（环境工程专业论文）土壤中多氯联苯对蚯蚓的生物有效性评价方法研究.pdf

浙江大学硕：上学位论文 摘要 多氯联苯( p o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s ，p c b s ) 属于全球性的持久性有机污染物， 具有致癌、致畸、致突变及内分泌干扰等多种毒性效应。我国由于对含p c b s 的 电容器、变压器不当封存、拆解等导致周边土壤受到污染，对人居环境、农产品 及生态系统的安全构成严重威胁。土壤p c b s 污染的风险很大程度上取决于p c b s 在土壤中的生物有效性，目前采用p c b s 总量测定的方法并不能准确评估土壤污 染风险。因此，亟需发展一种能够快速准确评价土壤中p c b s 生物有效性的方法。 本研究采用赤子爱胜蚓( e i s e n i a f e t i d a ) 作为土壤模式参照生物，比较了4 种化 学方法对老化与堆制土壤中p c b s 生物有效性的评价效果，主要结果如下： ( 1 ) 以添加p c b s 的壤土为研究对象，以蚯蚓蓄积试验为参照比较了温和有 机溶剂提取、温和d 环糊精( h y d r o x y p r o p y l c y c l o d e x t r i n ，h p c d ) 提取、半透 膜被动采样( s e m i p e r m e a b l em e m b r a n ed e v i c e s ，s p m d ) 与固相微萃取 ( s o l i d p h a s e m i c r o e x t r a c t i o n ，s p m e ) 四种方法对p c b s 的提取情况。四种方法 对土壤中p c b s 的提取量与蚯蚓蓄积量均有显著的正相关关系( p 5 0 0gl ， 2 0 ) ，文献中使用的均为h p b c d s 。h p c d 在水中会形成亲水的外表面以及亲 脂的内表面。基于h p c d 的这一特点，土壤水溶液中的有机污染物分子易于进 入h p c d 巨大分子的内表面，从而形成包含有机污染物的复合分子。因此，土 壤中游离态以及易解吸的有机污染物能够快速进入水相，而难解吸或被锁定的污 1 0 浙江人学硕士学位论文 染物无法进入肿c d 。 w n e f 蟹只= c h 2 c h o h e h 3o rh 图1 3 羟丙基环糊精的分子结构 f i g 1 3m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fh y d r o x y p r o p y l c y c l o d c x t r m r e i d 等【4 2 1 报道了老化对土壤中菲的回收率的影响，研究指出随着时间的延 长，土壤中菲的有效性逐渐降低；并且，研究使用了h p c d 水溶液萃取对土壤 中菲的回收率进行了测定，结果显示h p c d 提取与索式提取有类似的两阶段模 式：在最初的阶段菲的回收率较高，随后菲的回收率迅速下降。 c u y p e r s 掣5 9 1 使用h p c d 与t r i t o nx 1 0 0 评价了污染底泥中多环芳烃的生物 有效性，实验以t e n a x t a 树脂固相萃取为对照，结果显示底泥中生物有效态多 环芳烃是能够快速解吸的那部分。h p c d 提取与s p e 萃取有着良好的可比性， 而t r i t o n x 1 0 0 提高了多环芳烃的生物有效性。同时，实验也指出，h p c d 昂贵 的价格与不可再生性是这个评价方法的缺陷。 a l l a n 等使用水和h p c d 提取剂评价了四种土壤中多环芳烃的微生物有效 性，发现温和水提取低估了土壤中多环芳烃的生物有效性，而h p c d 可以准确 预估土壤中多环芳烃的微生物有效性。 h i c k m a n 等【6 l 】使用水和h p c d 提取剂评价了四种土壤中多环芳烃对蚯蚓和 微生物的生物有效性，微生物降解量与水提取量之间的相关系数为0 4 8 ( r 2 = o 9 6 ) ，与h p c d 提取量之间的相关系数为0 9 9 ( r 2 = o 8 8 ) ；两种温和提取剂均 高估了多环芳烃对蚯蚓的生物有效性，原因是土壤与蚯蚓质量比过大，蚯蚓无法 浙江大学硕士学位论文 完全富集土壤中生物有效态多环芳烃。 