（发酵工程专业论文）海参肠中溶菌酶分离纯化的工艺研究.pdf

是否保密( 是) ，保密期至3 0 0 年牛月艿1 3 为止。 学生签名：蕉塞竖 别谧轹蹲 2 刃g 年垆月吕日 摘要 摘要 专门作用于细菌细胞壁的骨架物质一肽聚糖，广泛存 生动物、昆虫和各种微生物中。溶菌酶本身是一种蛋 、生物学中得到了广泛的应用。商品溶菌酶多由蛋清 ，限制了其应用范围，近年来国内外对多种来源的溶 洋生物溶菌酶的研究报道较少。本文对一种新型海洋 进行了研究，为海洋生物溶菌酶的进一步研究和应用 菌酶，并测定其酶学性质及抑菌作用。首先在4 c 下 将海参湿肠打浆，用t r i s h c i 缓冲液抽提得到含有溶菌酶的上清液。上清液经浊点萃取 法( c p e ) 浓缩、透析、阳离子交换柱( c m 5 2 纤维素) 层析和s e p h a d e xg 7 5 凝胶过滤层析 分步纯化，最后得到电泳纯的溶菌酶制剂。 实验结果表明，海参肠溶菌酶经c m 5 2 纤维素阳离子交换柱层析纯化效果最为明显， 纯度提高了1 1 3 倍，去除了大部分杂蛋白。经s e p h a d e xg 7 5 凝胶过滤层析柱层析纯化海 参肠溶菌酶纯度提高n 1 8 7 倍。最终溶菌酶经纯化比活达至u 3 0 2 6 1 u m g ，纯度提高了1 8 7 倍，活力回收为4 6 o 。 最后对纯化的溶菌酶性质研究表明，该酶分子量约为1 6 k d ，对溶壁微球菌的最适作 用温度为3 5 ，最适作用p h 为6 5 ，在4 5 以下和p h 4 0 - - 8 0 之间都有较好的稳定性，并 与常见金属离子和化学试剂有良好的配伍性。实验证明，与通常从蛋清中提取的溶菌酶 相比较，从海参中分离纯化的溶菌酶具有广谱杀菌功能，即对常见的革兰氏阴性菌和阳 性菌细胞壁均有溶解作用。 -关键词：海洋生物，溶菌酶，浊点萃取，分离纯化，理化性质 i a b s t r a c t 一一 a b s t r a c t l y s o z y m e ，a l s oc a l l e dc e l lw a l lh y d r o l a s e ，s p e c i a l l yf u n c t i o nt op e p t i d o g l y c a n ，c h a i n m a t e r i a lo fc e l lw a l l ，e x i s t si nm a n yt i s s u e sa n ds e c r e t i o nf o r a n i m a l ，p l a n t ，p r o t o z o a ，i n s e c ta s w e l l 勰m i c r o o r g a n i s m l y s o z y m ei sak i n do fp r o t e i n ，h a sb e e nw i d e l yu s e di n f o o d m e d i c i n ea n db i o l o g yf o ri t ss a f e t y t h ec o m m e r c i a l l y s o z y m e ，m a i n l yo b t a i n e df r o mh e ne g g w h i t e ，o n l yf u n c t i o nt og r a mp o s i t i v eb a c t e r i a ，s oi t sa p p l i e df i e l dw a sl i m i t e d i nr e c e n ty e a r s t h er e s e a r c ht ol y s o z y m ef r o mm a n ys o u r c eh a v eb e e nd o n e w i d e l y ，b u tt h er e p o r to fr e s e a r c h t ol y s o z y m ef r o mm a r i n el i f ew a sv e r yl i t t l e i nt h i s t h er e s e a r c ht o p u r i f i c a t i o na n d p h y s i c o 。