0 5 r a g l - 1o r m s + i b a 0 3 m g ，p i nw h i c he o n d i o n st h er o o t i n gr a t ec a l lr e a c h8 7 6 a n d8 2 5 s e p a r a t e l y 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 ( 7 ) t h eo p t i m u mc u l t u r a lc o n d i t i o n so f g r o w t ha n da r t e m i s i n i na c c u m u l a t i o no fs h o o tc l u s t e ri na ww e r ei d e n t i f i e da sf o l l o w s ：s u c r o s cc o n c e n t r a t i o n , 3 0g l j ；n i t r a t er o o u r c e c o n c e n t r a t i o n ，4 5 m m ；i n o r g a n i c p h o s p h a t e c o n c e n t r a t i o n ，2 0 r a m ；m f n n 0 3 一- nr a t i o ，1 ：3 ； g i b b e r e l l i ca c i d c o n c e n t r a t i o n ，3 0 r a g l 1 ；u n d e r t h e a b o v e c o n d i t i o n s 。a t t e m i s i n i n p r u d u c t i o n c 缸r e a c h1 5 8m g l 1a f t e r2 5d a y so f c u l t u r e k e yw o r d s ：a r t e m i s i a4 l ：t i s s u ec u l t u r e ；s h o o tc l u s t e r s ；a r t e m i s i n i nc o n t e n t i i i 美子学位论文独立完成和肉容创新韵声明 本人向河南大学提出顽士学位年请。蠢人郑重声明：所呈交纳学住论工置 蠢人在导师鹋指导下独立完成的，对所研究旮勺课题有新碴宅见解。据栽所知，黔 文章特别力。雌说明、标注牵致谢魄地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰 写过的研元威景，也不包括其他人为获得任何教育、科研机构奇勺学住或证书而 段保存、汇编学位论文( 甄质文本知电亍文奉) 。 ( 涉及保餐肉吝鲋学位论文在擗容后适用轰捩权书) 学住获得者( 学住论文作者) 釜名 2o 0 7 土r 月z , o 目 学住论文指导数师釜名：i 盏重兰曼 2 0 一年f 月；o 岛 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 1 前言 1 1 黄花蒿的生物学特性 黄花蒿( a r t e m i s i a ml ) 又称青蒿，是菊科( a 蛳c c a e ) 蒿属“r t e m i s i a ) 一年生草 本植物。它多生长于海拔5 0 - 4 0 0 m 的低山丘陵地带，喜光，对土壤要求不严。它的整个生育 期约2 4 0d ，株高4 0 - 1 5 0 c m ，全株具较强的挥发性物质，茎直立，具纵沟棱，无毛多分枝。 叶互生，茎基部及下部的时在花期枯萎；中部叶彝形，长4 - 7 c m ，宽2 - 3 c m ，2 - 3 回羽状全裂， 小裂片长圆状条形或线形，先端锐尖，表面深绿色，背面淡绿色，具细微软毛，叶轴两侧具 窄翅；茎上部的时向上逐渐细小成线形，常i - 2 回羽状全裂，无柄，头状花序多数管状花， 外层雌性，中央的两性，绿黄色，花冠顶端5 裂；雄蕊5 ，花药合生，花丝细短，着生于花 冠管内中部；雌蕊1 ，花柱丝状，柱头z 裂，分叉；瘦果椭圆形，淡褐色，无毛，其种子小 而多，千粒重为o 0 3 9 , 每克种子约为3 3 3 3 0 粒，萌发能力强且野生适应性强，能在自然条件 下大量繁殖，是极常见的侵入摞荒地的先锋植物，花期7 9 月，果期9 一加月“1 。 