（制糖工程专业论文）发酵液中普鲁兰多糖提取工艺条件的研究.pdf

摘要 摘要 普鲁兰多糖的后提取工艺研究 学科、专业：工科、制糖工程 入学时间：2 0 0 7 9 硕士研究生姓名：牛登飞答辩时间：2 0 0 9 1 2 指导教师：童群义教授 普鲁兰多糖是一种新型的微生物多糖，目前已广泛应用于医药、食品、轻工和化工 等领域中。本文较为深入地研究了发酵液中普鲁兰多糖的后提取工艺条件，主要包括发 酵液的澄清、脱色、除蛋白、脱盐等。 将发酵液经过沸水浴3 0 m i n 进行灭酶以减少普鲁兰多糖的分解。灭酶后的发酵液用 无机絮凝剂去除菌体，用乙酸锌和亚铁氰化钾进行澄清，用硅藻土进行过滤。实验结果 显示，三氯化铝的絮凝效果较好；乙酸锌和亚铁氰化钾的总添加量为8 时，澄清效果 最好；硅藻土加量为3 0 5 0 0 m l 时，助滤效果较好。 以脱色率和多糖损失率为指标对粉末活性炭的脱色工艺进行优化。对粉末活性炭的 用量、发酵液p h 值、发酵液稀释倍数、温度以及脱色时间等几个主要影响因素进行单 因素试验，在此基础上进行正交试验设计，得出粉末活性炭脱色的最佳条件为活性炭用 量为1 0 ，脱色温度5 0 ，脱色时间4 0 m i n ，发酵液稀释5 倍，自然p h 值，此时的脱 色率为9 5 4 6 ，多糖损失率为1 0 1 3 。 通过考察p h ，脱色温度，脱色时间以及过氧化氢的加入量对脱色率的影响，得出过 氧化氢最佳脱色条件为：p h8 o ，加热温度为4 0 ，过氧化氢的添加量为2 0 2 5 ， 作用时间为4 0 5 0m i n 。过氧化氢作用后，多糖溶液的黏度下降，羧基含量增大。 为了达到更好的分离效果，本文选取几种不同的有机溶剂分别对多糖进行沉淀，并 考察了乙醇浓度和添加量对多糖沉淀率的影响。研究结果表明，乙醇具有最好的多糖沉 淀效果，而丁酮具有最好的脱色效果，当乙醇浓度为8 0 时，添加倍数为3 倍时，多糖 的沉淀效果最好。 在多糖溶液中加入氯化钠，水浴加热使蛋白质变性沉淀，残留的蛋白质加入碱性蛋 白酶进行降解。文中分别考察了氯化钠饱和度、溶液浓缩比例和加热时间对蛋白质去除 率的影响，同时对碱性蛋白酶的添加量、p h 、温度和时间四个因素进行正交优化，最终 得到碱性蛋白酶除蛋白的最佳条件是加酶量为1 0 0 u g ，水解时间3 h ，温度5 5 和p h 为8 5 ，该条件下去除率达8 3 7 4 。 选用平板超滤膜进行超滤脱盐。超滤以膜通量为指标，分别考察了进料的浓度、超 滤时间、操作压力以及料液温度对膜通量的影响，通过正交优化得出最佳超滤条件为： 操作压力0 5 m p a ，料液浓度3 ，进料温度2 0 ，超滤时间2 0 m i n 。 测定喷雾干燥后产品的质量指标，主要包括多糖含量、分子量分布、水溶液黏度、 蛋白质含量和产品白度等。 关键词：普鲁兰多糖；提取；脱色；脱蛋白；超滤；质量指标 a b s t r a c t a b s t r a c t p u l l u l a ni san e wm i c r o b i a lp o l y s a c c h a d d ew h i c hi sw i d e l yu s e di nf o o di n d u s t r y m e d i c i n ea n ds oo n i nt h i sp a p e r ，w em a i n l ys t u d i e dt h ee x t r a c t i o np r o c e s sc o n d i t i o n so f p u l l u l a np o l y s a c c h a d d e i tm a i n l yi n c l u d e dc l a r i f i c a t i o n ，d e c o l o r i z a t i o n ，r e m o v i n gp r o t e i na n d d e s a l i n a t i o ni ne x t r a c t i o no fm i c r o b i a lp o l y s a c c h a r i d e s t h ee n z y m e sw e r ed e s t r o y e dt h r o u g hb a t h i n gi nb o i l i n gw a t e rf o r3 0m i n u t e si no r d e rt o r e d u c et h ed e c o m p o s i t i o no fp u l l u l a n t h ef e r m e n t a t i o nb r o t hw a sa d d e di n t od i f f e r e n t i n o r g a n i cf l o c c u l a n t sf o rr e m o v et h et h a l l u s f e r m e n t a t i o nb r o t hw a sc l a d f i c a t e da f t e ra d d i n g z i n