（食品科学专业论文）ε聚赖氨酸产生菌的筛选、鉴定及发酵的研究.pdf

沈阳农业大学博士学位论文 摘要 随着人们对食品安全性的认识和要求的逐步提高，化学防腐剂受到严竣挑战，食 品防霉防腐荆的天然化已成为今后的发展趋势。开发抗菌性强、安全无毒的天然防腐 剂已成为各国食品科技工作者的研究重点。 - 聚赖氨酸( 8 - p o l y 1 y s i n e ，- p l ) 是目前天然防腐剂中具有优良防腐性能和巨大 商业潜力的微生物类食品防腐剂，g - p l 是由2 0 一3 5 个赖氨酸残基通过a - 羧基和氨基 聚合成的具有抑菌功效的多肽。它具有安全性高、对革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌， 真菌等都有广泛的抑制作用等优点，且热稳定性，水溶性好。在食品保鲜防腐、医学 等方面都有广泛的应用。因此g - p l 的研究开发具有十分重要的理论意义和应用价值。 本研究对g - p l 产生菌的筛选、鉴定及其发酵高产的条件进行了系统的研究，并在 此基础上探讨了g - p l 的提取工艺、生物活性、抑菌和生物合成的机理，取得了以下结 果与进展。 ” l 、8 - p l 含量测定的最佳反应体系建立 本研究建立了测定p l 含量的最佳反应体系， 1 p 2 m l 浓度为o 1 2 0 9 l 的g - p l 与 2 m l 浓度为0 7 5 m m o l l 甲基橙的混合，混合液振荡3 0 分钟，室温下离, l , 1 5 分钟，速度 是4 0 0 0 转分，上清夜稀释2 0 倍，测4 6 5 n m 吸光度。而且当反应液中含半胱氨酸、组氨 酸、精氨酸、对测定结果有影响。同时，通过最佳体系，进行了标准曲线的测定。 2 、争p l 产生菌的筛选与鉴定 本研究通过用形态特征和生理生化特征对土样进行初筛，用滤纸片抑菌圈法进行 复筛和摇瓶发酵测定- p l 产量，筛选出一株争p l 产生菌一菌株b 一2 1 5 ，g - p l 产量为o 6 5 班。对菌株& 2 1 5 的形态特征、培养特征、生理生化特征、1 6 s r r n a 基因序列进行 了系统的研究与分析。结果表明，菌株& 2 1 5 具有8 - p l 产生菌的典型的形态特征、培 养特征和生理生化特征以1 6 sr d n a 全序列为基础的系统发育树与s t r e p t o m y c e s a l b u s 的序列同源性最高，达9 9 。综合形态、生理生化和化学分类特征，对照参考文献， 将菌株b 2 1 5 的鉴定结果定名为：白色链霉菌b - - 2 1 5 ( s t r e p t o m y c e sa l b u s & 2 1 5 ) 。 3 、e - p l 高产菌株的选育及培养条件研究 s t r e p t o m y c e sa l b u sb 2 1 5 通过紫外诱变，得到一株g - p l 产量为o 7 5g ，l 的突变株 s t r e p t o m y c e sa l b u sb u 2 1 5 ，比未诱变的产量提高2 0 9 7 。其发酵液抑菌圈的h c 为 1 5 6 ，比对照菌株高2 5 8 l 。 单因子实验结果表明，对砌印幻磁弦醛a l b u sb u - 2 1 5 发酵产g - p l 具有显著影响的培 摘要 养基因子是葡萄糖、酵母膏、k h 2 p 0 4 、( n h 4 ) 2 s 0 4 、初始p h 、接种量、转速和装液 量。 发酵液的- p l 含量对关键培养基因子的多元回归方程： y = 0 8 3 5 4 + 0 0 3 4 蜀- o 0 3 局+ o 0 0 7 x 3 - 0 0 0 4 7 x 4 + 0 0 2 4 局+ o 0 2 5 x i x 3 + 0 0 1 2 m 局一0 0 5 9 3 x 2 x 3 0 0 3 x 2 x 4 - 0 0 3 3 x 3 x 4 - 0 0 3 2 x 1 “2 0 0 2 4 ： 2 “2 - 0 0 0 7 8 x 3 2 + 0 0 1 5 x 4 2 由方程可以看出a ( 葡萄糖) 、b ( 硫酸铵) 、a b 项、a c 项、b c ( 磷酸= 氢钾) 项、b d ( 酵母膏) 项、c d 项对8 - p l 含量的影响均达到显著水平，方程拟合优度好，r 2 值为0 9 5 8 3 ，r 2 a 由值为0 9 1 8 4 ，二者均达到显著水平。预测值与实测值具有高度相 关性，r 2 p r e = 0 7 8 3 4 。 发酵液的e - p l 含量对关键发酵条件的多元回归方程： y = 0 9 6 - 0 0 0 2 4 x i + o 0 9 8 为+ o 0 5 2 局+ o 0 11 x 4 - 0 0 4 4 x t x 2 + o 0 0 5 x l x 3 + o 0 1 9 j ，l x 4 - 0 0 1 6 x 2 x 3 - 0 0 0 8 x z x 4 + 0 0 2 7 x 3 x 4 - 0 0 0 1 7 x i “2 0 0 4 7 x 2 “2 - 0 0 2 3 3 ( 3 “2 + 0 0 0 4 5 x 4 “2 方程极显著( p 0 0 0 0 1 ) 其中b ( p h ) 、c ( 接种量) 、a b 项、a d 项、b 一2 、c a 2 对 s - p l 含量的影响均达到极显著水平。