（微生物学专业论文）斑痣盘菌科分类及被子植物生散斑壳属分子生物学研究.pdf

摘要 本论文采用目前世界上最新颖、先进的分类系统和多性状综合分类方法，根据形 态解剖学、个体发育学、生态及生物学等特征，对采自安徽天堂寨国家森林公园和牯 牛降自然保护区的斑痣盘菌科3 属的若干种进行了分类学研究。同时，采用9 个重复 性好的随机引物对被子植物上的2 8 个散斑壳属( l o p h o d e r m i u mc h e v a l l ) 菌株进行 r a p d - p c r 扩增反应，通过r a p d 分析结果结合表型性状的比较和分析，确定了子 囊果埋生位置，子座、子囊、予囊孢子、侧丝等形态学特征以及寄主种类差异在该类 真菌种水平分类上的重要性，进一步明确了被子植物生散斑壳属若干种内和种间的遗 传多样性和亲缘关系。主要研究结果如下： 1 以d a r k e r ( 1 9 6 7 ) 、c a n n o n & m i n t e r ( 1 9 8 6 ) 、k i r ke ta i ( 2 0 0 1 ) 等人提出的 分类观点为主要依据，对采自安徽天堂寨国家森林公园、牯牛降自然保护区以及保藏 于安徽农业大学森保教研室( a a u f p ) 的近3 0 0 号标本进行鉴定、分类。研究了齿 裂菌属( c o c c o m y c e s ) 的显缘齿裂菌( cl i m i t a t u s ) ，皮下盘菌属( h y p o d e r m a ) 的野 珠兰皮下盘菌( 皿s t e p h a n a n d r a e ) 以及散斑壳属( l o p h o d e r m i u m ) 的贝壳衫散斑壳 ( 厶a g a t h i d i s ) 、纠丝散斑壳( 工i m p l i c a t u m ) 、小散斑壳( m i n u s ) 、红褐散斑壳( l r u f u m ) 、蝙蝠葛散斑壳( 工m e n i s p e r m i ) 和石楠散斑壳( lp h o t i n i a e ) 8 个种，其中 野珠兰皮下盘菌、蝙蝠葛散斑壳和石楠散斑壳为新种。编制了二叉式分种检索表，各 种均附有形态解剖学特征的描述与图解以及寄主、生境的记载，并加以讨论。 2 利用组织分离法对采自安徽天堂寨国家森林公园的散斑壳属成员进行了分离 培养，获得9 个生于被子植物上的散斑壳属菌株。培养期问，定期观察发现不同种之 间的培养性状存在显著差别，甚至同种的不同生境及寄主的分离株在菌落生长速度、 大小、颜色以及色素产生方面也存差异；各菌株均附培养性状描述。 3 利用随机扩增多态性d n a 技术( r a p d ) 对源于安徽黄山风景区以及天堂寨 国家森林公园的2 8 个被子植物生散斑壳属菌株进行了基因组d n a 多态性分析。采 用筛选出的9 个l o 一寡聚核苷酸随机引物，通过r a p d p c r 扩增反应，共获得扩增 条带1 0 5 条，其中特异性条带1 0 0 条，占9 5 “；用u p g m a 方法构建聚类图，在 遗传距离4 1 0 处将2 8 个供试菌株分为7 类，其聚类结果与表型性状分类极其相近。 通过r a p d 分析结果结合表型性状的比较和分析，确定了子囊果埋生位置，子座、 予囊、子囊孢子、侧丝等形态学特征以及寄主种类差异等表型性状在该类菌物分类上 的重要性。 关键词：斑痣盘菌科，分类学，教斑壳属，分子生物学，被子植物 a b s t r a c t s o m em e m b e r so ft h r e eg e n e r ai ng h y t i s m a t a c e a ew h i c hc o l l e c t e df r o mt h es o u t h m o u n t a i n so fa n h u ip r o v i n c ew e r es y s t e m a t i c a l l ys t u d i e dw i t ht h em o s tn o v e l t ya n d a d v a n c e dp o l y - c h a r a c t e ri n t e g r a t e dt a x o n o m ym e t h o dw h i c hi sb a s e do i lt h ec h a r a c t e r so f m o r p h o l o g y , d e v e l o p m e n t a lb i o l o g y , e c o l o g y a n d d i s t r i b u t i o n t w e n t y - e i g h t l o p h o d e r m i u ms t r a i n so na n g i o s p e r m sw e r ec h a r a t e r i z e db yr a p d p c rr e a c t i o nw i t h9 r a n d o mp r i m e r sw h o s eg e le l e c t r o e r s i sd i a g r a m sc a nb ea m p l i f i e dr e p