（生物医学工程专业论文）多通道细胞芯片传感接口及其采集系统的设计.pdf

一 a b s t r a c t n o w a d a y s ，t h er e s e 矗r c hl e v e la b o u th u m a nb e i n g sn e es y s t c mh a sb e e ni h ec e l l sm o l e c u l a r l e v e l b u tt h e r ea r es t d ls o m eh i n d r a n c e s ，h o l d i n gu pt l i er e s e a r c bp r o g 化s s t h er e a s o no ft l l a t a l w a y ss h 叽l db et h eh a r d n e s so fd a t aa c q u i s i t i o n ，a n dt h ea b s e m0 fae 骶“v eh i g hs p dd a t a a c q u i s i t i o ns y s t e m m e a 廿m e t b ec e l l - b a s e db i o s e n s o r sw i t hm e aa n d 肿t om e a s u r ec e s e l e c ”i cs i g n a lh a v e b ni m p l u v e dg 佗a y s oi f 、c 咖d e v e l o pad a t a 孤c q u i s i “蚰w i i hm u l 廿曲卸n e lc e u - b a d b i o c h i pb i o s e n s o ri n t c d h c e ，w ew j l lc l e a rn 擗m 鸵岫h i n d f a n c e sm e n t i 0 e da b 0 v e t h i st h e s i sw i t hs 雌hab k 群o u n d ，f o i i o w i n gt h em o d e me k t i c s t h e o 啪e 即越a t e st h e m e t h o dt 0d e s i g nam u n k h a 蛐e lc e - b a s e d b 岫i pb i o s e n s o ri n t e r f a c ea n di t ss i 印a la c q u i s i t j o n s y s i e 1 n i sk i n do fd a t aa c q u i s i i i o nc 柚a c q u a i n tn l ec e l l s 、s i 印a ld a t a ，w h j c h 玳c i l l t i v a l e d0 n t h ec e b i o c l l i p s ，a n di tc 柚r i l n “c h 珊e l ss ”c h f o n o u s l yw i t h4s t i m u l a t i v es i g r i a lo u t p u l c h 如n e l s t h ec e 珏se l e c i “cs i g i l a li sak i n d0 fv e r yl o wa a l o gs i g i i a l ，w h o v a l u er 明g eo f a m p l i t u d ei sf m mf vt om va n di t s 缸q u e n c yi sl o w e r 山a n1 k a o r d i n gt ot l l e s es p e c i a l c h a r a c i e r i s t i c s ，o u rm u l i i - c h a n n e lc e n - b 舾e db i o c h i pb i o s e n s o fi n i e h c c 柚di t ss i g n a la c q u i s i 曲n s y s t e ms h o u l do w nn l ea b i l i t yt oi 珀n s f e rd a i ai nah i g hs p e e d ，m e m o r yd a t ai nr c a li i m ea n ds h o w d a t aw i t l ln ol o s i n g t h ed e v e l o p m e n to fas i g n a la c q u i s i t i o n f t w a r es y s t e m ，b a s e do nn lm e a 文鹏m e n ts t u d i o 妯d v i s u a ls t i l d i o6 o ，i sa n 0 i h e re m p b a o ft h i st h e s i s k e yw o r 出：m e a ；c e l lb i o c h i p ；b i o s 哪ri n t e r f a c e ；d a l aa c q u i s i 廿咖s y s i e m ； 3 第一章绪论 1 1 细胞芯片技术及其在神经系统领域研究现状概述 当；i ，人们对神经系统的研究已经进入细胞分子学领域。