c h e m i c a lp r o p e r t i e so fan e wm a r i n el i f el y s o z y m eh a db e e nd o n e ，m a d eaf o u n d a t i o n t of u r t h e rr e s e a r c ha n d a p p l i c a t i o nt om a r i n el i f el y s o z y m e a l y s o z y m ef r o mt h ei n t e s t i n eo fs e ac u c u m b e r sw a sp u r i f i e dt h r o u g ht h ec l o u dp o i n t e x t r a c t i o n ( c p e ) ，c a t i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yw i t hc m 5 2c e l l u l o s ea n dg e lf i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h yw i t hs e p h a d e xg 一7 5 t h er e s u l ts h o wt h a t ，c a t i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yw i t hc m 5 2 c e l l u l o s eh a da e v i d e n te f f e c tt op u r i f i c a t i o no fl y s o z y m e ，a n dp u r i f i c a t i o nf o l dw a s11 3 t h e p u r i f i c a t i o n f o l do fl y s o z y m et h r o u g h g e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h yw i t hs e p h a d e xg 7 5a f t e rc m 5 2w a s l8 7 f i n a l l y ，t h es p e c i f i ca c t i v i t y , p u r i f i c a t i o nf o l da n dy i e l do fl y s o z y m ew e r e 3 0 2 6 1u m g ， l8 7a n d 4 6 ，r e s p e c t i v e l y t h ef i n a le n z y m ep r e p a r a t i o nw a s n e a r l yh o m o g e n e o u si ns d s p a g ea n di t sm o l e c u l a r w e i g h tw a se s t i m a t e da sa p p r o x i m a t e l y16 k d t h eo p t i m u mp ha n dt e m p e r a t u r ea g a i n s t m i c r o c o c c u sl y s o d l e i k t i c u sw e r ep h6 5a n d3 5 c ，r e s p e c t i v e l y ，a n dt h ee n z y m ew a s s t a b l ea t t e m p e r a t u r eb e l o w4 5 。ca n dp h 4 0 8 0 t h ep u r i f i e dl y s o z y m eh a ss h o w e db r o a d s p e c t r u m a g a i n s tm a n yb a c t e r i a ，n o to n l yi n h i b i t i n gt h eg r o w t ho fg r a m p o s i t i v eb a c t e r i a ，b u ta l s oa n d g r a m - n e g a t i v eb a c t e r i aa sw e l l 鹊an u m b e ro fp a t h o g e n s k e yw o r d s ：m a rin o i if e ，l y s o z y m e olo u dp oin t e