e a t e d l ya n dc l e a r l y b yt h ec o m p p a i s o no fr a p da n a l y t i cr e s u l t sa n dt h ep h e n o t y p i cc h a r a c t e r s , i n d i c a t e dt h e i m p o r t a n c eo fs o m em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r ss u c ha st h ee m b e d d e dp o s i t i o no f a s c o m a t a , s t r o m a m , a s c i ，a s e n s p o r e s ，p a r a p h y s e sa n dt h ec a t e g o r yo fh o s t s0 nt h ec l a s s i f i c a t i o no f s p e c i e sl e v e l r e l a t i o n s h i p so fs o m ei n t r a s p e c i f i ca n di n t e r s p e c i f i c s l 雕l i n so f l o p h o d e r m u i mo na n g i o s p e r m sw e r ea f f i r m e d t h e m a i nr e s u l ti sa sf o l l o w s ： ( 1 ) n e a r l y3 0 0s p e c i m e n sf r o mt h es o u t hm o u n t a i n so fa n h u ip r o v i n c ea n da n h u i a g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t yf o r e s tp r o t e c t i o n ( a u u f p ) w e r ei d e n t i f i e da c c o r d i n gt ot h e t a x o n o i cp r i n c i p l e so f d a r k e r ( 1 9 6 7 ) c a n n o n & m i n t e r ( 1 9 8 6 ) a n dk i r ke ta 1 ( 2 0 0 1 ) ，8 s p e c i e so fr h y t i s m a t a c e a ew e r es t u d i e d ，i n c l u d i n gcl i m i t a t u so fc o c c o m y c e s ，h s t e p h a n a n d r a eo fh y p o d e r m a ，l a g a t h i d i s ，三i m p l i c a t u m ，三m i n u s ，lr u f u m ，l m e n i s p e r m ia n d l p h o t i n i a eo fl o p h o e d e m i u m 1 t s t e p h a n a n d r a e lm e n i s p e r m ia n d 厶p h o t i n i a ea r en e ws p e c i e sa m o n gt h e m d i c h o t o m o u sk e yt o t h e s es p e c i e sw e r e c o m p l i e d m o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sw e r ed e s c r i b e da n di l l u s t e a t e d ，a n dh a b i t s ，h o s t s a n dd i s t r i b u t i o n sw r er e c o r d e df o rt h es p e c i e s ( 2 ) l i v i n gf u n g im a t e r i a l sc o l l e c t e df r o mt h en a t i o n a lf o r e s tp a r ko ft i a n t a n g z h a i ， a n h u iw e r ei s o l a t e di nm ac u l t u r em e d i ab yt i s s u ei s o l a t i o nt e c h n i c s ，a n d9 l o p h o d e r m i u ms t r a i n so na n g i o s p e r m sw e r eo b t a i n e d d u r i n gt h ep e r i o do f t h es i n g l ep o i n t c u l t i v a