为深入研究神经元 突触的发育过程、外加激励对神经元突触可塑性的影响等许多神经生物学的基本 问题，也为了对损伤或退化的生物神经功能进行修复，人们需要明确生物神经 网络在外加激励模式下的响应规律峨 但是从目前神经电生理的检测技术来看，在体内同步直接地检测大量神经元 的电活动在技术上有一定的难度显微操纵器需要支撑每个吸管，由于细胞的复 杂特性，同时记录多个细胞是较困难的。由于细胞体是运动的，神经细胞不能固 定在电极周围，因此所测量的信号不能与特定神经细胞对应一致。而且许多典型 的基于在显微镜观察下用微电极进行记录细胞电生理信号的方法，由于人为的干 扰、以及测量导致的界面的损伤都限制了记录的长期进行。 为了提高长时间无损记录体外培养细胞的可能性，用微细加工技术制作的平 面微电极阵列( m e a ) 或场效应管阵列【2 1 应运而生，它能无损、同步地记录多个 可兴奋细胞或组织的动作电位的传播n 所谓微电极阵列，是一个由金属微电极 所构成的平面阵列，细胞在电极上培养。它是细胞和外围电路之间的桥梁，通过 它可将细胞的静息电位、动作电位等信号传递给外围电路。这种阵列又被称为细 胞芯片( c e l l 咱a s e d b i o c h i p ) ，当培养的细胞是神经元细胞时我们又把它称为 神经五片( n e u r o c h i p ) 。 细胞芯片利用活细胞作为研究对象或敏感元件，使之与电极或其他信号元 件组合，定性定量地检测细胞的基本功能信息和被分析物的性质。细胞传感器还 可以确定被分析物的存在与否及浓度大小。因此，可以通过测量电信号实现检测 待测物的目的。细胞芯片还可以检测细胞内部基因和蛋白质表达的变化，如在芯 片上通过培养吸收了已知c d n a 的细胞，利用生物芯片探针杂交检测原理，便可检 测激动剂或抑制剂对细胞内部基因表达的影响【引。 在神经系统研究领域，神经芯片技术是一种将神经元与场效应管技术结合起 来研究神经元电活动的新技术。该技术具有无损检测及长时程记录的优点，是研 究活体培养的神经元或神经元集群在不同外加刺激下的动力学好方法f 5 j 。神经芯 一 片其实是一种用硅微加工技术制造的微机电器件。活体的哺乳动物神经元细胞在 神经芯片上培养存活，通过外加电路的控制，人们可以方便地对活体神经元进行 检测，研究其在外加激励模式下的响应，整个研究过程具有选择性、实时性、连 续性的特点。 基于f e t 和j f e t 技术的8 8 神经芯片已成现实【6 j ，国外的研究者已成功 地将4 4 的传感器阵列应用于老鼠海马区神经细胞电活动的检测【训。这种借助 于神经芯片的可重复和精确的测量对动力学系统模型的抽象和表达具有现实意 义。 目前在嗅觉神经领域，为了更好地认识嗅觉神经系统的生理过程，已将嗅 觉系统的神经组织分离并在体外联合培养1 8 l ( ”，通过测量动作电位和实体观察， 研究发现体外培养的来自不同区域的嗅觉神经细胞建立了生理上的联系。从生理 的角度看，这种实验对研究神经细胞的功能十分有意义。 1 1 论文课题背景 本论文的课题背景是一个国家自然科学基金项目，内容是研究嗅觉系统的生 理机理和建立时空分辨的动力学模型。2 0 0 4 年度诺贝尔生理学和医学奖获奖者、 美国科学家鼬c h a r da x e i 和l _ j n d ab u c k 【l o 1 1 】的研究揭示：有气味的物质会首先与 气味受体结合，这些气味受体位于鼻上皮的气味受体细胞中。 研究表明，嗅觉神经系统和其他的感觉神经系统具有同源性和一定的相似 性，而且在脊椎动物大脑的进化过程中，嗅觉系统比其他的感觉系统进化的更快， 并为其他感觉系统的进化指明了方向。所以对于嗅觉神经系统的研究对于理解其 他感觉神经系统和脑的信息处理机制都有很重要的价值。并且对嗅觉系统工作机 理的研究，对人们进一步展开研究嗅觉的外周机制和中枢机制的研究，以及深入 的开展对大脑的研究具有重要意义。但是，应当说当前对整个神经系统领域包括 嗅觉神经领域的研究还存在着一定的瓶颈。 更加具体的说，根据目前的文献【1 2 1 ，对于嗅觉神经系统研究主要存在的问 题是：第一，由于在嗅神经电位的检测上可能因为体感电位以及其它神经电位等 干扰因素的存在而造成测量的不确定，测量精确度受限，从而给数据分析带来难 度；第二，人们对气味的时空分辨的研究还处于相对独立和片面的阶段，人们只 f 矮孰 塑坚查堂堡主兰篁堕苎 飞；纱 能定性地描述嗅上皮嗅觉感受器和嗅球在气味时空分辨中可能起到的作用。这种 能将嗅觉传感器输入与嗅球输出有机结合、能较为定量地动态地反映出气味信号 分辨的生理实验数据和理论模型都十分缺乏。第三，对气味在大脑皮层的表达目 前只处于假设和推测，这方面的实验也很少，这种对解码过程机理的种种阐述缺 乏实验数据的进一步证实。 在这些问题中，我们可以看到，用以定量研究神经细胞生理活动的实验数 据的匮乏是形成研究瓶颈的主要因素。而数据的缺稀又根源于数据采集的困难。 数据采集困难，当然有数据源本身的问题，但是更多的可能是缺少一个高效，精 准，稳定的神经信号数据采集系统。