s e m p l e 掣6 2 】为了评估微生物矿化作用能否反映土壤中有机污染物的微生物 有效性，在微生物矿化停止后的菲污染土壤中，加入菲，降解菌与营养物质，新 加入的菲被快速降解，而微生物的量保持恒定，说明矿化的停止取决于土壤中有 效态的菲含量，而不是微生物的死亡或营养物质的减少。微生物降解菲与h p c d 提取量有很好的相关性。 随后，s e m p l e 等【6 3 】使用h p c d 提取技术评价了不同浓度菲污染土壤中( o 。1 0 0 m gk g o ) 的微生物有效性，并且在不同理化性质的土壤中( p h ：3 7 4 8 ；有机 质含量：5 7 1 0 8 ) 均能准确预测菲和芘的生物有效性。 h i c k m a n 等【删研究了4 种混合污染土壤与2 种高浓度污染土中1 6 种多环芳烃 的微生物降解量与h p c d 提取量之间的关系，发现6 种土壤中多环芳烃的的降解 量与h p c d 提取量有很好的相关性。 1 5 1 2 半透膜被动采样装置萃取( s e m i p e r m e a b l em e m b r a n ed e v i c e s ，s p m d ) 半透膜被动采样技术是由h u c k i n s 等人于1 9 9 0 年发展起来的，他们使用聚 乙烯或其他聚合物制成薄层膜套筒，筒内装有三油酸甘油酸酯的s p m d 来监测 水中的疏水性污染物。s p m d 的结构包括一薄长带状的聚乙烯膜套筒或其他非极 性的低密度的聚合物膜( 例如，聚丙烯或离子化硅树脂) 制成的套筒，其内装有 一薄层的大分子量( 6 0 0 d a ) 的中性脂( 例如三油酸甘油酯) 。由于许多环境污 染物的大小与这小孔的孔径接近，这使得那些分子量较小的溶解态的有机物得以 经扩散进入膜内。而那些附着在水中微粒上的或与一些溶解态的有机碳( 如腐殖 酸) 相结合的环境污染物由于其体积的限制就无法进入s p m d 内。进入s p m d 的有机污染物已被证明可定量地用有机溶剂从s p m d 中透析出来，而只有少量 的类脂物被带出【6 5 】。这样，就可以利用s p m d 对环境中的有机污染物进行时间 累加性的采集和定量分析。对于离子态的无机物和有机物，由于荷电离子在通过 膜时有高的质量传输阻力以及离子型化合物在类脂物中低的溶解度，不能被 s p m d 富集 6 6 】。虽然s p m d 所使用的非极性聚合物( 如聚乙烯) 的组成与由磷 脂双分子和蛋白质构成的生物膜的差别很大，但已有研究表明，一些非极性有机 物扩散通过聚合膜与扩散通过生物膜的行为极为相似。 1 2 浙太学砸 学位论文 图i as p m d 膜的构j 盘【“i f i g1 4s m n j r e o f s p m d s p m d 内装的螫台介质二三油酸甘油酯易得，易纯化。对许多环境污染物而言， 它们各自的辛醇一水的分配系数( 1 ( 0 。) 与三油酸甘油酯一水的分配系数( k 。) 极 为相近。其次，许多疏水性环境污染物k 。值很大，因此装有三油酸甘油酯的 s p m d 对这些污染物富集能力很强。再者三油酸甘油酯有较高的分子量( 8 8 54 ) ， 在样品采集和预处理过程中，不易引起螫合介质的扩散损失，此外，尽管三油酸 甘油酯的分子量高，但其熔点根低这就使得它也口丁以被应用在较冷豹环境中。 一是由于装有三油酸甘油酯的聚乙烯膜套筒的诸多优势，h u c k m s 等设置的这类 s p m d 得到了广泛的应用。目前，环境科学中所用的s p m d 常常指的就是 h u c k i n s 的s p m d 。 h u c k i n s “ 1 9 9 3 年提出了一个一层数学模型用来模拟s p m d 富集有机污染物 的过程，浚模型基于过膜传质阻力理论。这个模型假设污染物扩散进入聚合膜是 富集过程唯一的速度控制步骤，并假设污染物在水中的浓度是恒定的。