（生物化学与分子生物学专业论文）糖化酶生产菌次要水解酶的研究.pdf

摘要 摘要 糖化酶是目前重要的工业酶制剂之一，广泛应用于淀粉加工业和发酵工业中。然而， 在目前的糖化酶制剂生产过程中常会伴随有一种水解酶副产物a 葡萄糖苷酶的生成， 它可以从低聚糖类底物的非还原末端切开甜1 ，4 糖苷键，释放出葡萄糖或将游离出的葡 萄糖残基转移到另一糖类底物形成q 1 ，6 糖苷键，得到非发酵性寡聚糖。洳葡萄糖苷酶 的存在影响了糖化酶制剂的质量和纯度，给工业生产带来不便，因此它越来越受到研究 者的重视。 c i c i mf 0 4 1 0 是生产糖化酶的工业菌株，本文考察了该菌株产洳葡萄糖苷酶的变化 进程与酶学性质，发现该菌株在发酵周期9 6h 时的a 葡萄糖苷酶产量最高；该酶的最 适p h 值5 0 ，最适反应温度5 5 ，o 5m m 的m 9 2 + 对该酶活有较显著的激活作用，并 对其热稳定性有一定的保护作用。 对菌株的培养基和发酵条件进行了优化，在保证糖化酶产量的前提下，最大限度的 降低泓葡萄糖苷酶的活力。最佳发酵培养基组成( g l ) ：葡萄糖1 0 9 ，豆饼粉2 5 ( 添加终 浓度0 0 1m 的n h a c l ) ，玉米浆3 1 。摇瓶发酵最佳培养条件：培养基初始p h 值5 5 ， 种子培养9 6h ，接种量9 ，旋转式摇床3 4 培养，摇床转速2 2 0r m i n ，发酵周期为 1 4 4h 。通过发酵条件的优化，每1 0 0 0 u 糖化酶中俚葡萄糖苷酶的含量降低了5 3 1 6 。 利用p c r 方法扩增到大小为3 1 2 4b p 的a 葡萄糖苷酶基因，其中编码序列长度为 2 9 7 3b p ，含有三段内含子，推衍得到该段序列编码9 9 0 个氨基酸残基，其中包括一条含 有5 7 个氨基酸残基的信号肽，与g e n b a n k 上公布的黑曲霉c b s 5 1 3 8 8 的d 葡萄糖苷酶基 因相似性达到9 9 9 4 。构建了用于敲除该基因片段的重组质粒p m d l 9 a g l u ：g 4 1 8 ，。为 下一步在基因水平上改造菌株奠定了基础。 关键词：黑曲霉，舡葡萄糖苷酶，发酵，优化，酶学性质，基因克隆 a b s t r a c t a b s t r a c t g l u c o a m y l a s ei so n eo ft h ei m p o r t a n ti n d u s t r i a le n z y m e s i th a sb e e nw i d e l ya p p l i e di n f e r m e n t a t i o ni n d u s t r yt h a tn e e dg l y c o s y l a t e ds t a r c h 嬲ar a wm a t e r i a l h o w e v e r , w h e n m i c r o o r g a n i s mp r o d u c e sg l u c o a m y l a s e ，ak i n do fh y d r o l a s c - - - i x g l u c o s i d a s ei sp r o d u c e d 雒a b y - p r o d u c t , w h i c hw o u l dd e c r e a s eg l u c o a m y l a s ee f f i c i e n c y i nf e r m e n t a t i o np r o c e s s t h e 0 【一g l u c o s i d a s ec a l lc a t a l y z eg u l c o s ef r o mt h en o n - r e d u c i n ge n d so fo l i g o s a c c h a r i d e so rt r a n s f e r t h eg l u c o s er e s i d u et oa n o t h e rc a r b o h y d r a t es u b s t r a t et of o r mi x - 1 ，6g l y c o s i d i cb o n d sw h i c h b e l o n g st ot h eo l i g o s a c c h a r i d e so fn o n f e r m e n t a t i o n t h e r e f o r e ，t h ea g l u c o s i d a s ei sp a i d m o r ea t t e n t i o nb ym a n yr e s e a r c h e r s c i c i mf 0 410i sa ni n d u s t r i a lp r o d u c e ro fg l u c o a m y l a s e t h et i m ec o u r s eo ft h ee n z y m e p r o d u c t i o na n dt h ep r o p e r t i e