此处r 2 值为0 9 4 6 1 ，r 2 a d j 值为o 8 9 5 8 ，二者均 达到显著水平，表明拟合优度好，预测值与实测值具有高度相关性，r 2 p r e = 0 8 3 7 3 。 通过响应面法设计和分析得到的优化结果为：葡萄糖5 5 5 0 l ，硫酸铵1 2 2 5 8 l ， 磷酸二氢钾1 7 2 8 n 。，酵母膏7 8 0 l ，装液量5 0 m l 5 0 0 m l ，p h = 7 ，接种量1 0 ，转速1 8 0 r p m ， 8 - p l 产量为1 0 8 5 l 。验证实验表明实验模型准确、可靠，说明r s b 法可以推广应用于 各种各样的生物过程优化中。 4 、- p l 提取方法的研究 碱变性法除杂蛋白的效果比较好，预处理后蛋白含量减少了4 8 5 7 ，而- p l 量 变化不大，只损失了4 0 8 。 由圆盘电泳结果和薄层层析结果说明，提取后的收集液中只含有一种多肽， s t r e p t o m y c e sa l b u sb u 2 1 5 提取液中活性多肽氨基酸组成分析说明，多肽水解后主要含 有赖氨酸。在此可以确定这种多肽就是p l ，b o s t r e p t o m y c e sa l b u sb u - 2 1 5 是产p l 的菌 株。说明本研究所使用的p l 的提取工艺是适合的。 5 、e - p l 的生物活性及生物合成机理 v - p l 的生物活性高，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、绿色木霉、啤酒酵母、 红酵母、苏云金芽孢杆菌和番茄灰霉病菌都有强的抑菌效果，是一种广谱天然抑菌剂。 同时p l 的热稳定性非常好，其在高温情况下不分解，不失活，能够承受一般食品加工 过程中的热处理，可以随原料一同进行灭菌处理，防止二次污染。 电镜结果表明：g - p l 抑菌机理主要表现在破坏微生物的细胞膜结构，使细胞丧失 i i 沈阳农业大学博士学位论文 对物质的选择性，并可导致胞内溶酶体膜破裂而诱导微生物产生自溶作用，最终导致 细胞死亡。 e - p l 的生物合成与其产生菌白色链霉菌b u 2 1 5 0 0 的质粒有关。质粒消除后的白色 链霉菌b u 2 1 5 的发酵液没有抑菌效果，且发酵液中g - p l 的含量几乎为零。 关键词：c 一聚赖氨酸；菌种筛选与鉴定；菌种选育；发酵；提取方法；生物活性： 抑菌与生物合成机理 1 1 1 摘要 a b s t r a c t n o w a d a y s ，c h e m i c a lp r e s e r v a t i v e sa r ec o n f r o n t e dw i t ha u s t e r ec h a l l e n g e so fn a t u r a l o n e sa l o n gw i t ht h ei m p r o v i n go fk n o w l e d g ea n dr e q u e s to ff o o ds a f e t y i ti sa ni m p o r t a n t f o c u so ff o o ds c i e n t i s ti nt h ew o r l dt os e a r c hn a t u r a l p r e s e r v a t i v e sw i ms t r o n g b a c t e r i a - r e s i s t a n c e ，s a f e t ya n di r m o c u i t y i nt h em i c r o b i a l p r e s e r v a t i v ea r e a ，s - p o l y l y s i n es h o w se f e c t i v ea n t i m i c r o b i a l p r o p e r t i e sa n dg r e a tc o m m e r c i a lp o t e n t i a i 8 - p l ak i n do fp e p t i d eo f2 5 3 0a m i n oa c i d r e s i d u e sw i t hal i n k a g eb e t w e e na - c a r b o x y l g r o u pa n ds - a m i n og r o u p ，h a s l o t so f a d v a n t a g e s o v e rt r a d i t i o n a l p r e s e r v a t i v e s ，s u c h a s h i g hs a f e t y ，s t r o n g h e a t s t a b i l i t y ， s o l u b i l i t y i nw a t e r ，a n de x t e n s i v ea n t i m i c r o b i a l a g a i n s tm o s tg r a m - p o