基于上述 假设，h u c k i n s 等得到如下方程： c s ? m 口2 c w p m w p 岍 1 一e x p ( - k o ap m s t c , ) 2 c 以【1 - e x p ( - k v ，) 式中c s p m d 是污染物枉s p m d 中的浓度( n gg 。1 ) ，c w 是污染物在水中的浓 度( n gl 。) ，p m w 是污染物在膜和水之间的分配系数，r m s p是污染物相一膜和溶剂 怕帅 = 堇 浙江大学硕士学位论文 之间的分配系数，p s w 是污染物在溶剂和水之间的分配系数，k o 是总体传质系 数( m h 。1 ) ，a 是膜的表面积( m 2 ) ，k v 是吸附速率( h 1 ) ，v s 是溶剂体积( m 3 ) 。 当k o a p m s t v s 很小时( 1 ) ，或c s c w 、 k s w 时，上述方程可写成c s = c w p m wk oa t v s = c wr st v s 。r s = k m wk oa 可以看作s p m d 的吸收速率或采样速 率，其单位可用l d 表示。 随后，也有其他人提出一些新的模型，如g a l e 6 8 1 于1 9 9 8 年提出的一个新的 三层模型用于模拟s p m d 的吸收，但这些模型都较复杂，应用的时候常缺少某些 参数，所以目前广泛使用的还是h u c k i n s 的一层模型。 s p m d 被广泛用于模拟水生生物对于持久性有机污染物富集的最重要的特 点就是三油酸甘油酯是生物体内类脂的主要成分，这种亲脂性溶剂使得s p m d 可以模拟生物富集的全过程，从而可以用来评价生物有效性。任何中性的或者疏 水性的物质，只要它辛醇水分配系数的对数值大于3 ，就可以被s p m d 显著的 富集。许多持久性有机污染物已经在多种环境介质中被s p m d s 有效的富集，例 如多环芳烃( p a i l s ) 6 9 1 ，多氯联苯( p c b s ) 7 0 】，有机氯农药( o c p s ) 【7 1 7 2 1 ， 多氯二苯并二恶英( p c d d s ) ，多氯二苯并呋喃( p c d f s ) 6 7 】等。 s p m d 在水和大气中已经有了广泛的应用和研列7 3 1 ，但其在土壤中的应用前 景还不明确。 m e r j a 等1 7 4 】测定了1 0 种不同的沉积物中p c d d f s 和p c d e s 的含量，并测定 了s p m d 和蚯蚓对p c d d f s 和p c d e s 的富集程度，并通过偏最d - - 乘回归方法， 得到了污染物的物理化学性质( 水溶性，亲脂性，偶极距，分子尺寸和构造) 和 沉积物性质( 有机碳含量，颗粒尺寸，有机碳的极性) 对富集的影响。他指出： 污染物的亲脂性不是一个影响富集的最充分影响因子，分子的尺寸和构造( 平面 的分子) 和沉积物的性质同样是一个影响因素。影响蚯蚓富集的主要是生物因素， 而影响s p m d 的主要是污染物的物理化学性质。m a t t i 等【75 】在研究了蚯蚓和 s p m d 对沉积物中苯并 a 芘和3 ，3 ，4 ，4 一四氯联苯的富集曲线后指出：s p m d 对 有机物的富集速率要低于蚯蚓，有机物的解吸是影响生物有效性的很重要的作 用，同时，土壤动物的行为同样起着很重要的作用。m a g n u s 等【7 6 1 通过使用不同 化学评价方法和生物评价方法对土壤中p a i l 的生物有效性进行了评价，比较 s p m d s 与蚯蚓富集的程度，指出s p m d s 夸大了土壤中p a i l 的生物有效性。目 1 4 浙江大学硕士学位论文 前，使用s p m d s 评价土壤中持久性有机污染物的生物有效性的研究还较少， s p m d s 对土壤中持久性有机物的富集能力及其对土壤中p o p s 的生物有效性的 评价需要进行进一步深入研究。 