1 2 世界黄花蒿资源分布 黄花蒿原产于中国，广泛分布于世界各地，其中以北纬4 0 度，东经1 0 9 度，海拔在1 0 0 0 至0 1 5 0 0 米的地区分布最广，但其青蒿素含量随产地不同差异极大，且绝大多数地区含量很低， 一般在0 2 9 6 以下。1 ，无利用价值，全世界平均值为0 卜0 2 ，我国则是0 卜1 2 不等。1 。美国 也有野生的黄花蒿，但全世界只有中国、越南在进行人工种植。国外其他地区的黄花蒿中部 不含青蒿素或含量极低。我国的黄花蒿的青蒿素含量整体上表现为由南向北逐渐降低”1 。川东 西、鄂西、湘西、黔东北的武陵山区的黄花蒿中青蒿素含量普遍较高。，尤其是重庆酉阳地区 武陵山脉的黄花蒿有较高工业提炼价值。黄花蒿作为我国的优势资源，我们要加大对其的开 发力度，清晰认识其种质优势及特点。在此基础上积极开展黄花蒿栽培和优质选育工作。 1 3 黄花蒿栽培育种的研究进展 黄花蒿生活力强，野生资源丰富，但近年来由于需求量增大，主要依靠人工栽培种植。 7 0 年代开始，研究者们着手黄花蒿的引种和驯化工作，他们从黄花蒿的生物学特性、栽培条 件、生活习性、生长发育规律等方面进行了研究，为黄花蒿栽培提供了科学依据。 青蒿素在黄花蒿中储存部位的研究尚没有肯定的答案现在普遍认为黄花蒿叶及花中存 黄花蒿组织培养及培养物中青蒿素含量的研究 在的腺毛状分泌腺和t 一型网状分泌腺则是青蒿素合成和储存的位点”l 。 目前普遍认为黄花蒿是一种严格的短日照植物，未成年的植株对光周期信号很敏感，光 处理两周就会开花。黄花蒿抗逆性强，在栽培条件下，只要黄花蒿的基本营养得到满足，就 能正常生长发育、开花、结籽，种子繁殖能力强，栽培植株生长比野生植株好，含量也明显 高于当地野生种。微量元素硼能提高青蒿素含量，外施生长调节物质能够促进植株长高，含 量提高”7 ，赤霉素对黄花蒿组培苗青蔫素含量有较大的影响，其含量是对照的3 - 4 倍”1 。而收 获前水胁迫两星期会导致青蒿素含量大大降低。张萍认为黄花蒿具有种子驯化现象，经过多 年种植后，青蒿素含量明显升高，提前播种移栽能提高产量和含量”1 。对青蒿素含量达最高点 时黄花蒿的生长时期进行了许多研究，但结论不一，但多数认为集中在营养生长末期到开花 期这段时期，综合考虑到生物量和含量，一般的收获时间是在花芽分化期。青蒿素含量最高 值出现在晴好天气的中午1 2 时到1 6 时 目前还没有真正意义上的黄花蒿栽培品种1 ，近年来，人们在高含量黄花蒿品种选育上作 了一些基础性工作。f e r i m 等”“在温室和田间条件下对青蒿素产生的广义遗传性状进行分析， 发现青蒿素的含量高低是由遗传性状决定的。w a l a r t 等1 利用秋水仙素诱导出四倍体黄花蒿， 发现四倍体植株青蒿素含量比二倍体植株高3 8 ，叶片比二倍体大得多，但植株矮小，产量低。 m a g a i h e 等“报道了黄花蒿杂交种青蒿素产量可增加5l c g h a - 。印度研究者“利用分子标 记，发现不同基因型黄花蒿之间存在较高的多态性，揭示了植株化学物质的差异源于遗传性 状的多态性。湖南农业大学中药研究室朱卫平对高青蒿素含量黄花蒿栽培品种选育目标性 状进行较深入的研究，发现通过优中选优的方法可以使青蒿素含量逐年提高；而且研究了叶 的形态与青蒿素含量的相关性，发现狭裂片型叶比宽裂片型叶的含量要高；此外还对黄花蒿 叶的结构进行显微观察及青蓠素的组织化学定位，发现叶片中的毛状分泌腺是青蒿素的储存 部位，其浓度与含量里正相关。目前，国内外改造黄花蒿的遗传工作仍然进展缓慢，原因是 其代谢复杂，遗传机制不甚明了。 1 4 黄花蒿组织培养研究进展 1 4 1 不定芽培养 黄花蒿不定芽的诱导和培养已经有许多成功的报道。