x t r a c tio n p u rific a tio n p b y s i c o c h e m i c a ip r o p e r t i o s i i 日录 目录 第一章文献综述1 1 1 溶菌酶的性质1 1 1 1 溶菌酶的分型2 1 1 1 1c 型溶菌酶3 1 1 1 2g 型溶菌酶g g oao m0 loboo 3 1 1 1 3 噬菌体溶菌酶0 00 3 1 1 1 4 植物溶菌酶4 1 1 1 5 真菌与细菌溶菌酶o mo o 4 1 1 1 6 无脊椎型溶菌酶4 1 1 2 溶菌酶的抗菌作用机制0 000m 5 1 2 溶菌酶的应用0 000 0 5 1 2 1 溶菌酶在食品中的应用5 1 2 1 1 溶菌酶在乳制品中的应用6 1 2 1 2 溶菌酶在肉制品中的应用6 1 2 1 3 溶菌酶在水果保鲜上的应用6 1 2 1 4 溶菌酶在海产品和水产品保鲜上的应用6 1 2 1 5 溶菌酶在低度酒及饮料中的应用0 00 00o qg 7 1 2 1 6 溶菌酶在降解壳聚糖上的应用7 1 2 1 7 溶菌酶在其它食品中的应用7 1 2 2 溶菌酶在生物医药上的应用7 1 2 2 1 溶菌酶在基因工程和酶工程上的应用7 1 2 2 2 溶菌酶在抗菌消炎、增强免疫力方面的应用8 1 2 2 3 溶菌酶在多种疾病诊断方面的应用8 1 2 2 4 溶菌酶在牙膏、洗手液等产品中的应用8 1 3 溶菌酶的生产现状及前景8 1 4 溶菌酶的分离纯化方法9 1 4 1 结晶法9 日录 4 2 离子交换法o 0gg ooo o o g 1 0 4 3 膜色谱技术1 0 4 4 亲和膜色谱l l 4 5 离子交换膜色谱1 1 4 6 超滤o oo ooe 000 0 1 1 4 7 反胶团萃取1 2 4 8 以亲和力为基础的生物分离技术1 2 4 8 1 固定金属亲和层析1 2 4 8 2 亲和沉淀1 3 4 8 3 亲和过滤法1 3 4 9 扩张床吸附法1 4 溶菌酶活力的测定方法o o0o oo o lo o0o oo oo oo 1 4 本文的主要研究内容1 7 第二章溶菌酶的提取o oooo0 1 8 2 1 引言1 8 2 2 材料与仪器1 8 2 2 1 材料1 8 2 2 2 仪器1 9 2 3 实验方法1 9 2 3 1 盐溶液提取1 9 2 3 2 等渗溶液提取1 9 2 3 3 有机溶剂提取2 0 2 3 4 正丁醇提取2 0 2 3 5 表面活性剂提取2 0 2 3 6 溶菌酶活性的测定2 l 2 4 结果与讨论0 ooo 2 1 2 4 1 盐溶液提取2 1 2 4 2 等渗溶液提取2 l 2 4 3 有机溶剂提取o o oio 2 1 2 4 4j 下丁醇提取2 2 2 4 5 表面活性剂提取2 3 i v 目录 结2 3 溶菌酶的分离纯化2 4 言2 4石”“z 4 料与仪器2 4 1 材料2 4 2 仪器o o to0 000008 2 5 要试剂的配制0 00000 2 5 1 抽提缓冲液的配制2 5 2 标准蛋白溶液的配制2 5 3 3 3 考马斯亮蓝g 2 5 0 的配制2 5 3 3 4s d s p a g e 试剂的配制2 6 3 4 实验方法2 6 3 4 1 粗酶的制备o oo oo 2 6 3 4 2 液体浓缩酶的制备o o oo bo 2 7 3 4 3 透耖i 2 7 3 4 3 1 透析袋的预处理2 7 3 4 3 2 透析法改变溶剂成分2 7 3 4 4c m 5 2 纤维素阳离子交换柱层析分离纯化海参肠溶菌酶2 7 3 4 4 1c m 5 2 纤维素层析柱的预处理2 7 3 4 4 2c m 5 2 纤维素柱层析纯化海参肠溶菌酶2 8 3 4 5s e p h a d e xg 7 5 凝胶过滤柱层析分离纯化海参肠溶菌酶2 8 3 4 5 1s e p h a d e xg 7 5 凝胶过滤层析柱的预处理2 8 3 4 5 2s e p h a d e xg 7 5 凝胶过滤柱层析纯化海参肠溶菌酶2 8 3 4 5 3 透析法除表面活性剂o o oo o 2 8 3 4 6 溶菌酶分子量的测定2 9 3 4 7 溶菌酶活性的测定3 0 3 4 8 蛋白含量测定3 0 3 5 结果与讨论3 l 3 5 1 液体浓缩酶的制备3 1 3 5 2c m 5 2 纤维素柱层析纯化海参肠溶菌酶3 2 3 5 3 s e p h a d e xg 7 5 凝胶过滤柱层析纯化海参肠溶菌酶3 2 v 