ca c e t a t ea n dp o t a s s i u mf e r r o c y a n i d e i tw a sb e t t e rf o rf e r m e n t a t i o nb r o t ht or e m o v et h e t h a l l u sw i t ha l u m i n u mc h l o r i d e c l a d f i e df e r m e n t a t i o nb r o t hw a so b t a i n e dw i t ht h ea d d i n g a m o u n to fz i n ca c e t a t ea n dp o t a s s i u mf e r r o c y a n i d eo f8 a n dt h e nf i l t e r e db yd i a t o m a c e o u s e a r t ho f3 0 5 0 0 m l w | ei n v e s t g a t e dd e c o l o r i z a t i o nr e s u l tf r o md o s a g e ，p h ，d i l u t i o nt i m e s ，b l e a c h i n gt i m ea n d t e m p e r a t u r eo nd e c o l o r i z a t i o nr a t ea n dl o s so fp o l y s a c c h a r i d e i nt h eo r t h o g o n a lt e s t w e o b t a i n e dt h eb e s td e c o l o r i z a t i o nc o n d i t i o nf o rp o w d e r e da c t i v a t e dc a r b o nt h a tt h ed o s a g ew a s 1 o ，t e m p e r a t u r ew a s5 0 ，b l e a c h i n gt i m ew a s4 0 m i n d i l u t i o nt i m e sw a s5 。n a t u r a lp h a t t h i st i m et h ed e c o l o r i z a t i o nr a t ew a s9 5 4 6 a n dp o l y s a c c h a r i d el o s sr a t ew a s1o 13 b ye x a m i n i n gp h ，t e m p e r a t u r e ，t i m ea n da m o u n to fh y d r o g e np e r o x i d e ，i tw a ss h o w e d m a tb l e a c h i n ge f f e c tw a sb e t t e ri nt h ec o n d i t i o no fh y d r o g e np e r o x i d ed o s a g eo f2 2 5 4 0 p ho f8a n da c t i o nt i m eo f4 0 5 0 m i n t h ev i s c o s i t yo fp u l l u l a np o l y s a c c h a r i d es o l u t i o n d e c r e a s e d t h ec a r b o x y lc o n t e n ti n c r e a s e da f t e rd e c o l o r i z a t i o n w es e l e c t e dd i f f e r e n to r g a n i cs o l v e n t sf o rs e p a r a t i o n r e s u l t ss h o w e dt h a ti tw a sb e s t e f f e c tf o re t h a n o lt op r e c i p i t a t ep o l y s a c c h a r i d ea n dm e t h y le t h y lk e t o n et od e c o l o r a t e w 色 i n v e s t g a t e dp o l y s a c c h a r i d ep r e c i p i t a t i o nr a t ef r o me t h a n o lc o n c e n t r a t i o n t h er e s u l ts h o w e d t h a tt h ep o l y s a c c h a d d ep r e c i p i t a t i o nr a t ew a sb e t t e rw h e ne t h a n o lc o n c e n t r a t i o nw a s8 0 a