n a i r 等人用黄花蒿叶片或愈伤组织诱 2 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 导的生根苗中含有青蒿素；而愈伤组织和不定芽中未检测到青蒿索“”。w h i p k e y 等a 报道，0 1 m g l b a 和1 0m g l 1k t 可以使丛生芽培养物中青蒿素的产量提高3 0 ，但是这种增长是通过 增加生物量来实现的，而不是通过增加青蒿素的含量“； w o c r d e n b a g 等人通过调整m s 培养 基中激素的浓度和配比、蔗糖浓度等手段，解决了不定芽生长与青蔫素合成之间的矛盾，获 得了生长较快的不定芽培养物，未生根不定芽中青蒿素的含量达0 1 6 d w “”。v i s h w e s h w a r 等人研究了耱类对黄花蒿生长和青蒿紊生物合成的影响，结果表明，用其它糖类代替蔗糖 或将蔗糖和其它糖类组合使用，对黄花蒿不定芽的生长和青蒿素含量都有影响。当培养基中 添加蔗糖或蔗糖与麦芽糖组合使用时，黄花蔫不定芽生长最好；用乳糖代替蔗糖，生长最差： 单独使用麦芽糖作为碳源时，生物量较低。 1 4 2 发根培养 1 9 8 2 年c h i l t o n 报道在发根农杆菌侵染植物的过程中，在感染部位上或附近能产生大量副 产物一发状根。这种发状根又称毛状根，毛状根是由发根农杆菌含有的r i 质粒引起的。发 根农杆菌( a g r o b a c t c r i u mr h i z o g o l e s ) 是根瘤菌科( r h i - z o b i a c e a e ) 农杆菌属( a g r o b a c t e r i u m ) 一类革兰氏阴性土壤农杆菌，可以侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物，甚至是裸子植 物。而诱发植物产生毛状根。目前它己广泛应用于植物基因工程、植物次生代谢产物生产、 植物品种改良和植物栽培等领域。相对于常规细胞培养和组织培养，毛状根培养系统具有生 长侠速、不需外源植物激素、合成次生物质能力强而且稳定并能商培养液释放部分代游产 物等优点，通过改变培养条件，毛状根甚至可以合成比原有植物中高出数倍的活性物质，以 及原来植物所不含有的活性成分。 多数实验结果表明，在离体培养的黄花篙根中检测不到青蒿素，但也有报道指出在根中 能检测到微量的青蒿素。”。虽然根中不含青蒿素，但生根能明显增加芽培养物中青蒿索的含 量1 。在不含激素的培养基中，芽持续生根，在有些株系中青蒿素的含量高达千重的0 2 8 ”。 在芽培养物中青蒿素的含量与根的数目有很高的相关性。在不舍激素的培养基中，当根的产 量达到最大时，青蒿素的产量也达到晟高值；在无激素的液体培养基中，将芽培养物的根去 掉，芽中青蒿素减少5 3 ，青蒿素b 减少6 0 1 。 九十年代初中科院植物所首先将r i 质粒诱导植物产生发根的技术应用于黄花蒿研究， 3 黄花蒿组织培养及培养物中青蔷素含量的研究 成功地建立了发根农杆菌r i 质粒介导的黄花蒿发根离体培养体系，并在发根中检测到青蒿素 ”“1 。随后又进一步研究了影响r i 质粒转化黄花蒿的各种影响因素，确定了最佳的转化条件， 并利用筛选出的高产发根系，研究了不同理化因子对发根生长及发根中青蒿素生物合成的影 响“7 “1 。w e a t h e r 等人用发根农杆菌a t c c l 5 8 3 4 转化黄花蒿并获得发根，经h p l c 检测的1 0 个 不同发根系的青蒿素含量为0 - o 4 2 ( d w ) 。另外他们在发根中还检测到脱氢青蒿素、青蒿素 b 和青蒿酸1 。j a z i f i 等人采用e l a s a 方法检测了1 6 d , 时光周期条件下的黄花蒿绿色发根的提 取物，结果表明，提取物中存在一些与青蒿素结构相关的化合物，而在黑暗条件下生长的正 常根和发根没有任何免疫信号1 。中科院植物所还研究了真菌诱导子处理对发根中青蒿素合 成的影响”“。在大丽花轮枝孢、葡枝根霉和束状刺盘孢三种真菌诱导子中，大丽花轮枝孢的 诱导效果最好，处理后的发根中青蒿素含量为0 1 1 2 d w ，比对照提高4 5 。