s i t i v e a n d g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i aa n df u n g i i th a sb e e n a p p l i e de x t e n s i v e l y i nf o o da n d p h a r m a c e u t i c a li n d u s t r y s of a r ，i ti sm o s ti m p o r t a n tn o to n l yi nt h e o r yb u ta l s oi n a p p l i c a t i o n st os t u d ya n de x p l o i tg - p l t h i sa r t i c l eh a sas y s t e m i cs t u d yo ni s o l a t i n ga n di d e n t i f y i n gm u s h r o o mw i t hh i g i i y i e l do fc - p lp r o d u c t i o n ，a n dr e v e a l st h eb e s tg r o w i n gc o n d i t i o nf o rh i g hy i e l d m o r e o v e r ， t h et e c h n o l o g i c a lp r o c e s so fe x t r a c t i o n ，b i o l o g i c a la c t i v i t y ，m e c h a n i s mo fa n t i m i c r o b i a l a c t i v i t ya n db i o s y n t h e s i sp a t h w a yo fs - p l ，h a sb e e ni n v e s t i g a t e dc o m p r e h e n s i v e l y t h e r e s u l t sa sf o l l o w s ： 1 s e t t i n gu pt h eb e s tr e a c t i o ns y s t e mt om e n s u r a t e p lc o n t e n t t h i sr e s e a r c hh a ss e t t e du pt h eb e s tr e a c t i o ns y s t e mt om e n s u r a t eg - p lc o n t e n t ：t om i x 2 m l0 - 1 2 0 9 lg - p l w i t h2 m l0 7 5 m m o l lm e o ，a n ds u r g et h em i x t u r el i q u i d3 0r a i n ；t o t a k e4 0 0 0 r p mc e n t r i f u g a lt r e a t m e n tf o r1 5 m i nu n d e rt h er o o mt e m p e r a t u r e ，d i l u t et h e c e n t r i f u g a ll i q u i d 2 0t i m e sa n dm e a s u r et h ea b s o r b e n c yi n 4 6 5 n m h o w e v e r ，w h e n c y s t e i n e , h i s t i d i n ea n da r g i n i n eb e i n ga d d e di n t ot h em i x t u r e ，t h ev a l u eo ft h ea b s o r b e n c ya t 4 6 5 n mw o u l db ei n f l u e n c e d t h es t a n d a r d w o r k i n gc u r v eo fs - p lh a sb e e nf i n i s h e d a c c o r d i n gt ot h eb e s tr e a c t i o ns y s t e m 2 i s o l a t i n ga n di d e n t i f y i n gm u s h r o o m sw i t hh i 【g l iy i e l dg - p lp r o d u c t i o n am u s h r o o ms t r a i nw i t hh i g l ly i e l d p lp r o d u c t i o nh a sb e e ni s o l a t e du n d e rt h i s w a y ：f i s t l y ，t o i s o l a t et h em u s h r o o m sp r i m a r i l y b ym o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s s e c o n d l y ，t o i s o l a t et h em u s h r o o m s a g a i n b y a n t i m i e r o b i a l e x p e r i m e n t f i n a l l y ，am u s h r o o ms t r a i nn a m e da sb 一2 1 5w i t ho 6 5e g le - p lp r o d u c t i o nh a s b e e nd i s c o v e r e d t h ec h a r a c t e r i s t i c so fm o r p h o l o g y ，c u l t u r e ，p h y s i o c h e m i s t r y ，a n ds e q u e n c eo f1 6 s i v 沈阳农业大学博士学位论文 r d n a ，o f b 一2 1 5s t r a i n ，h a sb e e ns h o w n t h er e s u l t si n d i c a t et h a ts t r a i nb - 2 1 5h a st h et y p i c a l c h a r a c t e r i s t i co fm u s h r o o m st op r o d u c eg - p l p h y l o g e n e t i ct r e eb a s e do nt h e1 6 s rd n as e q u e n c eo fb 一2 1 5 ，s h o w st h eh i g h e s t h o m o l o g y ，9 9 ，t os t r e p t o m y c e sa l b u s t h u s ，t h e m u s h r o o mb - 2 1 5i sn a m e da s s t r e p t o m y c e sa l b u sb 一2 1 5 3 m u t a g e n e s i sa n dc u l t u r ec o n d i t i o no f h i g hy i e l do f g - p lp r o d u c t i o no f m u s h r o o m a f t e ru vm u t a g e n e s i s ，am u t a n ts t r e p t o m y c e sa l b u sb u - 2 1 5 、】i ，i t l lo 7 5g ，ly i e l do f 8 - p lp r o d u c t i o n s h o w s2 0 9 7 h i g h e r t h a n t h ec o n t r 0 1 t h eh co f b u 2 1 5i s1 5 6 ，w h i c h i s2 5 8 1 h i g e rt h a nt h ec o n t r 0 1 t h er e s u l to fs i n g l ef a c t o re x p e r i m e n ts h o w st h a tt h ec r i t i c a lf a c t o ro f8 - p lp r o d u c t i o n o fs t r e p t o m y c e sa l b u sb u - 2 1 5a r e 翻u c o s e , y e a s te x t r a c t i o n ，k h 2 p 0 4 ，州i - i , ) 2 s 0 4 ，p r i m a r y p h ，i n o c u l a t i o nv o l u m e ，r o t a t i o ns p e e da n dm e d i u mv o l u m e 1 1 mr e g r e s s i o ne q u a t i o no f s - p ly i e l dt ot h ec r i t i c a lc u l t u r em e d i u mf a c t o ri s ： y = o 8 3 5 4 + 0 0 3 4 x t - 0 0 3 x 2 + o 0 0 7 7 ( 3 - 0 0 0 4 7 x 4 + 0 0 2 4 x t x 2 + 0 0 2 5 x l x 3 + 0 0 1 2 蜀甄- 0 0 5 9 3 x z x 3 - 0 0 3 x 2 x 4 - 0 0 3 3 x v x 4 - 0 0 3 2 x 1 2 - 0 0 2 4 _ ，2 “2 - 0 0 0 7 8 x 3 2 + o 0 1 5 x 4 2 t h ee q u a t i o ns h o w sa ( g l u e o s e ) ，b ( ( n h a ) 2 s 0 4 ) ，aa n db ，aa n dc ( k h 2 p 0 4 ) ，ba n d c ，ba n dd ( y e a s te x t r a c t i o n ) ，ca n dda r ea l lt h ec r u c i a lf a c t o r sr e m a