t i n g , c u l t u r ec h a r a c t e ro ft h es a m es p e c i e s f u n g iw e r ed i s t i n c t ，e v e nt h es a m e s p e c i e so fd i f f e r e n th o s t sw e r ed i f f e r e n ti ng r o w t hr a t e , c o l o n ys i z e , c o l o n yc o l o ra n d p i g m e n tp r o d u c i n g e a c hi s o l a t e ds t r a i n sa t t a c h e st h ed e s c r i p t i o no f t h ec u l t u r ec h a r a c t e r ( 3 ) 9p r i m e r sw h i c hi sc o m p o s e do f1 0 - o l i g o r i b o n u c l e o t i d ea r eu s e dt oa n a l y z et h e g e n e t i cd i v e r s i t yo f 2 8l o p h o d e r m i u ms t r a i n so na n g i o s p e r m s 1 0 5l o c ia r ed e c e t e di nt o t a l , a m o n gw h i c ht h e r ea r e1 0 0p o l y m o r p h i cl o c i t h ep e r c e n t a g eo fp o l y m o r p h i cl o c i i s 9 5 2 4 d e n d r o g r a mo fg e n e t i cr e l a t i o n s h i p sa m o n gl o p h o d e r m i u m s t r a i n so n a n g i o s p e r m s i sc o n s t r u c t e do nt h eu p m g a t h er e s u l td e m o n s t r a t e st h a t2 8 l o p h o d e r m u i ms t r a i n so na n g i o s p e r m sa r ec l u s t e r e di n t o7g r o u p si ng e n e t i cd i s t a n c e4 1 0 i i b yt h ec o m p a r i s o no fr a p da n a l y t i cm s u l t sa n dt h ep h e n o t y p i cc h a r a c t e r , w ec 觚c o n f i r m t h ei m p o r t a n c eo fs o m em o r p h o l o 西c a lc h a r a c t e rs u c ha st h ee m b e d d e dp o s i t i o no f a s c o m a t a , s t r o m a t a , a s c i ，a s c o s p o r e s ，p a r a p h y s e sa n dt h ec a t e g o r yo fh o s t s o nt h e c l a s s i f i c a t i o no f l o p h o d e r m i u m k e yw o r d s ：r h y t i s m a t a c e a e ，t a x o n o m y , l o p h o d e r m i u m ，m o l e c u l a r b i o l o g y , a n g i o s p e r m i i i 独创性声明 本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得安徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：茏始 签字日期：力7 年月侈曰 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 文件，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文( 保密的学位论文在解密后适 用本授权书) 。 学位论文作者签名：盏拯 签字日期：抄7 年绢吵日 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通信地址： 指导教师签名：趟! 