（草业科学专业论文）编码白颖苔草热激转录因子基因的克隆及其序列分析.pdf

中国农业大学硕t 学位论文摘要 摘要 高温及其他一些化学和生理胁迫能诱导机体产生热激蛋白。真核生物中热激因子调节热激 基因的表达植物热激转录因子可分为三类：h s f a 、h s f b 、h s f c 。在非生物逆境。尤其是热逆境 下， 类热激转录因子在调节热激蛋白的表达方面起着藿要作用。在正常生长条件下，热激因子 处于钝化的单体状态，热激时，热激因子形成三聚体并与热激原件( h s e ) 结合，从而激活热激蛋 白基因的表达。此外。热激蛋白也对热激转录因子起负反馈调节作用。 本文比较了g e n b a n k 中已登录的多种植物热激转录因子的氨基酸序列和核苷酸序列，根据保 守序列设计一对简并引物，通过r t - p c r 从白颖苔草( c a r e xr i g e s c e n s ) 中扩增出1 8 9 b pc d n a 片段，根据此片段序列设计3 端特异引物。利用3 r a c e 得到9 0 2 b p 的3 端c d n a 片段。根据 3 端片段序列设计5 端特异引物，利用5 p a c e 得到3 2 3 b p 的5 端c d n a 片段。通过序列拼 接获得该基因的全长c d n a ，序列分析其含有一个完整的开放阅读框( 1 0 3 b p - 1 0 2 3 b p ) ，编码的蛋 白质含有3 0 6 个氨基酸，分子量为3 8 7 5 k d a ，等电点为5 8 5 。c r h s f 的氨基酸序列与o s h s f 的同 源性为5 9 ，与已知的其他热激转录因子也具有较高的同源性。在c r h s f 的氨基酸序列中没有预 测的信号肽以及跨膜区域，但是具有多种翻译后修饰的加工位点：1 个酪蛋白激酶h 磷酸化位点、 3 个n 端酰基化位点、2 个n 端糖基化位点、3 个蛋白激酶c 磷酸化位点和1 个c a m p 和c g m p 依 赖的蛋白激酶磷酸化位点 关键词：白颖苔草，热激转录因子，r t - p c r ，r a c e ，基因克隆，序列分析 中国农业大学硕 学位论文摘要 i a b s t r a c t o r g a n i s m sr e s p o n dt oe l e v a t e dt e m p e r a t u r e sa n dt oc h e m i c a la n dp h y s i o l o g i c a ls t r e s s e sb y i n c r e a s i n gt h es y n t h e s i so f h e a ts h o c kp r o t e i n s ( h s p s ) t h ee x p r e s s i o no f h e a ts h o c kg e n ei ne u k a r y o t e s i sr e g u l a t e db yc o n s e r v e dh e a ts h o c kw a m c r i p t i o nf a c t o r ( i - i s v 0 h s fc a l lb ed i v i d e di n t ot h r e ec l a s s e s ， h s fa h s fba n dh s fc c l a 站ah s fp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nr e g u l a 咖gt h eh s p sg e n e si na b i o t i c s 仃。c s p o c i a l l yi nh e a ts h 嘲h s fi sp r e s e n ti nal a t e n ts t a t eu n d e rn o r m a lc o n d i t i o n s i ti sa c t i v a t e d u p o nh e a ts t r e s sb yi n d u c t i o no ft f i m e r i z a t i o n ，h i g h - a f f i n i t yb i n d i n gt oh e a ts h o c ke l e m e n t ( h s e ) a n dt r a n s c r i p f i o n a la c t i v i t y i na d d i t i o n , h s p sa l s oa c ta sn e g a t i v ef e e d b a c kr e g u l a t i o no f h s f b yt h em u l t i p l ya l i g n m e n to fa m i n oa c i ds e q u e n c e sa n dn u c l e n f i d ea c i ds e q u e n c e so fs e v e r a l p l a n t sh e a ts h o c kt r a n s c