r k a b l ya f f e c t i n g 和p l y i e l d b o t ho ft h ed e t e r m i n a t i o nc o e f f i c i e n t ( r 2 ) w h i c hi s0 9 5 8 3a n da d j u s tc o e f f i c i e n to f d e t e r m i n a t i o n ( r 2 a d j ) w h i c hi so 9 1 8 4 ，r e a c ht h er e m a r k a b l el e v e l t h ev a l u e si n d i c a t et h e a c c u r a c ya n dg e n e r a la v a i l a b i l i t yo f t h ep o l y n o m i a lm o d e l t h ep r e d i c t e dv a l u es h o w sg r e a t c o r r e l a t i o nw i t ht h ee x p e r i m e n t a lv a l u e ，r 2 p r e = 0 7 8 3 4 t h er e g r e s s i o ne q u a t i o no f p ly i e l dt ot h ec r i t i c a lf a c t o ro ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n i s ： y = 0 9 6 - 0 0 0 2 4 x i + o 0 9 8 配+ o 0 5 2局+ 0 0 l1 x 4 - 0 0 4 4 x t x 2 + 0 0 0 5 x i x 3 + 0 0 1 9 蜀x 4 - 0 0 1 6 x 2 x 3 - 0 0 0 8 x v z 4 + 0 0 2 7 x 3 x 4 - 0 0 0 1 7 蜀 2 - 0 0 4 7 x 2 2 - 0 0 2 3 x 3 2 + 0 0 0 4 5 x 4 2 a c c o r d i n gt ot h ee q u t i o n ( p 唧年月，2 日 关于论文知识产权和使用授权的说明 本论文的知识产权为沈阳农业大学所有。本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使 用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的内容。 学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅自对外发表。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：井切吾侈 翩鹕。钐f 参泸 时间：砷年月。日 时间：) 卯7 年易月从日 沈阳农业大学博士学位论文 第一章前言 1 1 本研究的目的与意义 食品防腐是食品工业的重要内容。目前，食品防腐剂主要有人工合成防腐剂和 天然防腐剂。人工合成防腐剂的防腐作用常常受到p h 值的影响，即通常只在酸性条 件下才有效，而在p h 值接近中性的食品中几乎丧失防腐作用，并且对人体有一定的 毒副作用。而当前所常用的天然防腐剂抗菌谱窄、效率低，其防腐作用十分有限。 因此，抗菌谱广、高效、无毒、不受p h 值影响的防腐剂的研究与开发是食品工业的 重大课题。 随着人们对食品安全认识和要求的逐步提高，化学防腐剂的应用已受到严峻挑 战，食品防腐剂的天然化是大势所趋。天然防腐剂是近年来国内外倡导、开发和寻 求的新型产品，它不但对人体健康无害，有的还具有一定的营养价值，是今后开发 的方向。 天然防腐剂是指从生物体内，通过生物培养、提取和分离技术获得的具有抑制 和杀灭微生物的天然生物活性物质( 贾士儒，2 0 0 5 ) 。目前天然防腐剂有三种类型： 天然动植物的直接提取物；生物工程产品如乳酸链球菌素、海松素、溶菌酶和8 p l 等；天然存在于各种生物体且可以通过人工修饰、分解、蒸馏等方法制得的产品， 如丙酸、维生素k 等。国外对天然食品防腐剂的合成、筛选、抗菌性能和抗菌机理 进行大量研究的同时，对有关食品防腐剂的法规也不断补充、完善。 到目前为止，国外食品防腐剂行业已相当成熟，开发出了数十种天然食品防腐 剂，建立了完备的法规( 李兆龙，1 9 8 9 ) 。国内对天然食品防腐剂的研究起步较晚， 目前尚属初级阶段，为适应社会发展要求，国内学者也做了大量的工作。2 l 世纪是“绿 色”的世纪，是追求食品安全与可持续发展的世纪。因此，开发绿色食品、有机食品 成为提高经济效益，增加市场竞争力，提高人民生活质量的重要举措。随着人民生 活水平的进一步提高，天然食品防腐剂在食品加工保藏过程中将被广泛使用。生物 技术的飞速发展，为开发、应用天然食品防腐剂开辟了一条崭新的途径。 8 - 聚赖氨酸( - p o l y 1 y s i n e ，t - p l ) 是目前生物防腐剂中具有优良防腐性能和巨大 商业潜力的微生物类食品防腐剂( h i r a k ij ，1 9 9 5 ) 。