sw e r ei n v e s t i g a t e di nt h i ss t u d y t h em a x i m u mg l u c o s i d a s e a c t i v i t yw a so b t a i n e di n9 6h o ft h ef e r m e n t a t i o n ，a t5 5 a n dp h5 0 f u r t h e r m o r e ，0 5m m m 9 2 + p r o m o t e dt h ee n z y m ea c t i v i t ya n d i n c r e a s e dt h eh e a ts t a b i l i t yo fg l u c o s i d a s e t h eo p t i m i z a t i o no fm e d i u ma n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rf 0 410w a sc o n d u c t e d w e 仃i e dt od e c r e a s et h er e l a t i v ea - g l u c o s i d a s ea c t i v i t yp e r10 0 0ug l u c o a m y l a s ea sm u c ha l sp o s s i b l eg e t t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nm e d i u m ( l ) ：g l u c o s e10 9 ，s o y b e a np o w d e r2 5 ( a d daf i n a l c o n c e n t r a t i o no f0 01mo fn h 4 c 1 ) ，c o r ns t e e pl i q u o r31 ；t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s w e r e5 0m lb r o t hw i t hi n i t i a lp h5 5i n2 5 0m lf l a s k , i n o c u l a t e d9 6ha t3 4 o nr o t a r y s h a k e r , t h er o t a t i o n a ls p e e dw a s2 2 0r r a i n , i n o c u l u mc o n c e n t r a t i o nw a s9 ，f e r m e n t a t i o n p e r i o dw a s14 4h u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n ，t h ec o n t e n to f - g l u c o s i d a s ep e r10 0 0 u g l u c o a m y l a s ed e c r e a s e dt o5 1 3 6 a31 2 4b pn u c l e i ca c i df r a g m e n tc o n t a i n i n g0 【- g l u c o s i d a s eg e n ew a sa m p l i f i e db yp c r t h ec o d i n gs e q u e n c e sw e r e2 9 7 3b p ，c o n t a i n i n gt h r e ei n t r o n s t h ed e d u c e dp r o t e i nw a s9 9 0 a m i n oa c i d sc o n t a i n i n gas i g n a lp e p t i d ec o n s i s t i n go f5 7a m i n oa c i dr e s i d u e s s e q u e n c e a l i g n m e n t 、忻mt h ea g l u c o s i d a s es e q u e n c eo fa n o t h e ra n i g e r ( g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e r x p _ 0 0 14 0 2 0 5 3 ) s h o w e dt h a tt h et w on u c l e o t i d es e q u e n c e s s i m i l a r i t yr e a c h e dt o9 9 9 4 m e a n w h i l e ，ar e c o m b i n a n tp l a s m i dp m d l 9 一a g i u ：g 4 18w a sc o n s t r u c t e dw h i c hw o u l db e u s e dt ok n o c k o u tt h ea g l u c o s i d a s eg e n ei n t h ef u r t h e rs t u d y k e yw o r d s a s p e r g i l l u sn i g e r , f e r m e n t a t i o n , o p t i m i z a t i o n , e n z y m ep r o p e r t y , g e n ec l o n i n g 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 压3 亟 日 期： 2 量：! 