r i p t i o nf a c t o ri ng e n b a n k , ap a i ro f d e g e n e r a t ep r i m e r sw a sd e s i g n e da g a i n s tt h e c o n s e r v e dr e g i o n st h a tw a su s e df o rr t - p c rt oa m p l i f ya1 8 9 b pe d n as e g m e n tf r o mt h e r i g e s e e n t s e d g e b a s e do nt h e q u o n c eo ft h ee d n as e g m e n t , p r i m e rw a sd e s i g n e df o r3 r a c ea n da9 0 2 b p c d n as e g m e n tw a sa c q u i r e d ；f r o mt h es e q u e n c eo f3 e n do ft h eg e u e , p r i m e rw a sd e s i g n e df o r 5 r a c ee n da3 2 3 b pc d n as e g m e n tw a sa c q u i r e d t h ef u l l l e n g t he d n aw a sg a i n e db yo v e r l a p p i n g s e q u e n c e s ，a n dt h ea n a l y s i so ft h es e q u e n c ei n d i c a t e st h a ti tc o n t a i n e sa l lo p e n - r e a d i n gf l a m ef r o m 1 0 3 b pt o1 0 2 3 b p ，c o m p r i s i n g3 0 6a m i n oa c i dr e s i d u e s , w i t hp r e d i c t e dm o l e c u l a rm a s so f3 4 9 3 k d aa n d i s o e l e c t r i cp o i n t5 7 7w a so b t a i n e d t h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c es h o w e d5 9 s i m i l a r i t yt oo s h s f a n di ta l s os h a r e ds i g n i f i c a n ts i m i l a r i t i e sw i t ho t h e rc h a r a c t e r i z e dh e a ts h o c kt r a n s c r i p t i o nf a c t o r i n a d d i t i o n , t h ec r h s fc o n t a i n e dn op r e d i c t e ds i g n a lp e p t i d ea n dn op r e d i c t i o n , b u ti tc o n t a i n e ds e v e r a l p o s t - t r a n s l a t i o nm o d i f i c a t i o na n dp r o c e s s i n gs i t e s ：1c a s e i nk i n a s e p h o s p h o r y l a t i o ns i t e , 3 n - m y r i s t o y l a t i o ns i t e ，3n - g l y c o s y l a t i o ns i t e 。3p r o t e i nk i n a s ecp h o s p h o r y l a t i o ns i t e , 1c a m p a n d c g m p d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s 。p h o s p h o r y l a t i o ns i t e k y e w o r d s ：c a m sr i g e a c e n $ ，h e a ts h o c kt r a n s c r i p t i o nf a c t o r , r t - p c r , r a c e ，m o l e c u l a rc l o n i n g ， s e q u e n c ea n a l y s i s 英文缩写 a 皿p b i s b s c a m c 删p c d n a d b d d d h z o d e p c d n a d n 限 肼广r e c o l i 叭 b g t a g u s h s e i i