s p l 是一种天然的微生物代谢产 物，是经分离提取精制而获得的发酵产品。8 p l 抑菌谱广，在酸性和微酸性环境中 对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均有一定的抑菌效果，尤其对其他 天然防腐剂不易抑制的大肠杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌抑菌效果非常好( k i t o m 第一章前言 e ta l 。2 0 0 2 ) 。8 p l 的用途十分广泛，例如可以作为广谱食品防腐剂，作为药物载体、 作为细胞融合中的促融剂、作为人工合成抗原的载体、化妆品中的增白剂等。此外， - p l 作为食品防腐剂，具有广谱、高效、无毒、受p h 值影响小等特点，这些特点是 目前普遍使用的各种其它防腐剂所欠缺的，完全符合食品防腐剂的发展要求。 1 9 4 7 年，e p r a i n 首先完成p l 的化学合成。人工合成的p l 为o r 型，其赖氨酸残基之 间的酰胺键是由a 氨基和口羧基缩合而成，c t p l 比- p l 抑菌活性差且有一定的毒性。 目前在国际市场上s p l 作为食品防腐剂已经取代了a - p l 。 1 9 7 7 年，日本科学家腾井正弘和平木纯等发现了c - p l 。- p l 是链霉菌产生的， 由多个赖氨酸单体组成。争p l 可以完全被人体消化吸收，没有任何毒副作用，还可 以作为一种赖氨酸的来源( s h o j is h i m a ，1 9 7 7 ) ；另外，- p l 的抗菌谱广，对革兰氏阳 性和革兰氏阴性细菌、酵母、霉菌、病毒等都有明显的杀灭作用；抑菌效率高，在 浓度很低时就起作用；它还不受食品p h 值的影响。因此，研究开发这种新型食品防 腐剂具有十分重要的理论意义和应用价值。 当前，8 - p l 的微生物发酵在日本已实现工业化，p l 的现代化工业装置已建成 投产，年产量上千吨。但该技术在国内还处于实验室阶段，8 p l 生物防腐剂的开发 和生产还属空白，因此，开发出具有自主知识产权的p l 生物防腐剂，对我国的食 品工业具有重大的意义，预计产生的经济效益和社会效益也势必极为可观。 1 2 国内外研究进展 1 2 1 - p l 简介 1 2 1 1 z p l 的发现 g - p l 最早是在1 9 7 7 年由同本科学家发现的，当时偶然发现了一株链霉菌能分泌 一种碱性成分。对该碱性成分先后通过离子交换层析、活性炭脱色、乙醇一乙醚( 2 ： 1 ) 混合有机溶剂沉淀等方法纯化，得到了一种白色粉末。将此白色粉末进一步通过 c m - - s e p h a r o s e 离子交换层析和s e p h a d e xg 2 5 凝胶柱层析，得到纯化。该白色粉末 对d r a g e n d o r f s 试剂、茚三酮、c 1 2 k i 一淀粉试剂呈阳性反应，在1 6 8 0 1 6 4 0 c m 以 及1 5 8 0 c m 1 5 2 0 c m 处有红外吸收。元素分析表明该产物含有3 9 7 5 c 、1 5 3 3 n 、 8 1 l h 、2 1 6 6 c l ，表明该白色粉末中有肽键。将此白色粉末用盐酸完全水解后， 用纸层析和氨基酸分析仪分析发现水解产物中只有赖氨酸而没有其他氨基酸。以上 表明，该白色粉末由赖氨酸缩合而成，每个赖氨酸单体上结合一分子水和一分子盐 酸。用n a o h 滴定该白色粉末，与p l 的滴定曲线比较，该白色粉木的p k a = 7 6 ，在 p i l l 0 处没有缓冲效应，说明组成该白色粉末的赖氨酸的a 氨基是游离的，而8 氨基 参与形成了肽键。该白色粉末部分水解后用纤维素层析，用线性梯度的n a c l 洗脱， 2 沈刚农业人学博十学位论文 表明由2 5 3 0 个赖氨酸单体组成。 1 2 1 2s - p l 的定量分析 发酵液中p l 含量的测定方法目前主要有以下3 种。 茚三酮法：l 一赖氨酸是合成8 - p l 的前体物质，白色链霉菌发酵液中l 一赖氨酸 的浓度直接影响到- p l 的合成状况，因此，准确测定发酵液中的l 一赖氨酸含量对探 讨8 - p l 的合成进程很有必要。目前发酵法生产赖氨酸的菌种都是细菌，常用的发 酵液中l 一赖氨酸浓度的测定方法也都是针对细菌的。白色链霉菌发酵液中赖氨酸 含量的测定方法可用茚三酮法。即利用赖氨酸与茚三酮在p h 3 以下的专一显色反应， 在4 7 5 n m 处定量测定。将发酵液4 0 0 0r r a i n 离心1 5 r a i n ，上清液适当稀释，取2m l 稀释液与茚三酮反应，测得样品o d 值后，在标准曲线上求出p l 浓度，再乘以稀释 倍数即为发酵原液中的p l 浓度。 i t z h a k i 方法：此法是一种简单而很灵敏的定量分析g - p l 的方法。采用甲基橙与 8 - p l 在一定条件下结合，产生沉淀，通过比色法测出未与p l 结合的甲基橙含量， 进一步可以得至i j p l 的浓度。一般测定步骤如下：取一个干燥的小试管，加入2 m l 待 测液，2 m l 甲基橙，摇床振荡3 0 m i n ，保温3 0r a i n ，转速3 0 0 0 r p m ，离心分离1 5 r a i n ，比 色。 