（药理学专业论文）egcg对appps1转基因鼠保护作用及可能机制.pdf

中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名： 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 论文作者签名 指导教师签名 日 目录 、摘要 中文论著摘要l 英文论著摘要6 二、英文缩略语1 2 三、论文 前言1 3刖舌1 3 材料与方法1 9 实验结果2 5 讨论4 7 结 仑5 5 四、本研究创新性的自我评价5 6 五、参考文献5 7 六、附录 综述6 3 在学期间科研成绩7 2 致谢7 3 个人简介7 4 中文论著摘要 绿茶提取物e g c g 对a p p p s l 转基因鼠保护作用及 可能机制 目的 阿尔茨海默病( a l z h e i r n e r sd i s e a s e , a d ) 亦称老年性痴呆( s e n i l ed e m e n t i a ) ，是 一种发生于中老年的以进行性认知障碍和记忆能力下降为主的退行性神经病变。 该病起病隐袭，病程呈进行性进展，以渐进性学习记忆、认知功能减退、行为异 常、日常生活能力下降及情感、思维障碍等为主要临床表现。其典型的病理改变 是神经细胞间出现大量以p - 淀粉样肽( p a m y l o i d ，a p ) 为核心的老年斑( s e n i l e p l a q u e s ，s p ) 、神经元的胞体中出现神经原纤维缠结( n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s ，n f d 及 神经元的丢失等。a d 的发病机制目前尚未完全阐明，但自由基损伤学说和细胞凋 亡学说备受人们的关注。自由基形成和氧化应激增强，进一步引起神经细胞凋亡， 是导致a d 的功能退化和神经变性的基础。p 7 5 神经营养因子受体( p 7 5n e u r o t r o p h i n r e c e p t o r , p 7 5 n t r ) 是神经营养素的低亲和力受体，与a d 神经元细胞凋亡有关。 t r k a 即酪氨酸激酶a ( t y r o s i n el ( i n a s e a ) 是神经营养素的特异性受体，与神经元 细胞分化、生长、修复、存活密切有关。p 7 5 n t r 诱导凋亡的信号通路目前仍不 十分清楚，但已广泛公认的是其对c - j u n 氨基末端激酶( c - j u nn - t e r m i n a lk i n a s e ，y n k ) 的激活是介导神经元细胞凋亡的关键步骤，并进一步通过激活促凋亡蛋白p 5 3 、 b a d 等的表达，促进或引起细胞凋亡。此外，j n k 还能通过诱导细胞色素c 的释 放进一步活化c a s p a s e - 3 而导致细胞凋亡。t r k a 对神经元发挥促进其分化、生长、 存活功能的机制研究的相对比较透彻，其主要通过激活r a s m a p k e r k 信号转导 通路，特别是通过活化的e r k l 2 信号转导通路来实现。 研究并建立可靠的a d 动物模型对于探明a d 的病因、发病机制及防治药物 的研发均有重要的意义。到目前为止用于a d 研究的动物模型很多，其中转基因 模型是一种病因模型，过量表达人源性突变a d 相关基因的转基因鼠，因其具有 明确的病因，并能反映a d 的部分病理与功能变化，有助于我们了解a d 的发病 机制，也逐渐成为研究a d 的最为理想的整体模型。 防治a d 的抗氧化剂及抗凋亡药物的研究与开发成为当今药理学研究领域的 重要课题之一。( 一) 表没食子儿茶素没食子酸酯( e p i g a l l o c a t e c h i n - 3 g a l l a t e ，e g c g ) 是 绿茶的一种主要多酚成分，研究证实绿茶有效的铁螯和、抗氧化、抗炎、抗癌及 神经保护等作用的发挥主要依赖于e g c g 。l e v i t e s 等人通过研究人类成神经细胞 瘤s h s y 5 y 细胞和大鼠成纤维细胞瘤p c i 2 细胞，发现e g c g 能够减少具有神经 毒性作用的a 1 3 的产生。因此，本研究拟通过遗传性的4 尸：形盼，转基因小鼠，采 用n i s s l 、t u n e l 染色、免疫组化、w e s t e r nb l o t 等方法研究a p p p s l 转基因小鼠 认知行为、病理改变、抗氧化能力、细胞凋亡、a 1 3 ( 1 4 0 ) 、淀粉样前体蛋i 兰! ( a m y l o i d p r e c u r s o rp r o t e i n ，a p p ) 、促凋亡蛋白c a s p a s e 一3 及p 7 5 j n k - p 5 3 凋亡相关通路及抗 凋亡蛋白p h o s p h o c r a f , p h o s p h o - m e k l 2 、p h o s p h o e r k l 2 、p h o s p h o - p 9 0 r s k 、 p h o s p h o m s k l 相关通路的影响，即9 月龄的么纠煳转基因小鼠上述指标的改 变，同时进一步探讨e g c g 对a p p p s l 转基因小鼠模型的神经保护作用及其作用 机制。 材料与方法 a p p p s l 转基因小鼠实验取c 5 7 小鼠1 0 只及a p p p s i 小鼠2 2 只，c 5 7 小 鼠为对照组( c o n t r 0 1 ) 、刎惝j 小鼠2 2 只随机分为模型组( a p p p s l ) 和实验组 ( a p p p s i + 2m g k ge g c g ) 。实验组4 p p p ，7 转基因小鼠按2m 班g 的剂量灌胃 o 0 4 的e g c g ，每日一次，连续灌胃4 周；对照组及模型组小鼠灌胃等量的双蒸 水，每日一次，连续灌胃4 周。最后一周对小鼠进行水迷宫、避暗及自主活动等 行为学检测，其间继续给药。