诱导子的作用效 果与诱导子浓度、诱导子作用时间及发根的生长状态有关对大丽花轮枝抱来说，诱导子作 用的晟适浓度为每毫升培养基含糖0 4m g ：发根在指数生长末期对诱导作用最敏感；在加入 诱导子4 天后收获发根，发根中的青蒿素的含量最高。1 9 9 8 年和1 9 9 9 年中科院植物所分别得到 过量表达棉花杜松烯合酶基因和法呢基焦磷酸合成酶基因的转基因发根“1 。其中转法呢基 焦磷酸合成酶基因的发根中青蒿素的含量为0 2 - 0 3 d w ，比对照提高了3 - 4 倍”“。 1 4 3 细胞和愈伤组织培养 1 9 8 3 年，贺锡纯等人首次报道以黄花蒿的嫩茎和嫩叶为外植体，诱导愈伤组织，但是愈 伤组织中未检测到青蒿素1 ，以后的研究发现，在培养基中添加不同浓度组合的细胞分裂素 和生长素，诱导产生愈伤组织并不困难1 “，但是通常得到的都是比较致密的愈伤组织。f e r | e i r a 和j a n i c k 使用4 4p m6 - b a 和4 5p m2 , 4 - d ，得到疏松的愈伤组织，但是愈伤组织的诱导率只 有1 0 ”。从愈伤组织可以获得细胞悬浮培养物，但是比较困难“”。一般认为，黄花蒿未分化 的愈伤组织和细胞培养物不能合成青蒿素，或只能合成微量的青蒿素。1 9 9 2 年，e l h a g 等人报 道，用筛选出来的黄花蒿高产株系的叶子作外植体，诱导产生的愈伤组织中检测不到青蒿素 或青蒿素b ，在培养基中也检测不到i 。f u l z e l e 等人报道，当芽培养物生根后，能观察到活跃 的青蒿素b 和青蒿素的合成，这表明青蒿素的合成需要一定程度的组织分化1 。p a n i e g o 和 g i u l i e t i 报道从愈伤组织得到的脱分化和已分化的培养物中青蒿索的含量分别为0 1 1 3 和 4 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 0 0 7 8 d w ，他们在细胞悬浮培养物中未检铡到青蒿素1 。细胞培养物中青蒿素水平很低，可 能与这些未分化组织中过氧化物酶的活性较高有关1 。青蒿素一般不分泌到培养基中但也 有报道称在愈伤组织的培养液中能检测到微量的青蒿素。 1 5 植物组织培养和细胞培养生产次生代谢产物的研究 利用组织培养方法培养植物的某些器官或愈伤组织，并筛选出高产、高合成能力、生长 快的细胞株系，以进行工业化生产，是一条行之有效的途径。 次生代谢物的研究和组织培养方面，进行工作最多的是德国和日本。用组织培养可以生 产的化合物有强心苷、吲哚生物碱、黄连素、辅酶q 1 9 等，现已选出高产的细胞系，大规模 生产亦有成效。如人参为我国名贵药材，现今因野生资源缺少，多用人工栽培，但人参生长 慢，6 年才有1 0 克左右的人参根( 干重) ，采用组织培养方法可比天然生长速度提高上百倍左 右。从理论上讲，任何植物的组织与细胞培养物都能产生原植物中的药用成分，但实际情况 并不是完全如此。原植物中所存在的成分，培养物中不一定产生；原植物中所不存在的成分， 培养物中也有可能产生。但总的来说，培养物中主要还是产生原植物中所存在的成分。目 前看来，植物体中所存在的生物碱类、蒽醌类、黄酮类、萜类、强心苷类、皂苷类以及糖类 等次生产物都能在培养物中产生并检测出来。在再分化或部分分化组织培养中次生代谢物的 形成，说明不分化的细胞仍然保持着合成次生代谢物的能力。 有三个方面的因素影响植物次生代谢物的积累，邸酶催化的生物合成、产物在细胞内或 组织问进行分部运输和积累、产物的生成和化学降解。所以细胞内次生代谢物的积累是生物 体内生物合成和降解的总结果。在细胞和组织中，底物和酶的积累、贮存及合成部位常常是 分开的，即以区域化进行的。细胞中各种细胞器和不同功能组织的分化均参与特异基因的表 达和酶的活性调节，进而调节次生代谢物的合成和积累。生物体内的反应总是与酶联系在一 起的，而且处于一种动态平衡中。终产物的浓度过高，就会产生反馈抑制作用从而使该反应 难以继续向终产物形成的方向进行。次生产物在细胞内浓度过高也会对细胞产生毒害作用。 