高效液相色谱法：配制一定浓度的p l 标准样品溶液，利用紫外波长扫描仪检 测p l 的最大紫外吸收波长。色谱条件：色谱柱为q d s 一1 2 0 1 ，柱( s h i m a d z u ) 。 2 5 4 x 4 6 m m ，流动相为0 1 h 3 p 0 4 ( 分析纯，经o 5 斗m 微滤膜过滤) ，柱温为室温，流 速为0 4 m l m i n ，检测波长为2 1 0 n m ，进样体积为l o l 。定性：相同色谱条件下，将样 品色谱图s p l 标准液色谱图进行对照，根据保留时间确定样品中的g - p l 。或在样品 溶液中加入一定量的- p l 标准液，根据对应峰形变化进一步确定。定量：以不同质量 浓度的p l 标准溶液各1 0 m l 分别进样，测定其峰面积，以标准品浓度( x ) 与其相应 峰面积( y ) 做出线性关系图。在标准样与样品进样量相同的情况下，由已知峰面积 大小，根据线性关系图计算出样品中8 p l 的含量。 1 2 1 38 - p l 的结构和性质 ， g - p l 的分子结构图如下所示： h 七n h c h 2 一c h 2 - - c h 2 c h 2 c h c o 击o h i n h ， 赖氨酸含有两个氨基，聚合时有a 位和- 位两个位点的聚合产物，而8 - 位的聚合 物具有较强的抑菌能力，- p l 的聚合度一般为2 5 3 0 ，平均分子量( m n ) 4 0 9 0 ；融点： 第一章前言 1 7 2 8 ：转晶点8 8 。p l 是含有2 5 3 0 个赖氨酸残基的阳离子聚合多肽，当聚合 度低于十肽，会丧失抑菌活性。具有高抑菌活性的g - p l 的分子量在3 6 0 0 4 3 0 0 之间。 研究证明8 p l 比o t p l 有更强的抑菌活性，加之a p l 有一定的毒性，目前在国际 市场上c p l 作为食品防腐剂已经取代了a p l 。8 p l 带正电荷，可以与阴离子结合。 p l 没有固定的熔点，2 5 0 。c 以上开始软化分解。s p l 为淡黄色粉末、吸湿性强，略 有苦味，溶于水，微溶于乙醇，但不溶于乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂：能够承受一 般食品加工过程中的热处理，热稳定性高，1 2 0 0 c 加热l o m i n 仍具有抑菌活性。- p l 可随原料一同进行灭菌处理，防止二次污染，但遇酸性多糖类、盐酸盐类、磷酸盐 类、铜离子等可因结合而使活性降低，与盐酸、柠檬酸、苹果酸、甘氨酸和高级脂 肪甘油酯等合用有增效作用。 s p l 是一种具有抑菌功效的多肽，能在人体内分解为赖氨酸，而赖氨酸是人体 必需的氨基酸之一，也是世界范围内各国允许在食品中强化的一种氨基酸。因此， p l 是一种营养型抑菌剂，安全性高于其他化学抑菌剂，其急性口服毒性为5 9 k g 。 p l 抑菌谱广，在酸性和微酸性环境中对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、 霉菌均有一定的抑菌效果，而且其对耐热性芽抱杆菌和一些病毒也有抑制作用，但 在酸性和碱性条件下抑菌效果不同。 1 2 1 4 p l 的抑菌性能 p l 的抑菌性是8 0 年代由日本科学家首先提出的，它不同于传统的化学抑菌剂， 主要有以下几方面特点： 安全性高。赖氨酸是人体的一种必需氨基酸，也是许多国家允许在食品中强化 的一种氨基酸。因此，- p l 是一种营养型抑茵剂，安全性高于其他化学抑菌剂。 抑菌范围广。8 - p l 具有广谱抑菌性，对于酵母属的尖锐假丝酵母菌、法红酵母 菌、产膜毕氏酵母，和革兰氏阳性菌中的耐热脂肪芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草 芽孢杆菌，以及革兰氏阴性菌中的产气节杆菌、大肠杆菌等引起食物腐败的菌类均 有强烈的抑制作用，其最小抑制浓度小于或等于5 0 9 9 m l 。通过p l 在5 0 l a g m l 的浓 度水平下对大肠杆菌抑制实验，发现其明显影响大肠杆菌的蛋白质合成，并且使大 肠杆菌的细胞壁结构出现异常，从而抑制大肠杆菌的繁殖。此外，8 p l 还具有一定 的抗噬菌体能力。 8 p l 抑菌的最适p h 值范围较宽。p l 抑菌的最适p h 值为5 8 ，也就是说p l 在中 性和微酸性环境中均有较强的抑菌性，但是在酸性和碱性条件下抑菌效果不理想。 可能与p l 在酸性和碱性条件下易分解有关。 p l 在水中的溶解性极强。它的溶解性强于游离赖氨酸，这样更利于在食品中 4 沈阳农业人学博士学位论文 的添加使用。 热稳定性较好。p l 的热稳定性非常好，徐红华等( 1 9 9 9 ) 研究表明，p l 的 水溶液在8 0 处理6 0 分钟、1 0 0 处理3 0 分钟、1 2 0 处理2 0 分钟后对大肠杆菌的最 小抑制浓度不变，即说明其在高温情况下不分解，不失活。- p l 能够承受一般食品 加工过程中的热处理，可以随原料一同进行灭菌处理，防止二次污染。 施庆珊等( 2 0 0 5 ) 研究发现，防腐剂主要是抑制微生物的呼吸作用，引起能量 物质a t p 和还原物质n a d h 亏缺，导致合成代谢受阻，活性的动态膜结构不能维持， 代谢方向趋予水解，最后产生细胞自溶。