行为学结束后，快速取一部分小鼠脑组织入8 0 低 温冰箱中冻存，分别进行s o d 、g s h p x 、a c h e 酶活性、m d a 含量的测定及w e s t e r n b l o t 印迹分析a p p 、c a s p a s e 3 、n g f 、p 7 5 、j n k 2 、p 5 3 、p h o s p h o - t r k a 、p h o s p h o c - m f , p h o s p h o m e k l 2 ，p h o s p h o e r k l 2 ，p h o s p h o p 9 0 r s k ，p h o s p h o m s k l ，c r e b 等蛋白表达水平的实验。另一部分小鼠进行灌流固定，取脑后分别进行h e 染色、 n i s s l 染色、t u n e l 染色及a 1 3 ( 1 - 4 0 ) 、c 弱p 嬲e - 3 、a p p 、c r e b 、t r k a 等免疫组 化的检测分析。 2 实验结果 1 、e g c g 对4 p p 尸s ，转基因小鼠记忆及判断能力的影响 水迷宫、避暗、自主活动等行为学结果显示a p p p s l 转基因小鼠出现明显的 学习记忆及判断能力的下降，但活动能力未受影响。e g c g 明显的改善了a p p p s l 转基因小鼠的学习记忆障碍，提高了小鼠的记忆与判断能力。 2 、e g c g 对4 p 尸：尸s ，转基因小鼠脑组织病理改变的影响 h e 染色及n i s s l 染色结果显示，a p p p s l 转基因小鼠大脑皮层及海马区神经 元数量明显减少，细胞排列松散，细胞核固缩、染色质边集和核碎裂，尼氏体分 界不清，排列紊乱、松散，细胞周围出现间隙，其中许多细胞胞体缩小、胞浆呈 淡红色、胞核固缩，可见坏死的神经元；e g c g 明显的减轻了a p p p s l 转基因小 鼠脑内神经元损伤程度，细胞排列相对整齐，细胞形态规则，层次丰富，核仁清 晰。 3 、e g c g 对彳p 尸：尸j s ，转基因小鼠脑内a p ( 1 4 0 ) 蛋白表达的影响 a p ( 1 4 0 ) 蛋白免疫组化染色结果显示：么纠例转基因小鼠大脑皮层及海马 区的a f t ( 1 4 0 ) 蛋白表达水平显著增高；e g c g 能明显抑n d , 鼠大脑皮层及海马区 的a p ( 1 4 0 ) 蛋白表达水平。 4 、e g c g 对彳p p 僻s j 转基因小鼠海马区s o d 、g s h p x 及a c h e 酶活性及m d a 含量的影响 酶学结果显示a p p p s l 转基因小鼠海马内s o d 、g s h p x 活性明显降低， a c h e 酶活性及m d a 含量明显升高；e g c g 能明显的提高小鼠海马内s o d 、 g s h p x 酶活性，并明显的降低m d a 含量和a d 也酶的活性。 5 、e g c g 对彳p 尸：尸j s j 转基因小鼠脑区神经元细胞凋亡的影响 t u n e l 法染色结果显示a p p p s l 转基因小鼠大脑皮层及海马区可见有较多 的凋亡细胞，且细胞凋亡指数与空白对照组比明显增多；e g c g 能明显的减少 a p p p s i 转基因小鼠大脑内神经元细胞的凋亡。 6 、e g c g 对彳p p 尸j 9 ，转基因小鼠脑内c r e b 蛋白表达的影响 3 c r e b 免疫组化染色及w e s t e r nb l o t 印迹分析结果显示a p p p s l 转基因小鼠大 脑皮层及海马区的c r e b 蛋白表达水平明显降低；e g c g 明显的提高了a p p p s l 转基因小鼠大脑皮层及海马区的c r e b 蛋白表达水平。 7 、e g c g 对彳p 尸：僻s ，转基因小鼠脑内a p p 蛋白表达的影响 a p p 免疫组化染色及w e s t e r nb l o t 印迹分析结果显示a p p p s l 转基因小鼠大 脑皮层及海马区的a p p 蛋白表达水平明显增高；e g c g 明显的抑制了a p p p s l 转 基因小鼠大脑皮层及海马区的a p p 蛋白表达水平的增高。 8 、e g c g 对彳嬲，转基因小鼠脑内内p 7 5 n t r 、j n k 2 及p 5 3 蛋白表达的影响 w e s t e r n b l o t 印迹分析结果显示a p p p s l 转基因脑内海马内p 7 5 蛋白的表达水 平增高，同时海马区j n k 2 及p 5 3 蛋白表达水平增加；e g c g 可明显的抑$ 1 j p 7 5 i c d 、 j n k 2 及p 5 3 蛋白表达水平。 9 、e g c g 对彳p p 尸j ，l r 转基因小鼠脑内内p h o s p h o c r a f 、 p h o s p h o m e k l 2 、p h o s p h o e r k l 2 、p h o s p h o p 9 0 r s k 、p h o s p h o - m s k l 蛋白表达的影响 w e s t e r nb l o t 印迹分析结果显示彳纠叨铆转基因小鼠脑内p h o s p h o - e - r a f p h o s p h o - m e k l 2 、p h o s p h o - e r k l 2 、p h o s p h o - p 9 0 r s k 、p h o s p h o - m s k l 蛋白的表 达水平降低；e g c g 可明显的提高4 p 以陋，转基因小鼠脑内p h o s p h o - c r a t p h o s p h o m e k l 2 、p h o s p h o - e r k i 2 、p h o s p h o - p 9 0 r s k 、p h o s p h o m s k l 等蛋白表 达水平。 结论 l 、e g c g 能够改善a p p p s l 转基因小鼠的学习记忆障碍。 2 、e g c g 能够提高a p p p s l 转基因小鼠脑内内的抗氧化酶活性，及降低a c h e 酶的活性，发挥有效的抗氧化作用及增强记忆能力的作用。 