日录 3 5 4 溶菌酶分子量测定3 4 3 6 刀、结”3 4 第四章溶菌酶的酶学性质3 6 4 1 引言0 00 0 0 0 3 6 4 2 材料与仪器3 6 4 2 1 材料3 6 4 2 2 仪器3 6 4 3 实验方法0 00 000 3 7 4 3 1 溶菌酶的最适作用p h 3 7 4 3 2 溶菌酶的最适作用温度3 7 4 3 3 溶菌酶的p h 稳定性3 7 4 3 4 溶菌酶的热稳定性3 8 4 3 5 金属离子对酶活力的影响0 0 00 008 3 8 4 3 6 酶对细菌的水解作用3 8 4 3 6 1 指示茵培养3 8 4 3 6 2 待测菌的制备3 8 4 3 6 3 抑菌活性检测一管碟法3 9 4 4 结论与讨论3 9 4 4 1 溶菌酶的最适作用p h 3 9 4 4 2 溶菌酶的最适作用温度4 0 4 4 3 溶菌酶的p h 稳定性4 l 4 4 4 溶菌酶的热稳定性o o g 00ooq 4 2 4 4 5 金属离子对酶活力的影响4 2 4 4 6 酶对细菌的水解作用4 3 4 5 ，j 、结o a oo g bo o 0 0 0 4 5 第五章结论4 6 参考文献4 8 致谢o ooooo ooo 5 4 v i 弄清了溶菌酶的立体结构【4 l 。此后人们发现溶菌酶广泛地存在于人体多种组织中，鸟类 和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁体液、木瓜、大麦、无花果和卷 心菜等植物中以及微生物中也含此酶，其中以新鲜的鸡蛋清中含量最为丰富。 然而，近年来海洋生物作为产酶资源以正成为一个新的研究热点，由于海洋的特殊 环境，使海洋生物组织中所含有的酶具有一些较之相应的陆生动植物及微生物产生的酶 更为独特的性质，如在低温条件下具有相对高的活力，最适p h 和反应温度适中，作用p h 范围宽，在碱性环境下稳定等，这些结构和功能新颖的酶类具有独特的生理、药理及生 化活性，在医药、食品、酶工业等领域中有着广阔的应用前景和开发潜力【5 1 。 1 1 溶菌酶的性质 鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。 此酶为白色、无臭结晶粉末，味甜，易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚中【6 1 。 其分子是由1 2 9 个氨基酸残基排列构成的单一肽链，有四对二硫键，分子量为1 4 3 0 0 。结 晶形状随结晶条件而异，有菱形八面体、正方形六面体及棒状结晶等。 溶菌酶是一种碱性球蛋白，由1 8 种氨基酸组成，分子中碱性氨基酸残基及芳香族氨 基酸如色氨酸残基的比例很高。其等电点为p h l 0 7 ；最适p h 为7 0 左右，最适温度为5 0 0 。 溶菌酶是一个不规则的椭圆体，用x 一射线衍射测得此酶的体积为4 5 x 3 0 x 3 0 a 7 1 。 第一章义献综述 溶菌酶的结构不很紧密，大多数极性基分布在表面，便于和溶剂小分子结合，在溶 菌酶的整个分子中有一个狭长的凹陷，最适小分子底物与酶结合时，正好与此长形凹陷 相嵌【8 j 。它的活性中心是天门冬氨酸5 2 和谷氨酸3 5 ，它属于最广泛的水解酶类，是一种 糖苷水解酶，能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖或甲壳素，其水解位点是n 一乙酰胞壁酸 ( n a m ) 的l 位碳原子和n 一乙酰葡萄糖胺( n a g ) 的4 位碳原子间的1 3 1 ，4 糖苷键，它也可 行使转葡萄糖基酶的作用。 溶菌酶是非常稳定的蛋白质，当p h 在1 2 1 1 3 范围内剧烈变化时，其结构几乎不变 一j 。遇热也很稳定，p h 4 - 7 、1 0 0 ( 2 处理1 分钟仍保持原酶活性；p h 5 5 ，5 0 加热4 小时 后，酶活不受影响。但是，在碱性条件下，溶菌酶的热稳定性较差，易变性。溶菌酶的 热变性是可逆的，不可逆变性的临界点是7 7 ，随溶剂的变化，不可逆变性临界点也变 化，当溶菌酶所处溶液p h 在l 以下时，变性临界点降低到4 3 。此酶的热变性随着有机 溶剂的增加而直线下降，在相同的溶剂浓度下，溶菌酶的热变性下降率按以下溶剂的顺 序而递增：丙酮 二甲基甲酰胺 二甲基乙酰胺 二恶烷。 溶菌酶对变性剂相对不敏剧1 0 】口比啶、十二烷基磺酸钠等对酶有抑制作用，滤纸也可 抑制酶的活性，氧化剂能使酶钝化。