目前，在此研究领域享有盛名的是美国 c v b e r k i n e t i c s 公司和德国m u l t ic h a | l n e ls v s t e m s 公司开发的产品【1 3 】【14 1 ，这些公司 在体内和体外领域应用神经电子设备进行高速数据采集研发方面已发展成为当 今市场的主导，然而其价格相当昂贵；而目前国内用于这个领域研究的，采样速 率大于2 0 k h z c h a n n e l 、采样通道数多于3 2 通道和采样分辨率高于1 2 b i t 的高质 量的多通道高速数据采集系统却相对少见。 要设计采集系统首先必须要解决的问题就是信号调理模块，也就是上面所 提到的细胞芯片传感接口，而且还需要一个完善的上位机软件。 1 3 多通道细胞芯片传感接口设计概述 我们需要对培养在神经芯片上的多路嗅神经细胞的动作电位信号进行同步 采集，以分析动作电位在不同神经元细胞间的传递。动作电位信号是一个很快的 放电过程，又是一个很微弱的模拟信号，而且动作电位的范围变化又比较宽广， 是一个从几个uv 到几十个m v 的双极性的信号，频率范围在l kh z 以内。因此对神 经信号的采集系统必须具有多通道、高速、同步采集的能力。 神经信号采集系统要具备这样的功能，首先就必需要一个具备多通道、高速、 通道之间同步无相位延迟功能的多通道神经芯片传感接口。 这个传感接口，可以被理解为一个多通道的高级生物学信号放大器，必然要 求其具备良好的信号调理功能。和一般芯片之间的接口一样，作为一个特定的管 理协调和信息变换缓冲部件，神经芯片接口担负着在神经芯片和数据采集系统 之间的搭起信号无损高速传输桥梁的使命。 一 在设计这个接口时应该考虑以下几个问题，首先，要有足够大的输入阻抗 能够便于神经芯片各通道的信号输出；其次，在硬件设计的时候信号在信号线上 的传输时问要足够的短，以减少微弱的原始信号在信号传输过程中的损失；第三， 信号放大功能。因为在接口的输出端连接的是数据采集系统的a d 转换器，为 了提高模数转换结果的精度，要求把信号的幅度放大。根据原始信号的幅度，基 本要求接口的放大倍数能够达到1 0 0 0 倍。但是考虑到神经细胞信号幅度的量级 变化较大，接口的放大倍数要求能够可变，而且可以由数据采集系统的上位机软 件来控制，甚至可以设计成根据数据采集系统最终输出信号的质量，软件自动调 整放大倍数。这样既能够充分展示信号的细节，又不至于因为放大倍数过大而导 致信号的失真。第四，在整个接口设计的过程中，非常重要的一点，不同的信号 通道之间对于在1 0 k h z 之内的频段内不允许有较大的信号相位延迟存在。第五， 使用高速光耦进行数模隔离，使数字信号处理电路的性能增强。第六，接口要基 本硬件滤波环节，以去除混在在原始信号中的高频信号噪声。 这里简要叙述了神经芯片传感接口设计应当注意的一些问题，后面的将有 详细的论述。 1 4 数据采集系统软件设计思路概述 一个多通道高速数据采集系统应满足以下两个基本性能要求：高速性和大 容量i ”j 。一个堪称完整的数据采集设备，一个非常重要的部分是安装在上位机 的集成软件。上位机集成软件的功能是，第一，底层硬件的驱动以及人机交互的 控制命令接口。因为高速的数据传输涉及到许多上位机和下位机硬部件的精准的 协同和交互，这些都需要一整套完整设备驱动程序来完成和保证。因此硬部件的 设备驱动程序是上位机软件中十分重要的一个内容。同时，上位机软件也需要提 高使操作人员能够控制底层硬件的人机交互接口，这样设备对不同的信号，不同 环境的适应性得到了提高，操作人员就可以根据不同的实际情况来实时调整系统 的配置和参数，当然我们的系统还远远没有做的智能仪器的水平，尽量减少操作 人员的工作，提高设备的自主适应能力应该是将来仪器设计的目标。第二，一个 完整的用户操作界面，可以清晰的展示所采集数据的每个细节，提高多个信号分 析和观测工具，方便操作人员对数据采集情况的实时观察。这个应该来讲是上位 一 机集成软件的另一个十分重要的内容。根据软件工程理论，一个有价值的软件在 开始编写的第一个环节是用户需求分析，我们正是在深入的研究了一个数据采集 软件所应当具备的功能特性爿开始进入软件设计流程的。 1 - 5 论文总体框架 1 - 5 - 1 课题研究任务 为了更进一步的深化对嗅觉神经系统的研究，消除研究瓶颈和实验技术障 碍，本课题旨在结合神经芯片技术研制个配有神经芯片传感接口和完善的上位 机集成软件的高速多通道神经信号采集和处理系统。 本论文将着重论述研发流程中的四块重要的内容： 1 、对实验用微电极阵列m e 缸系列结构和类型的研究。 2 、多通道神经芯片传感接口的设计：该接口电路的功能是对微弱的神经信 号采集并进行高质量的信号调理。 3 、刺激电路设计：我们需要我们的采集系统能够具有细胞刺激器的功能。 4 、集成采集软件的设计：集成采集软件包括底层硬件驱动程序和数据显示、 存储、处理等上层软件。 在系统中，还有一块重要的内容是系统数字电路和数据传输电路的设计，将 有实验室其他研究人员详述。 