兰：兰2 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，- j - 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并耳本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名： 2 氢鱼 导师签名： 日 期： _ 仉 也。疳 。l 、 丫 第一章绪论 1 1 糖化酶的概况及工业应用 第一章绪论 糖化酶，全名葡萄糖淀粉酶( g l u c o a m y l a s ee c 3 2 1 3 ) ，又名淀粉葡萄糖苷酶 ( a m y l o g l u c o s i d a s e ) 或y 淀粉酶( y a m y l a s e ) ，因发酵工业中大量用作淀粉糖化剂，习 惯上称为糖化酶。它可以作用于淀粉、糊精或糖原等碳水化合物的非还原性末端从而释 放p d 葡萄糖。糖化酶底物专一性较低，它除了能从非还原性末端断裂0 【1 ，4 糖苷键外， 也能水解0 【1 ，6 糖苷键和洳1 ，3 糖苷键【i 】，但是相对水解速度较慢，水解q 1 ，6 糖苷键的比速 率仅为水解c 【1 ，4 糖苷键的0 2 。糖化酶是水解淀粉产生葡萄糖的主要酶类，因此被广泛 地应用于食品、医药、发酵等工业，具有很高的商业价值【2 j 。 糖化酶在工业生产中的应用非常广泛。糖化酶制剂代替自制麸曲用于酒精工业是我 国酒精生产的一大进步，它简化了生产工艺，减少了厂房和设备的投资，实现了分工协 作的新格局。高转化率糖化酶用于酒精生产时作为糖化剂，对提高原料出酒率【3 j 、减少 糖化剂用量、降低生产成本具有重要的意义。 利用糖化酶、淀粉酶等酶制剂催化水解淀粉能够避免无机酸水解淀粉糖苷键的随机 性，从而控制糖浆产品的糖分组成。在酸法工艺中酸把淀粉原料中的蛋白质、脂肪等物 质水解成小分子，发生分解和复合反应，产生色素、脂肪皂【4 】等杂质；而用酶法生产可 以提高产品纯度，克服酸水解时对生产设备的腐蚀。 ， 干啤酒是比较流行的啤酒品种，其特点就是发酵度高，一般在7 2 以上，而一般啤 酒只有6 0 左右。啤酒口味纯正淡爽，色泽浅，苦味清，残糖量和热值都很低，要获得 如此高的发酵度，必须将麦芽中残存的淀粉和糊精降解。由于大麦中有4 5 - - 5 0 的支 链淀粉，有较多的q 1 ，6 糖苷键，因此在麦汁生产和干啤酒的酿造过程中一般添加糖化 酶、普鲁兰酶等解支酶，可以有效的提高麦汁中可发酵性糖的含量。 我国传统白酒的生产大多使用淀粉质原料，以曲为糖化剂，采用固态发酵法，成本 高、出酒率低。根据理论分析，高粱出酒率可达5 5 左右，而实际上随着制曲温度的提 高，出酒率只有2 0 一- 4 0 左右，且白酒生产用曲中的微生物是依靠自然界带入的，未 经筛选，其糖化力较低，耐酸耐热性都较差。糖化酶作用的p h 范围为3 o 5 5 ，最适 作用范围为4 0 4 5 ，这使得白酒酿造过程中酸度不断增加，适宜发酵。糖化酶的应用 使粮醅入酵后发酵升温快，升温幅度大，提高原料的出酒率，缩短发酵周期，降低生产 成本。味精工业是以粮食、淀粉为原料的发酵工业，原料( 玉米、淀粉) 经淘洗加水打 浆，首先利用淀粉酶、糖化酶将其转化为低分子量糖类作为培养基注入菌种发酵生成谷 氨酸i 经等电点谷氨酸结晶，离心过滤提取谷氨酸，精制产出味精。 在食用醋生产中，应用耐高温甜淀粉酶及糖化酣5 】可以解决企业自制酒母质量不稳 定和夏季高温等生产难题，使食用醋生产正常进行。同时可以降低原材料的消耗，减轻 工人的劳动强度，显著提高淀粉利用率和出醋率，获得较好的经济效益。 江南大学硕士论文 1 2 国内外对于提高糖化酶活力的研究 几十年来我国科研工作者为提高糖化酶的活力进行了不懈的努力，常规的物理及化 学诱变的方法依然是方便有效的途径。谷海先等【6 】对黑曲霉a n 1 4 9 菌进行自然分离、 紫外线和n t g 的复合诱变处理，得到了一株高产糖化酶的菌株w g 9 3 ，经3 0l 发酵罐 试验，酶活力达2 9k u m l ( 原糖化酶生产发酵水平为1 2k u m l ) 。此外为了寻找既经济 有效、又能充分发挥糖化酶菌种生产能力的发酵工艺，研究者也做了大量探索工作。有 研究发现用农副作物制出的培养基可以提高糖化酶产量。许艳萍等采用黑曲霉变异株进 行了用玉米粉、高粱粉、土豆淀粉、甘薯淀粉、糊精、蔗糖、麦芽糖和葡萄糖作碳源的 和用豆饼粉、蛋白胨、酵母膏等不同氮源的比较实验，发现以玉米粉为碳源，以豆饼粉 为有机氮源最，以硝酸铵为无机氮源最佳，最高摇瓶酶活可达1 0 3 5 3u m l ，应用于1 5m 3 发酵罐酶活可达8 7 9 2u m l 。