在6 m 盐酸胍溶液中，酶完全变性，但在1 0 m 尿素中 则不变性。 1 1 1 溶菌酶的分型 溶菌酶根据其作用的微生物不同可以分为两大类：细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁 溶菌酶。细菌细胞壁溶菌酶又细分为两种，一种是作用于1 3 1 ，4 糖苷键的细胞壁溶解酶， 另一种是作用于肽链尾端和酰胺部分的细胞壁溶解酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细 胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酣1 1j 。 按对肽聚糖作用位点的差异【l 到，可分为作用于聚糖链的n 一乙酞胞壁质酶 ( n - a c e t y l - m u r a m i d a s e ) ，作用于肽桥的内肽酶( e n d o p e p t i d a s e ) 以及作用于连接聚糖链与 肽桥间酞胺键的_ 乙酞- l - 丙氨酸酞胺酶( n a c e t y l m u r a m o y l l a l a n i n ea m i d a s e ) 。 根据氨基酸组成、酶催化活性及免疫学交叉反应【1 3 】，溶菌酶根据来源可分为六类： ( 1 ) 鸡型溶菌酶，又称c 型溶菌酶( c t y p e ) ；( 2 ) 鹅型溶菌酶，又称g 型溶菌酶( g - t y p e ) 1 1 4 】； ( 3 ) 无脊椎动物溶菌酶，又称i 型溶菌酶( i - t y p e ) 1 5 - 1 7 j ；( 4 ) 植物溶菌酶：( 5 ) 真菌与细菌溶 菌酶；( 6 ) t 4 噬菌体溶菌酶( p t y p e ) i r a l 。 动物界的溶菌酶包括f j 三种类型，其中c 型溶菌酶分布最广泛，脊椎动物与无脊椎 2 “s s 、氢键及疏水键等。3 5 位g l u l 2 1 1 和5 2 位a s p t 2 2 1 是酶的主要催化基团。最适作用 温度为5 0 ，化学性质很稳定，p h 在1 2 1 1 3 之间变化不会影响酶结构太大的改变， 遇热该酶也很稳定。p h 4 - - - ，7 的范围内，酶在1 0 0 处理l m i n 仍有近1 0 0 的活力，但 在碱性环境条件下，酶稳定性较差。卵清溶菌酶是被作为一种模式酶来进行研究的：它 是第一个进行氨基酸序列测定的蛋白劂2 3 1 ，是第一种借助x 一射线衍射确定出立体构造 的酶【2 4 l ，也是第一种搞清了立体结构与作用底物的结合形式、详细阐述作用机制的酶【2 5 1 ， 在免疫学及物理化学研究方面，卵清溶菌酶也是一种模型物质【2 6 1 。 1 1 1 2g 型溶菌酶 代表为鹅卵清溶菌酶( g o o s ee g g - w h i t el y s o z y m e ，g e w l ) ，只有鹅及黑天鹅等少数几 个种属于此类型。与c 型存在很大差异，只有胞壁质酶活性，无壳多糖酶活性，不能分 解甲壳质，不能分解细胞壁降解后的四糖产物( n a g - n a m n a g n a m ) 。g e w l 分子量 为2 0 5 0 0 1 2 7 1 ，由1 8 5 个氨基酸组成，“s s ”键和t r p 含量远小于c 型，稳定性能差，活性中 心结构与鸡及其他鸟类的完全不同，7 3 位g l u 和8 6 位a s p 可能是酶的主要催化基团【2 引。 1 1 1 3 噬菌体溶菌酶 该酶是一种特异性的酶，由噬菌体感染、诱导产生，但未被感染的宿主细胞上不存 在该酶。代表为细菌噬菌体t 4 溶菌酶( b a c t e r i o p h a g et 4l y s o z y m e ，t 4 l ) ，分子量为1 8 7 0 0 ， 由1 6 4 个氨基酸组成1 2 9 1 ，g l u 1 1 和a s p 2 0 是催化基团。噬菌体产生的能够裂解细菌细胞 的溶菌素多属于此类型，在序列上与c 型溶菌酶没有同源性，但是在主链组成上很相似 3 第一章文献综述 1 3 0 - 3 2 】，在酶学分类上，噬菌体溶菌酶多数属于胞壁质酶，少数还有酞胺酶、内酞酶、氨 基葡糖苷酶活性。与分解细菌肽聚糖的溶菌酶不同，噬菌体溶菌酶能作用于荚膜和粘液 的多糖类物质，与噬菌体感染的周期息息相关。在作用机制上，噬菌体溶菌酶也与分解 细胞壁的溶菌酶不同，它只能减少菌体的体积，而不能使菌体死绝。 