组织细胞培养中次生代谢化合物含量有时较低，可能是因为：细胞较低程度的分化不适宜的发 育状态j 从次生代谢来的前体转移至初生代谢过程中、在脱分化细胞中关键酶的表达酶的表 达受到抑制而降低、或是缺少合适的贮存场所等。然而在植物组织和细胞培养中，有用成分 5 黄花蒿组织培养及培养物中青蒿素含量的研究 可分泌到培养基中，基于这些认识，可将“两相培养”的方法用于植物组织和细胞培养，提 高次生产物的产生和积累。在培养基中加入次生代谢产物合成的前体或能促进前体产生的化 合物，都能显著提高次生代谢产物的含量和产量。向培养基中加入适当的诱导子对次生产物 的产生和积累很有帮助。 在这方面尚待解决的问题是：( 1 ) 选出的细胞系中次生物质的产量是否高于起源植物：( 2 ) 继代培养后生物合成能力是否能保持；( 3 ) 生长是否快速；( 4 ) 成本核算问题。 1 6 黄花蒿中药用成分青蒿素简介 1 6 1 青蒿素的分子结构及理化性质 青蒿素是从复合花序植物黄花蒿( 即中药青蒿) 中提取得到的一种无色针状晶体，分子 式c 1 5 h 2 2 0 5 ，是一种新型倍半萜内酯，具有过氧键和6 一内酯环，有一个包括过氧化物在内 的l ，2 ，4 一三呃烷结构单元，这在自然界中是十分罕见的，它的分子中包括有7 个手性中心， 如图1 所示，它的生源关系属于a m o r p h a n e 类型，其特征是a ，b 环顺联，异丙基与桥头氢 呈反式关系，青蒿素中a 环碳架被一个氧原子打断“。 青蒿素为无色针状晶体，熔点1 5 6 1 5 7 。c ， a d 1 7 = + 6 6 3 。( c = 1 6 4 氯仿) 。易溶于氯仿、丙 酮、乙酸乙酯和苯，可溶于乙醇、乙醚，微溶于冷石油醚，几乎不溶于水。因其具有特殊的过 氧基因，它对热不稳定，易受湿、熟和还原性物质的影响而分解“”。 o 圈1 青蒿素的分子结构 f i g u r e lm o l e c u l a rs t r u c t u r eo f a n e m i s i n i n 1 6 2 青蒿素的药用价值 疟疾是世界上流行最广、发病率及死亡率最高的热带寄生虫传染病，尤其是非洲国家最 6 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 为严重。青蒿素的发现成为世界抗疟药史上继奎宁之后的又一个重要里程碑。由于其结构独 特，抗疟机理特别，对抗氯奎的恶性疟和脑性疟有特效，且高效低毒的特点，而被w h o 称为 “世界上目前唯一有效的疟疾治疗药物”。 青蒿素类药物对鼠疟，猴疟、人疟均有作用，通过阻断疟原虫的营养供应，达到抗疟目 的”1 。青蒿素的特殊药理作用源自于其结构中的过氧化桥，与以往的抗疟药相比更为高效、 快速、低毒、安全1 。许多青蒿素的衍生物，如双氢青蒿素( d i h y d r o a n e m i s i n i n ) 、青蒿琥酯 ( a r t e s u n a t e ) 、蓠甲醚( a r t e m e t h c r ) 、蒿乙醚( a r t e e t h e r ) 等在疟疾治疗中发挥了十分重要的作 用，由于在保留过氧基的基础上被不周基团的修饰后，溶解度加大，其药用效果与青蒿素相 比更为明显，抗疟活性提高l o 倍左右，用药量减少，复发率大大降低，同时也未见有毒副作 用。其中蒿乙醚和双氢青蒿素己成为世界抗疟药物市场必不可少的治疟药物。 青蒿素类药物对血吸虫有明显的杀伤力“”1 ；对体液免疫具有调节作用，可以治疗局限性 神经性皮炎，有效率较高，对湿疹、红斑狼疮、异位性皮炎等均有治愈作用“；青蒿素类药 物还对肿瘤和黄疸型肝炎的治疗、抗孕、抗心律失常、抗纤维化、治疗弓形虫感染也有一定 作用”；此外。青蒿索还有祛痰、镇咳、平喘、降压及利胆作用。 除以上这些在临床医学上的重要作用之外，青蒿素在生物防治领域中也表现出很好的前 景。刘春朝”1 1 等指出，青蒿素等可以作为一种植保素来抵抗病虫害的侵染。黄花蒿的乙醇、 氯仿、石油醚没提物对菜青虫的拒食和触杀作用“，以黄花蒿租提物对黑翅土白蚁、赤拟谷 盗、榴蚜、棉红蜘蛛、及豇豆荚螟、小菜蛾和菜耪蝶幼虫也具有较强的拒食性。