1 - 5 2 论文结构 本文第一章介绍了本课题涉及领域的研究现状并解释了本课题的研究目的； 第二章对平面电极阵列细胞传感器和细胞培养的综述；第三章详细介绍了实验用 微电极阵列m e a 和m e a s 系列及其相关内容；第四章详细介绍了细胞芯片传感接 口设计原理和方法；第五章介绍了基于a c t i v e x 控件集成采集软件的设计的设计 方法；第六章是实验结果和分析部分，包括本系统的各项性能指标，使用本系统 所采集的数据等；第七章是对本课题的总结以及工作展望。 1 0 本章参考文献 吴浩扬吴裕远神经芯片技术的研究进展，生物化学和生物物理进展2 0 0 4 年第3 1 期8 9 页 【2 l a m 0 h r ，w ff i n g e l k j 鼬lw g 6 p e l ，h h 细m e r l ea n dw n i s c h p e 哟啉a n c co fa t h i n 丘l mm i c r o e l e c m ) d ea f r a yf o rm o n i t o r i n ge l e c t r o g e n i cc e l l si nv i t r o ，s e n s o r s 柚da c l u a t o r sb ： c h e m j c a l ，、，0 l u m e3 4 ，l s s u e s1 3 ，a u g u s t1 9 9 6 ，p a g e s2 6 5 2 6 9 【3 】n ac h e n ，s h u l ic h e n ，y i n g l i a n g ，u 柚dj i n h u iw a n g ，n er c f r a d o r yp e r i o d sa n dt h r e s h o l d p o i e m i a l so f q u e m j a ls p i k e sm e a s u r e db yw h o l e c e u 陀c o r d i n g ，b i 0 沁l i l i c a la n db i o p h y s i c a l r e s e a r c hc o 衄u n i c a t i o n s ，v o l u m e3 4 0 ，i s s u e1 ，3f c b m a f y2 0 0 6 ，p a g e s1 5 1 - 1 5 7 1 4 j 吴浩扬吴裕远，神经芯片技术的研究进展，生物化学和生物物理进展2 0 0 4 年第3 l 期 8 9 页 阁颜红梅，尧德中，神经芯片：从神经元到脑研究的新技术，国外医学生物医学工程分册 2 0 0 5 年8 月第2 8 卷第4 期 【6 1e f w i nn e h e r m o i e c u i a f b i o l o g ym e e i sm i c r o e l e c t r o i c s ，n a t u r eb j o t e c h n o l o gy ，2 0 0 l ， 1 9 ：1 1 4 1 1 7 7 】m i c h a e lp ， m a h e r ，j e r o m ep i n e ，j o h nw r i g h t ，t h en e u r o c h i p ：an e wm u l t i e l e c t r o d e d e v i c ef o rs ti m u l a t i n ga n dr e c o r d i n gf r o mc u l t r u e dn e u r o n s ，j o u r n a lo f n e u r o s c i e n c em e t h o d s ，1 9 9 9 ，8 7 ：4 5 5 6 嘲k t a mk 觚a k j ，础m m i k os a l o ，m a k o t o s h i w a y 蛐a g i f u n c t i o n a ls y n a p s ef o 】曲a t i o nb e 憎e e n r a to 妇c t o r yr e p l o rn e u r o n s 柚d 曲c 幻r yb l i i bn e u r o n sj nv i t r o ，n e u r o s c i 蚰c cl e t t c f s ，2 0 0 0 ， 2 8 5 ：7 6 - 7 8 p 1 v i c e n tm i t t o u x ，l 胡u 如c eo ft h e t 叫，e t t i s 蛐eu p o n 缸叨a l 叫c g i 帆他粕dg l o m e r i i l u s 蕾0 删a t i o ni nr a te x p l a tc o c u l t u m so fo 如c t o r ye p i m e l i u m 粕d 曲咖r yb 山e c r 0 l l ， 1 1 l en i n e e n t hc o 啦船o ft h ee 啪p c 卸c h e m o f c c 印i i o l lr e 玳ho r g a n i s a t i o l l 1 9 9 8 f 1 0 l m a l n i cb ，h i m j ，s a t ot ，b u c kl b ，c o m b i n a i o 栅豫唧t o rc o