1 1 1 4 植物溶菌酶 主要存在于一些植物组织中，也有在植物花，根及茎中发现的。目前，植物溶茵酶 研究人员对1 1 6 科4 1 0 种植物进行普查，发现1 6 8 种植物中含有溶菌酶。其中木瓜、芜菁、 无花果，大麦等植物中均可分离出溶菌酶，其分子量较大，约为2 4 0 0 0 - - - 2 9 0 0 0 ，其对溶 壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋白溶菌酶的1 3 ，但其对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡 蛋清溶菌酶的1 0 倍左右。 代表为从番木瓜汁提纯得到的溶菌酶，分子量为2 5 0 0 0 ，等电点为1 0 5 f 3 3 3 4 1 ，这类酶 的溶菌活性可能更多表现为几丁质酶活性而不是溶菌酶活性【3 5 】。 1 1 1 5 真菌与细菌溶菌酶 1 9 6 3 年，h a s h 发现- j c h o l a r o s i s 产生n ，o 一二乙酞胞壁质酶，能够溶解s a u r e u s 的细胞 壁，这也是目前发现的唯一一种能够产生溶菌酶的霉菌。c h l 分子量为2 2 4 1 5 ，由2 1 1 个 氨基酸组成，6 位_ a s p 和3 3 位g l u 可能参与了酶的催化过型3 6 1 。产生此类溶菌酶的生物主 要是细菌噬菌体和革兰氏阳性细菌尤其是链霉菌，研究的比较透彻的除c h l 之外，还包 括肺炎链球菌( s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e ) 的c p 噬菌体溶菌酶，乳杆菌属( l a c t o b a c i l l u s ) 的m v l ，以及球袍链霉菌( s t r e p t o m y c e sg l o b i s p o r u s ) 和丙酮丁醇梭菌( c l o s t r i d i u m a c e t o b u t y l i c u m ) 产生的溶菌酶【3 7 0 8 】等。 目前真菌与细菌溶菌酶分为7 类：( 1 ) 内n 一乙酰已糖胺酶，此酶同于鸡蛋清溶菌酶， 破坏细菌细胞壁肽聚糖中的p 1 ，4 糖苷键：( 2 ) 酰胺酶，切断细菌细胞壁肽聚糖中n a m 与肽“尾”之间的n 乙酰胞壁酸一l 一丙氨酸键：( 3 ) 内肽酶，使肽“尾”及肽“桥”内的肽键断 裂；( 4 ) 3 - l ，3 、p 1 ，6 葡聚糖酶和甘露聚糖酶，此酶分解酵母细胞的细胞壁；( 5 ) 壳多 糖酶，与葡聚糖酶共同作用，可分解霉菌和酵母；( 6 ) 磷酸甘露糖酶，与葡甘露糖酶共 同作用，可分解原生质；( 7 ) 脱乙酰壳多糖酶，主要分解毛霉和根霉。 1 1 1 6 无脊椎型溶菌酶 i 型( i - t y p e ) 溶菌酶是溶菌酶家族的一个新成员，主要从昆虫目鳞翅类【3 9 l ，海洋无脊 椎生物及海洋双壳类生物中发现，1 9 7 5 年j o l l 6 s 在海洋无脊椎动物欧洲海星a s t e r i a s 4 第一章文献综述 r u b e n s 发现了一种新型溶菌酶i 型溶菌酶【4 ，海洋贝类溶菌酶第一次被发现于1 9 7 9 年，但直至u 1 9 9 9 年才得到其氨基酸全长序列f 4 3 l 。近年来，陆续从多种海洋贝类罩发现 了溶菌酶【删，根据它们的氨基酸序列和结构特征，可以将其归为i 型溶菌酶。此后相继 有关于虾【4 5 1 、海星【4 6 1 、海胆【4 7 1 等的报道，可见i 型溶菌酶是溶菌酶在海洋无脊椎动物的 一大分支。 1 1 2 溶菌酶的抗菌作用机制 目f j 已知的几种溶菌酶有：内- n - 乙酰己糖胺酶、酰胺酶、b 1 ，3 、6 1 ，6 葡聚糖 酶和甘露聚糖酶、几丁质酶、磷酸甘露糖酶、脱乙酰壳多糖酶【4 8 】。参与细菌细胞壁溶解 作用的溶菌酶大致可分为作用于糖苷键和作用于肽和酰胺部分的两类。内一n 一乙酰己糖 胺酶、p 1 ，3 、p 1 ，6 葡聚糖酶等主要作用于糖苷键，使糖苷键断裂，破坏细胞壁的分子 结构，而酰胺酶等则主要作用于多肽，使多肽断裂。以内一n 一乙酰己糖胺酶为例，内一n 一 乙酰己糖胺酶能够催化水解细胞壁肽聚糖分子中的n 一乙酰胞壁酸( n a m ) 与n _ 乙酰葡 萄糖氨( n a g ) 之间的p 1 ，4 糖苷键，使肽聚糖分子发生断裂，使细胞壁内外两侧渗透 压失衡，造成细胞破裂，导致微生物因细胞壁溶解而被杀死【4 9 】。