兰 签字日期：舢7 年g 月7 ，日 电话： 邮编： i 文献综述 1 斑痣盘菌分类历史回顾 斑痣盘菌科( r h y t i s m a t a e e a e ) 在现在菌物分类学中被归属于子囊菌门 ( a s e o m y e o t a ) 盘菌纲 d i s c o m y e e t e s ) 斑痣盘菌目( r h y t i s m a t a l e s ) ( c a n n o n & m i n t e r , 1 9 8 6 ) 1 1 1 。它是斑痣盘菌目中最大的一科，迄今已有7 4 属5 0 0 余种被报道( h a w k s w o r t h e ta 1 ，1 9 9 5 ；j o h o n s t o n ，2 0 0 1 ) l 。然而，在过去较长时期内斑痣盘菌科一直被不恰当 地置于星裂盘菌目( p h a e i d i a l c s ) 中( h 0 h n e l ，1 9 1 7 ；n a n n f e l d t , 1 9 3 2 ；k o r f , 1 9 7 3 ；d e n n i s 。 1 9 7 8 ) 1 4 - 7 1 。 二十世纪八十年代初期，一些学者建立了斑痣盘菌目( r h y t i s m a t a l e s ) ( e r i c s s o n , 1 9 7 0 ；h a w k s w o r t he ta 1 ，1 9 8 3 ) ，承认斑痣盘菌科( r h y t i s m a t a c e a e ) 、异盘菌科 ( a s c o d i c h a e n a e e a e ) 、鲜色盘菌科( c r y p t o d m y c e t a c e a e ) 和皮下盘菌科 ( h y p o d e r m a t a e e a e ) 在内的4 科系统，并将星裂盘菌科移至柔膜菌目中i 9 1 。不久 c a n n o n & m i n t e r ( 1 9 8 6 ) 将皮下盘菌处理为斑痣盘菌科的异名【l i ，这一分类主张已被 安、比氏菌物词典第八版( h a w k s w o r t hc ta 1 ，1 9 9 5 ) 和现在多数菌物工作者所接受【”。 属的系统沿革相当复杂，早期的一些分类真菌学方面的研究者注意到了 r h t i s m a t a c e a e 。这些包括p e r s o o n ( 1 7 9 4 ) ，他描述了x y l o m a ( r h y t i s m a 的异名) ，d e c a n d o l l e ( 1 8 0 5 ) 他将h y p o d e r m a ( 当时也包括l o p h o d e r m i u m 的种) 从h y s t e r i u mp e r s ( 不 是t o d e ) 中分出【l “，f r i e s ( 1 8 1 5 ，1 8 2 3 ) 论述了当时认为h y s t e r i u m 中的r h y t i s m a t a e e a e 的多数种，但发表了r h t i s m a 这个属名【l l ，”i ，而c h e v a l l i e r ( 1 8 2 2 ，1 8 2 6 ) 描述了 l o p h o d e r m i u m 属m ”】，并将r h y t i s m a t a e e a e 认作一个科( 尽管l o p h o d e r m i u m 被保留 在h y s t e r i a e e a e 中) 。c h e v a l l i e r ( 1 8 2 2 ) 把h y p o d e r m a 分成两大类群，即h y p o d e r m a 和l o p h o d e r m a ，并作了简短的描述。c h e v a l l i e r ( 1 8 2 6 ) 正式建立的散斑壳属 ( l o p h o d e r m i u mc h e v a l l ) ，该属是斑痣盘菌科中一个最大的分类群。实际上早在 1 7 9 9 年该属的模式种( la r u m i d i n a c e u m ) 就由s c h r a d e r 作为h y s t e r i g m 下的一个种 来描述，但随后的1 8 0 5 该种又被d en o t a r i s 转移至皮下盘菌属。但c h e v a l i e r ( 1 8 2 6 ) 大体上改变了他对这些菌的早期处理。他完全废除了h y p o d e r m a 。f r i e s ( 1 8 2 3 ) 将 h y p o d e r m a 下的种分离进h y s t e r i u m 属下的不同族中。w a l l m t h ( 1 8 3 3 ) 主要接受f r i e s 的处理但建立一个新的属c o l p o m a 。 d e n o t a r i s ( 1 8 4 7 ) 根据子囊果程星裂开裂等特征建立了c o c c o m y c e s 属【1 目，但不 主张将h y p o d e r m a 属从l o p h o d e r m i u m 属中分开，他是第一个认可h y p o d e r m a 和 l o p h o d e r m i u m 之间前可被接受的区别的人，他将具圆柱状至椭圆形孢子的种放于 h y p o d e r m a 中，而将具线性孢子的种放于后者。