d e sf o ro d o 巧，c e l l ，1 9 9 9 ， 9 6 ：7 1 3 - 7 2 3 n 1 1 g b a r de n n e n 打叫ta n dd a v j d e j n f e l d ，v i e w p o i n tt r a v e l j n ge l e c t r i c a l 、v 髂i nc o n e x ： 1 n s i g l l t sf m mp h a 辩d y 棚i c sa n ds p c c u h 曲n 呻ac 咖1 p u t a i i o n a lr o l e ，n e u m n ，2 0 0 1 ，v 0 1 2 9 ： 3 3 _ _ 4 4 【1 2 j v o l k 钉b u c h 盯，m a r k u ss c h u b c f t ，d i e t c rk e m ，w i l 五d e dn i s c h ，i j g 越- a d d s ds u b - u m 1 1 一 e l c c t f o d e sf o re x l i a 玎l i l 盯r e c o r d i l l g 柚ds t i m u l a t i o n0 fe x d t a b l ec e i l s m i c r o e l e c h d n i c e n g i n e e i i n g ，2 0 0 l ，5 7 - 5 8 ：7 0 5 _ 7 1 2 1 3 i h i l p ：， w w m u l i i c b a n n e l s y s t e m s c o m m u l t i c h a 肿e l s y s t e m s c l l ，i n d e x h t n l l h l l p ：价n r w c y b e r k i n e i i c s i n c c o m c o n l e n l r e a r c b p m d u c t s d a i 船c q u i s i t i o n s y s t e m j s p 【1 5 1 丁锋侯永海_ f 建国，基丁- p c i 1 7 1 4 的高速数据采集系统方案设计微计算机信息f 测控 白动化砼0 0 5 年第2 l 卷第8 1 删，第6 0 页 第二章平面电极阵列细胞传感器原理 2 - 1 细胞传感器的研究 细胞传感器是微生物传感器的一个重要分支，它是由固定或未固定的活细胞 与电极或其他信号转换元件组合而成。微生物传感器依据微生物响应机理的不同 可分成如下两种：一种是利用微生物体内的各种酶系及代谢系统来检测相应底 物，这类统称为间接型微生物传感器：另一种是利用微生物本身能直接在电极 上反应的特性来检测某一物质量，这类称为直接型微生物传感器。前者微生物 起到了生物催化剂的作用，后者微生物与电极真正建立了电化学关系。为了同间 接法区别，我们称之为细胞传感器【l l o 细胞传感器的检测原理如下：微生物在呼吸代谢过程中可生产电子，这些 电子可直接在阳极上放电，也可通过电子传递媒介间接在电极上放电，产生可 被测量的电信号，从而实现检测微生物的目的。 在结构上，细胞是由两层脂质膜包裹着胞内的溶液组成，这层膜包含有多 种蛋白质、受体、离子通道和离子泵，用于保持胞内离子浓度和相对于胞外的胞 内电压。离子通道是活体细胞上最基本的可激活单位，胞膜上有许多种类型的离 子通道，比如n a + 通道、k + 通道等，允许不同的离子通过，且由不同机制决定其 开启。 由于药物作用或是外部加入的刺激而导致离子通道的改变，可通过观测细 胞的电信号的改变来实现对细胞活动的测量f 2 j 。同时可兴奋细胞的电生理信号与 细胞功能性信息紧密相关。可兴奋细胞，如神经细胞、肌肉细胞和内分泌细胞等、 均能产生动作电位响应外界刺激( 如光、电、药物等) 。活体细胞的电活动与器官 许多复杂的行为是息息相关的，感觉的产生，心脏的搏动，肌肉的调节等，都受 电活动的控制和调节，且与体内不同的细胞相关。 在以往对细胞的电活动的研究中，通常使用的方式是用微吸管 ( m i c r o p i p e t t e ) 电极和微丝电极( m i c r o w i r ee l e c t r o d e ) 进行测量。首先将 被测细胞培养在培养皿中并放置在显微镜下观察，然后用显微操作系统定位记录 电极，进行操作。 全鳃舱照 c 徽吸管) 胞内 ( 徽吸首) 膪外 ( 金属导线或徽嗳管) 图2 1 微电极测量细胞电位的方法 据电极的类型和被测量的方式，可采用多种不同的技术，如图2 1 。一般的， 为了直接记录跨膜电位，可将用于测量动作电位( a p ) 的胞内电极小心插入穿过 膜的微吸管，这种方法可测得约1 0 0 m v 的大信号。 上面所提到的典型方法都是基于用微电极进行记录的，记录时必须在显微镜下。 这些方式都是有损的检测方式，需要对神经元细胞进行穿刺，这是一种损伤性的 操作，不可避免地会改变细胞的电特性以及缩短细胞的寿命。人为的干扰、以及 测量导致的界面的损伤都限制了记录的长期进行。而且在受到长期测量时机械易 碎的困扰的同时，在某些情况下，插入细胞时引起的对细胞的损坏会影响胞内离 子的组成，这又反过来影响了胞内a p 的电频率f 引。