s f i p 3 i p l 咐 k d l b m l n 缩略词 英文名称 a m p i c i u i n n n - m e t h y l e n eb i sa c r y l a m i d e b o v i ns ma l b u m i n c a l m o d u l i n c y c l i ca d e n o s i n em o n o p h o s p h a t e c o m p l e m e n t a r yd n a d n a - b i n d i n gd o m a i n d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e s ( u s u a l l ya m i xo f d a t p d t t p d c t p d g t p l d i t h i o t h r c i t o l e s c h e r i c h i ac o l i e t h y l e n e d i a m i n et e t r a c e t i ca c i d e t h y l e n eg l y c o l - h i s ( 2 - a m i n o e t h y l e t h e r ) - n , n n 薄- t e m m , 硪i ca c i d 1 3 - g l u c y a i d a s e h e a ts h o c ke l e m e n t h e a ts h o c kt r a n s c r i p t i o nf a c t o r 1 , 4 ，5 - t r i p h o s - p h a t ei n o s i t o l i s o p r o p y l t h i o - b d g a l a c t o p y r a n o s i d e k i l o d a l t o n l u r i a - b e r t a n im e d i a m i n u t c 1 1 i 中文名称 氨苄青霉素 亚甲基双丙烯酰胺 牛血清白蛋白 钙调素 环腺苷酸 互补d n a d n 结合域 双蒸水 焦碳酸二乙脂 脱氧核糖核酸 脱氧腺苷三磷酸 0 曲：跨f 西强| d c t p d g 瓣 的混合物) 二硫苏糖醇 火肠杆菌 乙二胺四乙酸 乙二醇一双一( 2 一氨基乙基) 四乙酸 b 一葡萄糖苷酸酶 热激元件 热激转录因子 1 ，4 ，5 一三磷酸肌醇 异丙基一b d - 硫代半乳糖苷 千道尔顿 l b 培养基 分钟 中国农业大学硕卜学位论文缩略词 s e c o n d o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i rr e a c t i o n p l a s m am e m b r a n e 秒 光密度 聚合酶链式反应 质膜 c d n a r a p i da m p l i f i c a t i o no f c d n a e n d s 末端快速扩增技术 r i b o n u i c i ca c i d r o u n d sp e rm i n u t e 核糖核酸 每分钟转速 反转录p c r t r i s t r i h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 i v 喜 嗽 附 眦 眦 呻 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：夕琵彳z 吒_ 时间： p 7 年，臼m - - n 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：夕勿孕t 午 导师签名： 时间：z ，7 年白，l 日 时间： 问年月月 中国农业大学硕十学位论文第一章论文综述 第一章论文综述 生物体在胁迫环境中面牦高温等危害时，体内自身的免疫系统会及时作出应急反应，诱导或 增进某些热激蛋白基因的表达最终分子伴侣快速生成，避免蛋白的错误折叠，同时重新折叠形 成天然状态的蛋白质。热激基因的表达受一类转录因子的调控，这类转录因子称为热激因子( h e a t s h o c kt r a n s c r i p t i o nf a c t o r ) ，简称h s f 。1 9 8 4 年w uc ”首次利用足迹法( f o o t p r i n t i n ga s s a y ) 和亲和层析法( a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y ) 找到并纯化了热激转录因子。自此掀开了热激转录因子研 究的序幕。迄今为止在植物中已克隆出数百种转录因子基因：果蝇、酵母、拟南芥、烟草，人、 大豆、番茄、玉米、水稻、紫花苜蓿等。 1 植物热激转录因子研究进展 1 1 热激转录因子的类型 h s f 本质上是一种蛋白质。植物h s f 的分子量为3 1 2 至5 7 5 k d 。