刘慧等( 2 0 0 0 ) 研究表明，天然防腐剂- p l 对大肠杆菌的呼吸有一定抑制作用，并与典型的呼吸途径抑制剂存在显著区别。同 时p l 还作用于生物膜系统和蛋白合成系统，通过与核糖体结合进而抑制蛋白质的 合成。因为生物膜系统是微生物进行能量转化、物质代谢等生命活动的主要场所， 所以，8 一p l 作用于生物膜后，可直接而迅速地破坏依赖于膜结构完整性的能量代谢 以及细胞、细胞器赖以生存的物质选择性，导致胞内溶酶体膜破裂而诱导微生物产 生自溶作用，最终导致细胞死亡( h o yt e ta l ，2 0 0 0 ) 。 8 p l 与其他防腐剂的协同作用：p l 与酒精、甘氨酸、硫胺烷基硫酸盐等其他 抗菌性物质具有良好的协同效应。例如p l 对于大肠杆菌的最小抑制浓度为5 0 i _ t g m l ， 酒精对于大肠杆菌的最小抑制浓度为5 ，而两者混合使用时，只需要5 l a g m l p l 的0 0 2 5 酒精就对大肠杆菌就有强烈的抑制作用。因此，- p l 作为抑菌剂在食品中 应用时，通常与其它物质配合使用，以达到增效和经济的目的。常用的配合物质可 分为五类：酒精，使用量为3 0 一7 0 ；有机酸，常常使用的有机酸一般有：醋 酸、苹果酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸等，使用量在0 5 5 0 之间；甘油脂，甘 油酯多为低级脂肪酸酯，用量在0 0 1 5 o 之间；甘氨酸，用量为0 0 l l o ； 其它天然抑菌剂，如：鱼精蛋白、茶多酚等。 8 - p l 由于其抗菌性和安全性已广泛应用到食品工业的各个领域，如用于面包点 心、奶制品、肉制品、冷藏食品和袋装食品等。8 - p l 作为一种生物防腐剂，并且是 人体必须氨基酸一赖氨酸的聚合物随着进一步的研究，其应用领域在不断拓展。 1 2 1 sg - p l 的抑菌谱 e - p l 抑菌谱广，在酸性和微酸性环境中对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母 菌、霉菌均有一定的抑菌效果，还对其他天然防腐剂不易抑制的革兰氏阴性的大肠 杆菌、沙门氏菌抑菌效果非常好，而且对耐热性芽孢杆菌和一些病毒也有抑制作用。 单独使用p l 对枯草芽孢杆菌、黑曲霉抑制不明显，采用p l 与醋酸复合作用对枯草芽 孢杆菌等耐热性较强的芽孢菌抑制增强，因此p l 与醋酸双重作用比单独使用时抑菌 s 第一章前言 范围更加广泛。 1 2 2 p l 的应用 1 2 2 1 - p l 在食品中的应用 通过遗传育种的方法可以提高p l 的产率，实现工业化生产。- p l 优良的抑菌 活性，使其在食品防腐领域得到广泛应用。- p l 添加于食品中仅需微量就能奏效， 且不会影响食品味感，可做食品的天然保存剂。它天然安全，符合消费者的健康需 求。在日本，利用p l 作为食品保存剂的生产规模发展迅速，市场规模达数十亿日 元。- p l 应用于糕点、面包食品中，能有效的抑制耐热性芽孢杆菌的增殖，延长保 存期；应用于低糖低热量食品，如乳蛋白冰淇淋，奶油制品等，可改善其保存性： 在低温软罐头食品中加微量p l 可防止杀菌后产生异味；在冷藏食品中添加p l 能 起到保证质量的效果。 徐红华与刘慧( 2 0 0 0 ) 通过饱和试验设计研究了- p l 和甘氨酸对牛奶的保鲜作 用，结果表明单独使用p l 和甘氨酸，其抑菌能力明显低于二者混合使用的效果。 混合使用时其增效随二者用量的增加而增加，但当- p l 用量过高时，这种增效作用 会有所减弱，其中添力h 4 2 0 m g l p l 和2 的甘氨酸抑菌效果最佳。 腾井正弘( 1 9 9 3 ) 在米饭中添加o 4 一o 6 - p l 醋酸制剂，结果表明- p l 的醋 酸制剂有明显的抑菌作用。刘慧等( 2 0 0 0 ) 将鸡肉、肉类浸渍在溶有0 1 2 - p l - 甘 氨酸制剂调味液中，再涂上面粉用油炸。这种炸鸡在3 0 c 放置7 2 h r ，经细菌总数检 测发现：浸渍过炸鸡中细菌总数为1 0 4 个幢，而对照样中为1 0 8 个倌以上。 1 2 2 2 p l 在生物学中的应用 在生物科学研究领域，8 - p l 是电融合技术中的有效促融剂。j u nh i r a k i 等 ( 1 9 9 8 ) 研究发现，细胞膜吸附高分子量p l 会降低其破损临界电压。g r o e b n e r 等的研究也发现，平均分子量为3 9 7 0 - - - 1 3 2 3 0 0 的纳摩尔级浓度的p l 能促进大麦 原生质体的电融率，与葡聚糖相比，是其电融率的2 倍。 1 2 2 38 - p l 在其它领域的应用 - p l 呈高聚合多价阳离子态，可用作基因治疗的非病毒载体、药物缓释的包被 物，以及可生物降解材料等( kdm o d i ，2 0 0 0 ) 。- p l 富含阳离子，与带有阴离子的 物质有强的静电作用力并且对生物膜有良好的穿透力，基于这一特性，p l 可用与某 些药物的载体，因此在医疗和制药方面得到广泛应用。将8 p l 与海藻酸盐复合体做 成缓释胶囊的包被膜，通过p l 改变海藻酸盐膜的通透性，从而实现逐步释放内容物 的目的。 6 沈阳农业大学博十学位论文