溶菌酶对革兰氏阳性菌 ( g + ) 细胞与革兰氏阴性菌( g 。) 的溶菌作用，由于两者细胞壁中肽聚糖含量不同而存在差 异，g + 细胞壁含8 0 肽聚糖，而g 细胞壁只有在内壁层含有少量肽聚糖，因此，溶菌 酶能有效杀死g + 菌，而对g 。细胞破坏很小。 1 2 溶菌酶的应用 溶菌酶作为一种天然蛋白质，能在胃肠内被消化和吸收，对人体无毒害作用，是一 种安全系数很高的食品保鲜剂、营养保健品和药品。由于溶菌酶具有良好的理化特性， 具有一定的保健作用，如在化妆品中用可消除粉刺，使皮肤滑嫩，促进皮肤的新陈代谢； 具有止血，促进组织再生的作用，如在牙膏中添加可防止牙龈出血、保护牙龈并具有杀 菌作用。因此溶菌酶的应用领域非常广泛，在食品、医药、生物工程等方面都具有很大 的应用前景。此外，溶菌酶除作为医药原材料外，仅在食品防腐、强化方面市场就比较 可观，如乳制品、肉制品、酒类发酵、水果防腐等方面。随着对溶菌酶的研究的深入和 应用产品的不断开发，溶菌酶一旦被人们认识接受，其对市场的占有率将大幅提高。 1 2 1 溶菌酶在食品中的应用 5 第一章文献综述 1 2 1 1 溶菌酶在乳制品中的应用 人乳与牛乳的最大差别之一在于溶菌酶的含量，溶菌酶在人乳中含量是牛乳的3 0 0 0 倍。将溶菌酶添加到牛乳及其制品中，可使牛乳人乳化【5 0 1 ；研究还表明：它还能够强化 血清灭菌蛋白、r 球蛋白等体内防御因子，以增强对感染的抵抗力；同时溶菌酶是双歧 杆菌增长因子，促进婴儿胃肠内乳酪蛋白形成微细凝乳，延长在肠道停留时间，有利于 消化吸收1 5 l l ；抑制肠道中腐败性细菌的增殖，维持肠道内菌群正常化，有防止肠炎和变 态反应的作用，对婴、幼儿的肠道菌群有平衡作用，增强婴儿对病菌的抵抗力。此外， 在奶酪产业溶菌酶也被广泛使用，如在干酪生产中替代硝酸盐，加入0 0 0 1 的溶菌酶， 可防止干酪产气，保持香味物质丁酸1 5 2 】。德国于1 9 9 5 年1 1 月2 2 只发布了奶酪法规，批准 使用溶菌酶来阻止在半硬奶酪的生产中由厌氧孢子增殖所引起的胀气现象f 5 3 1 。 1 2 1 2 溶菌酶在肉制品中的应用 低温肉制品由于口感鲜嫩，营养丰富，获得消费者的喜爱。但由于肉类冷藏的温度， 并不能彻底杀死微生物或抑制其生长，因而保鲜期短，不能满足消费者需求。溶菌酶本 身无毒、无害，可替代如苯甲酸及其钠盐等化学防腐剂添加到肉制品中，能有效延长食 品保质期。如顾仁勇掣”l 采用0 0 5 溶菌酶和0 0 5 n i s i n 混合液保鲜猪肉，4 下可保 鲜1 2 d ，真空包装保鲜期可达2 4 d 。而傅伟昌等1 5 5 】在此基础上添加了18 n a c i 和4 5 葡 萄糖组成复合保鲜剂，用于小包装分割冷却肉的保鲜，保质期明显提高。同样，曾友明 等【5 6 】将溶菌酶与n i s i n 、复合磷酸盐、茶多酚、酪朊酸钠组成复合保鲜剂与鲜肉混合， 制成盐水火腿，其保质期可达3 个月。同时，溶菌酶在红肠的加工，延长其货架期方面 的报道也非常多。总体上溶菌酶在肉制品上的保鲜作用已经得到认可，并且取得了不少 的进展，各种相关工作也在广泛展开。 1 2 1 3 溶菌酶在水果保鲜上的应用 经溶菌酶浸泡过的水果，其表面细菌被有效抑制，在防止烂果、延长水果保鲜期方 面有重要意义。如章银良等【5 7 l 研究指出，应用复合含溶菌酶0 0 7 、氯化钙o 5 、甘氨 酸1 5 t g 仞j 下的保鲜剂对草莓保鲜效果最好。又如吴晓英等【5 8 l 在溶菌酶涂膜保鲜杨梅中 研究表明，加入溶菌酶的处理组，其烂果率、失重率，分别下降了6 0 、4 5 。 1 2 1 4 溶菌酶在海产品和水产品保鲜上的应用 研究采用o 0 5 的溶菌酶、1 5 甘氨酸和3 的食盐溶液中将海产品或水产品浸渍 5 m i n ，沥干水分，常温下保存9 d 后无异味、无色泽变化。溶菌酶的使用，极大提高了 6 第一章义献综述 海产品或水产品的保鲜期，对其储存、运输等带来了很大的方便。 1 2 1 5 溶菌酶在低度酒及饮料中的应用 在低度酒中添加溶菌酶不仅对酒的风味无任何不良影响，还可防止产酸菌生长，是 低度酒良好的防腐剂。在同本清酒中大部分微生物不能生存，但有一种叫做火落菌的乳 酸菌则能生长，并引起产酸和产生臭味，以往通常加水杨酸作防腐剂，但因为水杨酸有 一定毒性，其应用受到了限制。目前，日本已成功用鸡蛋清溶菌酶代替水杨酸作防腐剂， 其加入量为1 5 m g k g t 5 9 l 。