（农产品加工及贮藏工程专业论文）微生物法制备富含游离型大豆异黄酮发酵豆乳的研究.pdf

摘要 摘要 大豆异黄酮是一种有丰富生理功能的营养保健因子，用途极为广泛。大豆异黄酮类物质 作为大豆的生物活性成分，其药理保健功能和l 临床治疗作用正逐渐被人们所认识和关注。本 实验通过筛选出一株发酵效果最好的乳酸菌来制备游离型大豆异黄酮，并对其发酵条件和提 取工艺条件进行优化，最后研制一种富含黄豆苷元和染料木黄酮的发酵豆乳。目前，国内外 关于把糖苷型大豆异黄酮水解为游离型大豆异黄酮的方法很多，概括起来主要有酸水解法、 碱水解法、s m i t h 降解、酶法水解、微生物法水解等，但从食品安全性的角度考虑还是采取 微生物法制备游离型大豆异黄酮更为合适。 在对乳酸菌培养条件的研究中，以发酵后豆乳中黄豆苷元和染料木黄酮的浓度为指标， 综合考察了各种培养条件对产游离型大豆异黄酮的影响，确定了发酵温度、发酵时间和接菌 量各因素对制备游离型大豆异黄酮效果的影响。并通过二次旋转正交实验，优选出制备游离 型大豆异黄酮工艺的最佳方案。发酵温度4 1 、发酵时间2 8 h 、接菌量4 ，在此条件下游 离型大豆异黄酮含量为：1 2 7 4 3 9 9 m l 1 。 在对大豆异黄酮提取过程的研究中，重点考察了乙醇浓度、提取温度、提取时间对大豆 异黄酮提取效果的影响。以黄豆苷元在水解液中的浓度作为指标，通过正交实验优选出超声 波辅助水解大豆异黄酮的工艺参数，确定出最佳提取工艺参数为：水解温度为6 0 ，水解时 间为4 5 m i n ，乙醇浓度为9 0 。在此条件下游离型大豆异黄酮含量为：1 3 4 4 1 9 9 m l 。 在制作富含游离型大豆异黄酮的发酵豆乳过程中，评价了蔗糖、乳糖、葡萄糖三种糖的 不同添加量和添加比例对发酵豆乳总感官评价的影响，最后确定最佳的添加比例和添加量： 在发酵豆乳中添加8 蔗糖+ 2 乳糖，发酵豆乳的感官评价效果最好。 关键词：大豆异黄酮；染料木黄酮；黄豆苷元；发酵；提取 a b s t r a c t p r e p a r a t i o ns o yi s o f l a v o n e - g l y c o s i d a s ew i t h f e r m e n t a t i o n a b s t r a c t s o yi s o f l a v o n eh a sal o to fn u t r i m e n t sa n dh e a l t hp r o t e c t i o ne f f e c t s s ow a sw i d e l yu s e d a s t h em a i na c t i v ec o m p o n e n to fs o y b e a n ，s o yi s o f l a v o n eh a sb e e np a i dm o r ea n dm o r ea t t e n t i o na n d k n o w nf o rj l sm e d i c a t i v eh e a l t hp r o t e c t i o nf u n c t i o na n dc l i n i cc u r ee f f e c t n l r o u mt h ee x p e r i m e n t t h el a c t o b a c i l l u sw h i c hh a st h eb e s th y d r o l y s i sf u n c t i o nf o rs o yi s o f l a v o n ew a ss e l e c t e d ，c o n d u c t e d t oo p t i m i z et h ep r o c e s sc o n d i t i o n so fh y d r o l y s i sa n de x t r a c t i o n ，a n do n ek i n do ff e r m e n t a t i o n s o y m i l kw h i c hw a sr i c h e di ng e n i s t e i na n dd a i d z e i nw a sp r e p a r e d ，a tp r e s e n tt h e r ew e r em a n y w a y st oh y d r o l y s i ss o yi s o f l a v o n e sg l y c o s i d ei n t os o yi s o f l a v o n e sa g l y c o n ，t h a ti sa c i d h y d r o l y s i s ， a l k a l i h y d r o l y s i s ，e n z y m e h y d r o l y s i s ，s m i t h - h y d r o l y s i s ，m i c r o b e - h y d r o l y s i s ，b u tt h eb e s tw a yw a s m i c r o h y d r o l y s i sf r o ms e c u r i t yo f f o o d i nt h ep r o c e s so fp r e p a r a t i o nd a i d z e i na n dg e n i s t e i n , t a k i n gc o n c e n t r a t i o no fd a i d z e i na n d g e n i s t e i ni nf e r m e n t a t i o ns o ) 7 m i l ka si n d e xt h ee f f e c to ff a c t o r so nc u l t i v a t i o np r o c e s sh a db e e n s t u d i e d tw a sd e c i d e dt h r o u g ht h er e s e a r c ht h a tt h ee f f e c to ff a c t o r so ff e r m e n t i o nt e m p e r a t r u e f e r m e n t i o nt i m ea n di n o c u l u ms i z eo nt h ep r o c e s so fp r e p a r a t i o nd a i d z e i na n dg e n i s t e i n t h e o p t i m a lo p e r a t i o np a r a m e t e r so fp r e p a r a t i o np r o c e s sw e r ec h o s e nf r o mr o t a t a b l ed e s i g n 。