1 。另外，青 蒿素提取液对水稻种子萌发和幼苗生长有明显促进作用“” 1 7 青蒿素的来源 1 7 1 青蒿素的化学合成 由于黄花蒿有限的资源和对青蒿素需求的不断增长，用化学合成方法来生产青蒿素是一 个颤具吸引力的途径。青蒿紊的结构非常复杂( 青蒿素只是理论上存在的6 4 种立体异构体中的 一种) ，是一种分子内含有过氧基团的倍半萜内酯，因此从头进行化学合成很困难，但是可以 由不同的前体经过若干步化学合成步骤合成青蒿素。1 9 8 3 年s c h m i d 和h o n i e t n z 报道了第一例完 全化学合成青盏素，由异胡薄荷酵( i s o p u l e 9 0 1 ) 开始，用1 3 步反应合成青蒿素，产率5 1 。1 9 8 6 7 黄花蔷组织古养及培养物中青蔺索含量的研究 年，x u 等报道了青蒿素的全合成途径，其合成以r ( 廿香草醛为原料，经十几步合成青蒿素。 国外也以不同原料为出发点进行青蒿素一类物的化学合成研究。1 9 9 4 年，z h o u 和x u 综述了国 内外青蒿索全合成的研究进展。青蒿素全合成研究虽已取得一些明显的进展，但到目前尚未 显示出商业的可行性。 1 7 2 青蒿素的生物合成 近年来，随着分子生物学技术的迅速发展和对青蒿素生物合成途径知识的积累，青蒿素生 物合成途径的一些关键酶基因已被克隆，使得通过基因工程方法获得青蒿素高产株系成为该 研究领域新的热点。现在结合前人己做的有关工作，就该领域国内外的最新研究进展进行简要 综述。 1 7 2 1 从乙酰辅酶a 到法呢基焦磷酸( f d p ) 青蒿素的生物合成途径属于植物类异戊二烯代谢途径。近年来的研究表明，植物类异戊二 烯的生物合成至少存在两条途径，即甲羟戊酸途径和丙酮酸磷酸甘油醛途径。青蒿素等倍半 萜类的生物合成途径属于甲羟戊酸途径，该途径在细胞质中进行。首先，由3 个乙酰辅酶a 缩合 生成3 一羟基一3 一甲基戊二单酰辅酶a ( h m g - c o a ) ，随后，在h m g - c o a 还原酶( h m g r ) 的作 用下，产生甲羟戊酸( m v a ) 。以后m v a 经焦磷酸化及脱羧脱水作用。形成c s 的异戊烯基焦磷酸 ( i p p ) 。在这个过程中，由于甲羟戊酸的形成是一个不可逆的过程，因此，h m g r 被认为是该途 径中的第一个限速酶”7 “1 。然后，i p p 与其异构体二甲基烯丙基焦磷酸( d a m p p ) 在法呢基焦磷 酸合成酶( f d p s ) 的催化下，通过亲电反应机制形成牦牛儿基焦磷酸( g p p ) ，进而形成法呢基 焦磷酸( f d p ) ，如图2 所示。 1 7 2 2 从法呢基焦磷酸到青蒿素 a k h i l a 等1 通过放射性同位素示踪法研究了青蒿素的生物合成途径，提出青蒿素生物 合成的框架为：法昵基焦磷酸( f d p ) 一青蒿酸一二氢青蒿酸一青蒿素。在此过程中，首先由f d p 经 过酶促反应形成一种未知的倍半萜类中间产物，该步反应被认为是青蒿素形成过程的重要限 速步骤。1 9 9 9 年，b o u w m e e s t e r 等”“从青蒿叶片中分离到青蒿素生物合成途径的重要倍半萜类 中间产物- - a m o r p h a - 4 。1 1 - d i e n e ，并进一步分离了催化a m o r p h a 一4 ，1 1 一d i e n e 形成的酶，该酶是 催化青蒿素生物合成的关键酶。 8 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 最近，w a l l a a r t 等“从青蒿中分离到另外两种参与青蒿素生物合成的中间产物：二氢青 蒿酸( d i h y d r o a r t e m i s i n i ca c i d ) 和二氢青蒿酸氢过氧化物( d i h y d r o a r t e m i s i n i ca c i dh y d r o p - e r o x i d e ) ，并通过1 h 和”c 光谱证实了其结构。