(作物遗传育种专业论文)用基因芯片研究诱抗剂诱导水稻耐盐性的差异基因表达谱分析.pdf_第1页
(作物遗传育种专业论文)用基因芯片研究诱抗剂诱导水稻耐盐性的差异基因表达谱分析.pdf_第2页
(作物遗传育种专业论文)用基因芯片研究诱抗剂诱导水稻耐盐性的差异基因表达谱分析.pdf_第3页
(作物遗传育种专业论文)用基因芯片研究诱抗剂诱导水稻耐盐性的差异基因表达谱分析.pdf_第4页
(作物遗传育种专业论文)用基因芯片研究诱抗剂诱导水稻耐盐性的差异基因表达谱分析.pdf_第5页
已阅读5页,还剩69页未读 继续免费阅读

(作物遗传育种专业论文)用基因芯片研究诱抗剂诱导水稻耐盐性的差异基因表达谱分析.pdf.pdf 免费下载

版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领

文档简介

用基因芯片研究诱抗剂诱导水稻耐盐性的差异基因表达谱分析中文摘要盐害严重影响水稻的产量,水稻是重要的粮食作物,因此培育耐盐水稻新品种就可以有效利用盐碱地,扩大水稻种植面积和提高产量。目前大多是通过传统的育种方法,往往受到耐逆反应遗传复杂性的制约。运用诱抗剂提高水稻耐盐性选育耐豁品种,是一种快捷有效的途径。利用分子生物学的方法从整体水平研究在盐胁迫下诱抗剂诱导水稻耐盐性的差异基因表达谱,对于全面认识水稻耐盐机理及其遗传基础,为开展分子标记、基因缺失突变体的筛选、诱导抗性基因的研究及培育诱导耐盐新品种等都具有重要意义。本研究以耐盐性低的水稻地方品种r 6 作为实验对象。以1 n a c l 胁迫为对照,诱抗剂h i 诱导处理后再经1 n a c l 胁迫3 0 h 的r 6 水稻根的总r n a ,经过荧光标记后反转录成e d n a ,与含有代表水稻功能基因的6 力点寡核苷酸序列的基因芯片杂交,通过激光共聚焦显微镜扫描后获得分子生物学信息,并进行数据分析。对于r a t i o 大于2 和小于0 5 的基因片段通过b l a s t 工具中的b l a s t n 搜索n c b i 上的n r 数据库,并对筛选出的差异表达基因进行初步的生物信息学分析,将其按照功能进行大致归类。根据同源性分析芯片上的寡核苷酸序列,结合p c r 引物设计的原则,设计相对应的特异引物对不同品种、不同单株进行了检测。杂交芯片的结果是共有5 1 7 个差异表达基因,其中7 8 个是未知基因,2 5 7 个可以找到e d n a 序列,上调表达的基因有2 1 2 个,下调表达的基因有3 0 5 个。经过生物信息学初步分析,发现上调表达基因中,与渗透调节物质合成相关基困有n 个,逆境和抗病相关基因有2 6 个,转录调控相关基因有1 7 个,信号转导相关基因有1 8 个,其他基因有1 4 0 个,其中包含3 6 个未知蛋白基因;下调表达的基因中,与逆境和抗病相关基因有9 个,转录调控相关基因有2 3 个,信号转导相关基因有3 0 个,其他基因有2 4 3 个,其中包含5 2 个未知蛋白基因。可见与各种胁迫相关的基因大多数呈现上调,这些基因大多是在生物与非生物胁迫条件下表达的,包括病原菌诱导、干旱、热、盐等,说明r 6 经过诱抗剂处理后,整体抗性得到一定的提高。根据寡核昔酸芯片分析结果设计了1 6 对特异引物对不同水稻品种及r 6 原始品种的不同单株进行检测。结果发现品种间存在一定差异,r 6 原始品种单株问存在较大差异,而经过诱抗剂处理后能在1 盐胁迫下完成整个生育期的r 6 单株后代则都能够扩增出特异条带。运用基因芯片技术,选取耐盐性低的水稻地方品种r 6 为实验材料,筛选出盐胁迫下诱抗剂诱导水稻差异表达基因片段,通过对序列结果进行生物信息学分析,初步i建立了诱抗剂诱导水稻幼苗期耐盐性差异基因的表达谱,并根据p c r 检测结果,初步构建了诱抗剂诱导水稻幼苗期耐盐性基因缺失突变体库。关键词:水稻,基因芯片,诱抗剂,耐盐性,差异基因表达谱t ia p p l i c a t i o no fg e n ec h i pt e c h n o l o g yo nt h eg e n ee x p r e s s i o np r o f i l e so fr i c es a l tt o l e r a n c ei n d u c e db ye l i c i t o ra b s t r a c tr i c ep r o d u c t i v i t yi ss e v e r e l ya f f e c t e db ys o i ls a l i n i t y , i so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tc r o pi nt h ew o r l d t h em o s te f f e c t i v ea p p r o a c ht oi m p r o v er i c es a l tt o l e r a n c ei sb r e e d i n gs a l tt o l e r a n c ev a r i e t i e s i t sh e l p f u lt ou t i l i z ee f f e c t i v e l ys a l i n i t yl a n d ,e n l a r g er i c ep l a n t i n ga r e aa n di n c r e a s er i c ey