有报道【_ 7 】指出，在黑曲霉培养基中添加少量聚乙烯醇衍生 物可防止菌丝体结球而提高酶产量，添加脂肪酸或其酯类、氨基酸类、微量钼盐等对提 高酶活力均有明显的促进效果。 常规的物理和化学选育方法尽管有一定成效，但周期长、且突变范围有限，难以大 幅度提高酶的活力。d n a 重组技术发展以来，分子生物学手段被广泛应用于构建基因 工程菌株提高糖化酶活力。近年来，国内外已经多次将a n i g e ，糖化酶、a s h i r o s a m i i 糖化酶和r h i z o p u s 糖化酶基因引入到酵母【8 】中，并得到成功表达。本实验室姚婷婷曾通 过增加黑曲霉c i c i mf 0 4 1 0 中糖化酶基因g l a a 的拷贝数实现了提高糖化酶活力的目的， 重组子经摇瓶发酵，活力比出发菌株提高了至少1 7 5 n 。s w i f t t l o j 对携带有2 0 个糖化 酶基因拷贝的重组菌a n i g e ，b 1 进行了糖化酶发酵研究，大幅度地提高了糖化酶产率。 r y s z k a t l l j 对整合了多拷贝糖化酶基因的重组菌进行过糖化酶发酵研究。对于液态发酵， 重组菌a a w a m o r i a 色2 2 和a n i g e r a n 2 0 的糖化酶活力是出发菌株的两倍；对于固态 发酵，重组菌a a w a m o r ia a 1 4 的糖化酶活力比出发菌株提高了8 5 。 1 3 国产糖化酶制剂中存在的问题 我国的糖化酶制剂经过数年的发展，在酶活力方面已经接近世界先进水平，但与国 际酶制剂大公司如n o v o 等相比，存在着糖化酶中a 葡萄糖苷酶活性普遍较高的严重 问题。c 【葡萄糖苷酶( a g l u c o s i d a s e ，e c 3 2 1 2 0 ) 又叫0 【葡萄糖苷水解酶或葡萄糖基转移酶 ( g t a s e ) ，是一种0 【d 葡萄糖苷酶【1 2 】，它可以从低聚糖类底物的非还原末端切开a 1 ，4 糖 苷键，释放出葡萄糖，或将游离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形成静1 ，6 糖苷键， 从而形成非发酵性的异麦芽糖、异麦芽三糖、潘糖、异麦芽四糖、异麦芽五糖等低聚异 麦芽糖( d 以o ) 或糖酯、糖肽【1 3 】。因此它成为国产糖化酶的杂质成分。尤其是在葡萄糖 生产行业，使用含o r , 葡萄糖苷酶的糖化酶制剂会降低原料的利用率、产品的纯度和产率， 同时低聚异麦芽糖的存在会有碍于葡萄糖的结晶。所以降低糖化酶中q 葡萄糖苷酶的活 性在葡萄糖生产中显得尤为重要。 2 第一章绪论 1 4a 葡萄糖苷酶的分布及组分多型性 a 一葡萄糖苷酶在自然界中分布广泛、种类繁多、性质各异，几乎存在于所有生物体 中1 1 4 】。l u c i a 1 5 】等根据a 葡萄糖苷酶氨基酸序列的保守性，将a 葡萄糖苷酶分为两大类： q 葡萄糖苷酶i 和i i ，分别为碳水化合物水解酶家族的g h l 3 和g h 3 1 的成员，其来源 物种如图1 1 。a 葡萄糖苷酶i 偏好于水解异源底物如：a 葡萄糖苷、蔗糖、麦芽糖等， 主要分布于细菌和昆虫之中；a 葡萄糖苷酶偏好于水解同源底物，如寡聚麦芽糖和淀 粉。该酶主要分布于动物、植物和真菌中。 图1 1 口葡萄糖苷酶i 和的来源物种 f i g 1 - la - g l u c o s i d a s ei nd i f f e r e n ts p e c i e s 1 5a 葡萄糖苷酶的特性 1 5 1 相对分子质量 洳葡萄糖苷酶的相对分子质量一般在4 0k d a - - 一1 5 0k d a 之间【1 6 1 。不同来源、即使同 一菌种的不同菌株或同一生物组织中的a 葡萄糖苷酶其相对分子质量差异也很大。例 如，研究发现日本天野株氏会保藏的一株黑曲霉所产a 一葡萄糖苷酶( t r a n s g l u c o s i d a s el a m a n o ，以下简称t g l a ) 的相对分子量为1 2 5k d a 1 7 1 ，而藤野井聪【l s 】等从中国华南地区 的粉葛根中分离出的一株丝状真菌所产0 【葡萄糖苷酶，其相对分子质量经凝胶色谱法测 定为5 7k d a ，十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶法( s d s p a g e ) 测定为6 0k d a 。 1 5 2 。热稳定性及p h 稳定性 a 葡萄糖苷酶的等电点大多在酸性范围内，并且变化不大。一般在3 0 - - - 5 0 之间， 但有的最适p h 值可超过7 o 且酸碱耐受性强。例如r a d i v o 1 9 】发现，从面包酵母中提取 的0 一葡萄糖苷酶的p h 值适应范围在1 5 - 1 0 之间，黑曲霉a 葡萄糖苷酶的最适p h 则 在3 5 5 5 之间。大多数a 葡萄糖苷酶的p h 稳定范围超过2 个p h 单位。 