其结构和功能在进化中较少 变异。因此具有广泛的同源性。热激转录因子依据氨基酸序列将它们划分成三类：即h s f a 、h s f b 、 h s f c a 类h s f 是胁迫诱导的热激基因转录的中介子，是广大研究者研究热胁迫反应得对象已有大 量深入的研究和报道h s f a 是组成型表达的，热胁迫条件下会在植物体内迅速积累，是一个对热 激反应的起主要作用的正向调控因子但在拟南芥中它的调控作用却有所不同，拟南芥a t h s f a l a 的t - d n a 突变体并不影响植株的热激反应，这说明还存在与a t h s f a l a 协同作用的调节因子h s f a 2 在通常条件下是不表达的，当受到热胁迫时h s f 9 2 基因迅速表达，并且大量积累1 2 j 。h s f a 2 的c 端有一 个非常强的核输出信号，它通常定位于细胞质，当生物体受到胁迫后过量表达的h s f a l 与h s f a 2 形 成异源寡聚体进入并滞留于细胞核，这样可以增加了h s f a 2 的转录活性。 在正常或热胁迫条件下，b 类h s f s 没有激活功能。b 类h s f s 可充当热激反应的阻抑蛋白或 负调节物。经体外实验表明，h s f b 特定地与基本转录因子t b p 和t f i i b 结合形成非功能性转录复 合体以抑制热激蛋白的表达”1 该数据表明，植物一些惰性的b 类h s f s 可在热激反应中起抑制 作用。h s f b 由于缺乏a i i a 基序而不能与一些基本的转录元件结合，可作为辅转录激活因子，保持 或快速恢复一些特定持家基因的表达“1 在某个特定的发育阶段。它结合d n a 的能力能够专一地被 激活，表明h s f b 可能在热激反应的发育调节中起作用。 c 类h s f 在植物中发现较少，只有在鸟类中有所报道。c 类的h s f s 缺少a h a 基元而不具备激活功 能。作用机制尚不清楚。 在所有已研究的植物中，都存在i l s f ，不同种类h s f 可能在细胞不同部位、不同发育阶段行使 不同的功能，但是在大多数情况下不同类型的h s f s 针对逆境是协同作用的，共同调节下游基因的 表达。具体的机理有待进一步研究。 中同农业大学硕卜学位论文第一章论文综述 1 2 热激因子的结构 所有已研究的h s f 都包含以下几个重要的结构域：d n a 结合域、寡聚域、核定位信号、c 端的7 元重复域及激活域。其中d n a 结台域和寡聚域的主要结构是保守的，其它区域只是在相邻近的h s f 中才表现出同源性 曩射哪譬h r lh i i - o 慵1 辨1 l ：t l 摊，辅村5 娶仁罩卜热芦皿 轴翻睁期掰 、 潞 & 妇c t b 嘲, a e e l 1 氍o n h a u 嘲龇一一 l c o n 喇h m 朔 煳秘碡憎憎蟑艄 圈lh s f 结梅豳( m o r i - o t o 瓤1 啦7 ) f i e1s t r u c t u r ef o fe s f 1 2 1d n a 结合域( d n a - b i n d i n gd o m a i n ，简称明d ) d n a 结合域是h s f 分子中最保守的一个区域，由大约9 5 个氨基酸组成，位于h s f 的n 端。d n a 结 合域具有d n a 结合蛋白特征性的螺旋一转角一螺旋结构基元( h e l i x - - t u r n - - h e l i x m o t i f ) ：3 个螺 旋( h i 、h 2 和h 3 ) 和4 个反向平行的p 一片层( b l 、b 2 、p 3 和阱) 。d n a 结合区域通过螺旋一转角一 螺旋结构形成了一个紧密的球形结构但与其它d n a 结合蛋白( 如c a p ) 的d n a 结合区域不同的 是：h s f 的d n a 结合区域有一个n 一螺旋凸起( a h e l i c a lb u l g e ) ；一个由脯氨酸诱导的扭结 ( p r o l i n e i n d u c e dk i n k ) ，该扭结使1 1 2 发生明显扭曲；在1 1 2 和h 3 之间有一段5 7 个氨基酸的 间隔。 h s f 的d n a 结合区域与热激元件( h s e ) 的d n a 结合的部位起始于h 1 的n 端后数个氨基酸处。终 止位置因不同种类的h s f 而异，多数情况下认为终止位置位于b4 末端之后的1 6 个氨基酸处这 1 6 个氨基酸由一些非常保守的氨基酸残基组成，它们的功能包括两个方面：一方面通过与疏水 核心的相互作用在空间结构上封闭d n a 结构区域的一个侧面；另一方面使h s f 三聚体中各h s f 单 体的d n a 结合区域相互协调，以获得对h s e 的高亲和力。h s f 能识j ；i j h s e 上特异性的“一n g a a n 一” 结构，h s f 单体与“一n g a a n 一”结构以1 ：1 的比例结合h s e 上“一n g a a n 一”结构的数目 对h s f 与h s e 亲和性有很大的影响。