倪瑛等报道，向葡萄酒中加入一定量的溶菌酶，可以大大减少 s 0 2 的使用量，减小t s 0 2 使用过多可能对人体造成的毒害作用【6 0 】。此外，溶菌酶还可 以添加到果汁中作为防腐剂使用。此外，溶菌酶还可应用于料酒的防腐和p h 6 o 7 5 的 饮料的防腐。 1 2 1 6 溶菌酶在降解壳聚糖上的应用 天然的壳聚糖广泛存在于虾壳、蟹壳及真菌中，在医学、食品等领域具有重要的应 用价值，但由于壳聚糖分子量很大，溶解性差使它的应用受到极大限制。研究表明，低 分子量的壳聚糖不仅易吸收，而且具有更强的生物活性【6 1 】。目前，发现溶菌酶在降解天 然高分子壳聚糖有着得天独厚的优势。邓倩莹等1 6 2 1 研究报道，溶菌酶可以大大提高壳聚 糖的降解速率，无溶菌酶时，壳聚糖ll 天降解了1 9 ，而在溶菌酶的作用下，壳聚糖 1 1 天降解了4 4 。 1 2 1 7 溶菌酶在其它食品中的应用 用溶菌酶处理后的酵母，在培养过程中氮核蛋白质的释放量增加，提高了酵母蛋白 利用率。在生面条、花生酱、色拉等食品中，加入溶菌酶均可以起到良好的防腐保鲜作 用。奶油蛋糕是容易腐败变质的食品之一，在糕点中加入溶菌酶，可防止微生物的繁殖， 起到防腐作用。在应用溶菌酶作为食品防腐剂时，必需注意到酶的专一性，对于酵母、 霉菌和革兰氏阴性菌等引起的腐败变质，溶菌酶不能起到防腐作用。但溶菌酶有良好的 配伍性，可与其他添加剂( 如植酸、甘氨酸、聚合磷酸盐等) 复配使用，可大大提高其防 腐保鲜的效果。 1 2 2 溶菌酶在生物医药上的应用 1 2 2 1 溶菌酶在基因工程和酶工程上的应用 7 第一章文献综述 随着生物科学的发展，溶菌酶已成为基因工程及酶工程中必不可少的工具酶，用以 制造和提取菌体内的活性物质如核酸、酶及活性多肽等【4 9 j 利用其专一性水解细胞壁的特 点，有助于人们对细胞壁细微结构的认识，为我们深入研究细胞壁的构造打下了坚实的 基础，同时作为是一种重要的破壁酶，在原生质体的制备方面提供了新的方法，因此溶菌 酶被广泛应用于生物技术、生物工程中。 1 2 2 2 溶菌酶在抗菌消炎、增强免疫力方面的应用 溶菌酶对g + 、枯草杆菌等有很好的杀灭作用，对大肠杆菌、普通变球菌等g 。也具 有一定程度溶解。此外，溶菌酶与抗菌素合用效果更佳，因而，溶菌酶广泛应用于医药 行业，如利用溶菌酶治疗各种五官科炎症，尤其对急性炎症如急性咽炎、急性喉炎、急 性中耳炎等效果明显【6 引。 1 2 2 3 溶菌酶在多种疾病诊断方面的应用 人体组织和体液中均含有溶菌酶，它在其中的水平与机体的生理状况有关，它能反 映某些组织的病变。尿液中此酶的含量可作为肾移植排斥、肾肿瘤、各种肾病的早期诊 断【6 i l ，以及肿瘤病人由于放疗所引起的辐射病的早期诊断。烧伤病人分泌的溶菌酶比常 人多出几倍，也可在尿液中检出，有助于对手术移植排斥、烧伤严重程度的判断。测定 血清及尿中溶菌酶可用来诊断单球性白血病，1 9 7 0 年p r u z a n s k i 等首先把血清溶菌酶水 平的测定作为白血病分型的依据【6 4 1 ，提供了诊断急性白血病的新方法。测定粪便溶菌酶 对诊断溃疡性大肠炎及肝病等可提供依据。角膜结膜炎干燥引起的泪腺退化不仅导致眼 泪的减少，而且也降低了眼泪中溶菌酶的浓度；脑脊髓液中溶菌酶的增加被称为是炎症 和中枢神经系统疾病的敏感信号。 1 2 2 4 溶菌酶在牙膏、洗手液等产品中的应用 溶菌酶广泛应用于牙膏行业和漱口液的生产中，目i j i 在日本已经生产出含有溶菌酶 的漱口液和牙膏，研究表明这种产品可有效防治龋齿的发生。同时含有溶菌酶的洗手液 也开始在国内生产，如国内某公司生产的洗手液，能有效防止手部细菌的增殖。 1 3 溶菌酶的生产现状及前景 随着环境的污染同益严重，科学技术的进步和人民生活水平的提高，人们对食品和 医药的安全性要求越来越高，许多国家对某些化学防腐刺已限制使用，因此高效、安全、 8 代进入 家主要 工程研 为国家 食品应 用溶菌酶时，还应注意几个事项：首先，要充分了解食品的营养成分、p h 、食盐浓度等 影响溶菌酶效果的因素以及造成某种食品腐败的主要微生物群体，之前采取相应的预实 验确定添加一定量的溶菌酶，才能达到有效的防腐效果。其次，为了更好的发挥溶菌酶 防腐作用，可以与其它物质配比使用。如甘氨酸和溶菌酶的配比使用可取得了很好的防 腐效果。 近年来天然防腐剂越来越受到食品消费者的青睐，因此开发高效、安全、性能稳定 和经济的天然防腐剂已成为国内外一个炙手可热的研究领域，而溶菌酶优良的理化性质 恰好符合人们对食品安全性的要求，它将成为