不幸的是，这一点取消了c h e v a l l i e r ( 1 8 8 2 ) 赞成的种的排列法。c a n n o n & m i m e r ( 1 9 8 4 ) 认为l o p h p d e r m i u m 和h y p o d e r m a 是两个完全不同的属【1 6 1 。l i n d a n 在对该群分类中是第一个考虑到子囊果埋生深度的作 者。h o h n e l ( 1 9 1 7 ) 介绍了一个全新的分类系统，根据子囊果埋生的深度描述了一系 列的科。他的系统显然是人为的，并被后来的几乎所有的研究者所丢弃。然而他将 r h y t i s m a 处理在与h y p o d e r m a 和l o p h o d e r m i u m 相同的目中。h i l i t z e r ( 1 9 2 9 ) 考虑到无 性态在分类上的重要性。n 踟f e l d t ( 1 9 3 2 ) 不赞成h o h n e l ( 1 9 1 7 ) 将星裂盘菌目划 分为6 科的处理，只承认包括b f f u s e l l a 等多个具有缝裂囊壳的属和c o c c o m y c e s 等星 状开裂的属在内的星裂盘菌科。t e r r i e r ( 1 9 4 2 ) 审查了n a n n f e l d t 列举的星裂盘菌科 各属，将它们分别置于斑痣盘菌科、皮下盘菌科和星裂盘菌科中1 1 7 。 d a r k e r ( 1 9 6 7 ) 对斑痣盘菌科、属进行了一次全新的修订，他对温带地区的属和种， 尤其对针叶树上种的描述更是准确而详尽的0 8 1 。他把r h y t i s m a t a c e a e 视为 h y p o d e r m a t a c e a e 科的异名。在其分类系统中，主要把子囊果、子囊、子囊孢子的形 态作为重要的分类依据并且许多新属也是建立在此基础上的。尽管d a r k e r 的一些分 类体系是人为的，但是由于令人满意的替换体系尚未形成，故该分类系统至今仍被广 大工作者所使用【1 9 1 。 自d a r k e r 之后，大部分研究都集中在单个的属上。p o w e l l ( 1 9 7 4 ) 撰写了一篇关于 h y p o d e r m a 属的尚未发表的文章，该文中记录了8 个种【2 0 1 。s h e r w o o d ( 1 9 8 0 ) 发表了 一篇关于c o c c o m y c e s 属的综合的分类专题论文f 2 i j ，然而，她认为自己的分类方法是 保守的并且是人为的。国内学者林英任等( 1 9 9 9 ) 建立n e o c o c c o m y c e s 属田1 ，并根据 子囊孢子多隔且呈双纺锤形将其与c o c c o m y c e s 属相区别。有人还建议将d a r k e r 建立 的l s t h m i e l l a 等5 属分别处理为b i f u s e l l a 等属的异名1 2 3 。1 。 种以及种以下阶元的分类依据视不同的属而定。斑痣盘菌科种级阶元的分类比较 混乱。不同的属，往往分种依据不同。传统分类主要是依据形态学特征为主要分类依 据，特别是有性型特征j 。如s h e r w o o d ( 1 9 8 0 ) f z q 、林英任( 1 9 9 8 ) 印嗨子囊和子 囊孢子的形状、大小以及侧丝顶端的形状作为c o c c o m y c e s 属划分种的主要依据； j o h n s t o n ( 1 9 8 6 1 9 9 0 ) 1 3 5 - 3 8 1 在h y p o d e r m a 、l o p h o d e r m i u m 和坛l o d e r m a 属的分类中 强调子囊果非育组织( 子座、囊盘被和唇细胞等) 发育特征的重要性；m i n t e r ( 1 9 7 8 ， 1 9 8 0 。1 9 8 1 ，1 9 8 2 ) 在研究松树上的l o p h o d e r m i u m 属时将子囊果的埋生位置作为最主 要的分种依据p 9 - 4 3 1 ，并将无性型特征和生活习性作为辅助依据；何宇峰，叶光斌等 ( 2 0 0 4 ，2 0 0 5 ) u - 4 6 1 将培养性状和酯酶同工酶分析结果用于c o c c o m y c e s 、r h y t i s m a 和 s 0 昭池等属近似种的区分。同一属在针、阔叶树等不同寄主上的分类标准也不尽相 同 4 7 4 9 。此外，有不少种或种以下分类单元的建立只是基于同相近类群在表型特征方 面的细微差别，尚缺乏可靠而又有力的证据。 近年，随着生物技术的不断发展和创新，分子生物技术已经渗透到许多相关的领 2 域，尤其是以p c r 技术为基础的r a p d 、s s r 、r f l p 、p f g e 、a f l p 、s n p 等技术 在真菌分类和系统学研究方面得到了越来越多的应用 5 0 - 5 s l 。何宇峰，叶光斌等( 2 0 0 5 ) 首次对我国斑痣盘菌中的皮下盘菌属( h y p o d e r m a ) 、齿裂盘菌( c o c c o m y c e s ) 和斑 痣盘菌属( r h y t i s m a ) 若干种以及环纹符氏盘菌( f l a d r a e u l aa n n u l 龋o r m i s ) 进行r a p d 分析p t 删。