i e l d a tp r e s e n t ,m a j o r i t yu s i n gt r a d i t i o n a la p p r o a c ht ob r e e dv a r i e t i e sh a v eh a dl i m i t e ds u c c e s s - o w i n gt ot h eg e n e t i cc o m p l e x i t yo fs t r e s sr e s p o n s e s w ea d o p t e de l i c i t o ri sar e l a t i v e l yr a p i dw a yf o rb r e e d i n gs a l tt o l e r a n c ev a r i e t i e sa n de n h a n c er i c ec a p a b i l i t yo fs a l ts u e s s i th a ss i g n i f i c a n tm e a n i n gt os t u d yt h es a l t - r e s i s t a n tm e c h a n i s mf r o mt h ei n t e g r a ll e v e la n dt oi m p r o v es a l tr e s i s t a n c ei nr i c eu s i n gt h eb i o t e c h n o l o g y , a sw e l la st h ea p p l i c a t i o no fm o l e c u l a rm a r k i n gt e c h n o l o g y , g e n e r a t i o no far i c eg e n em u t a n tl i b r a r y ,s t u d yr e s i s t a n t i n d u c e dg e n ea n db r e e d i n ge l i c i t o r - i n d u c e ds a l tt o l e r a n c ev a r i e t i e s i nt h i sr e s e a r c h ,r 6 ,ar i c er e g i o n a lc u l t i v a rw i t hw e a ks a l tt o l e r a n c ew a se m p l o y e da st h ep l a nm a t e r i a l i n d u c e dr 6w i t he l i c i t o rh it h e na d d i n g1 n a c lf o r3 0 hi s o l a t et o t a lr n ac o m p a r e dt h et o t a lr n aw h i c ho n l ya d d i n g1 n a c l ,i nt h ec o u r s eo ft h er e v e r s et r a n s c r i p t i o n , t h ef l u o r e s c e n td y ew e r ei n c o r p o r a t ei n t ot h ee d n af r a g m e n t s t h ef l u o r e s c e n t l a b e l e de d n aw e r eh y b r i d i z e d 、而t ho l i g od n ac h i p sw h i c hc o n t a i nr i c es i x t yt h o u s a n df u n c t i o ng e n e s o l i g os e q u e n c e s c a n n e db yl a s e rf o c a l i z em i c r o s c o p et oo b t a i n i n gm o l e c u l a rb i o i n f o r m a t i o n ,a n da n a l y s e dt h ed a t a t h ed i s t i n g u i s hs e q u e n c er a t i ou p p e rt h a n2a n dl o w e rt h a n0 5w a ss e a r c h e d ,c o n s t r u e da n dc l a s s i f i e dt h r o u g hu s i n gt h eb l a s t ( b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht 0 0 1 ) t o o lb t l a s t no fn c b i ( n a t i o n a lc e n t e ro fb i o l o g i c a li n f o r m a t i o n ) n rd a t a b a s e o np r i n c i p l eo fp r i m e rd e s i g np c rp r i m e r sb a s e do no l i g os e q u e n c eh o m o l