一个完整的h s e 结构上通常有3 个“一n g a a n 一”结构，而 完整的h s f 也是以三聚体的形式与h s e 结合，这样的结合具有最大的亲和力。若h s e 上只有2 个 “一n g a a n 一”结构，两者的亲和力只能达到中等水平。许多物理学与遗传学证据都表明，d n a 2 中国农业大学硕 学位论文第一章论文综述 结合区域螺旋一转角一螺旋结构上的第3 个螺旋( h 3 ) 起识别h s e 上“- n g a a n 一”结构的作用。 h 3 通过其极性及阳性氨基酸残基在溶液中形成一个典型的双岐性螺旋( a m p h i p a t h i ch e l i x ) ，与 d n a 通过离子键相互作用，但具体的机制尚不清楚。 h s f l 的d n a 结合结构域内的环状结构决定了其d n a 结合特异性和对靶基因的倾向性将该环状 结构转移至i l s f 2 ，可改变i i s f 2 的d n a 结合特异性，并使h s f 2 在热应激时诱导基因的表达和保护热 诱导的细胞凋亡。另外，环状结构在正常情况下可抑制h s f i - _ 三聚体的形成，而在热应激时又可以 促进 i s f l 三聚体的形成，提示其对应激时1 1 s f l 的活化起着重要作用”1 。 1 2 2 寡聚域( o l i g o m e r i z a t i o nd o m a i n ，简称o d ) 寡聚域是由2 个疏水7 肽重复区域a 和b ( 职一a b ) 组成。位于h s f 的n 端，它的功能是允许h s f 形成 同源三聚体构型，是使h s f 高效结合于h s f 的d n a 和促成h s p s 基因转录的前提”1 。h r a b 结构域 的缺失对生物体生存于高温下没有影响，但却显著地影响h s f s 的聚合化作用。s c h a r f 等( 1 9 9 8 ) o j 用免疫共沉淀和酵母双杂交试验证实了番茄的h s f a 2 的核输入需要通过与h s f a l 同源寡聚化 结构域职一 b 的相互作用来完成l e e 等( 1 9 9 5 ) 1 通过e g s 交联和电泳迁移率变动分析，转基 因拟南芥植株嵌合的h s f - g u s 以三聚体形式组成犁地结合于热激蛋白基因中的热激元件上，组 成型地表达了热激蛋白，从而提高了其抗热性 1 2 3 核定位信号( n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l ，简称n l s ) 核定位信号是h s f 携带两簇基本氨基酸序列，被认为起核定位的功能。一簇高度保守的基本氨基 酸位于d b d 的c 端( n 端n l s ，也称n l s ) ，另一簇位于i i i c a b 的c 端( c 端n l s ，也称n e s ) ，n 端的n l s 与h s f 的输入无关而c 端n l s 对h s f 的核输入更为重要。而脊椎动物h s f 的核输入需要两端或只需要n 端的 n l s h s f 输入核是胁迫调节h s f 的一个层次。大多数情况下，h s f sa 和h s f sb 的核定位信号( n l s ) 是在邻近h r a b 区域的i 或2 簇基本的氨基酸残基。番茄h s f s a l 的研究表明只有 吸- a b 区域n 端的 n l s 与h s f s 的核输入有关。在番茄h s f bl 的c 端附近存在1 簇富含精氨酸和赖氦酸的残基，起核定 位的作用在这一组的其它成员及b 2 和b 4 组中也存在相似的基元只有a t h s f b 3 的n l s 位于脓一 和i i i l - b 的连接区域。免疫荧光分析表明，番茄h s f a 2 的核输入只能依赖于与h s f a l 协同运输，这 种协同输入要求两者均必须具有n l s 基元。缺失n l s 则不具备核输入的能力【l q 。 1 2 4c 端的7 元重复域( c - t e r m i n a lh e p t a dr e p e a ，简称p - c ) 在h s f 的c 端存在另一个疏水7 肽重复( h r - c ) ，这个区域与h s f 三聚化的调节有关。i i - c 突变可 导致一种组成型的l s f 三聚化和d n a 结合活性。皿- c 在动物 i s f 中是非常保守的，而在植物和酵母 中是不保守的。在正常生长条件下，i 瑕- a b 和l 珏c _ c 之闻通过通过分子内的卷曲螺旋型相互作用， 抑制h s f - - - 聚体的形成 1 2 5 激活域( a c t i v a t o rd o m a i n 。简称 d ) 3 中国农业大学硕上学位论文第一章论文综述 高等真核生物h s f 的激活域位于分子的c 末端。该区域的氨基酸序列不是很保守的。富含疏水性和 酸性氨基酸，序列中芳香族的、大的疏水性的和酸性氨基酸残基( a h a ) 可能在转录激活中起作用 1 1 2 j 番茄h s f 的缺失图谱分析表明，a d 对转录激活具有重要作用t r e u t e r 等( 1 9 9 3 ) 发现在三种番 茄h s f 中存在1 至2 个考贝的色氨酸重复基元，认为起转录激活( t r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t o r ) 基 元的作用，定位于一个富含负电荷的区域在大豆g m i i s f 2 9 和g 田f i s f 3 4 中，存在单一考贝的t r p 基 元。