通过摸索并优化r a p d 分析的体系，建立了适合一些斑痣盘菌属r a p d 分析的体系数据。根据类平均法( u p g m a ) 得到的聚类结果显示环纹符氏盘菌 ( f l a d r a c u l aa n n u l i f o r m i s ) 应该置于斑痣盘菌属( r h y t i s m a ) 内。 在分类系统的长期进化过程中，广大的国内外研究者对其做出了卓越的贡献，但 还存在一些分歧和迷团，而解决这些问题的方法，就是探寻并建立更加自然、合理与 实用的斑痣盘菌科分类体系。 2 斑痣盘菌的生态与地理分布 各类真菌在生态、地理分布等方面均有其特殊要求和耐性界限，这为利用生态或 者地理分布的差异行进种的划分提供了可能性。菌物生长不仅受地区、气候等环境因 子影响，而且与植物种类、年龄等寄主因素也有直接关系，甚至同一地区不同采集点 因寄主、温度、湿度等不同，同一种也能表现出不同的培养性状。就r h y t i s m a t a c e s 而言，除对温度、湿度、p h 值等环境条件有要求外，寄主的存在对其分布的决定性 作用更强。斑痣盘菌科成员的地理分布研究是由p i o z y n s k i & w e r e s u b ( 1 9 7 7 ) 正式提 出来的1 6 l l 。该科的多数成员分布于世界各地，但是有少数种类分布范围狭窄，如 l o p h o m e r u m p o n t i c u m 仅分布在b r i t i s hi s l e s 地区r h o d o d e ? i r o n p o n t i c u m 的落叶上。 大量的调查资料显示该科的多数成员具一定程度的寄主专化性。对寄主的选择似 乎主要取决于基物的形态结构和寄主的生态习性，而不是分类上的亲缘关系。该类真 菌在形态学上的变化正是适应了生态因素的改变，往往是生态环境的不同导致了形态 学上的差异，这对物种的进化研究提供了一个可靠的依据。 3 菌物多相分类学的产生和发展 传统的菌物分类主要是形态分类学，随着研究的不断深入与分类学的发展，分类 学家们在形态分类中遇到的问题越来越多，越来越感觉到单纯依靠形态观察难以解决 分类过程中遇到的新问题，于是各种新的分类方法不断产生。分类依据从形态特征发 展至生理生化和分子性状，分类所依据的特征由少至多，逐渐呈现多相分类的发展趋 势1 6 “。这些分类方法主要有； ( 1 ) 形态分类法：主要借助显微镜对菌物的营养体与繁殖体形态解剖特征进行 检查与测量，并进行客观描述。方法直观可靠，可比性强，但对特征相似的种类往往 难以区分，给种或种以下单元的界定带来困难。 ( 2 ) 化学分类法：化学分类是基于化学特征的分类方法。几十年来，它一直是 许多生物分类的一个重要手段，由于分析方法、分子生物学方法发展以及有关仪器的 改进，许多不同化学分类方法相继产生。主要包括对多糖、蛋白质及脂肪酸分析，细 胞壁组成分析，代谢成分分析，同工酶分析等等。 ( 3 ) 电镜技术：电镜技术的发展为观察和研究菌物的细微结构和亚显微结构提 供了有力手段，从而促进了菌物的系统分类和鉴定工作的发展。在对菌物的超微研究 中，大多学者侧重于子囊菌的子囊顶端构造、子囊孢子隔膜存在与否、子囊孢子表面 特征以及其他细微结构的研究( k i n b r o u g h ，1 9 9 4 ；v e r k l e y , 1 9 9 5 。1 9 9 6 ；h y d e & w o n g , 1 9 9 9 ) | 6 3 - 6 6 1 。 ( 4 ) 色谱法：被广泛的应用于医学、微生物学和工业领域的分析与科学研究中， 但用于菌物的分类和鉴定还处在探索阶段。 ( 5 ) 数值分类法：是生物分类学在本世纪中的一项突破。它是依靠电子计算机， 根据等权原则，按运筹分类单位性状状态的全面相似性，将它们分为不同的表现群。 ( 6 ) 分子分类法：传统的菌物分类都是基于各种形态解剖特征观察与生理、生 态及生物学性状的描述。在许多情况下这些特征是可变的，如在人工培养条件下很难 产孢，形态特征相近而难以区分，以及易受环境条件的影响而不稳定，尤其是在某些 形态学或生理生化指标相似的情况下，给鉴定分类工作造成一定的困难。由于菌物细 胞的绝大多数形态特征和生理生化特征都是由细胞内核酸分子决定的，且不受环境因 素的影响，故可以通过分析其d n a 性状予以鉴别区分。因此，分子生物学技术被菌 物学家们广泛用于菌物分类研究中。 4 现代分子生物技术在菌物分类上的应用 菌物分类的目的是要真正按照亲缘关系客观地反映其系统发育，构建一个反映进 化关系的自然分类系统( h i b b e t t & d o n o g h u e ，1 9 8 8 ) ，也就是说，菌物分类必须符合 系统发育，菌物分类单元的合理程度必须接受菌物系统学的检验。因此在传统的以形 态特征为主要依据的分类体系中，应将现代分子生物技术加入其中。