另外，由于要次性地对许 多神经元同时作成功穿刺非常困难，所以也不能对整个神经元网络中的全都神 经细胞同时作测量。 为了提高长时间记录体外培养细胞的可能性，人们致力于将细胞和传感器 结合起来的方法，所以，用微细加工技术制作的平面微电极阵列( m e a ) 或场效 应管阵列1 4 l 应运而生，它能无损、同步地记录多个可兴奋细胞或组织的动作电位 的传播1 5 1 。这类传感器不仅可以研究神经元的电生理现象，也能研究细胞间的通 讯。 1 4 2 - 2 平面电极阵列细胞传感器 近年束，采用平面传感器阵列来检测细胞膜电位等各项参数的细胞传感器得 到了很大的进展，相对于以往的检测方式，具有无损，保持细胞正常生理状态等 特点，这类传感器最普遍表现形式有两种，一种采用f e t 阵列形式，另一种采用 平面金属电极阵列形式。 2 2 1 细胞f e t 的检测原理 f e t 可以放大模拟信号和数字信号，因此常用作微弱信号的检测。f e t 有栅 极( g a t e ) 、源极( s o u r c e ) 和漏极( d r a i n ) 三个端子，漏极与源极间形成电流通道 ( c h a n n e l ) ，电流通道的物理直径是固定的，但通过栅极的电压变化可以改变通 道的有效直径，也就是说，在某一给定时刻，f e t 的导电性依赖于通道的电学直 径。栅极上很小的电压变化可以引起从源极到漏极的较大的电流变化，正是这种 效应被利用来检测神经细胞的电信号 检测细胞动作电位的场效应管与普通m o s 场效应管的区别在于，没有金属 栅极，栅绝缘层直接和被测物质相接触。 s gd 芷 ，7 墨： 卜s i 图2 2 场效应管原理图 具体来说：普通m o s 场效应管的衬底材料为p 型硅，两个n 十区由扩散工艺 形成，分别称为源和漏，以s 和d 表示。在源和漏之间生长一层s i 0 ：层，在上 面蒸发一层铝层，这一金属层称为金属栅极，以g 表示。源和漏分别由金属欧姆 接触形成源极和漏极。衬底引出的电极用b 表示。 以n 沟道增强型f e t 为例，当栅压为0 时，栅氧化层下面的硅表面为p 型导 一 电，而当在栅极上加以j 下电压v 。， v t ( v ，为阈电压) 时，栅氧化层下面的硅表面 就反型，形成n 型导电层，将源区和漏区连接起来形成一个导电沟道，称为沟道， 从而使m o s f e t 进入工作状态。 检测细胞动作电位的场效应管是将普通m 0 s f e t 的金属栅去掉，将细胞直接 培养在栅极上，当细胞膜电位由于感受刺激发生变化时，这个微小的电压就会通 过细胞和绝缘层间的一薄层电解液耦合到栅极电压上，从而调制f e t 的漏源电 流，利用这个特性就能检钡4 出膜上的动作电位【4 1 。 参考地 【r a n 5 i s 幻r 图2 3f e t 电极阵列检测原理图 2 2 - 2 平面金属电极的检溯原理 已往几乎所有的系统都需要对电极表面做一定的处理来降低阻抗，这是因为 在细胞芯片输出信号的放大电路中，基于运放的标准放大电路要求电极的阻抗尽 量小于放大电路的输入阻抗，这样才能尽可能大的获得信号的能量。这种处理包 括在电极表面覆盖多孔铂和t i n 微柱等。但是这些覆盖不仅会改变电极的电气特 性，而且经过一段时间还也会降解，这些因素影响了测量的准确性和持续时间用。 然而在平面金属电极检测系统中，金电极就相当于场效应管的扩展门电极， 相对于放大电路来说，就具有非常高的输入阻抗，这样平面金属电极就可以不作 任何表面修饰了，可以直接将金属电极的输出接到放大器输入端，完全避免电极 的影响。单个的金属电极如图2 4 所示。 1 6 图2 4 单个金电极扫描电镜 平面金属电极阵列的捡测原理如图2 5 所示。将金属电极阵列直接连到f e t 的栅极上。就好像金属电极是场效应管的扩展栅极，当培养在金电极上的细胞出 现电活动时，细胞的动作电位通过导线传到j f e t 的栅极上，通过细胞的动作电 位调节j f e t 的漏源电流，再通过后面的i - v 转换电路，将电流信号转换为电压 信号，通过后面的二级放大电路进行放大，从而检测出细胞动作电位【5 ，6 j 。 2 - 3 本章小结 图2 5 金属平面电极阵列检测原理 在本章里，回顾了细胞动作电位检测方法的发展历史，并对目前应用最多的 两种方法：f e t 阵列和平面金属电极阵列的原理进行了说明。 1 7 本章参考文献 【1 1 谢平会刘鹰许春向细胞传感器，传感技术学报2 0 0 0 年9 月第3 期 【2 j r i c a r d oc a m n e d a ，a b h a yd 描n ia n ds t u a nf i r e s t e i n ，t b em o l e c u l a rt e c e p t i v em 1 1 9 co f 强 o d o r a n tr e c e p t o r ，n a t u r en e u r o s c i e n c q2 0 0 0 ，1 2 ：1 2 4 8 - 1 2 5 5 3 】b r e c k e n r i d g elj ，w i l s o nr j a ，c o n n 0 1 