多数泓葡萄糖苷酶具有较高的热稳定性。例如，藤野井聪1 1 8 】等提取的真菌小葡萄 江南大学硕士论文 糖苷酶最适温度为5 0 。p i l l e r 2 0 1 等从一株嗜热性古细菌中分离出的1 2 葡萄糖苷酶最适 温度在7 5 左右，在缓冲液中9 8 下半衰期达3 5r a i n ；若添加1 - - 硫苏糖醇和1 牛血清白蛋白，其半衰期可提高2 1 5m i l l ，而采用特殊的化学修饰和固定化技术可使其 稳定性提高到1 3 0 。另据报道【2 l j 从硫磺矿硫化叶菌( 锄珈肠6 埘s o l f a t a r i c u s ) 分离出的 1 2 葡萄糖苷酶的最适温度为8 5 ；从嗜热芽孢杆菌中分离出的a 一葡萄糖苷酶最适温度 高达9 5 。毕金峰【2 2 】从株曲霉菌株中分离得到的0 【葡萄糖苷酶最适温度为5 5 ， 该酶在3 5 - - 一4 5 之间也具有较高的活性。a 一葡萄糖苷酶的热稳定性可能与其氨基酸组 成有关，并随着酶分子中疏水氨基酸成分的增加而提高。 表1 1 不同来源的c c 葡萄糖苷酶的生化性质 t a b l e1 - 1t h eb i o c h e m i c a lp r o p e r t i e so fa g l u c o s i d a s ei nd i f f e r e n ts p e c i e s 1 5 3 底物专一性 a 葡萄糖苷酶对底物要求不甚严格，具有广泛的底物专一性 2 6 - 1 。它可以切开糖类 底物伐1 ，4 糖苷键，个别种类的伐葡萄糖苷酶也可以作用于蔗糖的旺1 ，2 糖苷键。例如， t g l a 可作用于麦芽二八糖、苯基a 麦芽糖苷、a 葡萄糖苷、海藻糖、黑曲糖、环状 糊精、可溶性淀粉及直链淀粉等；蜜蜂a 葡萄糖苷酶i i 可作用于麦芽二七糖、海藻 糖、曲霉糖、异麦芽糖、蔗糖、松二糖、苯基a 一葡萄糖苷、对硝基q 葡萄糖苷、环状 糊精、可溶性淀粉等，其最适作用底物为苯基a 葡萄糖苷和对硝基0 【- 葡萄糖苷【2 7 1 。 a 葡萄糖苷酶底物专一性的差异取决于活性中心结合部位的氨基酸构成。中山亨【1 6 】 等对b a c i l l u ss p s a m1 6 0 6 1 2 葡萄糖苷酶底物的专一性进行了探讨。为了研究哪些关键 氨基酸残基决定了该酶与底物结合的能力，对s a m1 6 0 6 a 葡萄糖苷酶的5 个氨基酸残 基进行了定向诱变，结果表明，所有诱变株对麦芽糖、异麦芽糖和蔗糖的k m 值无显著 变化，而含有g l y z 7 3 p r o 残基的诱变株对海藻糖的k m 值有明显增加，这说明对海藻糖 的亲和性主要由g l y 2 7 3 p r o 残基控制，而进一步的研究表明皿l r 3 4 2 a s n 残基可提高其控制 效果。 4 第一章绪论 1 6 仅一葡萄糖苷酶的分子结构及催化机制 1 6 1 基本结构 a 葡萄糖苷酶是糖苷水解酶( g l y c o s i d eh y d r o l a s e ) 的种，一般糖苷水解酶由催化 域、连接域及结合域组成【2 8 1 。作为g h 3 1 家族的a 葡萄糖苷酶由n 端结构域、结构域 a 、c 一端结构域和结构域d 组成。n 端结构域是由1 1 条反平行链和几个长环组成，它 与催化域密切相关，有大约1 0 0 个氨基酸残基。目前n 端结构域的功能还不完全清楚， 其高度保守的氨基酸残基可能参与底物转移性结合或者维持活性位点的基本结构。结构 域a 为催化域，该域有一特殊的结构环，与n 端和c 端结构域紧密相连，而在该区域 的螺旋环b 1 上的p h e 3 2 7 直接影响催化中心与底物的结合。c 端结构域相对于n 端结构 域高度保守，该域有8 个反平行d 链折叠，起到保护和维持催化域功能稳定性的作用。 结构域d 是由1 1 个反平行链折叠、每个折叠由5 、6 股链组成，该域在植物来源的仅一 葡萄糖苷酶中起到增强结合域与生淀粉结合力的作用1 2 9 。 1 6 2 催化机制 在糖类底物的水解和转苷反应中，糖基的异头碳和糖苷氧原子之间发生糖苷键的裂 解，糖基残基在转移反应中被来自受体的质子取代，而在水解反应中被水分子的质子取 代1 3 0 j ，在水解反应和转苷反应中都发生了糖基和质子问的交换。以麦芽糖为底物合成低 聚异麦芽糖的动力学反应过程依赖于葡萄糖酶中间体，当水是亲核物质时，该酶充当 水解酶的作用；当麦芽糖是亲核物质时，该酶就执行转苷功能【3 。当低聚异麦芽糖达到 相对高的浓度时，又会被该酶水解。寡聚糖产量依赖于两个参数：麦芽糖的浓度和该酶 的转苷作用与水解反应的比速率。 a 葡萄糖苷酶的催化反应属于氧碳正离子催化机制，由2 步组成：第一步为塑性阶 段，在此阶段中0 【葡萄糖苷酶的活性中心可根据不同类型的底物而相应发生一定程度的 结构变化，从而使旺葡萄糖苷酶可以与多种糖类底物结合，这一步决定了g 葡萄糖苷酶 具有广泛的底物专性；第二步是立体结构保持阶段，这取决于酶分子的结构，酶分子 的结构决定了水分子或其他受体接近或定向于酶反应中心的位型3 2 l 。在这一催化机制 中，过渡态结构的离去基团彻底质子化，并且无论底物的初始异头碳构型如何( a 型或b 型) ，酶分子稳定化的氧碳正离子中间体的立体构型不变，即反应的立体结构由酶分子 的结构控制而与底物构型无关。