现代分子生物技 术是在2 0 世纪7 0 年代初发展起来的- f - 新兴学科，自1 9 7 2 年美国斯坦福大学的p b e r g 博士等人成功建立重组d n a 技术以来，世界各国都十分重视发展现代分子生物技术， 并将其广泛应用于相关研究领域，主要包括r a p d ( r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i c d n a 即随机扩增多态性d n a ) 、r f l p ( r e s t r i c tf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，限 制性片段长度多态性、a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m , 扩 增片段长度多态性) 、s c a r ( s e q u e n c ec h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n ，特征序列扩增区 段1 分析和d n a 测序等技术，由于可直接或间接分析微生物基因组，更好地反映不同 类群间亲缘关系，因而近年在真菌分类和系统学研究方面得到了越来越多的应用 6 7 - 7 4 1 。随着分子生物技术的飞速发展，其重要地位日益突出，目前已成为国内外各相 关学科的研究热点1 7 ”s l 。 1 9 7 1 年k h o r a n a 等提出了p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n , 聚合酶链式反应) 4 的概念，它是一种在体外扩增d n a 的新技术，其基本原理是通过高温使双链d n a 解旋成单链，然后退火，使特征引物与互补序列配对，最后在t a q d n a 聚合酶的作 用下合成d n a 片段，经多次循环，直至产生足够的d n a 片段。p c r 技术对d n a 样品要求不严格，且用量少、特异性强，可以在一个酶促反应中产生大量已知序列的 d n a 片段，大大简化了克隆、分析、修饰核酸等许多程序。由于p c r 技术具有快速、 简便、经济、高效等特点，使p c r 在问世不久便得到广泛发展，成为分子生物学相 关领域研究的有力工具。自p c r 技术出现之后，基于p c r 的各种分子生物技术相继 产生，而r a p d 技术正是其中的一种。r a p d ( r a n d o m a m p l i f i e d p o l y m o r p h i cd n a s 随机扩增多态性d n a ) 技术是1 9 9 0 年由美国科学家w i l l i a m s 等和w e l s h 等几乎同时 建立发展起来的。建立在p c r 基础之上的分子生物技术，其原理是以基因组d n a 为 模板，利用人工合成的l o 个碱基的随机寡聚核苷酸为引物，通过p c r 扩增反应，并 经过琼脂糖凝胶电泳来检测d n a 片段的多态性。r a p d 技术具有引物没有严格的种 属界限、多态性强及检测灵敏等特点，但r a p d 技术的稳定性和重复性差，因此， r a p d 要求严格控制试验条件，提高其稳定性和可重复性。p c r 技术和r a p d 技术 的出现为从分子水平上对真菌进行研究提供了方便、准确的方法。 s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，简单序列重复) 在真核生物基因组中，散布着由1 4 个碱基对组成的简单重复序列：即s s r ，它又称为微卫星d n a ( m i c r o s a t e l l i t ed n a ) 。 s s r 序列的侧翼具有保守的d n a 序列，由于重复基数的数日变化大，因此s s r 显示 出较强的多态性。人们把以微卫星d n a 标记建立的遗传连锁图称为继r f l p 作图后 的第二代遗传连锁图。1 9 8 5 年l e f f r e y s 己从人肌红蛋白位点获得了3 b p 核心序列作探 针，与人的酶切后的总体d n a 进行杂交，得到了杂交带谱，大多数带谱代表人基因 组内不同座位上的卫星d n a ，它们组合在一起成为人的d n a 指纹图，它有高度的个 体差异，且按孟德尔方式稳定遗传。此法流行了近1 0 年，在法医鉴定方而作出了贡 献。1 9 9 3 年w u 和t a n k s l e v 改用小卫星探针显示带谱的方法，创造了用s s r 侧翼序 列作引物的一部分，用来扩增重复序列木身，由于重复序列的长度变化极大，因此是 检测多态性的一种有效的方法。该技术一般检测到的是一个单一的多等位基因位点， 此标记为共显性，所得的结果重复性高，为了提高分辨率，常使用变性的聚丙烯酞胺 凝胶电泳，它可检测出中一拷贝差异。该标记比r f l p 的多态性更丰富，且操作上比 r f l p 简便快速，因此正在被广泛应用。 1 9 7 4 年，o r o a j i c k e r 等最早提出r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o 棚s m ， 限制性片断长度多态性) 的概念。其原理是，由于不同个体的等位基因之间的碱基代 换、插入、缺失、重组等，当用限制性内切酶酶切不同个体的基因组d n a 时，不同 个体所产生的d n a 片断大小和数目不同，经琼脂糖凝胶电泳后即可分开，然后再利 用特异d n a 探针进行s o u m e m 杂交。