o g o u sc o m p a r i s o ni n t h ec h i p s d e t e c t e dd i f f e r e n tv a r i e t i e sa n di n d i v i d u a lp l a n t sb ys p e c i a lp r i m e r sd e s i g n e dr e l a t i v e l y t h er e s u l to fh y b r i d i z e dc h i p sr e v e a l e dt h a tat o t a lo f517d i f f e r e n te x p r e s s e dg e n e s ,7 8o f w h i c hw e r eu p l k l l o w ng e n e s ,2 5 7o f w h i c hc a l lf m dt h ek n o w ne d n af r a g m e n t s ,2 1 2w e r eu p r e g u l a t e dg e n e s ,3 0 5w e r ed o w n r e g u l a t e dg e n e s t h ee l e m e n t a r yb i o i n f o r m a t i o na n a l y s i sw a ss h o w nt h a ta m o n gt h eu p - g e n e s ,11o fw h i c hw e l eo s m o l y t eb i o s y n t h e s i sg e n e s ,2 6o fw h i c hw e r ee n v i r o n m e n t a ls t r e s so rd i s e a s er e s i s t a n c eg e n e s ,1 7o fw h i c hw e r ec o n t r o lo f t r a n s c r i p t i o ng e n e s ,1 8o f w h i c hw e r es i g n a l i n gc o m p o n e n t sg e n e s ,1 4 0o f1 1 1w h i c hw e r eo t h e rf u n c t i o nu n c l a s s i f yg e n e so b t a i n e d3 6u n k n o w np r o t e i ng e n e s a m o n gt h e3 0 5d o w n - g e n e s ,9o fw h i c hw e r ee n v i r o n m e n t a ls t r e s so rd i s e a s er e s i s t a n c eg e n e s ,2 3o fw h i c hw e r ec o n t r o lo ft r a n s c r i p t i o ng e n e s ,3 0o fw h i c hw e r es i g n a l i n gc o m p o n e n t sg e n e s ,2 4 3o fw h i c hw e r eo t h e rf u n c t i o nu n c l a s s i f yg e n e so b t a i n e d5 2u n k n o w np r o t e i ng e n e s i ti so b v i o u st h a tam a j o r i t yo fv a r i o u ss t r e s sr e l a t e dg e n e su p r e g u l a t e d ,m o s to ft h e mi n d u c e db ya b i o t i co rb i o l o g i cs t r e s s e si np l a n t s t h es t r e s s e si n c l u d ep a t h o g e n yi n f e c t e d ,d r o u g h t ( o rd e h y d r m i o n ) ,h e a t ,s a l ta n ds oo n ,i ti m p l i c a t e dt h a ta f t e re l i c i t o ri n d u c e d ,t h ei n t e g r a ll e v e ld e , n e eo fr 6e n h a n c e d a c c o r d i n gt ot h ea n a l y t i cr e s u l to ft h eg e n ec h i p s ,w ed e s i g n e d16 p a i r ss p e c i f i cp r i m e r st od e t e c td i f f e r e n tr i c ev a r i e t i e sa n do r i g i n a lr 6 sd i f f e r e n ti n d i v i d u a lp l a n t s t h er e s u l t sf o u n dt h a tt h e r ew e r es o