3 、e g c g 通过抑制d p p p j s ，转基因小鼠大脑皮层及海马内的a p p 及a i b ( 1 - 4 0 ) 蛋白水平，对神经细胞发挥一定的保护作用。 4 5 m e m o r yl o s s ，c o g n i t i v ed e t e r i o r a t i o n , b e h a v i o r a ld i s o r d e r s a n da tl a s td e c r e a s e d a b i l i t yo fl i f ea di sp a t h o l o g i c a l l yc h a r a c t e r i z e db yd e p o s i t i o no fi l a m y l o i d ( a 1 3 ) p e p t i d e s a ss e n i l ep l a q u e sa n dn e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e si n t h eb r a i n t h ep r e c i s e m e c h a n i s m so fa da len o ty e tc l e a r l yu n d e r s t o o d ，b u tf r e er a d i c a ls t r e s st h e o r ya n d c e l la p o p t o s i st h e o r ya r ep a i dc l o s ea t t e n t i o nt o o x i d a t i v es t r e s sa n dr e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s ( r o s ) h a v eb e e np r o p o s e dt ob em a j o rc a u s eo ff u n c t i o n a ld i s o r d e ra n d n e u r o d e g e n e r a t i o ni na d p 7 5n e u r o t r o p h i nr e c e p t o ri st h el o wa f f i n i t yr e c e p t o ro f n e u r o t r o p h i n sa n di t i sc l o s e l yr e l a t i v et on e u r o n a la p o p t o s i si na d t h ea p o p t o s i s s i g n a l i n gp a t h w a yp 7 5 n t ri n v o l v e di ni sn o ty e tc l e a r l yu n d e r s t o o d ，b u ti ti sw e l l k n o w nt h a tp 7 5 n t rc a l la c t i v a t ec - j u nn - t e r m i n a lk i n a s e ( y n k ) a n dp r o a p o p t o t i c p r o t e i np 5 3a n db a d ，a n di n d u c ec e l la p o p t o s i s i na d d i t i o n , j n kc a l la l s op r o m o t e c y t o c h r o m ecr e l e a s ea n da c t i v a t i o no fc a s p a s e - 3 t r k a ( t y r o s i n ek i n a s ea ) i st h eh i g l l a f f i n i t yr e c e p t o ro fne u _ r o t r o p h i n sa n di ti sc l o s e l yr e l a t i v et on e u r o n a la n t i - a p o p t o s i si n a d w h e nn g f a n dt r k aa r eb i n d e dt o g e t h e r , t h o u g hm a p k - e r k p a t h w a yt r k a p e r f o r m si t se f f e c t s i ti sv e r yi m p o r t a n tt os t u d ya n dm a k es u i t a b l ea n i m a lm o d e l sf o re v a l u a t i n gt h e c a u s e ，p a t h o g e n e s yo fa da n dd e v e l o p i n gd r u g st oc u r ea d s of a rd i f f e r e n ta n i m a l m o d e l sh a v eb e e nd e v e l o p e dt os t u d yt h ee t i o l o g y , e v o l u t i o na n dn e wt h e r a p e u t i c a l t e r n a t i v e sf o rt h ei l l n e s s e s ，a m o n gw h i c ht h em i c et r a n s g e n i cm o u s em o d e l sh a v e b e e nc r e a t e dw i t hm u t a t i o n si ng e n e sr e l a t e dt oa d m o r e o v e r , d o u b l et r a n s g e n i c s ，s u c h 6 a sa p p f p slt r a n s g e n i cm i c e , p r o v i d eav a l u a b l em o d e lf o re v a l u a t i n gt h ep a t h o g e n e s y o f a d o - e p i g a l l o c a t e c h i n - 3 - g a l l a t e ( e g c g ) ，w h i c hi sc l a s s i f i e dt h ec a t e c h i nf a m i l ya n d i so n eo ft h em a j o rp o l y p h c n o lc o n s t i t u e n t so fg r e e nt e a i th a sb e e nr e p o r t e dt h a t e g c gp o s s e s sp o t e n ti r o n - c h e l a t i n g , a n t i o x i d a n t ，a n t i - i n f l a m m a t o r y , a n t i c a n c e ra n d n e u r o p r o t e c t i v ea c t i v i t i e s e g c gh a sb e e ns h o w nt oh a v en e u r o p r o t e c t i v ee f f e c t sb y e l e v a t i n ga - s e c r e t a s ea c t i v i t yo fa m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n ( a p p ) t os o l u b l ea p p a l p h a ( s a p p - n ) a n dr e d u c i n ga m y l o i db e t a ( a 1 3 ) 一i n d u c e dn c u r o t o x i c i t yi nh u m a ns h s y 5 y n e u r o b l a s t o m aa n dr a tp h c o c h r o m o c y t o m ap c12c e l l s i nt h ep r e s e n ts t u d y , w eu s e d a p p p slt r a n s g e n i cm i c e ，a n do b s e r v e dw h e t h e re g c gq m g k g 氐4w e e k s ，i g ) h a d t h ep o t e n ta n t i o x i d a n ta n da n t i a p o p t o t i cn e u r o p r o t e c t i v ee f f e c t so nt h ea dm i c ea n d 彳嬲jt r a n s g e n i cb yb e h a v i o r a la n dp a d l o l o 西c a lt e s t i n g ,m e 觞u r e m e n t so ft h e a c t i v i t i e so ft o t a ls u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( t - s o d ) a n dg l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ( g s h p x ) ， c o n t e n t so fm a l o n d i a l d e h y d e ( m d a ) a n da c t i v a t i o na n de x p r e s s i o no fp r o - a p o p t o t i c p r o t e i nc a s p a s e 一3 ，p 7 5 ，kp 5 3 a n da n t i a p o p t o t i cp r o t e i np h o s p h o c - r a f 、 p h o s p h o - m e k i 2 ，p h o s p h o - e r k l 2 ，p h o s p h o - p 9 0 r s k , p h o s p h o - m s k l i nt h e h i p p o c a m p u so f m i c eb yi m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n ga n dw e s t e r nb l o ta n a l y s i s m a t e r i a l sa n dm e t h o d s t e nc 5 7m i c ea n dt w e n t yt w oa p p p s lm i c ew e r er a n d o m l yd i v i d e di n t ot h r e e g r o u p s 萨1 0e a c hg r o u p ) ：c o n t r o lg r o u p 。