1 5 1 3 固相微萃取( s o l i d p h a s em i c r o e x t r a c t i o n ，s p m e ) 固相微萃取技术是2 0 世纪9 0 年代兴起的一项新颖的样品前处理技术，它最 先由加拿大w a t e r l o o 大学p a w l i s z y n 教授的研究小组于1 9 8 9 年首次进行开发研 究，属于非溶剂型选择性萃取法【77 1 。这是基于萃取涂层与样品之间的吸收解吸 平衡而建立起来的集萃取、浓缩、进样功能于一体的新颖样品制备技术。 s p m e 已由美国的s u p e l c o 公司在1 9 9 3 年实现商品化，其装置类似于一支气 相色谱的微量进样器，萃取头是在一根石英纤维上涂上涂层，外套细不锈钢管以 保护石英纤维，纤维头可在钢管内自由伸缩。将纤维头浸入样品溶液中或顶空气 体中一段时间，待平衡后将纤维头取出插入气相色谱汽化室，解吸涂层上吸附的 物质。被萃取物在汽化室内解吸后，靠流动相将其导入色谱柱，完成提取、分离、 浓缩的全过程【7 8 】。固相微萃取技术几乎可以用于气体、液体、生物、固体等样品 中各类挥发性或半挥发性物质的分析中。 i l 图1 5s u p e l e o 公司的商品化s p m e f i g 1 5c o m m e r c i a l i z e ds p m eo fc o m p a n ys u p e l c o 浙江大学硕士学位论文 与传统的样品前处理技术相比，固相微萃取具有明显的优势： ( 1 ) 快速，简便，无需溶剂对样品进行提取； ( 2 ) 这是一个简单而有效的吸附、脱附技术； ( 3 ) 对于不同浓度的萃取物具有很好的线性结果； ( 4 ) 体积小，是可以进行实地取样的便携式装置； ( 5 ) 对于低浓度的目标萃取物，它可以提供高度一致，可量化的结果。 s p m e 装置中对萃取起决定作用的是萃取纤维。由于熔融石英纤维具有很好 的耐热性及化学稳定性，最初的方法就是直接利用熔融石英为吸附层【7 9 1 。 p a w l i s z y n 等最早使用的是涂渍有二甲基硅氧烷( p d m s ) 和聚丙烯酸酯( p a ) 涂层的萃取丝。起初商品s p m e 萃取丝的固定相有：聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 、 聚丙烯酸酯( p a ) 、碳吸附剂等。 在s p m e 的应用中，没有一种单一的涂层可以适应所有的化合物。除了这些 常用的固定相之外，十几年来人们逐渐研究了多种固定相涂层。针对不同的分析 物可选择不同涂层，以适应各种需要【8 0 】。人们首先开发的是混合型s p m e 萃取 丝涂层，如p d m s d v b ( 聚二甲基硅氧烷一二乙烯基苯) 、p d m s c a r b o x e n ( 聚 二甲基硅氧烷一专利碳吸附剂) 、c w - d v b ( 聚乙二醇二乙烯基苯) 、c w - t r r ( 聚 乙二醇高温树脂) ，s u p e l c o 公司把它们制成商品化s p m e 产品。这些纤维已经 应用到分析非极性有机化合物，例如苯系物，多环芳烃，农药等，极性有机化合 物，如酚，醇，酮，硝基芳烃等。 虽然使用固相微萃取纤维是越来越普及，他们目前仍有一些缺点，例如： ( 1 ) 相对较低的操作温度( 一般在2 4 0 2 8 0 ) ； ( 2 ) 纤维易断裂； ( 3 ) 涂层易脱落； ( 4 ) 针头易弯曲以及昂贵的成本。 s p m e 萃取方式的选择主要与待测物的挥发性、基质和探针固定相涂层的性 质有关。s p m e 有三种不同的萃取方式：顶空萃取、膜保护萃取和直接萃取【8 l 】。 直接萃取，既是将萃取纤维直接插入待测样品中，目标萃取物直接从样品转 移到萃取相中，可以对半挥发性和不挥发性样品进行萃取。为了快速萃取，一定 程度的搅动是需要的。对于气态样品，气体自然的对流就已经可以使萃取很快达 1 6 浙江大学硕士学位论文 到平衡。对于水相样品而言，搅动或者超声辅助萃取也是需要的，适当升高温度 可使分子运动加快，分子扩散速度更快，从而萃取相水相之间的平衡时间可以 缩短。 s p m e 萃取纤维直接插入水样或气体中进行萃取。