m ed i s t i n c t i o n si nd i f f e r e n tr i c ev a r i e t i e s a n dt h e r ew e r er e l a t i v e l yg r e a td i s t i n c t i o ni no r i g i n a lr 6 sd i f f e r e n ti n d i v i d u a lp l a n t s b u tr 6 sd i f f e r e n ti n d i v i d u a lp l a n t sa f t e re l i c i t o ri n d u c e dw h i c hc a ng e tt h r o u g ht h ew h o l eg r o w t ha n dd e v e l o p m e n tp e r i o du n d e r1 n a c is t r e s s t h ep l a n tm a t e r i a lr 6w h i c hw e r ei n d u c e db ye l i c i t o r ,o l i g oc h i pw a sa p p l i e dt os e l e c ts a l ts t r e s sd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n es e q u e n c e s d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e sp r o f i l eb yb i o - i n f o r m a t i o na n a l y s i sw a sb u i l t a c c o r d i n gt h er e s u l t so fp c r ,g e n e r a t i o no fr i c e ss e e d l i n gs a l tt o l e r a n c em i s s i n gg e n e sm u t a n tl i b r a r yw a ss e tu p k e yw o r d s :r i c e ,g e n ec h i p ,e l i c i t o r , s a l tt o l e r a n c e ,g e n ee x p r e s s i o np r o f i l e si v英文缩写词表广东海洋大学学位论文独创性及知识产权声明本人郑重声明:所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得本校或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文成果归广东海洋大学所有。指导教师签名年z 月,1 日研究生签名:叶珥时k 年月4 t 日广东海洋大学硕士学位论文1 前言1 1 文献综述中国有盐渍化和次生盐渍化土地4 千万h i l l 2 以上,占我国耕地的1 1 0 左右,严重影响了粮食产量,成为限制农业生产的主要因素之一。水稻是重要的粮食作物,对盐胁迫中度敏感。盐害是限制水稻生产的主要非生物逆境,培育耐盐水稻新品种可以有效利用赫碱地,因此充分开发和利用这些盐碱地扩大水稻种植面积,提高水稻蕾产和总产,对于增加我国农业生产,有着重要的意义。过去通过传统的育种和遗传工程取得的成功范例有限,近1 0 年来,由于分子生物学的发展,发现了一些与涮盐相关的基因,对于这些基因的表达方式及其在耐盐反应中的作用已逐步得到了解,人们都希望可以找到台适的途径来增强水稻的耐盐能力,然而水稻的耐盐性是出多基因控制的复合性状,因而挖掘更多的水稻耐盐相关基因成为目前植物遗传资源与品种改良研究的热点。1 1 1 植物耐盐基因研究进展1 1 1 1 盐胁迫下参与渗透调节相关基因在盐渍土壤中,植物吸水困难或根本不能吸水,从而导致生理干旱,使植物受到渗透胁迫,引起细胞脱水【lj 。植物必须能够忍耐脱水才能生存,因此植物必须采取措施来使其在渗透胁迫下不发生脱水,其中最有效的就是进行渗透调节,渗透调节是指当植物体与外界环境的渗透势不平衡时,植物细胞内渗透势变化所表现出的调节作用【2 。渗透胁迫下参与渗透调节的可溶性物质基本上分为两大类:一是外界环境进人细胞内的无机离子;二是在细胞内合成的有机溶质,主要是脯氨酸、甜菜碱、糖醇类及偶极含氮类化合物包括甘露糖醇、山梨醇、海藻糖、果聚糖等小分子相溶性溶质或渗压剂起了很大作用【3 i ,它们可以降低细胞内的水势,提高作物的吸水能力,而它们本身不会对作物细胞造成伤害,是植物耐盐的重要原因h j 。1 1 1 2 脯氨酸合成酶基因王呜刚f 5 l 等的实验中,对照系脯氨酸相对含量在n a c i 为o 8 1 2 时有所增加,但在1 4 n a c i 时急剧下降,而耐盐愈伤组织相对含量则随n a c i 浓度的提高一直呈上升趋势,尤其是在1 6 n a c i 时脯氨酸含量比起始增加了3 倍多,由此可见,细胞内脯氨酸的积累能够提高植物的耐盐性1 3 】。据研究表明:在盐胁迫下,脯氨酸可以作为渗调剂、氮源、酶和细胞结构的保护剂,还能够防止质膜通透性的变化,对质膜的完整性有保护作用。植物中脯氨酸的积累是两条途径相互调控的结果,即增加脯氨酸合成酶基因( p 5 c s 和p j c 足) 的表达量,同时抑制脯氨酸降解酶的活性【6 】。