n d d o s a g ew a s 3t i m e s i nt h ec o n d i t i o no fw a t e rb a t hh e a t i n g ，w ec o u l da d dac e r t a i na m o u n to fs o d i u mc h l o r i d e i np o l y s a c c h a r i d es o l u t i o nf o rp r o t e i nd e n a t u r a t i o n s a t u r a t i o n ，c o n c e n t r a t i o nr a t i oo fs o l u t i o n a n dh e a t i n gt i m ew e r ei n v e s t i g a t e df o re f f e c t so fr e m o v i n gp r o t e i n t h er e s i d u a lp a r to ft h e p r o t e i nc o u l db er e m o v e db ya d d i n ga l k a l i n ep r o t e a s e w r ei n v e s t i g a t e de n z y m ed o s a g e p h t e m p e r a t u r ea n dt i m e w eg o tt h eb e s tc o n d i t i o n so fr e m o v i n gp r o t e i n st h r o u g ht h eo r t h o g o n a l t e s t s i ts h o w e dt h a ti tw a sb e t t e rw h e ne n z y m ed o s a g ew a s1 0 0 u g p hw a s8 5 t e m p e r a t u r e w a s5 5 a n dt i m ew a s3 h a tt h i st i m et h er e m o v a lr a t ea tt h i st i m ew a s8 3 7 4 p o l y s a c c h a r i d es h o u l db eu l t r a f i l t r a t e di no r d e rt or e m o v es m a l lm o l e c u l e s i nt h e u l t r a f i l t r a t i o ne x p e r i m e n t s ，w ei n v e s t g a t e dt h ee f f e c to fm a t e f i a lc o n c e n t r a t i o n ，u l t r a f i l t r a t i o n t i m e ，o p e r a t i n gp r e s s u r ea n dt e m p e r a t u r eo nm e m b r a n ef l u x i nt h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，t h e o p t i m u mc o n d i t i o n s w a so p e r a t i n g p r e s s u r e0 5 m p 钆m a t e r i a l c o n c e n t r a t i o no f3 ， u l t r a f i l t r a t i o nt i m eo f2 0 m i n t h et e m p e r a t u r eo f2 0 q u a l i t yi n d e xo fd r i e dp r o d u c ts h o u l db ed e t e r m i n e d i nt h i sp a d e r ，w em e a s u r e dt h e p o l y s a c c h a r i d ec o n t e n t ，m o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o n ，s o l u t i o nv i s c o s i t y , p r o t e i nc o n t e n ta n d w h i t e n e s s k e y w o r d s ：p u l l u l a n ；e x t r a c t i o n ；d e c o l o r i z a t i o n ；p r o t e i nr e m o v i n g ；u l t r a f i l t r a t i o n ；q u a l i t y i n d e x h 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含冥他人已经发表或撰写过的研冗成果，也不包含本人为获 得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示谢意。 