l yp ，c u r t i sa s g ，d o w ，j a t ， b l a c k s h a ws e a n dw i l k i 鹏o n ，c d w ，a d v a n t a g e so fu s i n gm i c r o f a b r e de x l r a c e l l u l 缸e l e c t m d e sf o ri n v i t r on e u m n a ln c o r d i n g ，j o u m a l0 fn e u r o s c i e n c er e 辩a r c h ，1 9 9 5 ，4 2 ：2 6 6 2 7 6 【4 】h e c k 蛐，s b g e b r a n d t ，m k r 蛐， e x t e n d e dg a t ee l 咖d ea m y sf o fe x t r a l i l 盯s i 舯a l r e c o r d i n g s ，s e n s o r s 卸da c t u a t o r sb ，2 0 0 0 7 0 ：1 0 1 - 1 0 7 陋】m k m u ，s i n g c b r a n d t ，d r i c h t e a o f f e n h a u 鼬6 4 c h a 衄e le x t e n d e dg a t ee l e c t r o d c a r r a y sf o re x t m c e l l u l a rs i g i l a lr e c o r d i n g ，e l e c t r o c h i n d c aa c i a ，2 0 0 3 ，4 8 ：3 3 5 5 - 3 3 6 2 1 6 l e r w i nn e h e r 。m o l e c u l a rb i o l o g ym e e t sm i c r o e l e c t r o n i c s ，n a t u r eb i o t e c h n o l o g y ，2 0 0 1 ， 1 9 ：1 1 4 一1 1 7 1 1 张贵东，基于芯片技术的嗅觉神经信号采集系统的研究 1 8 一 第三章实验用微电极阵列m e a s 系列的研究 3 - 1 利用微电极阵列的胞外记录 生物传感器是一种把生物体本身或尘物物质作为识别元件的测量系统，用来 检测与生理或生化过程相关的测量系统吐细胞传感器( b i o s e n s o r ) 与芯片 ( c c l l b 鹤e db i o c h i p ) 已成为后基因时代生物科学研究的重要工具【2 l ，它们利用生 活细胞作为研究对象或敏感元件，与传感器和芯片技术相结合，通过生物信号与 物理、电化学等其他信号的转换，实现实时、快速、微量地检测细胞的功能信息 和待测物的性质。现有的神经芯片有两种类型，一种是阵列型神经芯片；另一种 是探针型神经芯片嘲1 4 j 嘲。 微电极阵列( m 队) 是一个由金属微电极所构成的平面阵列，神经元细胞在 电极上培养它是神经元细胞和外围电路之间的桥梁通过它可将神经元的静 息电位、动作电位等信号传递给外围电路与传统的基于玻璃电极的电生理测量 技术相比，微电极阵列技术具有非损伤的特性，非常适于研究神经元细胞的自 发活动，因此已经在神经生物学领域中得到了广泛的应用【6 】。 微电极阵列( m 队) 上有许多电极( 典型的是6 0 个) 排列，可以即时进行刺 激条件下的胞外记录。细胞和组织切片直接放置在m e a 上培养。细胞培养贴附于 m e a 芯片的电极表面，神经元细胞可以通过突触连接形成网络样功能连接回路， 其电生理活性和对药物识别的能力可以保持长达1 年之久【7 】i s 】。 记录的信号通过滤波放大器放大，然后通过细胞芯片传感接口传输到数据采 集系统上。 为了使其有更广的应用范围，需要提供几种脏a 几何结构。几乎所有的可兴 奋细胞，或者能够产生电位差的细胞和组织都可以在体外用这种方法进行胞外记 录，比如，中枢或者外周神经，心肌细胞，视网膜或者肌细胞。 m e a 系统的典型应用是：离子通道筛选，药物检测，安全性药理学研究，双 脉冲易化( p p f ) ，长时程增强( l t p ) ，长时程抑制( l t d ) ，生理节律，神经再生， 微脑电图( e e g ) ，微视网膜电流图( e r g ) 等。 3 - 2m e a 设计和产品 一个标准的m e a 生物传感器有一个正方形记录区域，长从7 0 0 u m 到5 0 0 0 u m 。在 这个区域中，6 0 个电极排列成8 8 的网格，电极间距离是l o o ，2 0 0 或5 0 0 u m 。平 面t i n 电极尺寸有1 0 ，2 0 和3 0 u m ；三维p t 电极直径为4 0 u m ，底部有一个尖端。标 准m e a s 有很广泛的应用。不同的几何结构匹配不同的解剖特性。大多数m e a s 都有 基底一集成参考电极来代替浴池中的银球。所有的电极不是用来记录，就是用来 刺激吼 准备工作可以直接在记录区域上进行：骶a 可以作为培养和灌注腔。细胞 或组织可以在碓e a 上培养长达凡个星期。稳定控铝目器控制培养腔的温度。