它要求所萃取的基质比较 干净，否则有严重的基体干扰，当基体比较复杂时，可采用膜保护萃取【8 2 1 。 顶空萃取，即把s p m e 纤维纤维置于待测物样品的上空进行萃取的方法【8 3 】， 被分析物通过空气介质到达萃取涂层。该方法适合于挥发性和半挥发性样品的萃 取。当样品的基质复杂时，使用这种顶空萃取可以减少基体的干扰。 萃取方式的选择对于萃取动力学有着非常显著的影响。对于顶空萃取，萃取 速率主要取决于被分析物从样品到顶空相的传质速率。由于挥发性物质相对于半 挥发性物质在项空相中有着更高的浓度，有着更快的传质速率，因此，挥发性物 质比半挥发性物质更容易达到平衡。 萃取时间主要是指达到平衡时所需的时间。而平衡时间由分配系数、物质的 扩散速度、样品基质、样品的体积、萃取头的性质等众多因素决定。实际萃取时 间可由萃取时间和萃取量的吸附平衡曲线来决定。萃取过程一开始，吸附量迅速 增加，而接近平衡时，速度变得非常缓慢。 顶空萃取是三相萃取体系，包括溶液相、顶空部分和s p m e 高分子膜。在该 体系中，当分析物通过扩散达到分配平衡时，可得到： k 2 k i 玢玩 ，、 ，1 0 = 一乙o k 2 k l v i + k l 玩+ 儿 式中：c o 为分析物在溶液中的初始浓度，m o lm l 1 ；v s 、v f 、v h 分别是样 品、固定相和顶空部分的体积，m l , k 2 为分析物在顶空和高分子膜之间的分配 系数；k l 为分析物在样品溶液和顶空之间的分配系数。 令k = k 2 k l ，k 为分析物在样品溶液和高分子膜之间的分配系数，则： n o = 。一l , 0 剐f v s k 玢+ k i 玩+ 以 方程式描述了平衡时萃取量与初始浓度的关系。基于分配平衡理论，上述项 空s p m e 萃取得到的公式证明分析物通过扩散达到平衡时，萃取量正比于溶液中 分析物的初始浓度，这是s p m e 方法的定量基础。 1 7 浙江大学硕士学位论文 顶空固相微萃取法具有很多优势，已有学者将其运用到对土壤和沉积物中有 机氯农药含量的测定 3 8 , 8 4 , 8 5 。 d o o n g 的研究小组通过往样品中加入蒸馏水，并随后将顶空固相微萃取纤维 置于泥浆上空，对土壤和沉积物进行了研究。实验中土壤质量为o 5 克和2 克，并加入一定量的蒸馏水( 土水比为1 ：1 0 ) 。实验主要关注土壤类型对s p m e 提取效率，以及色谱分离的不利影响。实验结果与索式提取法的测定效果具有很 好的一致性。 h e r b e r t 等【1 9 1 使用p d m s 涂层，运用m a e h s s p m e g c m s m s 方法，测定了 土壤中11 种有机氯农药。在他的研究中，他使用的测定条件所获得的中间精密度 要比单独使用m a e 或者s p m e 方法要高很多。 c h i a 等【8 6 】设计了一个新的顶空萃取系统，对土壤中p c d d s p c d f s 进行萃取。 在小瓶的上部，使用一个冷却系统来冷却萃取纤维；而在瓶子的下部，使用加热 装置和超声装置对样品进行活化。使用这一装置，他对土壤中p c d d s p c d f s 具 有很好的萃取效果。这一装置集样品净化和萃取于一体，不使用有机溶剂，比传 统的索式提取和加速溶剂萃取更令人满意。尽管测定某些七氯和八氯取代的 p c d d s p c d f s 的灵敏度不好，这一技术仍然是一个监测土壤中低氯取代p c d d s p c d f s 的有前景的技术。 总的来说，p d m s 涂层是测定卤代持久性污染物最常用的涂层。样品温度应 超过6 5 ，萃取时间在4 0 至6 0 分钟之间。 g h i a s v a n d 等【8 7 1 使用冷纤维顶空s p m e 对土壤中p a i l s 进行了测定。这一改进 的装置通过提高涂层与顶空相的温度梯度，增大了被分析物的分配系数，从而提 高了被分析物在土壤中释放效率，使得被分析物更易于扩散到顶空相。并且，这 一技术可以通过商业全自动化装置，实现萃取，富集和进样的自动化。