签名： 聋耋垒 日期。 1 年i 2 月s 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 魄1 年r 溯听 前言 1 前言 1 1 普鲁兰多糖简介 普鲁兰多糖，又名短梗霉多糖、茁霉多糖，是一种真菌多糖，是出芽短梗霉 ( a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s ) 合成的一种细胞外水溶性大分子中性多糖。它的化学结构是 以仅1 ，6 糖苷键连接的聚麦芽三糖，即葡萄糖按伍1 ，4 糖苷键结合成麦芽三糖，两端再 以a 1 ，6 糖苷键同另外的麦芽三糖结合，如此反复连接而成的高分子多糖【1 1 ( 如图1 所示) 。 但它也存在局部的结构异常。c a t l e y 等就发现了一种含有麦芽四糖的普鲁兰多糖，但这 种结构异常不会对普鲁兰多糖的整个理化性质有大的影响【2 】，其分子量一般在4 8 x 1 0 4 - - 2 2 1 0 6 之间( 商品普鲁兰多糖平均分子量为2 x 1 0 5 ，大约由4 8 0 个麦芽三糖组成) ， 聚合度1 0 0 5 0 0 0 ，是一种线性聚合物，在1 0g m 的浓度下其旋光度为1 9 2 0 。干燥的普 鲁兰多糖粉末为白色，无吸湿性，易溶解在冷水和热水中。普鲁兰多糖具有极佳的成膜 性、成纤维性、阻氧性、可塑性、粘结性及易自然降解等独特的理化和生物学特性，它 无毒无害，对人体无任何副作用，是一种有极大开发价值和前景的多功能新型生物制品 【3 5 1 。 l 图1 普鲁兰多糖的化学结构 f i g 1s t r u c t u r eo fp u l l u l a n 1 2 普鲁兰多糖的性质 1 2 1 溶解性能 普鲁兰多糖是种线性聚合的高分子多糖，它溶于水，溶解速度快，在水中膨胀， 具有很大的溶解度，水溶液为中性，不结晶。 1 2 2 黏度 普鲁兰多糖分子为线性结构，它的水溶液的黏度远低于其它多糖。与其它多糖一样， 普鲁兰多糖水溶液的黏度随平均分子量的增加而增加。温度对普鲁兰多糖水溶液的黏度 影响不大；溶液的p h 值对普鲁兰多糖水溶液黏度的影响也很小；普鲁兰多糖水溶液在 金属离子存在下不凝胶化，黏度不仅不下降，且有升高，任何浓度的食盐均不影响普鲁 兰多糖溶液的黏度。在金属离子存在时，普鲁兰多糖水溶液黏度会有显著变化，其中 m 9 2 + 使其黏度增加最大，n a + 的影响则很小【锚j 。 1 2 3 可塑性 普鲁兰多糖可通过挤压、热压、模铸、辊压、喷涂等方法制成各种薄膜和丝，具有 江南大学硕士学位论文 很强的可塑性。普鲁兰多糖制成的各种膜都具有透明、弹性强、耐油、可热封、可食、 可生物降解、几乎不透氧气、不透氮气和香气等特点【9 】。但是，和其它高分子材料膜一 样，普鲁兰多糖成膜的透气性随其含水量的增加而增高【l o 】。普鲁兰多糖成膜具有一定的 光泽、透明度和硬度，如同玻璃纸一样。在水分含量为3 - 7 范围内，普鲁兰多糖膜硬 度加强，而在高水分含量范围内，则显示强的柔软性】。 1 2 4 粘结性能 普鲁兰多糖的水溶液可以作为粘结剂使用，它对亲水性的材料有很强的粘结作用。 由于普鲁兰多糖的耐水性差，可预先用乙二醛进行耐水处理，增加其耐水性，同时还可 以增大其抗张强度 1 2 , 1 3 l 。 1 2 5 稳定性能 普鲁兰多糖性质稳定，其水溶液耐酸耐碱，当p h 11 普鲁兰多糖液会发生 水解。同其它糖一样，普鲁兰多糖在碱性溶液中加热也会发生褐变反应。干燥的普鲁兰 多糖粉末对热反应比较稳定，加热不熔化，1 0 0 以上开始失去平衡水分，2 5 0 以上才 开始分解炭化，其颜色由白变淡黄、褐色至黑色 1 4 , 1 5 】，炭化过程中不产生有毒气体。 1 2 6 化学性质 普鲁兰多糖分子上有很多羟基，可发生许多相关的化学反应。因此，可以利用普鲁 兰多糖这些羟基的化学性质对普鲁兰多糖进行化学改性如酯化、烷基化或进行接枝共 聚，以及自身或与其它化合物交联f l6 1 ，以改变其水溶性，达到脂溶性的目的。 1 2 7 安全性及生理功能 普鲁兰多糖并没有明显的毒性作用和致畸作用，这在其急性、亚急性、慢性实验和 致畸实验【1 7 】中已经得到证实。它在人体内的消化很慢，食品工业中利用此特点来生产低 热量食品和饮料。此外，普鲁兰多糖具有使双歧杆菌增殖和治疗便秘的作用。在自然界 普鲁兰多糖可被微生物降解，对环境不会造成污染。 1 3 普鲁兰多糖的研究进展 b a u e r 于1 9 3 8 年首次报道出芽短梗霉似u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s ) 的某些菌株在适当条 件下可产生一种黏性物质【1 8 】。1 9 5 8 年西德的b e m i e r 1 9 1 对该物质进行了分离提纯，次年 b e n d e r 等人将之命名为p u l l u l a n 2 0 1 。