通过与体内条件相同的光化学反应能使二氢青 蒿酸转变成青蒿素，反应中间产物是二氢青蒿酸氢过氧化物。二氢青蒿酸和二氢青蒿酸氢过氧 化物的分离及体外转化反应为青蒿体内由二氢青蒿酸到青蒿素的非酶促光化学反应提供了有 力的证据。 2 个乙酰c o a 【乙酰乙酰c o a 硫解酶 乙酰乙酰c o a 乙酰c o a n h m g - c 例蛤酶 3 羟基3 甲基戊二单酰c o a ( h m g - c o a ) ih m g - c o a 还原酶+ 甲羟戊酸( m v a l j ，焦磷酸化 m v a - 5 焦磷酸 异艘脉竺墨竺垡- 二甲赫丙款磷酸( d 删 焦磷酸( i p p ) 徒牛几基焦磷酸( g p p ) l f d p 合酽 法呢基焦磷酸( f o p ) 甾类化合物一鲨烯 倍半萜类中间产物卜 青蒿素等倍半萜 类化合物 图2 青蒿素的生物合成途径 f i g u r e2t h eb i o s y n t h e s i s p a t ho f a t t e m i s i n i n 1 7 3 利用生物反应器生产青葛素 利用反应器生产青蒿素最成功的研究，就是中国科学院的科学工作者利用新型雾化生物 9 黄花蔷组织培养厦培养物中青蒿素食量的研究 反应器培养青蒿发根和不定芽。他们为了充分利用反应器空间，减少营养液损失，降低染菌的 机率，对原有的超声雾化反应器进行了改进，利用一种新型的内环流超声雾化生物反应器进行 青蒿不定芽培养和发根培养生产青蒿素的初步研究，获得较好结果。不定芽在生物反应器中生 长速率明显高于三角瓶培养，分别为固体培养和摇瓶培养的2 4 倍和2 1 倍，青蒿素的含量分别 为固体培养和摇瓶培养的1 5 倍和1 8 倍，青蒿素产量分别为固体培养和摇瓶培养的2 9 倍和 3 2 倍l 。由此可见，雾化反应器为青蒿不定芽生长提供了适宜的环境条件，从而促进了黄花蒿 不定芽的快速生长和青蒿素的大量合成。另外，刘春朝等利用雾化生物反应器”和流化床生物 反应器1 分别培养青蒿发根生产青蒿素，并取得较理想的结果。如利用雾化生物反应器，在合 适的工艺条件下，经2 0d 分批培养获得生物量1 0 3g l 1 ，青蒿素产量1 7 9 1m g l - 1 ；如利用 流化床生物反应器，在合适的工艺条件下，经2 0d 分批培养获得生物量干重2 1 3g l 1 ，青蒿素 产量3 4 9 8m g l 1 ，这些记录为利用生物反应器大规模培养发根的研究工作提供了有益的借 鉴。 n a i r 等”7 1 利用愈伤组织和细胞作为悬浮培养材料，发现愈伤组织悬浮培养无青蒿素的产 生，但细胞悬浮培养则有青蒿素的产生。t a w f i q 等“7 1 利用青蒿细胞和组织悬浮培养则未检测到 青蒿素的存在。 以上这些生物技术的研究与应用为工业化生产青蒿素提供了有力的理论依据，但这些技 术中存在一个重要问题就是所用的青蒿材料以及生物技术培养后的材料青蒿素的含量仍然维 持在一个相当低的水平上，这是降低生产成本的一个最大障碍。 1 7 4 通过植物组织培养生产青蒿索 利用植物组织培养来生产青蒿索是目前青蒿素研究的另一热点，可能成为大规模生产青 蒿素的重要手段。a 8 0 年代以来，植物组织培养生产青蒿素的研究工作己进行不少，已经在 黄花蒿愈伤组织、悬浮细胞、芽和毛状根等培养体系中进行青蒿素台成的探索。 贺锡纯等1 对黄花蒿的愈伤组织、带芽的愈伤组织和由愈伤组织分化产生的小植株中青 蒿素的合成进行分析，认为黄花蒿愈伤组织中不含青蒿素，在愈伤组织伴随芽分化形成时， 检测到青蒿素的含量约为干重的0 0 0 8 ，而在分化苗长成的植株中，青蒿素的含量达到千重 的0 9 2 ，高于野生植株。n a i r 等i 在进行黄花蒿愈伤组织悬浮培养时，在愈伤组织中未检测到 1 0 塑宝盔堂! 塑z 星亟主塑壅生兰鱼鎏墨 青蒿素的存在。但在悬浮培养液中检测到微量的青蒿素，同样在b r o w n 在研究中也证实了黄花 蒿的愈伤组织中不含萜类但在分化的芽中检测到和亲本相似的萜类合成物。t a r o t ”等在研 究黄花蒿悬浮细胞培养时，在培养物中没有检测到青蒿素的合成，但在培养液的正己烷提取 物中检测到抗疟的活性。