高等植物中脯氨酸的合成有谷氨酸和鸟氨酸两种途径f 7 j 。1 9 9 0 年,d e l a u n e y 8 j 在大豆中发现p 5 c s 酶与渗透调节有关,而后又进一步筛选得到了a t p 5 c s 基因。v e r b r u g g e n 等1 9 9 3l用基因芯片研究诱抗剂诱导水稻耐盐性的差异基因表达谱分析年在拟南芥中筛选得到了编码p 5 c 还原酶的a t - p 5 c 1 基因,四年之后,s t r i z h o v 等又在拟南芥中发现p 5 c s 酶由两个不同的调节基因编码,并将其命名为a t p 5 c s l 和a t p 5 c s 2 。这三个基因( a t p 5 c i 、a t p 5 c s l 、a t p 5 c s 2 ) 有两种产物( p 5 c 、p 5 c a )在从谷氨酸到脯氨酸的生物合成过程中起重要作用,使拟南芥在受到盐胁迫后脯氨酸含量迅速增加。另外在水稻和豌豆中都得到了相关的p 5 c s 基因。【捌此,p 5 c s 是脯氨酸的编码基因,可以被盐胁迫、干旱胁迫和脱落酸诱导表达,是脯氨酸合成的关键酶,是一个双功能基因【lj 。1 1 1 3 甜菜碱合成的相关基因植物中常见的另一种有机渗透调节剂是甜菜碱,作为渗透物质可降低细胞水势。甜菜碱的合成途径比较简单,由胆碱经出两步氧化反应合成:胆碱一甜菜碱醛一甜菜碱,其中由胆碱单氧化物酶( c m o ) 催化的第一步氧化反应是限速步骤,甜菜碱醛脱氨酶( b a d h ) 催化第二步氧化反应。现在已证明甜菜碱合成后几乎不再被进一步代谢,属于永久性或半永久性渗透调节剂,因此甜菜碱被认为是最有希望的渗透保护剂之- - 1 1 i ,在植物抗盐、抗旱研究中已越来越受到重视。那么对两个关键的酶编码的基因( c m o ,且d d h ) 的研究也显得极其重要。现已在菠菜、甜菜、山菠菜中成功克隆出c m o 基因。c m o 是由核基因编码并定位于叶绿体基质中的一种特殊的酶,编码c m o 的基因中包含一个很大的启动子,重组实验表明c m o 是单拷贝基因。从甜菜、菠菜、山菠菜、大麦、水稻及木本植物海榄雌中克隆出b a d h 基因1 9 - - “】,b a d h 基因是目前耐盐、耐旱基因工程中研究得较深入的基因之一,是生物界广泛存在的细胞相容性物质,起着无毒渗透保护剂作用的主要次生代谢积累物之一,其积累使许多代谢过程中的重要酶类在渗透胁迫下能继续保持活性。将山菠菜甜菜碱醛脱氢酶( b a d h ) 基因经根癌土壤杆菌a g l l 介导转入豆瓣菜,膜的相对电导率测定结果说明,在盐胁迫下转基因豆瓣菜的膜结构所受损伤小于对照。转基因植株能够在0 5 n a c i 培养基上正常生长,而对照在相同的培养基上生根困难且生长缓慢。在0 8 n a c i 的培养基上,部分转基因植株虽然生长减慢,但生长状况明显优于对照,且对照植株在相同培养基上培养的叶片变黄并最终死亡i l ”。张艳敏【1 6 1 等的实验结果表明,在旱、盐胁迫条件下,转b a d h 基因小麦在种子萌发、幼苗生长、根系发育以及质膜保护等方面均比受体品种( 对照) 具有明显的优势。b a d h基因和菠菜中的c m o 基因类似,都有一个胁迫应答的顺式调节元件,其表达可能受到盐胁迫的调控。乙酰胆碱氧化酶( c o d ) 可以把乙酰胆碱一步合成甜菜碱,该酶同时具有c m o 和b a d h 两种酶滑陛能催化胆碱氧化为甜菜碱 1 7 1 ,因而日益受到人们的关注,目前,也己从水稻、拟南芥中成功克隆出c o d a 基因1 1 s , 1 9 。1 1 1 4 编码糖醇类及偶极含氮类化合物生物合成的基因肌醇甲基转移酶基因( i m t l ) 是从生长于南非沙漠中的冰叶日中花的c d n a 文库中分离得到的,该基因在盐碱或干旱胁迫下诱导表达,合成一种具有较强亲水能力的广东海洋大学硕士学位论文多羟基糖醇化合物芒柄醇1 2 0 , 2 1 。常见多元醇有甘露醇和山梨醇,分别由1 磷酸甘露醇脱氢酶基因( m t l d 基因) 编码的和6 磷酸山梨醇脱氢酶基因( g u t d 基因) 编码的。为了利用m t l d 基因和g u t d 基因,董云洲1 2 2 j 等利用已构建的3 个l m t l 基因的高效植物表达载体p d h 0 1 、p d h s 和p d h i i ,通过农杆菌介导的遗传转化法,分别得到了烟草转基因植株的后代表现出明显的耐盐能力,株高、单株鲜重、生长势等指标具有显著优势。海藻糖也是细胞渗透调节时产生的重要相溶性物质之一【2 1 1 ,高等植物一般都不能合成海藻糖,只有极少数极端耐旱的复苏植物以及能忍受完全干旱的昆虫、细菌、酵母等生物体中才发现大量的海藻糖,对生物体起着抗逆保护作用【l l 。海藻糖合成酶为一多酶体系1 2 j 是受干旱、高盐、重金属离子污染等胁迫诱导而表达的基因。海藻糖6 一磷酸合成酶基因家族( t p s ) 是从拟南芥等真核生物中分离得到的海藻糖合成酶基因,现己克隆出t p s l 基因和t p s 2 基因l ,分别控制海藻糖合成的两个关键步骤。1 1 1 5 编码与水分胁迫相关的功能蛋白的关键基因一些水孔蛋白或水孔蛋白同源物的表达就是植物适应耐盐的一种积极反应。水孑l蛋白在生物膜上的存在,不仅使水分跨膜运输成为可能,而且其更大的生物学意义还在于它能使植物快速灵敏地调节细胞内与细胞问的水分流动【2 4 1 ,这样植物体就可以通过调控水孔蛋白等膜蛋白以加强细胞与环境的信息交流和物质交换,从而达到增强抗旱、耐盐能力的目的。