甜菜种子和未发芽的稻谷种子的0 【葡萄糖苷酶以及结晶 态黑曲霉0 【葡萄糖苷酶可催化p 吡喃葡萄糖基氟生成仅葡萄糖苷的反应为这一机制提 供了证据。i g a k i 掣3 3 】对黑曲霉a 葡萄糖苷酶、甜菜0 【葡萄糖苷酶和蜜蜂u 葡萄糖苷酶 的反应动力学研究也证明了a 葡萄糖苷酶催化水解糖苷键的反应中氧碳正离子中间体 的存在。 毕金掣3 4 j 等在研究中发现：该酶在反应中先水解一部分麦芽糖生成葡萄糖，再将葡 萄糖通过0 【1 ，6 糖苷键转移到麦芽糖分子上，生成潘糖；随着反应时间的延长，该酶随 5 江南大学硕士论文 后水解麦芽糖分子和潘糖分子上的a 1 ，4 糖苷键生成葡萄糖和异麦芽糖；当葡萄糖以 0 【1 ，6 糖苷键转移到其它异麦芽糖分子上时，形成异麦芽三糖等。因此，可以通过控制 反应时间来达到提高产物中低聚异麦芽糖含量的目的【3 5 1 。 n u l n 2 j0 h 气h 气略赢t 肿毛。一?獬。鹣珊h。o厂choo h o ho h o h h”h u ，a 气j f l 、 。 忡h 受体 o h ! ! o l l o i t o h 图1 - 2a 一葡萄糖苷酶的反应机制 f i g 1 2t h er e a c t i o nm e c h a n i s mo fa - g l u c o s i d a s e 1 7 伍葡萄糖苷酶在分子生物学水平上的研究 近年来，一些研究者在研究0 【一葡萄糖苷酶空间构型的同时，也在致力于从分子水平 上探究不同来源0 【葡萄糖苷酶的基因组成。例如d e n n i s 3 6 j 克隆了牛的酸性a 葡萄糖苷 酶基因，发现其编码区由2 8 1 4 个核苷酸组成，编码9 3 7 个氨基酸，与人类的仅一葡萄糖 苷酶基因序列有8 6 的同源性。 h r g e n h o l t z l 3 7 】等从硫磺矿硫化叶菌( 勋物，d 6 埘s o t f a t a r i c u s ) 中克隆出热稳定性高的a 葡萄糖苷酶的基因，并在乳酸乳球菌中得到表达，以期获得利于乳酸工业生产的新性状。 t a n a k a 3 8 j 等人从m o r t i e r e l l aa l l i a c e a 中克隆出0 【葡萄糖苷酶的c d n a ，推衍出该酶 是由一条1 0 5 3 个氨基酸残基组成的多肽链，分子量大小为1 1 7k d a , 通过对推衍得到的 氨基酸序列和纯化后测序后得到的氨基酸序列进行比对后发现，未成熟蛋白在后加工过 程中有三个位点被剪切、拼接，最终形成由两个亚基组成的成熟肽。在酵母中获得表达 的重组酶表现出水解麦芽糖和可溶性淀粉的活性，该酶由胞内酶和胞外酶两种形式存 在。a 葡萄糖苷酶基因的酵母表达系统提供了一种通过底物专一性来探究0 【葡萄糖苷酶 多肽加工过程与其结构功能关系的新方法。 l e e 3 9 】等从黑曲霉工业菌株a s p e r g i l l u sn i g e rg n 3 中，克隆出0 【葡萄糖苷酶基因， 通过构建质粒载体重新转入到该工业菌株中，得到了a 葡萄糖苷酶产量提高的转化子。 n a k a r n u r a 4 0 1 等从黑曲霉中克隆出a 葡萄糖苷酶基因序列，转入到构巢曲霉中也得到了 表达，通过优化培养基的碳源对该酶活性的变化趋势进行了探讨。 t o s h i t a k a l 4 1 】曾通过敲除米根霉凹印p 唧刀淞o r z a e ) 的0 【葡萄糖苷酶基因的启动子，来 研究该元件与0 【葡萄糖苷酶分泌之间存在的关系。研究发现，该基因的启动子具有真核 生物基因启动子中常见的t a t a 盒，该元件的丢失将导致菌株产a 葡萄糖苷酶活力的明 显下降。 6 第一章绪论 刘军 4 2 1 等成功地构建了含有嗜热栖热菌( t h e r m u s t h e r mo p h i l u s ) a 一葡萄糖苷酶基因 h b g 的表达载体，并转化入大肠杆菌e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 中得到表达，通过研究该酶的酶 学性质发现，重组酶的最适反应温度为9 5 ，此研究为今后通过构建基因工程菌生产 a 葡萄糖苷酶奠定了基础。 于岚【4 3 】通过克隆黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) m 1 中0 【一葡萄糖苷酶的e d n a 、构建表达 载体，在大肠杆菌中实现了该基因的高表达。 1 8 本文立题意义与背景 a n g e rc i c i mf 0 4 1 0 是中国高校工业微生物资源与信息保藏中心保藏的是一株糖 化酶生产菌，本实验室曾对该菌的原生质体制备、再生及转化条件进行了探讨，研究了 菌龄、酶系统、渗透压稳定剂、酶解时间对菌株a n i g e rf 0 4 1 0 原生质体形成与再生的 影响，还建立了原生质体介导的黑曲霉转化系统j 。 本实验室克隆了a n i g e rf 0 4 1 0 糖化酶基因州，构建重组质粒p b c - h y g r o - g l a a 。 