1 9 6 1 年b e n d e r 和w a l l e n f e l s 发现了特异性极高的普鲁兰 多糖酶( 专一性水解仅1 ，6 葡萄糖苷键) ，其水解产物为麦芽三糖【2 1 1 。在此基础上1 9 6 5 年 w a l l e n f e l s 等人确认普鲁兰多糖是由3 个a 1 ，4 糖苷键连接的麦芽三糖经a 1 ，6 糖苷键聚合 而成的。 出芽短梗霉在发酵时所产色素和蛋白质等不利于其在各方面的应用。目前国内外主 要从两个方面解决这个问题：一是通过优化培养基或者诱变或者基因改造获得产糖高产 色素低的出芽短梗霉菌株1 2 2 - 2 4 】；一是通过优化后提取工艺来分离纯化普鲁兰多糖【2 5 1 。 工业中应用的微生物胞外多糖的提取回收一般有沉淀法和直接干燥法【2 锄】。沉淀法 2 中最成熟的是醇沉法和盐沉法，常用的醇沉剂有甲醇、乙醇、异丙醇等，常用的盐沉剂 主要有季胺盐、氯化钙、氢氧化钙以及氯化铝等。盐沉淀法主要适用于多聚阴离子多糖， 在碱性条件下，高价金属阳离子及有机阳离子( 如季铵盐) 可与多聚阴离子多糖形成沉 淀。盐沉法的优点是用醇量比醇沉法少2 3 倍，但产品质量略差。直接干燥法是将发酵 液蒸发水分而直接干燥成固体产品。在实验室中冷冻干燥是达到这一目的的最好方法， 工业上常用转筒烘烤、鼓风干燥、喷雾干燥等方法得到的产品都是粗制品，其中含有大 量菌体、无机盐、有机残余物等杂质，因此产品的水溶性差、色泽深、流变性也不好， 应用范围受到限制。 微生物多糖的提取步骤主要有预处理、脱色、脱蛋白和脱盐等。多糖的脱色方法主 要有活性炭吸附法、离子交换法、氧化脱色法和金属络合物法。活性炭脱色较彻底但由 于多糖被活性炭吸附会造成多糖的损失。离子交换法是利用弱碱性树脂来吸附色素，此 法对游离的负性离子色素有效，对与糖结合的色素则效果不佳。氧化脱色法主要是用氧 化剂在适当条件下将色素氧化脱除。多糖脱蛋白的方法主要有s e v a g e 法、三氯乙酸法、 鞣酸法、三氟三氯乙烷法和蛋白酶法等。经过脱色脱蛋白的多糖溶液可以运用乙醇分级 沉淀来分离多糖并运用膜技术来除去盐类和小分子。 普鲁兰多糖目前能够规模化生产的只有日本的林原公司，但由于技术封锁等原因， 国内对普鲁兰多糖的后提取工艺鲜有报道。目前只有中科院的孙万儒在小规模的提取方 面申请了专利以及苏理的一项专利，其余的提取方法仅限于实验室。在普鲁兰多糖的提 取过程中，主要的难点是蛋白质的去除。苏理采用膜滤技术对除菌体的发酵液直接进行 脱色脱蛋白和脱盐，摒弃传统的乙醇沉淀法，运用流化床干燥法对产品进行干燥，生产 过程可以实现自动化和连续化。该专利中的膜滤技术主要采用中空纤维或平板膜进行超 滤，贮罐中不停的加入去离子水，直到色度和盐度达到指标。孙万儒采用添加絮凝剂的 方法来去除菌体，然后运用膜技术对多糖溶液进行分离和浓缩，经过不同分子量的膜将 多糖分级，后经喷雾干燥达到去除水分的目的。以上两种方法中对蛋白质的去除都是运 用膜分离技术，然而膜分离去除蛋白质也具有很大的缺陷，所得产品蛋白含量较高，膜 的污染和堵塞也较为严重。由于普鲁兰多糖是一种水溶性的胞外多糖，其提取的方法和 工艺可以参考其他类似的微生物多糖，如黄原胶、结冷胶和热凝胶等。 1 4 普鲁兰多糖的应用 1 4 1 在农产品保鲜上的应用 普鲁兰多糖极佳的成膜性可以使其广泛应用于农产品如水果、蔬菜、鸡蛋等的保鲜 方面。许时婴等【2 9 】应用大豆分离蛋白、硬脂酸和普鲁兰多糖复合成的可食用膜来保存猕 猴桃；马海蓉【3 0 】等用不同分子量的普鲁兰多糖进行苹果保鲜；普鲁兰多糖及其衍生物应 用于鸡蛋保鲜方面也具有很多的优点【3 l 】。 1 4 2 在食品品质改良和成品保存上的应用 普鲁兰多糖水溶性良好，具有改善口感的作用。普鲁兰多糖的耐酸耐碱性能良好， 江南大学硕士学位论文 将其应用于高盐高酸高碱食品的增稠，其效果明显优于其它多糖。普鲁兰多糖膜的阻氧 性能良好，可将其应用于含油食品的保存。 1 4 3 在环境保护领域中的应用 普鲁兰多糖与无机絮凝剂复配使用时效果明显好于单独使用无机絮凝剂【3 2 】。同时， 由于出水无机絮凝剂残留量少，生物可降解性提高，污水回用和后续的污泥处理和处理 方法变得更加容易和多样化 3 3 , 3 4 】。陶涛等【3 5 】研究了微生物絮凝剂处理味精废水的絮凝效 果，普鲁兰多糖可以有效地降低出水的化学需氧量，并且不需要调节p h 值。 1 4 4 在医药工业上的应用 用普鲁兰多糖代替动物胶不仅可以简化防氧化胶囊的生产而且能够适当提高胶囊 的弹性、柔性和粘着性等，使它能在肠胃预定区域溶解，释放内容物，以提高药物的疗 效。 1 4 5 在包装行业中的应用 普鲁兰多糖经干燥或热压能制成厚度为0 0 1 m m 的薄膜，这种薄膜透明、无色、无 臭、无毒，具有韧性、高抗油性，能食用，可做食品包装。其光泽、强度、耐折性能都 比高链淀粉制得的薄膜好。 1 5 课题研究的意义及内容 我国糖资源十分丰富，由于生产过剩，蔗糖和淀粉企业效益下降，而蔗糖和淀粉都 可以作为很好的底物发酵生产高附加值的普鲁兰多糖。因此，加快普鲁兰多糖的后提取 工艺研究，可以降低普鲁兰多糖的生产成本，进而带动淀粉和蔗糖行业。 