植物水孔蛋白根据序列同源性可以分为3 类【2 5 】:质膜内在蛋白( p i p s ) 、液泡膜内在蛋白( t i p s ) 和n l m 蛋白( n l m s ) 。第一个被鉴定的水胁迫诱导的水孔蛋白是豌豆中7a 基因m j ,根据序列特征它属于p i p l 亚族。植物缺水如干旱和高盐能诱导一些基因表达,从而对细胞结构起保护作用,l e a基因是其中之一。l e a 基因表达的产物是l e a 蛋白胚胎发生后期富集蛋白【1 2 l ( t h el a t e e m b r y c g e n i s i sa b u n d a n tp r o t e i n s ,l e a 蛋白) 是一种脱水保护剂,起分子伴娘的作用【28 1 ,保护其他蛋白和膜的结构稳定性,使细胞结构和代谢机制免受伤害。水孔蛋白通过调控像l e a 这样的逆境诱导蛋白提高细胞渗透吸水能力,l e a 蛋白f 2 “2 8 l 具有高度的亲水性,能把足够的水分捕获到细胞内以保住水分,从而在水分胁迫下保护生物大分子。另外l e a 通过与核酸结合调节细胞内其他基因的表达f 2 9 l 。目前从棉花中克隆出了有关l e a 基因1 1 个相关基因1 3 0 :从拟南芥中克隆了c o r l 5 a 和i p r a b a t i 3 ”。此外,脱水素【3 2 j 是l e a 蛋白中的一员,是r a b 和脱水素基因的产物,在植物失水时能够部分替代水分子,保持细胞液处于溶解状态,从而避免细胞结构的塌陷,稳定细胞结构和保护蛋白质的结构和功能。1 1 1 5 编码与耐盐有关的转录因子和一些信号传导因子1 1 1 5 1 与耐盐有关的转录因子由于植物的抗盐性状以及生理生化多方面的因素是一个多基因控制的极为复杂的反应过程,这些能被盐胁迫诱导的有关的基因一定是受盐胁迫产生的信号调节。盐用基因芯片研究诱抗剂诱导水稻耐盐性的差异基因表达谱分析胁迫产生的信号可能是作用于某些共同的调控因子,再由这些调控因子来控制受盐胁迫诱导的基因的表达。传递信号和调控基因表达的因子( 如b z i p 转录因子、m y c 转录因子、m y b 转录因子及d r e b 转录因子等) 。通过对拟南芥等一批受干旱诱导基因的研究,发现d r e 顺式作用元件普遍存在于干旱、高捻或低温胁追应答基因的启动子中,对在这些胁迫条件下的基因诱导表达起调控作用。分析表明,拟南芥r d 2 9 a 在低温、干旱和高盐胁迫条件下的诱导表达,是这些转录因子协调作用的结果。一个d r e b 3 3 1 转录因子可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因的表达,在提高植物对环境胁迫抗性的分子育种中,与导入或改良个别功能基因柬提高某种抗性的传统方法相比,改良或增强一个关键的转录因子,通过它促使多个功能基因发挥作用,获得综合改良效果,也许是提高植物抗逆性更为有效的方法和途径。另外还鉴定了为数不多的受n a c i 和干旱调控的、能结合在启动子元件上的转录因子,而且大多数都具有基因特异性。砧f i n l 在体外能结合在根特异的n a c i 诱导的m s p r p 2 基因的启动子区域,由于a l f i n l 的特性可能在耐盐的基因表达调控过程中发挥重要功能。王东、杨金水【3 4 1 从棉花花瓣e d n a 文库中随机挑选一个与拟南芥耐盐锌指蛋白基因同源的e d n a ( c s t z ) 含典型的植物双锌指结构区,c s t z 的表达随棉花幼苗钠盐处理浓度的升高而增强。棉花在幼苗期对盐分比较敏感而花龄期有更高水平的耐盐基因的产物。目前,耐盐锌指蛋白是首次被证明与植物耐盐性表达调控有关的转录因子。拟南芥和棉花的s t z 基因的结构和功能在进化工程中具有相当的保守性,可能直接涉及启动耐盐耙基因的表达。或者我们可以把s t z 基因通过基因工程的方法转到植物中以期得到改良了的耐盐性的植物。1 1 1 5 2 编码感应和转导胁迫信号的蛋白激酶以及在信号转导中起重要作用的蛋白酶的基因在信号传递过程中,蛋白激酶起重要作用,至今已研究的与植物干旱、高盐应答有关的植物蛋白激酶主要有:与感受发育和环境胁迫信号有感应和转导胁迫信号的蛋白激酶( m a p 激酶、c d p 激酶、受体蛋白激酶、核糖体蛋白激酶和转录调控蛋白激酶等) ;以及在信号转导中起重要作用的蛋白酶( 如磷酸醋酶、磷脂酶c 等) 1 3 5 1 。最早分离的植物蛋白激酶的基因是被干旱、低温、n a c i 、a b a 所诱导小麦p k a b a l 3 6 1 。其他编码蛋白激酶的基因还有s o s 2 ”l 、r p k l 3 8 1 等。最近在拟南芥中和烟草中发现双组分系统| 3 9 , 4 0 1 ( t w o c o m p o n e n ts y s t e m ) 基因的存在,其基因产物为“感受器”( s e n s o r )和“应调节器”( r e s p o n s er e g u l a t o r ) 合二为一的激酶蛋白。已鉴定的与盐胁迫相关的m a p k 激酶级联反应中的组分有:拟南芥a t m e k k l 、一班纪k 崩f 诬 ,2 ,a t m p k 4 ,a n p l 以及烟草p k j 、a t m p k 3 和a t m p k 6 等1 3 9 1 。