a p p p s lg r o u pa n da p p 浔s l 娩m g k g e g c gg r o u p t h em i c eo fa p p i p s l 七e g c gq m g k g ) g r o u pw e r ei n t r a g a s t r i c l y g i v e nw i t he g c ga tt h ed o s eo f2m g k g df o r4w e e k s t h em i c eo fc o n t r o lg r o u pa n d a p p p s lg r o u pw e r ea d m i n i s t e r e dw i t hs a m ev o l u m ev e h i c l ed i s t i l l e dw a t e r a f t e r f i n i s h i n ga l lt r e a t m e n t s ，a n i m a l s w e r ee v a l u a t e db yb e h a v i o r a l t e s t i n g , a n dt h e n i m m e x i i a t d y s a c r i f i c e dt od i s s e c t h i p p o c a m p u s a n ds t o r e da t - 8 0o cf o rt h e e x a m i n a t i o n so fe x p r e s s i o no fp r o a p o p t o t i cp r o t e i np 7 5 ，j n k ，p 5 3a n da n t i a p o p t o t i c e h o s p h o c - r a f , p h o s p h o - m e k l 2 ，p h o s p h o - e r k l 2 ，p h o s p h o p 9 0 r s k , p h o s p h o m s k li nt h eh i p p o c a m p u so fm i c eb yw e s t e r nb l o ta n a l y s i s o t h e rm i c e ( i 一) w e r e 7 t r a n s e a r d i a l l yp e r f u s e dw i t hn o r m a ls a l i n ef o l l o w e db y4 p a r a f o r m a l d e h y d es o l u t i o n t h eh i p p o e a m p u sw e r er e m o v e d , p o s t - f i x e di n4 p a r a f o r m a l d e h y d ea n du s e df o rh e a n dt u n e la n di m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n go f a l b ( 1 - 4 0 ) a n dc r e b r e s u l t s 1 t h ee f f e c t so fe g c go nl e a r n i n ga n dm e m o r yi m p a i r m e n ti n a p p p slt r a n s g e n i cm o u s e t h er e s u l t sb yw a t e rm a z e , s t e p - t h r o u g ha n ds p o n t a n e o u sa c t i v i t yt e s ts h o w e d a p p f p s lt r a n s g e n i cm o u s ec o u l ds i g n i f i c a n t l yi m p a i rl e a r n i n ga n dm e m o r yo fm i c e , b u tc o u l dn o ta f f e c tt h e i rl o c o m o t o ra c t i v i t y a n de g c g ( 2m e g k g d ，4w e e k s ，i s ) c o u l de v i d e n t l yi m p r o v et h el e a r n i n ga n dm e m o r yi m p a i r m e n ti nt h i sa p p p s l t r a n s g e n i cm o u s e 2 t h eh i s t o p a t h o l o g i c a le f f e c t so fe g c go nt h eb r a i n so fa p p p s l t r a n s g e n i cm o u s e t h er e s u l t sb yh ea n dn i s s ls t a i n i n gs h o w e dt h en u m b e ro fn e u r o nw a s s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d ，t h ea r r a n g e m e n to fn e u r o n si nc o r t e xa n dh i p p o c a m p u so f a p p p s lt r a n s g e n i cm o u s ew a ss p a r s ea n dn i s s lb o d yw a sd e c r e a s e da n dd i s s o l v e d e g c gq m g k g ，4 w e e k s ，i s ) a n dc o u l de v i d e n t l yr e l e a s en e u r o n a li n j u r yi na p p 7 p s i t r a n s g e n i cm o u s e 3 t h ee f f e c t so fe g c go ne x p r e s s t i o no fa p ( 1 - 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