可能起转录激活子的作用。 类h s f s 上的a 砒基元的作用己被许多拟南芥h s f sc 端缺失突 变及a h a 基元上的丙氨酸替代基本的芳香族和疏水的残基的突变所证实。k o t a k 等( 2 0 0 4 ) “”通过 报告基因在烟草原生质体和酵母的表达及免疫共沉淀分析， i i a 基元为a 类的h s f s 转录活动所必 需相反，b 和c 类的h s f s 则缺乏a h a 基元且没有激活功能。 1 3 热激反应信号转导 热刺激能诱导机体产生热激蛋白。并使生物获得耐热性。这个现象已在几乎所有被研究过的 生物中证实了。目前热激反应的研究已经深入到细胞和分子水平，但是植物感受并传导热激信 号、激活热激基因的表达和诱导耐热性的机制还远未搞清。热激信号转导主要研究植物如何感受 并传递热激信号、以及该信号对生物体细胞基因表达的调控以及调控这一过程的分子途径，此过 程涉及到蛋白与蛋白分子间的相互作用及转录后修饰等多个环节，因此可能存在多种不同的信 号转导途径，它们相互协同作用形成一个精确的信号转导调节系统 1 3 1c a z + c a m 热激信号转导系统 c a 2 + 是植物细胞中被证实的胞内信使之一，钙调素( c a m ) 是细胞内重要的多功能钙信号感受 体，c a l l 是一种c a + 结合蛋白，每个c a l l 分子可以结合4 个c a 2 + ，广泛存在于真核生物中，其与c a 2 + 结合参与了为数众多的生理过程。植物中的c a m 是以家族形式存在的，其成员在基因、表达调节 和生理功能上都有差别钙一钙调素信号系统调控胞内许多生理过程。c a 2 + 和c a m 也是熟激信号转 导上游的重要成员。近年来，钙一钙调素信号系统在环境刺激信号转导中的作用也越来越多地受 到人们的重视。 1 3 1 1c a ”_ c a m 在热激反应中作用机制 这是目前我们正在进行的工作非热激条件下，l i s f 在细胞质中与h s p 7 0 或者t t s p 9 0 结合保持 一种钝化的状态。熟激信号被一种未知的受体感受，从而引起胞内c a 2 浓度的升高，c a 2 + 激活c a m 或促进c a m 基因的表达c a “- c a l i j 醴过激活h s f 从而促进热激基因的表达。途径可能有2 条，其一是 钙调素通过影响胞内钙钙调素依赖的蛋白激酶或蛋白磷酸酶的活性来调节i i s f 的磷酸化状态， 从而达到h s f 的活化其二是钙调素通过与h s p t o 的结合调节h s f 的活性状态：热激引起的胞内 c a z + 浓度的提高促进了钙调素与h s p 7 0 的结合，使h s f 从与h s p 7 0 的结合状态中释放出来三聚化 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章论文综述 而激活1 t t s f 的磷酸化是h s f 活性的一个主要的翻译后调节机制。h s f 的磷酸化位点及涉及到的蛋白 激酶和磷酸酶在其中发挥着重要的作用。h o l m b e r g 等( 2 0 0 1 ) 【1 月对人类h s f i 研究表明，h s f 中丝 氨酸2 3 0 位点是一个组成型和诱导型的磷酸化位点s e r 2 3 0 是依赖c 8 2 + - c a m 的蛋白激酶 ( c a 麟l i ) 的底物，c a 戤i i 促进s e r 2 3 0 的磷酸化并增强h s f 的转录活性。 s t e v e n s o n 等“”证明大鼠细胞h s p t o p q 有一段由2 1 个氨基酸组成的c a m 结合区域。s u n ( 2 0 0 0 ) 以玉米悬浮细胞为材料，通过体外结合和竞争性酶学实验。证明了h s p 7 0 能与c a m 结合， 并且玉米h s p 7 0 中也有一个非常保守的2 1 个氨基酸组成的c a m 结合序列“”说明h s p 7 0 是c a m 的 靶蛋白在以玉米幼苗为材料的h s p 7 0 免疫共沉淀实验中，在非热激、热激及热激后恢复条件下 都检测到了c a m - h s p 7 0 复合物的存在，并且热激后c a m - k s p 7 0 复合物含量增加；在c a m 免疫共沉 淀实验中，c a m - h s p 7 0 复合物出现在热激条件下实验表明，c a m 可能是通过与h s p 7 0 结合而调 节k s f 的活性“”。l u 等“”报告，从热激后悬浮培养的烟草细胞c d n a 表达文库中筛选到一个编码 与c a m 结合的h s p 的e d n a ，该c d n a 编码分子量为5 0l 【d 的蛋白，用凝胶覆盖技术证明这个蛋白 可与3 5 s 标记的c a m 结合。