1 1 1 6 编码与细胞排毒抗氧化防御能力相关的酶基因在干旱胁迫和盐胁迫下,植物组织细胞内产生过量的h 2 0 2 等活性氧( r o s ) ,为4广东海洋大学硕士学位论文了抵御这种毒害,植物细胞便启动一些活性氧清除机制。植物细胞中的超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶、抗坏血酸一谷光苷肽循环中的酶在清除细胞内过多的活性氧方面起重要作用j 。z n c us o d 是定位于叶绿体中的超氧化物歧化酶,转z n c us o d基因烟草在氧化胁迫下较对照植株光合成效率明显提高,植株对环境胁迫的抗性水平相应提高 4 1 1o a p x 是植物体内尤其是叶绿体中清除h 2 0 2 的关键酶【40 】下会提高a p x转录水平和酶活性来消除活性氧。n t g s t g p x 基因是编码具有谷光苷肽s 转移酶和谷光苷肽过氧化物酶双重活性的酶,在烟草中的过量表达该基因增强了植物的耐盐性和耐寒性m 1 。然而,各种植物抗氧化胁迫的机制不一定相同,因为在增加了氧化酶合成的同时,也会生成抗氧化物质代谢产物影响植物的证常的生长。因此在利用基因工程方法改良植物抗氧化胁迫能力时要估计其中的影响因素以免功亏一篑。1 1 1 7 讨论与展望目前耐盐基因的应用研究多集中于作物和草本植物,研究模式植物拟南芥的比较多。民以食为天,为了提高农作物耐盐能力来增加产量,我们必须扩大研究作物耐盐性。综合近来在耐盐性方面的研究来看,对转录因子的研究还是比较有发展前途的,因为极有可能找到某些因子控制着多种与耐盐相关的功能基因及其表达。令人欣喜的是,随着分子生物学的发展,使人们能够在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对盐胁迫的部分机理。经过大量研究,如今人们己在植物抗逆的形态学、生理生化、生物物理、生态及细胞遗传学方面取得了很大进展,并已克隆到来自微生物等有机体的编码生化代谢关键酶和逆境胁迫信号传导的一些重要基因。然而,涉及抗盐的基因很多,不可能全面研究清楚,以上所提到的都仅仅是其中的一部分。基因组学的出现使生物学研究进入了一个新的时期。我们可以利用基因组学的方法挖掘更多的耐盐基因,对其功能进行详细的研究,而且还有助于更全面理解植物的抗旱耐盐机理,为利用遗传工程提高植物抗盐性提供了基础,通过基因工程手段,采用重组d n a 和转基因技术向栽培植物导入抗性外源目的基因以改良植物抗旱耐盐能力。1 1 2 基因芯片基因芯片( g e n ec h i p ) 又称d n a 芯片、d n a 微阵列( d n am i c r o a r r a y ) 、寡核苷酸阵列( o l i g o n u c l e o t i d ea r r a y ) 【4 3 ,4 4 ,其将大量的基因片段有序地、高密度地排列在固相载体上,组成密集的按序排列的探针集群,通过与标记样品核酸杂交,杂交信号检测,判断靶核酸的有无或数量,是最近几年才发展起来的一种多学科交叉融合产生的高新技术产品,在生命科学诸多领域中已显示出巨大的潜力和诱人的前景1 4 5 i ,许多科学家和企业家将基因芯片同当年的p c r 相提并论,认为它将带来巨大的技术、社会和经济效益,正如电子管电路向晶体管电路和集成电路发展所经历的那样,核酸杂交技术的集成化也已经和正在使分子生物学技术发生着一场革命。1 1 ,2 1 基因芯片的原理和类型用基因芯片研究诱抗剂诱导水稻耐盐性的差异基因表达谱分析1 1 2 1 1 基因芯片的原理基因芯片常常用来检测未知分子,其原理是根据核酸分子碱基之j 、日j ( a t g c )互补配对的原理将一定规模的核酸片段( c d n a e s t 或寡聚核苷酸) 作为识别分子,按预先设置的排列固定于一种特定的固相支持载体( 纤维素、硝酸纤维素、尼龙、硅片、金片及载玻片等) 的表面,利用基因的碱基配对原理和印迹杂交技术等,先将经过生物处理获得的d n a 或r n a 经p c r 或r t - p c r 扩增并用同位素、荧光染料( 如c y 3 、c y 5 等) 等方法标记,然后与芯片探针杂交,洗涤,杂交后芯片扫描,通过配合计算机系统来高通量大规模地分析检测样品中多个基因的表达状况或者特定摹因( d n a ) 分子存在与否d 6 a 7 i 。因此,基因芯片技术是高效地获取相关生物信息的重要手段,目前主要用于基因表达谱分析、新基因发现、基因测序等方面。基因芯片技术包括四个关键的技术环节:芯片的制备、样品的制备、芯片的杂交以及芯片信号的检测以及分析 4 s , 6 6 。1 1 2 1 2 基因芯片的类型根据不同的分类方法,基因芯片的类型1 4 9 , 6 1 1 较多,主要有以下几种:( 1 ) 根据载体基质不同分为:以玻璃、硅片等无机物片基为基质的无机片基基因芯片和以凝胶、尼龙膜等有机片基为基质的有机片基基因芯片;( 2 ) 依据探针合成的顺序分为:原位合成基因芯片是通过聚乙二醇或硅烷类化学试剂在不同位点合成不同的探针,原位合成有两种途径就是光刻法和压电打印法。另外一种直接点样基因芯片则是先制备好c d n a 或寡核苷酸,然后在经特殊处理的玻片、硅片或膜上点样,比较简单;( 3 ) 依据芯片的用途不同,又可分为基因表达谱芯片、d n a 测序芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、毒理芯片等。