最后通过放射自显影来揭示d n a 的多态性。 r f l p 技术是对植物病原真菌种及种以下类群进行群体水平的变异与菌系鉴定等分类 研究的有效手段。只要有合适的质粒探针，就可以用r f l p 技术对大量的植物病原真 菌样品进行有效分析。基因组d n a 、m t d n a 、r r n a 及r d n a 等均可用来对真菌种 及种下类群进行r f l p 分析，其中以r r n a 和r d n a 较为灵敏。k o h n 等通过r r n a 的r f l p 研究发现，核盘菌( s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m ) 存在种内的异源性。r f l p 的 多态性源于d n a 的变异，数目是无限的，远比同工酶的种类多，且用于检测r f l p 的克隆探针可随意选择，因此可以产生丰富的多态性。r f l p 可以区分纯合基因和杂 合基因，结果稳定可靠，重复性好。因此，r f l p 在植物病原真菌的遗传图谱构建、 抗性基因定位与基因克隆及分类学等研究领域得到广泛应用。 1 9 8 2 年，s e h w a r t s 等建立了p f g e ( p u l s e df i e l dg e le l e e t r o p h o r e s i s ，脉冲电场凝 胶电泳，简称脉冲电泳) 技术，主要用来分离大于5 0 k b 的d n a 分子，其原理是采 用两个交变电场，交替开关，使d n a 分子在凝胶中处于有规律地变化方向的电场中， 小分子d n a 移动得快，大分子d n a 分子移动得慢，从而使d n a 分子得以分离，最 大分离能力达1 0 m b 。在分离真菌染色体d n a 分子时，可获得真菌的完整染色体d n a 数目和各完整染色体d n a 分子大小的谱带，即真菌的分子核型分析。s a h w a r t z 等在 1 9 8 4 年首次利用p f g e 技术成功分离了啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的完整 染色体d n a ，获得1 6 条染色体d n a 带，最大2 2 0 0 k b 。 a f l p 技术是1 9 9 3 年由荷兰的k e y g e n e 公司科学家z a b e a u 和v o s 创建的一种 d n a 指纹技术。b a e h e m 等于1 9 9 6 年将a f i p 技术应用于m r n a 表达差异分析，发 展了一种m r n a 指纹图谱技术，即e d n a - a f l p 技术，e d n a - a f l p 优于其它的r n a 指纹技术和以d n a 芯片为基础的方法。与差异显示方法相比，e d n a a f l p 的退火 温度相对较高，使其严谨度更高、结果可以重演，这己被r n a 凝胶分析证实( b a c h e m 等，1 9 9 6 ；b a e h e m 等，1 9 9 8 ) 。与以杂交为基础的技术( 如d n a 芯片) 相比，e d n a - a f l p 能揭示含有合适限制性酶切位点的任何基因时空表达的改变，且能区别同一个基因家 族中高度同源的基因，此外，e d n a - a f l p 技术所需仪器设备简单，相对于s a g e 和 微阵列而言，不需要任何事先已知的序列信息，可更广泛应用于生物体基因表达特性 的研究。这些优点使e d n a - a f l p 成为一种克隆新基因的良好的工具。其基本原理是： 提取样品总r n a 后，将模板m r n a 逆转录成e d n a ，两边同时利用合适的限制性内 切酶进行酶切，酶切产物同适宜的人工接头( a r t i f i c i a la d a p t e r ) 连接，然后利用与接头 互补的引物进行预扩增，在引物3 末端加2 3 个选择性碱基，即：引物= 接头序列+ 酶切位点序列+ 2 3 个随机核苷酸，以预扩增产物为模板，进行选择性扩增，最后在 测序胶上展示可获得大小在l o o l o o o b p 之间的重复性好、清晰的条带以便直观地进 行差异表达分析( b a e h e m 等，1 9 9 6 ，b a c h e m 等，1 9 9 8 ) 。a f l p 结合了r f l p 和r a p d 的特点，既具有r f l p 可靠性好、重复性高的特点，同时又具有p c r 的高效性、安 6 全性和方便性的优点，不需要了解基因组信息，且只需少量纯化的基因组d n a 即可 对整个基因组d n a 酶切片段进行选择性扩增，扩增结果产生大量的序列经电泳形成 复杂的d n a 指纹，得以反映基因组细微的变化，适合所有生物基因组的检测，因此 被认为是迄今为止最有效最理想的一种d n a 分子标记技术，已广泛应用于动植物及 微生物的遗传多样性研究、品系分析、高密度遗传图谱的构建、抗性育种、动物近交 系选育、疾病诊断、生态分析等各个方面p 9 - s 4 1 。 1 9 9 4 年，核苷酸多态性( s i n g l e n u c l e o t i d cp o l y m o r p h i s m