利用建立的原生质体转化方法将该重组质粒转入到a n g e ，f 0 4 1 0 中，得到了携多拷贝 g l a a 基因的重组子，使糖化酶活力与出发菌株相比至少提高了1 7 5 t 8 1 。同时，本实验 室还克隆了a n i g e rf 0 4 1 0 中糖化酶基因的启动子，构建了重组质粒p r s p 蒯k m 尺，在 大肠杆菌中也对该启动子的功能进行了鉴定。 但是，该菌株在发酵过程中也存在次要水解酶飞葡萄糖苷酶，该酶的存在将导致 糖化酶制剂纯度的下降，降低糖化酶在工业生产中的利用率，无形之中给工业生产提高 了成本。本课题研究了a n i g e rf 0 4 1 0 中伍葡萄糖苷酶的产酶进程及酶学性质，以期从 后提取工艺寻求解决途径；通过发酵优化寻求一种良好的发酵模式：即在保证和进一步 提高糖化酶产量的基础上，最大限度地降低q 葡萄糖苷酶的产酶水平。同时从基因水平 入手，通过克隆该菌株中0 【葡萄糖苷酶的基因序列、构建用于敲除该基因的重组质粒， 为今后从基因水平上改良该菌株，彻底消除菌株发酵中残留的a 葡萄糖苷酶奠定了基 础。 课题研究的主要内容包括： 1 c i c i mf 0 4 10 中a 葡萄糖苷酶的产酶进程以及酶学性质研究。 2 对c i c i mf 0 4 1 0 进行摇瓶发酵条件优化试验，利用响应面分析法优化培养基以及 培养条件，以达到提高糖化酶产量的同时，降低仅葡萄糖苷酶活力的目的。 3 a 葡萄糖苷酶基因的克隆、序列比对及基因敲除质粒的构建。 7 江南大学硕士论文 第二章仅葡萄糖苷酶的产酶进程及酶学性质研究 2 1 引言 0 【葡萄糖苷酶作为糖化酶生产菌中次要水解酶，普遍存在于糖化酶制剂中，由于其 特殊的转苷作用，可将游离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物上形成a 一1 ，6 糖苷键， 生成非发酵性的异麦芽糖、异麦芽三糖、潘糖、异麦芽四糖、异麦芽五糖等低聚异麦芽 糖( i m o ) 或糖酯、糖肽，影响了发酵过程中菌体对原料的利用。同时在产糖工业中添 加入含大量0 【葡萄糖苷酶的糖化酶制剂，会降低葡萄糖的产量和纯度、同时还会给葡萄 糖的结晶带来一定困难，影响了糖化酶在工业生产上的应用因此，研究c i c i mf 0 4 1 0 菌株产葡萄糖苷酶的变化趋势，有利于了解该菌株的产酶规律；掌握0 【葡萄糖苷酶的 生理生化性质，可以从后提取工艺寻求降低0 【葡萄糖苷酶产酶水平的途径；同时也可以 为下一步的发酵优化、降低发酵过程中a 葡萄糖苷酶的产酶水平提供必要依据。 2 2 材料与方法 2 2 1 菌株扣培养基 糖化酶生产菌c i c i mf 0 4 1 0 ，由江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心 ( h t t p ：c i c i m c u j i a n g n a n e d u c n ) 保藏，是经过多次物理和化学诱变获得的一株糖化酶生产 菌株。 t z 培养基( g l ) - 牛肉膏3 ，蛋白胨1 0 ，酵母提取物2 ，n a c l2 ，淀粉2 0 ，琼脂1 7 ， p h5 8 。 c d 固体培养基( g l ) ：改良过的查氏培养基，琼脂粉1 5 ，p h5 8 。 c d 液体培养基( l ) ：改良过的查氏培养基，p h5 8 ，用于种子的培养。 发酵培养基：( g l ) 葡萄糖8 0 ，豆饼粉1 5 ，玉米浆1 5 ，p h5 5 。 培养条件：该菌株的种子液制备及摇瓶发酵均在3 4 、2 2 0r m i n 发酵6 天。 2 2 2 主要试剂、缓冲液 a 甲基葡萄糖苷( 0 【m g ) 为f l u k a 公司产品，h p l c 纯度 9 9 7 ；血糖试剂盒为河北 保定临床试剂有限公司产品；离心超滤浓缩纯化柱为美国密里博公司产品。缓冲液p h 3 5 - 7 0 ，h a c n a a c 缓冲液；p h7 5 8 5 ，n a e h p 0 4 一k h 2 p 0 4 缓冲液；p h9 0 ，g i y - n a o h 缓冲液。 2 2 3 粗酶液的制备 发酵液定时取样，离心取上清，将上清液装入离心超滤浓缩纯化柱，10 0 0 0r m i n 离 心1 0m i n ，除净发酵液中残留的葡萄糖，进行后续酶学性质研究工作。 2 2 4 生物量的确定 取发酵摇瓶培养物5m l ，无菌水洗涤3 次，1 0 0 烘箱烘干至恒重，天平称重。以 8 第二章* 葡萄糖苷酶的产酶进程及酶学性质研究 未接种的培养液为空白对照。 2 2 5 主要仪器设备 紫外分光光度仪( u n ：c o 公司产品，型号u v 2 1 0 0 ) 电子分析天平( 瑞士梅特勒托利多公司) 台式高速离心机( 美国s i g m a 公司，型号1 1 5 ) s p x 2 5 0 型生化培养箱( 上海跃进医疗器械厂) 超净工作台( 苏净集团安泰公司) 2 2 6 糖化酶酶活测定方法 ( 1 ) 糖化酶酶活的测定【4 5 4 6 】：按q b 7 4 6 8 0 标准，原轻工部部颁标准测定( 稍变动) 。 ( 2 ) 酶活定义：1m l 酶液于4 0 、p h4 6 的条件下，1h 分解可溶性淀粉产生lm g 葡萄 糖，即为一个酶活力单位，以u m l 表示。 ( 3 ) 试剂及其配制 o 0 5m o l l 乙酸一乙酸钠缓冲液( p n4 6 ) - 取6 7g 三水乙酸钠溶于水中，加冰 乙酸2 6m l ，用水定容至1 0 0 0m l ，用冰乙酸调p h 至4 5 。 底物：取2 og 可溶性淀粉加热溶于7 0m l 热水中，用水定容至1 0 0m l 。 2 0 0g l 氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠2 0g ，用水溶解并定容至1 0 0m l 。 ( 4 ) 测定方法 发酵液离心取上清，用0 0 5m o l l 乙酸缓冲液稀释适当倍数供测定用。在甲、乙两 支离心管中，分别加入2 可溶性淀粉溶液1m l 及乙酸缓冲液0 2m l ，摇匀后，于4 0 恒温水浴中预热5m i n ，在甲管中加入待测酶液8 0 此，立刻摇匀，在此温度下准确反应 2m i n ，立即加入o 5m 氢氧化钠溶液8 此，摇匀，将两管取出迅速冷却，并于乙管中 补加待测酶液8 0 此，在上述条件下生成的葡萄糖的量用生物传感仪测定，甲管和乙管 测得的数据分别计为a 、b 。 ( 5 ) 标准曲线的绘制 将己知活性单位的液体糖化酶用p h 为4 6 的乙酸钠缓冲液分别稀释到1 0 0u m l ， 2 0 0u m l ，3 0 0u m l ，4 0 0u m l 和5 0 0u m l ，依上述方法反应，用生物传感器分别测 定反应管及空白管葡萄糖含量，计为a 、b 。作出糖化酶活力与葡萄糖含量( a b ) 的关系 曲线，即标准曲线如图2 1 。 9 江南大学硕士论文 6 0 0 5 0 0 34 0 0 目 鑫3 0 0 髓 蠢2 0 0 1 0 0 o 02 04 06 08 01 0 01 2 0 葡萄糖含量( r a g m e ) 图2 1 糖化酶活力和葡萄糖含量的关系 f i g 2 - 1r e l a t i o n s h i pb e t w e e ng l u c o a m y l a s ea c t i v i t ya n dg l u c o s ec o n t e n t 由图可得线性回归方程y = 5 31 9 1 ( a - b ) - 4 2 2 3 1 ( 6 ) 计算方法 x = n 【5 3 1 9 1 ( a - b ) - 4 2 2 3 1 】 式中：x 一样品的酶活力，u m l ； n 一稀释倍数； a 一样品反应测得的葡萄糖的量，m g m l , b 一空白反应测得的葡萄糖的量，m g m l 。 2 2 7 伍葡萄糖苷酶酶活测定方法 ( 1 ) 葡萄糖氧化酶法1 4 7 j 0 t 葡萄糖苷酶的活性是以q 甲基葡萄糖苷为底物进行测定的。0 t 葡萄糖苷酶催化0 c 甲基葡萄糖苷为a - d 一葡萄糖和甲醇，然后用含有葡萄糖氧化酶( g o d ) 和过氧化氢酶( p o d ) 的酶酚混合液来测定所形成的葡萄糖的量( 在波长5 0 5n l n 处测定醌蓝的吸光度，计算葡 萄糖的含量。 甲基仅d 葡萄糖苷 竺：望望鲨! 堕 d 葡萄糖+ 甲醇 d 葡萄糖堕望堕璺些堕 - 葡萄糖酸+ h 2 0 2 h 2 0 2 + 4 氨基氨替吡啉垫复垡堕- 醌蓝 ( 2 ) 标准曲线的绘制 图2 2 酶活测定原理 f i g 2 2t h em e c h a n i s mo fo t - g l u c o s i d a s er e a c t i o n 1 0 第二章甜葡萄糖苷酶的产酶进程及酶学性质研究 取无水葡萄糖1 0 5 烘干至恒重，称取2 5m g 定容至2 5m l ，即为lm g m l 的葡萄 糖标准液。取6 个试管，用微量取样器分别加入0 此、1 0 此、2 0 此、4 0 此、6 0 此和 8 0 此的葡萄糖标准液，补蒸馏水至o 1m l ，则各管的葡萄糖含量分别为01 t g 、1 0l x g 、 2 0 岭、4 0 鹇、6 0 肛g 和8 0 嵋。以上每管分别加入3m l 的酶酚试剂，4 0 保温2 0m i n 后冷却至室温，以7 2 2 型分光光度计在波长为5 0 5n l n 比色，以不含葡萄糖的反应液调 零，葡萄糖含量“g 为横坐标、吸光值( a s o s ) 为纵坐标绘制标准曲线。 表2 - 1 葡萄糖氧化酶法标准曲线的绘制 t a b l e2 - 1p r e p a r a t i o no fg o ds t a n d a r dc u r v e 葡萄话( p 专) 图2 - 3 葡萄糖含量与吸光值的关系 f i g 2 3t h er e l a t i o n s h i po fg l u c o s ec o n t e n ta n da b s o r p t i o n ( 3 ) 计算方法： y = 7 ( a 1 a o ) g n 式中： a 1 a 广分别为样品和空白吸光值 g 一常数8 3 3 ，即每l 吸光度相当于葡萄糖微克数 7 l 反应总体积