其中基因表达谱芯片可对来源于不同的个体、组织、细胞周期、发育阶段、分化阶段、病变、刺激( 不同诱导、不同治疗阶段) 下的细胞内m r n a或反转录后产生的c d n a 进行检测,从而对这些基因表达的各种特异性进行综合分析和判断,极大加快这些基因功能的确定,同时可进一步研究基因问相互作用的关系;( 4 ) 按基因芯片组装的探针可分为:寡核苷酸芯片用于基因组学及表达谱研究,而另外一种e d n a 芯片只用于表达谱研究。1 1 2 2 基因芯片技术1 1 2 2 1 基因芯片的制备基因芯片的制备是基因芯片技术中比较重要的一个环节,芯片制备的好坏直接关系到结果的准确性与可信度。首先要根据应用芯片研究的目的选择合适的寡核苷酸、c d n a 片段或特定的功能基因,构建合适的芯片核酸点阵列。核酸点阵列的集成有两种方法t 5 0 :一是直接合成法,利用半导体激光光刻技术和照相平板印刷技术,在固相支持物表面原位合成直接合成一定长度的核苷酸,这种方法的优点是可以在多个位点同时进行合成,适于制作高密度的d n a 芯片,但是合成的寡聚核苷酸较短,而且成本高;二是点印法,将合成好的探针、c d n a 或基因组d n a 通过计算机控制的工作广东海洋大学硕士学位论文平台直接点在芯片上,使之固定在其上,这种方法的优点是各技术环节均较成熟,目灵活性大,成本较低但是耗时长。1 1 2 2 2 样品的制备在与芯片结合探针杂交之前,对待测基因必需进行分离、扩增及标记,通常采用常规的基因分离从生物细胞中提取m r n a ,反转录成e d n a l 5 i ”j 。为了获得杂交信号,在扩增过中将对照和处理的样品进行标记,标记的方法有同位素标记、生物素标记、荧光标记等,目前普遍采用的是荧光标记法,对照和处理的样品的r n a 分别加入绿色荧光色素c y 3 d u t p 和红色荧光色素c y 5 d u t p 反转录成标记e d n a 。1 1 2 2 3 基因芯片的杂交经鉴定、纯化后将对照和处理的标记e d n a 等量混合后加样于玻片用于杂交 5 8 , 6 , 7 5 1 。由于研究目的探针的类型、长度的不同,样品浓度、盐浓度、温度和时间也不同,杂交的条件以能够检测到的丰度基因为佳,而且还要保证每条探针都能与互补模板杂交。1 1 2 2 4 基因芯片信号的检测及分析当芯片杂交完毕之后,就要检测和分析芯片的信号1 5 2 , 5 7 1 。同位素标记的样品核酸经杂交后通过放射自显影显示杂交信号的强弱与分布;由于同位索标记危险系数较高,目前主要用荧光标记l 鼽“1 ,检测荧光法最常用激光共聚焦显微扫描技术对杂交结果进行扫描来检测各个样点上的杂交信号得到相关图象后,经计算机软件分析获得有关生物信息。1 1 2 3 基因芯片在作物育种上的应用和发展前景1 1 2 3 1 基因芯片在作物育种上的应用基因芯片技术主要应用在医学领域 5 4 , 5 9 , 6 5 , 6 7 】,目前,关于基因芯片技术在植物中应用的报道并不多,主要集中在拟南芥、草莓、牵牛花等方面【55 ,”j ,在作物育种方面就更加少了。农业是国民经济的重要行业,农业的发展事关系到国民经济的发展和国家安全稳定,在育种工作中,基因资源是一个很重要的方面,运用基因芯片技术在育种中具有非常大的发展潜力。1 1 2 3 2 发现新基因利用基因芯片技术发现新基因,如构建e d n a 文库,对野生型和突变体的植株进行杂交筛选,发现其差异表达序列后,从文库中找出相应的克隆,以判断它是否是新的基因。s c h e n a e t a l 6 7 1 用包含1 0 5 6 个e d n a 的芯片与热休克作用和佛波酯处理的t细胞的e d n a 杂交,发现了4 个新基因。s e k ime ta l 6 8 1 利用各种发育时期,经不同处理( 干旱、冷害及未经胁迫处理) 的拟南芥构建e d n a 文库,结果1 3 0 0 种e d n a 中有4 4 种是受干旱诱导,1 9 种受冷害诱导,其中3 0 种和1 0 种是从未报道过的胁迫诱导基因,并且1 2 种胁迫诱导基因被鉴定为受d r e b l 调控的靶基因,其中6 个是新基因。用基因芯片研究诱抗剂诱导水稻耐盐性的差异基因表达谱分析t 1 2 3 3 基因表达水平检测在基因芯片应用上,基因表达水平的分析与检测是目前研究最多、最为成熟的领域 6 9 , 7 2 , 7 3 , 7 4 1 。y u l x l 7 0 1 等利用e d n a 微阵列研究了水胁迫下发育的玉米谷粒中胚乳和胎座,花梗组织的转录分布图。n e g i s h i ”】等运用水稻的8 9 8 7 个e d n ae s t 克隆检测了大麦在缺铁胁迫下的基因表达图谱,2 0 0 个基因是缺铁胁迫下的诱导表达,其中发现约5 0 个基因在中午和晚上随麦根酸分泌的昼夜变化而变化。因此在育种中,可以利用基因芯片技术 4 8 1 ,获得农作物在不同基因型发育阶段、环境等一系列影响条件下基因表达的数据,对这些数据进行分析,将有可能从基因型与表现型的角度找出土壤肥力、种子、产量、抗逆性、抗病性、抗虫性之间的关系,为作物育种提供方便快捷的选择手段,最终有可能免除费力费时的大用试验。1 1 2 3 4 作物基因组测序基因芯片技术利用寡核苷酸探针探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

评论

0/150

提交评论