可以配 置各种培养腔，比如带有密封盖的，或者半透膜的。 对于细胞培养，为了提高细胞的黏附和生长，不得不在m e a 上涂层。根据 细胞培养的特性，涂层方法是不同的。 市场上的多通道系统提供m e a s 具有最高的空问分辨率。高密度m e a s 电极直 径只有1 0 u m ，电极问中心到中心距离只有3 0 u m 。制作这么小的电极，同时还要 使阻抗和噪声级别下降就需要引入一种新的电极材料：钛氮( t i n ) 化合物。 t h en m ii nr e u t l i n g e n ，德国( w w w n m i c o m ) 用纯的高质量和生物兼容性 材料制作m e a s 。 在过去几年，质量控制和生产过程的提高，使得m e a s 具有相容性特性。 3 - 3 电极，轨道和绝缘 一 t n 材料的微皱褶结构导致其有很大的表面面积，因此其形成的电极具有很 好的信噪比，而不需要牺牲空间分辨率。 t i n 是十分稳定的材料，其广泛地用来覆盖厚重装茕。所有t i n 电极的m e a s 都有很长的使用寿命，如果小心使用的话。可以多次重复使用。如果作为急性切 片使用，m e a s 大概可以使用一年。细胞培养的长期实验和刚硬的清洗方法会缩 短m e a 寿命，但是你仍然可以重复使用m e a 大概3 0 次，取决与涂层，细胞培 养和清洗过程。所有的m e a s ( 除了f i e x m e a i s 和3 一dm e a 5 ) 都具有很好的温 度兼容性，在o 到1 2 5 范围是稳定的，也就是说它们可以被高压灭菌的。 平板、圆形钛氮( t i n ) 化合物电极的阻抗范围在2 0 4 0 0 k q ，取决于直径。 电极越小，阻抗越大。一方面，阻抗越低似乎越好，另一方面，电极和电极间距 离越小，空间分辨率越高。 m u l l ic h a 衄e ls y s t e m s 提供的m e a s 电极大小有1 0 ，2 0 ，3 0 i i m ，所有的都 有很好的性能和低噪声。3 0 u m 和l o i i m 电极的平均噪声峰峰值分别低于1 0 u v 和 1 5 u v 。 p t 电极( 3 dm e a s ) 也具有很好的噪声水平，但是电极比较大，空间分辨 率比较低。它们使用在比较强调好的表面面积，而不是好的空间分辨率的实验中。 金电极( e c 0 m e a s ) 只应用在低空间分辨率，而且花费是有限的实验中，用来 进行等通量新药筛选。 所有的平板1 1 n 电极都放置在直径4 0 u m 的圆盘上。3 dm e a s 中重要的尖 端电极的基底为4 0 啪。如果你想要用光学显微镜检查这些电极，那么你还需要 一个垂直显微镜从上来观察m e a 。如果使用倒置显微镜，那么你只能从下面观 察衬底，而不是电极本身。 电极植入到载体材料中，通常是玻璃。由钛或d 制作的标准轨道对于氮 化硅( p e v c d ) 是电隔离的。接触衬底的材料和轨道是一样的( 除了3 d m 队s ) 。 1 1 0 接触衬底和轨道是透明的，在显微镜下有更好的视觉效果。 3 4 电极类型和布局 各种不同的m e a 生物传感器适用于所有的在细胞外进行的多通道记录。 经典的用于体外操作对m e a s 是由种植在一块透明玻璃板上8 8 的网格中的 6 0 个微电极组成的。可以直接在弛a 上进行组织培养。 2 1 不同的m e a 类型在培养和记录区域的材料和几何结构是不同的也就是说电 极的大小和电极问的距离是不同的。利用电极大小和电极f b j 距离来给6 l 【队s 进行 分类：第一个数字指的是电极问的距离( 比如，1 0 0 u 1 t 1 ) ，第二个数字指的是电极 大小( 比如，l o u m ) ，也就是标准类型为1 0 0 1 0 。 标准的m e a s 在8 8 的网格上带有扁圆的t 州电极。 高密度m e a s ，具有很高的空间分辨率，5 6 个电极每个都有双倍记录区 域。 h e x a m e a s ：特有的六角形分布，十分适用于在视网膜中进行数据收集。 t h j n m e a s ：电极厚度只有1 8 0 啪，用来产生高解析度的图像。 3 一d m e a s ：用于急性切片的理想方法，因为3 d 形状的p t 电极可以刺穿死 细胞层，或者为了应用，其需要高电极表明区域。 新型的便宜的e c o m 队s 适用于只需要低空间解析度的操作。( 如细胞培养， 大的切片) 。 f 1 e 蝴e a s ：由柔韧的聚酰亚胺物质作的电极，尤其适用子体内操作，也用 于一些有特殊要求的体外操作。 3 4 _ 1 标准淝a s 标准m e a s 类型有：1 0 0 1 0 ，2 0 0 1 0 ，2 0 0 1 0i 。r ，2 0 0 3 0 ，2 0 0 3 0i r ， 5 0 0 1 0 ，5 0 0 1 0i r 。 标准m e a s 在8 x 8 格布局中有6 0 个电极，电极直径1 0 p m 或者3 0 u m ，电极 距离为3 0 p m ，l o o n m ，2 0 0 hm ，5 0 0 u m 。 版本2 0 0 1 0 ，2 0 0 3 0 ，5 0 0 1 0 和5 0 0 3 0 内部有