普鲁兰多糖具有许多独特的性能，它在2 0 0 6 年被卫生部批准为食品添加剂新品种。 中国近几年来对其的需求量快速增长，特别是在医药辅料领域引起了人们的广泛注意和 大量应用。然而，普鲁兰多糖产品目前主要由日本供应，国内普鲁兰多糖的生产还没有 规模化，产品价格高昂，这主要是由于后提取工艺不成熟。因此，简便有效的分离提取 方法具有重要的意义。 本论文主要研究了普鲁兰多糖提取工艺的条件，考察了发酵液的澄清、发酵液脱色 工艺、过氧化氢处理对多糖的影响、发酵液脱蛋白工艺、多糖溶液的超滤工艺以及多糖 质量指标的测定等几个方面内容。 4 材料与方法 2 材料与方法 2 1 实验材料与仪器 2 1 1 主要实验材料 菌种：出芽短梗霉似u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s ) g 5 8 菌株，本菌株产色素较少，实验室 筛选纯化并保存于冰箱中。 普鲁兰多糖发酵液：实验室制剖3 6 1 。制备后的发酵液要进行预处理，其方法是：发 酵液在8 0 加热6 0 m i n ，这样可以杀死菌体和钝化发酵液中的普鲁兰酶，减少其对普鲁 兰多糖的分解。灭酶的发酵液冷却到室温备用。 超滤平板膜：材质是p e s ( 聚醚砜) ，有效面积0 0 0 8 m 2 ，最高耐受温度5 0 c ，截 留分子量1 0 0 0 0 d ，一般运行p h 为2 - 11 。超滤膜使用后要进行清洗。先在去离子水中浸 泡一天，之后分别在0 1 m o l l 的h c i 和n a o h 中浸泡一天。 2 1 2 主要试剂 明矾、三氯化铝、硫酸亚铁、硫酸铁、氯化铁、过氧化氢、磷酸钾、硫酸钠、磷酸 铵、氢氧化钠、盐酸、苯酚、浓硫酸、蔗糖、硫酸铵、磷酸氢二钾、无水硫酸镁、氯化 钠、2 一丁酮、甲醇、无水乙醇、三氯乙酸、氯仿、粉末活性炭、正丁醇等均为分析纯， 考马斯亮蓝g 2 5 0 、酵母膏( b r ) 、牛血清血蛋白、硅藻土( l r ) ，以上试剂均购于国 药集团化学试剂有限公司。碱性蛋白酶( 1 万u g ) 购于无锡酶制剂有限公司。 2 1 3 主要实验仪器 7 2 1 型分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；l x j i i 型离心沉淀机：江苏江阴 矿山机械厂；1 0 1 1 型恒温干燥箱：上海市实验仪器总厂；s h z d ( i i i ) 型循环水式真 空泵：巩义市英峪予华仪器厂；h h s 型电热恒温水浴锅号：上海博讯实业有限公司医疗 设备厂：n d j 7 9 型旋转式粘度仪：同济大学机电厂；d s b d - - l 型数显白度仪：温州鹿 本仪器厂；s t z a 2 4 型浊度计：无锡光明浊度计厂；m i l l i p o r eb i o p r o c e s sd i v i s i o n b i u e r i c a , m a s s a c h u s e t t s 一018 21 ，m a d ei ni n d i a 2 2 实验方法 2 2 1 普鲁兰多糖提取的工艺流程 发酵液预处理发酵液澄清活性炭脱色过氧化氢处理 上 超滤_ 碱性蛋白酶处理卜乙醇沉淀卜蛋白质的去除 上 喷雾干燥 5 江南大学硕士学位论文 2 2 2 发酵液的澄清实验 2 2 2 1 絮凝剂对菌体絮凝的效果 取预处理后发酵液5 0 0 r a l 各5 份，分别添加l o ( w v ) 的明矾、三氯化铝、硫酸铁、 硫酸亚铁和氯化铁，搅拌后静置8 小时，然后在低速离心( 3 0 0 0 - 4 0 0 0r m i n ) 条件下 去除菌体，去上清液用于澄清。 2 2 2 2 乙酸锌和亚铁氰化钾的澄清效果 乙酸锌和亚铁氰化钾分别配置成1 0 ( w v ) 的溶液，两者按照3 ：2 的比例添加。经过 2 2 2 1 除菌体后的发酵液，取5 0 0 m l 各5 份，分别添加乙酸锌和亚铁氰化钾，总添加 量( v v ) 分别为2 、4 、6 、8 和1 0 ，搅拌l o m i n 后离心( 3 0 0 0 - - 4 0 0 0r r a i n ) 弃沉 淀，清液用浊度计测定浊度。 2 2 2 3 硅藻土助滤 取经2 2 2 2 后的发酵液5 0 0m l 各5 份，分别用硅藻土进行助滤，硅藻土分别制成 不同厚度的滤饼层，用量分别为l o g 、2 0g 、3 0g 和4 0g ，助滤后的发酵液用浊度计测 定浊度。 硅藻土层的制作方法是先制作一块同布氏漏斗内径相同大小的圆形滤布，铺在漏斗 的底面。用一定量的水加入到的硅藻土中，搅拌均匀后倒入漏斗中，待其自然成层后抽 滤，并使其相对致密。 2 2 3 粉末活性炭的脱色实验 2 2 3 1 粉末活性炭用量对脱色效果的影响 取经过2 2 2 的发酵液l o o m l ，活性炭添加量( w v ，以下相同) 分别取o 2 ，0 4 ， 0 6 ，0 8 和1 o ，发酵液稀释4 倍，自然p h ，放入恒温水浴锅中4 0 。c 保温脱色3 0 m i n ， 以玻璃棒不停搅拌，脱色后的发酵液经过真空抽滤后获取清液，计算多糖损失率及脱色 率。 