p a n i e g o 等1 在新诱导的黄花蒿愈伤组织中检测到青蒿素的含量约为 干重的0 1 - 0 0 8 。此培养物经三次继代培养后，愈伤组织内青蒿素的含量几乎难以检测到。 由此可见，在未分化的黄花蒿植物组织中不含或含有极低水平的青蒿素，而一定的组织分化 则可促进青蒿素的合成。w o e r d e n b a g “5 1 等在诱导的黄花蒿芽培养物检测到青蒿索的存在，并 对营养物和激素对青蒿芽生长和青蒿索的影响进行研究，发现赤霉素和水解酪蛋白等对芽中 青蒿素的合成具有强的刺激作用。1 9 9 4 年，秦明波等用发根农杆菌1 6 0 1 成功转化黄花蒿幼茎 获得毛状根培养物。提供了以发根农杆菌作为基因载体进行黄花蒿的遗传改造的可行性”。 与此同时，w e a t h e r s 等利用发根农杆菌1 5 8 3 4 感染黄花蒿的芽尖和叶片，获得黄花蒿毛状裉 培养物，并且检测到青蒿索的含量约为干重的0 4 3 。其含量远高于其它黄花蒿组织培养物中 青蒿素的含量。蔡国秦等2 1 利用发根农杆菌1 6 0 1 感染青篙叶片建立了毛状根培养系，并在培 养物中检测到青蒿素，在添加赤霉素的条件下青蒿素的含量约为干重的0 2 。v e r g a u w e 等利 用根癌农杆菌感染青蒿叶片。获得转基因植株中青蒿素含量约为干重的0 1 7 0 o ，青蒿素合成前 体青蒿素b 的含量约为0 2 2 ，为通过转基因植物进行青蒿素大量生产奠定基础1 。 目前，黄花蒿组织培养的研究工作主要集中在利用生物技术的手段来进行组织培养物的 改进和高青蒿素含量培养系的筛选和建立，对于利用生物反应器培养黄花蒿组织来生产青蒿 索的研究工作尚处于起步阶段。f u l z e l e 等”1 利用1 l 生物反应器进行青蔫芽的悬浮培养，经过 3 0 天的分批培养可获得再生的植株，生物量提高了4 - 5 倍。p 矾【等利用2 l 的长方形气提式生物 反应嚣培养青蒿芽，经过4 周的培养。培养物增殖8 倍，获得的青蒿芽可长出不定根。 黄花蒿植物组织培养生产青蒿素的一系列研究表明，在未分化的黄花蒿组织培养物( 愈伤 组织和悬浮细胞) 中，青蔫素的含量极低，且青蒿素合成不稳定；而在分化的器官( 芽、毛状 根和再生幼苗) 中，青蒿素的含量明显提高，并且具有较稳定的合成能力。尤其是转基因黄花 蒿毛状根培养物为青蒿素的大规模生产提供了潜在的应用前景。 l 7 5 基因工程的应用 黄花蒿组织培养及培养物中青蒿素含量的研究 目前科研者们已开始把眼光投向基因控制青蒿素合成。这方面的研究主要是对青蒿素生 物合成过程中几个关键酶的克隆和利用根癌农杆菌转化青蒿，建立青蒿发根离体培养体系。 许多学者试图通过基因工程技术将合成的关键酶基因转移到黄花蒿中，通过这些基因的 过度表达，增加酶含量及青蒿素含量。至今，人们已经知道与青蒿素生物合成相关的3 个酶： 法尼基焦磷酸合成酶、倍半萜合成酶和杜松烯合成酶。科学家们对通过调控编码青蒿素生物 合成酶的基因来提高青蒿素的产量产生极大的兴趣。科研者研究了异源f p s 基因1 对青蒿的遗 传转化，结果表明转基因植株青蒿素含量显著地大于野生植株：将已克隆的棉花杜松烯合成酶 的c d n a 通过发根农杆菌，导人青蒿，获得转杜松烯合成酶基因的发根，并建立了快速的青蒿 遗传转化程序”。转法尼基合成基因发根系青蒿索含量为对照的5 倍1 。另有研究通过转基因 手段来提高青蒿植株中细胞分裂素的含量，从而促进转基因青蒿中叶绿素的含量增加，青蒿 索的含量也相应增加3 0 - 7 0 5 “” 近年来，应用r i 质粒转化植物，尤其是药用植物的研究越来越广泛”。叶和春等利用发 根农杆菌r 1 6 0 1 、a t c c l 5 8 3 4 、n c i b 8 1 9 6 、0 3 - 0 1 7 2 4 转化青蒿茎取得成功青蒿发根”7 “1 。国 内外许多学者对青蒿发根培养系的生长条件、生长性状、产量、青蒿素含量以及毛状根的保 存等方面作了大量的研究。进行绿色发根系统的培养，实现大规模生产青蒿素是目前研究的 热点。目前