c a m 的作用途径的研究对阐明植物热激信号转导分子传递链有重要意 义，植物热激信号转导分子传递链的确定能为进一步发现调节热激基因表达及作物耐热性的关 键基因提供线索。 1 3 1 2c 矿及c a m 对热激转录因子的功能作用 机体感受并传导热激信号以激活热激基因的表达并诱导耐热性的信号转导机制基本还不清 楚。热激基因的表达能够被一些信号转导物所调节，例如：胞内p h ，c a 船，c a + 。c a m , n a ，i p 3 、 蛋白激酶和蛋白磷酸酶等研究教深入的是c a = + - c a m 信号系统。大量证据证明钙、钙调素参与热 激信号转导，表明在植物细胞内存在一条热激信号转导的钙一钙调素途径。 1 3 1 2 1c r 对热激转录因子的功能作用 b i y a s e h e v a 等【2 1 1 ( 1 9 9 3 ) 用荧光染料方法发现热激能使豌豆叶原生质体胞质c a 2 浓度增加4 倍。 李冰等“”( 2 0 0 4 ) 以小麦叶鞘表皮为材料，利用钙离子荧光指示剂f l u o - 3 a m ( 戊二酰氧甲基脂) 染色，通过激光共聚焦显微技术，观察到热激处理过程中胞质c a 2 + 浓度快速升高，1 5m i n 时c a 2 + 浓度开始上升，4 m i n 时已达到最高值。 g o n g 等( 1 9 9 7 ) 证明c a 2 + 能提高玉米幼苗热激诱导的耐热性，c a 螫合剂e g t a 、钙通道阻 断剂、异博定以及c a m 的拮抗剂c p z 都阻止了热激诱导的耐热性获得。c a 2 + 还提高转基因烟草热诱 导的耐热性而e g t a 处理则阻止了热激诱导的耐热性获得“t r o f i g o v a m ( 1 9 9 9 ) 等在甜菜上观察 到，c a c l 2 和钙载倒k a 2 3 1 8 7 预处理可促进h s p 的合成，而e g t a 则抑制h s p 的合成，即在蛋白合成水 平上表明了c a + 的影响。樊志和等。1 ( 2 0 0 0 ) 用删去测定小麦幼苗生活力作为小麦幼苗耐热性的 研究指标发现用钙离子螯合剂e g t a 、钙离子通道阻断剂异博定、钙调素拮抗剂c p z ，t f p 等效应剂 预处理小麦幼苗都明显妨碍了热激诱导的耐热性的提高而用c a c l 2 预处理则使耐热性略有提高。 刘宏涛 1 4 ( 2 0 0 4 ) c a c l 2 处理转a t h s p l 8 2p r o m o t e r g u s 基因的转基因拟南芥，体内( i nv i v o ) 5 中国农业大学硕士学位论文 第一章论文综述 实验证明发现无论是在热激还是非热激条件下，c a c l 2 处理都能提高转基因拟南芥的b 一葡萄糖 苷酸酶( g u s ) 的活性，而钙离子螯合剂e g t a 、钙离子通道阻断剂l a c l 3 和异博定、钙调素拮抗剂w 7 、 氯丙嗪( c p z ) 和三氟拉嗪( t ip ) 的处理均使g u s 的活性下降。 用玉米幼苗全细胞提取液进行凝胶阻滞分析的结果显示，4 4 热激诱导h s f 的d n a 结合活性， 但如向此细胞提取液中加入5m oi le g t a ，能明显降低热激诱导的i s f 的d n a 结合活性而回 加1m m oi l 和5m m ol l c a c l ：能明显恢复h s f 的d n a 结合活性在非热激温度2 2 时，向全细胞 提取液中直接加入1m m oi l 和l o m m ol l c a c l ：均可激活h s f 的d n a 结合活性，其中i m m oi l c a c l 2 的作用最显著。而相同浓度的m g c l 2 无此作用。表明c a 2 t 对h s f 的激活功能是特异的，且 c g + 可代替热激激活i s f 的d n a 结合活性“” 1 3 1 2 2o a m 对热激转录因子的功能作用 热激促进植物细胞中钙离子浓度提高的同时，也增高了细胞中钙调素的浓度。已经在烟草、 玉米、小麦幼苗中的得到了证实。而且这种升高是依赖钙的，热激过程中c a c i ：处理的幼苗中c a m 含量有明显的提高，而用钙鳌合剂e g t a 处理的幼苗中c a m 浓度无明显提高 刘宏涛等 2 6 1 ( 2 0 0 1 ) 以小麦c a m i - 2 基因为探针，通 过n o r t h e m b l o t 方法表明。小麦幼茁经3 7 热激1 0r a i n ，c a mm r n a 的表达已明显高于基础表达，2 0m i n 达到最高值，3 0m i l l 后开始下降， 最终回到基础水平。这一工作迸一步说明，热激时c a m 活性的增加可能不仅是因为c a z + 激活c a m ， 而且还由于促进c a m 基因的表达 jb r a a m 等p ( 1 9 9 2 ) 将悬浮培养的拟南芥细胞 h 2 4 1 2 升高到3 7 1 3 ，对拟南芥编码c a m 相关t c h 基因进行表达分析，实验表明热激可诱导t c h 2 ，t c h 3 ，t c h 4 表达，而在热激同时加入e g t a 则抑 制它们的表达，则热激诱导的t c h 基因表达是依赖钙的l u 等( 1 9 9 5 ) 【瑚1 从用热激后的烟草细胞构 建的表达文库中筛选到了一个所编码蛋白与c a m 能发生依赖钙结合的c d n a 克隆，n o r t h e n 证实该基 因被热激强烈诱导，所编码蛋白为h s p s o 刘宏涛用n o r t h e r nb l o t 实验证明t c d + _ c a l i 信号系统参与了热激基因的表达：在热激过程 中小麦c a m 蛋白含量增加。