2 2 3 2 保温时间对脱色效果的影响 取经过2 2 2 的发酵液l o o m l ，活性炭添加量为0 6 ，发酵液稀释4 倍后放入恒温 水浴锅中，4 0 c 不停搅拌脱色，自然p h 值，脱色时间分别为1 0 m i n ，2 0 m i n ，3 0 m i n ， 4 0 m i n 和5 0 r a i n 。脱色后的发酵液真空抽滤后取清液，计算多糖损失率及脱色率。 2 2 3 3 吸附温度对脱色效果的影响 取经过2 2 2 的发酵液l o o m l ，活性炭用量为o 6 ，发酵液稀释4 倍，自然p h 值， 温度分别设定为2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0 ，6 0 ，保温搅拌脱色3 0 m i n ，脱色后的发酵 液经真空抽滤后去清液，计算多糖损失率及脱色率。 2 2 3 4 发酵液p h 对脱色效果的影响 取经过2 2 2 的发酵液l o o m l ，脱色温度固定在4 0 ，活性炭用量为o 6 ，发酵液 6 材料与方法 稀释4 倍，分别调发酵液的p h 为4 0 ，5 0 ，6 0 ，7 0 ，8 0 和9 0 ，不停地搅拌脱色3 0 m i n ， 之后真空抽滤取清液，分别计算多糖损失率及脱色率。 2 2 3 5 发酵液稀释倍数对脱色效果的影响 取经过2 2 2 的发酵液1 0 0 m l ，脱色温度固定在室温，活性炭用量为o 6 ，自然p h 值，发酵液稀释倍数分别为2 ，3 ，4 ，5 ，6 ，恒温水浴锅中4 0 保温脱色3 0 m i n ，之后 真空抽滤取清液，并分别计算多糖损失率及脱色率。 2 2 4 过氧化氢对多糖溶液的处理 经过活性炭脱色后的发酵液会残留一些色素，这时可以通过添加过氧化氢来对发酵 液进行处理。实验中分别考察过氧化氢添加量、作用时间、温度和p h 对脱色率的影响， 并研究了脱色时过氧化氢对多糖溶液黏度和羧基含量的影响 3 7 - 3 9 1 。 2 2 4 1p h 对过氧化氢脱色效果的影响 取经过2 2 3 的多糖溶液1 0 0m l ，溶液的p h 分别调节为3 0 ，4 0 ，5 0 ，6 0 ，7 0 ， 8 0 和9 0 ，过氧化氢的添加量为2 o ( w v ，以下相同) ，4 0 脱色4 0 m i n ，计算脱色率。 2 2 4 2 温度对过氧化氢脱色效果的影响 取经过2 2 3 的多糖溶液1 0 0m l ，过氧化氢的添加量为2 0 ，p h 调节为8 o ，脱 色时间4 0 m i n ，脱色温度分别设定为2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0 和6 0 ，计算脱色率。 2 243 作用时间和添加量对过氧化氢脱色效果的影响 取经过2 2 3 的多糖溶液1 0 0m l 各5 份，调节溶液p h 至8 0 ，加热温度为4 0 。c ， 在脱色时间为1 0m i n 、2 0m i n 、3 0m i n 、4 0m i n 和5 0m i n 时，分别测定多糖溶液的黏度 和羧基含量并计算脱色率。 2 2 5 普鲁兰多糖的分离实验 2 2 5 1 不同有机溶剂对多糖分离脱色的效果比较 选取经过2 2 4 之后相同普鲁兰多糖溶液1 0 0 m l 各5 份，分别加入有机溶剂甲醇、 乙醇、异丙醇、丁酮和丙酮，添加量分别是原溶液体积的2 倍，不停搅拌后静置1 2 小 时，之后离心去除有机溶剂，沉淀于烘箱中干燥至恒重，称量并计算多糖沉淀率。沉淀 出来的多糖加水复溶配制成溶液进行脱色率的计算。 2 2 5 2 混合有机溶剂对多糖分离脱色的效果 选取经过2 2 4 之后相同普鲁兰多糖溶液1 0 0 m l 各5 份，采用2 2 5 1 中多糖沉淀率 最高和脱色率最好的两种溶剂进行混合实验。两者的添加比例分别为9 ：1 、8 ：2 、7 ：3 、6 ：4 和5 ：5 ，总添加量为原溶液体积的2 倍。之后的操作同2 2 5 1 ，计算多糖沉淀率和脱色 率。 7 江南大学硕士学位论文 2 2 5 3 单一有机溶剂分离多糖的效果 选取经过2 2 4 之后相同普鲁兰多糖溶液3 0 0 m l 各2 5 份，采用2 2 5 1 中多糖沉淀 率最高的溶剂进行多糖的分离实验。将原液浓缩后加入不同浓度的有机溶剂，浓缩比例 ( 原液：浓缩液) 分别为2 ：1 、3 ：1 、4 ：1 、5 ：1 和6 ：1 ，有机溶剂的浓度分别为5 0 、6 0 、 7 0 、8 0 和9 5 ，不停搅拌后静置1 2 小时，之后离心去除有机溶剂，沉淀于烘箱中干 燥至恒重，称量并计算多糖沉淀率。 2 2 5 4 单一有机溶剂添加倍数分离多糖的效果 选取经过2 2 4 之后相同普鲁兰多糖溶液1 0 0 m l 各5 份，选用2 2 5 3 中的有机溶剂 并设定浓缩比例和有机溶剂的浓度分别为其结果中最好的一组。不停搅拌后静置1 2 小 时，之后离心去除有机溶剂，沉淀于烘箱中干燥至恒重，称量并计算多糖沉淀率。 2 2 6 发酵液的脱蛋白实验 脱蛋白是微生物多糖的一个重要步骤，脱蛋白效果的好坏直接影响产品的质量。经 过脱色后的多糖溶液分别选用不同的方法进行蛋白质的去除1 4 0 4 1 1 。 