在最优化 的实验条件下，标准曲线线性范围在0 0 0 0 9 1 0 0 0n gg - i 之间，相关系数高达0 9 9 。 使用这一方法对已定量浓度的含p a h s 底泥标准样品进行测定，结果与标准浓度 相对一致。 e r i k s s o n 和他的研究小组【8 8 】将s p m e 与g c m s 联用，测定了土壤 p a h s 的含 量。他使用乙醛：正己烷( 8 0 ：2 0 ) 萃取与s p m e 萃取结果进行了比较：对于两 环和三环的p a h s ，使用s p m e 在6 0 。c 萃取测定的浓度与乙醛正己烷法测定的相 浙江大学硕士学位论文 关性非常好；而对于更高环数的p a l l s ，s p m e 萃取的浓度很低。这一结果说明 s p m e 是测定土壤中4 环以内p a h s ，非极性和挥发性物质的个快速有效的方法。 目前，对s p m e 的研究还停留在土壤中有机污染物的全量测定方面，使用 s p m e 评价土壤中持久性有机污染物的生物有效性的研究还较少，s p m e 对土壤 中p o p s 的富集能力与生物有效性的评价需要进行进一步深入研究。 1 5 2 生物学方法 生物方法评价生物有效性分为直接和间接两种： 1 5 2 1 直接生物方法 生物有效性的直接生物评价法是指直接测量生物体内富集污染物的含量或 微生物矿化的污染物的含量。这种方法将土壤中生物因素( 例如生物的新陈代谢) 与非生物因素( 如p h 值，有机质含量) 等影响生物有效性的因素综合起来考虑， 可以准确测定土壤中污染物对生物的有效性。常用的测定蚯蚓对有机污染物的生 物有效性的方法有两种：生物蓄积法和临界机体残留法( c r i t i c a lb o d y - r e s i d u e s ， c b 风) 。生物蓄积法是将蚯蚓直接暴露于污染土壤中，待富集平衡后，直接测定 蚯蚓体内污染物的含量。进入蚯蚓体内的污染物，一部分进入贮存组织，其他的 进入蚯蚓体内的毒性作用位点。当蚯蚓体内毒性作用位点的化合物的量低于引起 毒性作用的阈值时，不足以对蚯蚓产生毒性作用。c b r s 是指测定蚯蚓暴露在致 死或半致死剂量的有机污染物时体内该化合物的浓度 8 9 , 9 0 】。c b r s 方法测定的是 当化合物在蚯蚓体内毒性作用位点的积累量高于毒性阈值时，蚯蚓体内目标化合 物的总量。两种方法都可以直接准确地评价化合物的生物有效性，但是蚯蚓评价 法费用一般较高，试验的时间冗长，且生物的种类、个体差异大，实验重复性、 可比性差。 1 5 2 2 间接生物方法 当生物体暴露于污染土壤时，污染物会引起生物体中分子的、细胞的或生理 的改变。这些生理效应与土壤污染物的量之间有明显的剂量效应关系。因此， 通过测定这些生物效应可间接地反映有机污染物的生物有效性，通常生物体在微 观的水平上( 如组织、细胞、分子) 的生理、生化、分子或遗传指标被称为生物 标记物。生物标记物包括暴露生物标志物、效应生物标志物、易感性生物标志物 三类f 9 1 - 9 3 ：l 、暴露性生物标记物，外来因子与某些靶分子或细胞相互作用的产 1 9 浙江大学硕十学位论文 物都可认为是暴露生物标记物；2 、效应生物标记物，即在一定的环境暴露物作 用下，机体产生相应可测的生化、生理变化或其它病理改变；3 、易感性生物标 记物，它指机体暴露特定的外源化合物时，由于先天遗传性或后天缺陷而反映出 其反应能力的异类生物标记物。 生物标志物是用于检测和评价土壤污染的常用手段之，常用的生物标记物 有很多种，包括：溶酶体，金属硫蛋白，热休克蛋白，胆碱酯酶，多功能氧化酶， d n a 损伤等。热休克蛋白对多种胁迫因素都有反应【9 4 】，因此可以作为检测土壤 污染的生物标志物。热休克蛋白已用于五氯酚以及重金属铜、铅等污染物的土壤 暴露评价中 9 5 , 9 6 】，但由于热休克蛋白的应答缺乏特异性，且易受到各种环境因子 的影响，其在土壤污染诊断上的应用还有待于进一步改进。蚯蚓体内存在多种可 受污染物抑制或对污染物的诱导有响应的酶系，包括调控基础代谢与生理活动的 功能酶系、对外源物质具有降解作用的解毒或水解酶系，以及其他具有防御功能 的酶系如抗氧化酶、溶菌酶等。