预示了c a 2 + c a m 至少是在基因转录水平上参与了热激信号的转导过程。 李冰“”分别对小麦，玉米，番茄进行细胞提取液钙调素( c a m ) 抗血清比较试验，通过凝胶阻滞 分析证实了c a - c a m 信号系统参与了热激反应的调控。 李冰等( 2 0 0 2 ) 以2 7 下生长的玉米黄化苗的全蛋白提取液中加入c a m 抗血清或回加c a m 后 4 4 热激处理3 0m i n ，以 y 一”p t p 标记的h s e 为探针进行凝胶阻滞分析，结果显示正常生长温 度下h s f 的活性很低，而“热激3 0m i n 可激活h s f 的d n a 结合活性如果在热激前加入不同稀释倍 数( 1 ：2 0 0 ，1 ：1 0 0 ，1 ：5 0 ) 的c a m 抗血清则抑制h s f 的活性，c a m 抗血清浓度越大，抑制作用越强。如 果在加人1 ：5 0 的c a m 抗血清后再回加1 0 。或1 0 。r m o l l 的c a m ，则可恢复h s f 的活性在以小麦和番茄 为材料也得到类似的结果。此后在2 0 0 4 年“”分别在玉米。小麦等植物材料的未经热激处理的全蛋 白提取液中直接加人不同浓度的c a m ，凝胶阻滞分析结果显示，对照( 以蒸馏水处理) h s f 活性很低， 随着c a m 浓度的升高，其促进 i s f 活性的作用也越大，而1 0 1t o o l l o a m 反而抑制了h s f 的活性，这 可能是因为过高浓度的c 黼过某种未知的过程影响了热激信号转导过程。以同样浓度梯度的b s a 处理对h s f 的活性无明显的促进作用。以上结果说明，在非热激条件下，c 拼可代替热激激活h s f ， 6 中国农业大学硕士学位论文第一章论文综述 提供了c a m 调节h s f 活性的直接证据 小麦幼苗在经热激1 0a i n 后c a m 基因表达已明显高于基础表达，而热激2 0 r a i n 后h s p 2 6 基因 才开始有少量表达，表明热诱导的c a m 基因的转录先于h s p 2 6 基因的转录；但是如果只热激5m i n ， 然后给予一定的恢复时间，则h s p 2 6 基因也可以表达，说明h s p 2 6 基因转录在较短时间热刺激下即 能启动胞内某一关键因子，随后引起一系列生理生化反应，到2 0 m i n 时才导致基因的转录。c a m 对 h s f 的激活作用在植物中具有普遍意义。结合前面的研究工作。多数研究者认为c a m 在热激信号 转导中的作用是通过激活b s f 的d n a 结合活性来实现的 1 3 2 其它热激信号转导系统 1 3 2 1p h 与热激信号转导 在一些细胞系中，p h 的改变也影响第二信使的水平，胞内酸化会降低胞内c 矛+ 和a m p ，碱化则 升高。目前己在许多细胞中发现热激会产生胞内酸化作用，热激后胞内p h 值都会下降。这种热激 引起的p h 改变可能是由氧化磷酸化的抑制和n h + 泵活性的改变造成的。k i a n g 等( 1 9 9 6 ) 认为 其作用为减缓胞内各种生化过程，是一种保护机制。但是最近z h o n gm 等”( 1 9 9 9 ) 报道，在生 理范围内，p h 降低也能诱导h s f 的三聚化及d n a 结合活性，认为胞内酸化可能有助于激活热激反应。 但也有实验表明果蝇细胞的酸化并不诱导h s p s 的产生。 1 3 2 2c a m p 与热激信号转导 c a m p 是许多激素和细胞因子细胞信号转导的第二信使。许多动物细胞中都发现热激引起胞内 c a m p 水平升高。热激引起的c a m p 升高与州下降及胞内c f + 和m 9 2 + 浓度的升高无关，是由于腺苷酸环 化酶的激活、g 蛋白及腺苷的增多c a m p 具有逆转热激引起的正常蛋白合成受阻的作用，放线菌 素d 不能阻止c a m p 刺激的蛋白合成作用，认为胞内c a m p 水平的升高可能代表一种允许细胞热激恢 复的机制。在热激或其它刺激) 舌h s p t o 的过表达是否影响c a l 【p 的水平仍未知1 但有报道酵母中 许多热激基因由于c a n p 水平下降而被启动 1 3 2 3i p 。与热微信号转导 外界信号分子识别并结合膜表面受体，激活p i p s 磷酸二酯酶( p i c ) 催化使4 ，5 - - - - 磷酸磷脂 酰肌醇( p i p 2 ) 水解成1 ，4 ，5 一三磷酸肌醇( i p 3 ) 和二酰基甘油( d 6 ) 两个第二信使i p 3 能 从胞内钙库动员c a + 引起胞内c a z 升高，通过结合钙调素并使之构象改变，进一步调节受钙调素调 节的酶的活性，