2 2 6 1 实验室方法脱蛋白效果的比较 取经过脱色后的普鲁兰多糖溶液1 0 0 m l 各3 份，分别用s a v a g e 法、t c a 法和鞣酸 法去除蛋白质，计算蛋白质去除率和多糖损失率。 s a v a g e 法：向溶液中加入其体积1 5 的氯仿与正丁醇的混合物，氯仿：正丁醇= 4 ：1 ， 振摇3 0 m i n ，离心取上清液，重复以上操作3 次。 t c a 法：浓缩液置冰水浴中加入等体积3 - - 氯乙酸，搅拌1 0 m i n ，4 。c 放置4 h ， 调p h 值至7 0 ，浓缩至原体积，离心，取上清液，重复以上操作3 次。 鞣酸法：在微沸状态下，向多糖溶液中滴加1 的鞣酸溶液，直至无沉淀产生为止， 离心取上清液，重复以上操作3 次。 2 2 6 2 氯化钠热变性脱蛋白的效果 2 2 6 2 1 氯化钠饱和度对蛋白质去除率的影响 取经过脱色后的普鲁兰多糖溶液3 0 0 m l 各5 份，控制p h 在9 5 1 0 0 ，加热温度9 0 ，分别向浓缩为原液1 4 的发酵液中加入不同的氯化钠，加热时间6 0 m i n ，氯化钠的 饱和度分别控制为3 0 、4 0 、5 0 、6 0 和7 0 ，离心去除沉淀后计算蛋白质去除率。 2 2 6 2 2 多糖溶液浓缩比例对蛋白质去除率的影响 取经过脱色后的普鲁兰多糖溶液3 0 0 m l 各5 份，控制发酵液p h 在9 5 1 0 0 ，加热 温度9 0 ，向不同浓缩液中加入氯化钠使其饱和度为6 0 ，加热时间6 0 m i n ，原液浓缩 比例( 原液：浓缩液) 分别为1 ：l 、2 ：1 、3 ：1 、4 ：1 和5 ：1 ，离心去除沉淀后计算蛋白质去 除率。 8 堑型量查鎏 2 2 6 2 3 加热时间对蛋白质去除率的影响 取经过脱色后的普鲁兰多糖溶液3 0 0 m l 各5 份，调发酵液的p h 在9 5 1 0 0 之间， 加热温度控制在9 0 ，分别向浓缩为原液1 4 的发酵液中加入氯化钠使其饱和度为6 0 ， 加热时间分别设定为4 0 m i n 、5 0m i n 、6 0 m i n 、7 0m i n 和8 0m i n ，离心去除沉淀后计算 蛋白质去除率。 2 2 6 3 碱性蛋白酶脱蛋白的效果 经过2 2 6 2 后的多糖溶液用有机溶剂沉淀后烘干，烘干后的多糖溶液配制成水溶 液，将该多糖溶液浓缩。取上述的多糖溶液1 0 0 m l 若干份，加入碱性蛋白酶进行水解， 计算蛋白质的去除率。 2 2 7 超滤实验 将清洗后的膜组件置于超滤仪中，开机用去离子水清洗超滤系统。3 0 m i n 后，待超 滤处于稳定状态后，从进料口进料。分别考察不同因素对膜通量的影响。 2 2 7 1 不同操作压力对超滤膜通量的影响 室温下，多糖配制成5 ( w v ，以下相同) 的溶液，在0 2 0 ，0 2 5 ，0 3 0 ，o 3 5 ， 0 4 0 ，o 4 5 ，0 5 0 m p a 压力下进行超滤，膜通量为超滤后5 m i n 内的平均值。 2 2 7 2 不同进料温度对超虑膜通量的影响 脱色脱蛋白的多糖配制成5 的溶液，在0 4 0 m p a 的压力下进行超滤，料液温度分 别为1 0 ，2 0 ，3 0 ，4 0 和5 0 ，膜通量为超滤后5 m i n 内的平均值。 2 2 7 3 不同溶液浓度对膜通量的影响 室温下，脱色脱蛋白的多糖分别配制成3 ，5 ，7 ，9 ，1 1 ，1 3 ，1 5 的溶 液，在0 4 0 m p a 的压力下进行超滤，膜通量为超滤后5 m i n 内的平均值。 2 2 7 4 不同时间对超滤通量的影响 室温下，脱色脱蛋白的多糖分别配制成5 的溶液，在0 4 0 m p a 的压力下进行超滤， 每隔1 0 m i n 测定膜通量的值。 2 2 7 5 超滤正交试验 通过单因素试验选出各因素的较高水平进行正交试验以优化出多糖溶液脱盐和小 分子的最佳工艺条件【4 2 】并测定该工艺条件下的离子去除率。 2 2 8 普鲁兰多糖溶液的干燥实验 经过超滤后选用浓度为5 、1 5 和2 5 的多糖溶液进行喷雾干燥，对不同浓度的 多糖溶液喷雾产品的颗粒形态进行比较。取上述的多糖产品各0 5 9 ，分别溶于1 0 0 m l 水中，测定溶解时间。 9 江南大学硕士学位论文 2 3 分析和测定方法 2 3 1 多糖含量的测定及多糖损失率的计算 总糖的测定采用苯酚一硫酸法1 4 3 1 ，用7 2 1 型分光光度计在波长4 9 0 n m 处测定吸光值。 多糖的损失率( ) e = ( c o c ) c o * 1 0 0 ( c o ：脱色前普鲁兰多糖发酵液的糖含量；c ：脱色后 普鲁兰多糖发酵液糖含量) 。 2 3 2 色素含量的测定及脱色率的计算 发酵液中色素含量多少的相对值以7 2 1 分光光度计在6 5 4 n m 处的吸光度值来表示。 脱色率( ) d = ( a i i a o * 1 0 0 ( 舢：脱色前普鲁兰多糖发酵液的色素含量；a ：脱色后普 鲁兰多糖发酵液的色素含量) 1 4 4 1 。 2 3 3 多糖溶液中羧基含量的测定方法 采用乙酸锌与多糖溶液中的羧基进行离子交换，再用氢氧