由于这些酶系能对污染暴露做出敏锐的响应，因 而也是检测土壤污染的生物标志物。目前，蚯蚓体内的过氧化氢酶( c a t ) 、谷 胱甘肽s 转移酶( g s t ) 等已被证实可对多环芳烃、杀虫剂等做出响应【9 7 ，9 8 1 。 细胞色素p 4 5 0 酶系是生物体内多功能氧化酶的重要组成部分，在底物的诱导下 可大量快速地表达，催化外源化合物发生氧化降解，具有敏锐响应和早期预警等 功能。蚯蚓9 4 5 0 酶系可用于对土壤中的有机污染物如多环芳烃等进行监测【9 9 1 ， 但反应没有特异性，蛋白的提取纯化技术和测定方法也相对复杂和繁琐，影响酶 活测定的准确性。蚯蚓体腔细胞溶酶体试验用于农药、石油烃、多环芳烃等土壤 污染物的评价也有报道【9 7 一o o 。细胞d n a 损伤也是检测污染物致癌、致畸、致 突变效应的理想生物标志物，其在土壤污染遗传毒性分析和环境风险预测中有重 要的应用价值。 生物标记物在生态毒理风险评价中得到了广泛的应用。该方法的能为土壤的 实际危害提供更准确的估计，其结果直接与土壤中污染物的生物可利用性相关， 而不仅仅是测量土壤中总污染物的浓度。但是由于土壤环境复杂，环境因素对生 物标志物的生化指标有很大影响，且不同的污染物对这些指标会表现出相似的毒 性效应。因此，选择更加灵敏特异的生物标志物，区分环境因素和污染物的效应 以及各种不同污染物的效应的研究有待加强。 浙江大学硕_ = f ：学位论文 1 6 论文的研究意义、研究目标与研究内容 1 6 1 研究意义 土壤是人类赖以生存的主要自然资源之一，也是人类生态环境的重要组成部 分。我国些地区不当暂存、处置电力电容器、变压器已经导致了较为严重的土 壤p c b s 污染。p c b s 作为电子电器废弃物拆解作业所释放的各类有机污染物中 的一种，不但对土壤生态系统和微生物群落结构有影响，并且通过食物链对人类 健康产生影响。毒理研究表明：进入人体或动物体的高浓度多氯联苯，是典型的 环境激素，有强致毒、致癌性能，能引起肝损伤和白细胞增加，并可通过母体传 递给子体，并有致畸作用，其对生态环境的危害已经引起了人们的高度关注。 多氯联苯进入土壤后，首先吸附在土壤大孔隙及各种无机颗粒表面，随着与 土壤接触时间的延长，污染物逐渐扩散到微生物无法进入的极小孔隙中，或者分 配进土壤有机质( s o m ) 内。这一过程也被称为老化，老化过程中多氯联苯的 可提取性和生物有效性逐渐降低。如何快速准确评价土壤中多氯联苯的生物有效 性，已经成为学术界研究的热点问题。从修复角度讲，污染物的生物有效性已经 成为限制修复效果的主要因素之一。生物有效性的准确评价不仅可以为清除土壤 污染物提供理论基础，而且还可以为有关部门进行污染风险管理提供科学依据。 目前，土壤污染物的风险评价仍然采用耗竭性有机溶剂提取方法得到的总浓度， 并不能真实反应土壤中污染物的生物有效态的含量，过高地估计了土壤中污染物 对生物的毒性以及风险。常用的生物评价方法实验周期较长，所用生物个体差异 大，实验精度较低。因此，用化学提取模拟生物吸收是研究污染物生物有效性的 重要手段。 国内外已对化学提取模拟生物吸收评价土壤中持久性污染物的生物有效性 进行了大量研究，这些方法包括固相微萃取、半透膜被动采样、温和提取法( 包 括温和有机溶剂提取、温和表面活性剂提取) 等，但目标污染物主要集中于多环 芳烃，农药等，对多氯联苯的研究还不多。 浙江省台州市是华东地区乃至全国主要的电子电器废弃物资源回收利用中 ，t l , ，二十多年的拆解作业使得周边土壤以及耕作农用土壤受到不同程度的多氯联 苯污染。如何对污染土壤进行风险评价与修复是当地政府迫切需要解决的问题。 因此，土壤中多氯联苯的生物有效性研究是一个非常有意义的探索，如果能找到 2 l 浙江大学硕士学位论文 快速准确评价的化学提取方法，将能为评价多氯联苯污染土壤评价与修复提供理 论基础。本研究拟采用多种化学提取方法与蚯蚓蓄积实验相结合，研究土壤中多 氯联苯化学提取量与生物富集量之间的相关性，以期找到一种能够快速评价土壤 中多氯联苯生物有效性的化学提取方法，并最终为土壤多氯联苯风险评价与修复 提供相关技术支持。 1 6 2 研究目标 为了研究土壤中多氯联苯的生物有效性，以实验室添加多氯联苯的老化土壤 为实验样品，分析化学提取方法( 温和有机溶剂提取、温和表面活性剂提取、半 透膜被动采样、固相微萃取法) 提取量与蚯蚓蓄积量之间的关系，以期找到一种 能够快速评价土壤中多氯联苯生物有效性的化学提取方法。使用高浓度多氯联苯 污染土壤进行堆制实验，应用上述方法分析堆制前后土壤中多氯联苯的生物有效 性变化，验证化学提取方法评价污染土壤生物有效性的可行性，并为多氯联苯污 染土壤的生物修复与评价提供理论依据与技术支持。 1 6 3 研究内容 1 、老化土壤多氯联苯生物有效性研究 ( 1 ) 土壤多氯联苯含量测定和组成分析； ( 2 )温和正丁醇提取法评价土壤中多氯联苯的生物有效性； ( 3 ) 温和h p c d 提取法评价土壤中多氯联苯的生物有效性； ( 4 ) 半透膜被动采样装置评价评价土壤中多氯联苯的生物有效性； ( 5 )固相微萃取装置评价评价土壤中多氯联苯的生物有效性； ( 6 ) 土壤中多氯联苯的化学提取量与蚯蚓富集量之间的关系。 2 、堆制土壤多氯联苯生物有效性研究 ( 1 ) 堆制前后土壤多氯联苯含量分析和组成分析； ( 2 ) 堆制对土壤中多氯联苯的生物有效性的影响； ( 3 ) 堆制对土壤中多氯联苯的化学可提取性的影响； ( 4 ) 化学提取法预测土壤中多氯联苯的蚯蚓富集量。 浙江大学硕士学位论文 1 6 4 技术路线 浙江大学硕士学位论文 第二章老化土壤中多氯联苯对蚯蚓的生物有效性评价方法研究 2 1 前言 随着污染物与土壤接触时间的增加，污染物的生物有效性和化学可提取性逐 渐降低。在以往的研究中，由于忽略了土壤中污染物的生物可利用性，从而过高 地估计了污染物的生态风险。目前，污染物生物可利用性的重要性逐渐显现出来， 如何快速有效地评价有机污染物在土壤中的生物有效性是目前有机污染风险评 价研究的一个热点问题。研究土壤中有机污染物的生物可利用性主要有化学方法 和生物方法两种。化学方法通常采取溶剂萃取的方法来评价生物可利用性，过去 常采用强烈的耗竭性提取法，如索氏提取。然而由于老化现象的存在，这些方法 提取出的有机污染物的量与其生物有效性存在较大差异，因此过高地估计了土壤 中化学物质的生物有效性部分5 1 ，夸大了有机污染物的环境风险。常用的生物评 价方法实验周期较长，所用生物个体差异大，实验精度较低。近年来，有研究者 开始探讨用化学手段模拟有机污染物对生物的有效性。这些方法包括温和提取法 ( 包括温和有机溶剂提取、温和表面活性剂提取) 、半透膜被动采样、固相微萃 取等。 2 2 材料与方法 2 2 1 供试材料 赤子爱胜蚓( e i s e n i a f o e t i d a ) 购于浙江大学华家池校区农场。正式实验前， 所有蚯蚓在实验室至少驯化1 4 天。半透膜被动采样装置购于美国 e n v i r o n m e n t a ls a m p l i n gt e c h n o l o g i e s 公司，固相微萃取萃取头( p d m s ) 购自于 美国s i g m a 公司。 多氯联苯a r o c l o r1 2 5 4 购自上海百灵威公司，a r o c l o r1 2 5 4 标准物质含有以 下单体：p c b2 8 、p c b 3 1 、p c b 3 3 、p c b 3 7 、p c b4 1 、p c b4 2 、p c b 4 4 、p c b 4 7 ，p c b4 8 ，p c b4 9 ，p c b 5 2 ，p c b 5 3 ，p c b5 6 ，p c b6 0 ，p c b6 4 ，p c b6 6 、 p c b7 0 、p c b 7 4 、p c b8 2 、p c b8 3 、p c b8 4 、p c b8 5 、p c b 8 7 、p c b9 1 、p c b 9 5 、p c b9 7 、p c b 9 9 、p c b1 0 1 、p c b1 0 5 、p c b1 0 9 、p c b1 1 0 、p c b1 1 4 、p c b 1 1 8