t h e o p t i m u mh y d r o l y t i cp a r a m e t e r sf o rs o yi s o f l a v o n ea r eg o t t e n ，t h ec o n c l u s i o n sa r et h a tf e r m a t a t i o n t e m p e r a t u r e41 ，f e r m a t a t i o nt i m e2 8 ha n di n o c u l u ms i z eo fl a c t o b a c i l l u s4 i nt h i sc o n d i t i o n , c o n c e n t r a t i o no f d a i d z e i na n dg e n i s t e i na r e1 2 7 4 3 f t g m l i tw a sd e c i d e dt h r o u g ht h er e s e a r c ht ot h ee f f e c to f f a c t o r so f e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n ，e x t r a c t i o n t e m p e r a t u r ea n d e x t r a c t i o nt i m ei nt h ep r o c e s so fe x t r a c t i o nd a i d z e i na n dg e n i s t e i n t a k i n g c o n c e n t r a t i o no fd a i d z e i na n dg e n i s t e i ni nh y d r o l y z a t ea si n d e x , t h eo p t i m a lo p e r a t i o np a r a m e t e r s o fp r e p a r a t i o np r o c e s sw e r ec h o s e nf r o md e s i g n b y o r t h o g o n a le x p e r i m e n t sd e t e r m i n et h e f o l l o w i n go p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n s ：e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n9 0 。e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e6 0 a n de x t r a c t e df o r4 5 m i n u t e s i nt h i sc o n d i t i o n ，c o n c e n t r a t i o no fd a i d z e i na n d g e n i s t e i na r e 1 3 4 4 1 i _ t g m l i nt h ep r o c e s so fp r e p a r a t i o no n ek i n do ff e r m e n t a t i o ns o y m i l kw h i c hw a sr i c h e di ng e n i s t e i n a n dd a i d z e i n ，t h ei n f l u e n c eo ft h r e ed i f f e r e n t p r o p o r t i o n ss u c r o s e ，l a c t o s ea n dg l u c o s ew a s r e s e a r c h e db ys e n s o r ye v a l u a t i o n t h eo p t i m u ma d d i n ga m o u n to fs u r o s ea n dl a c t o s ea r e8 a n d 2 k e yw o r d s ：s o yi s o f l a v o n e ；g e n i s t e i n ；d a i d z e i n ；f e r m e n t a t i o n ；e x t r a c t i o n i i 东北农业大学1 二学硕士学位论文 i i i c a n d i d a t e ：m e n gx i a nj i n s p e c i a l i t y ：f o o ds c i e n c e s u p e r v i s o r ：p r o f y ug u o p i n g 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 注! 垫遗查墓丝益噩挂别直明鲍：奎拦互窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 虢抛 日期妒再年5 月影日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 签彳喜铂， 引一轹桶 日期：夕p 石年阳侈日 日期：，鼋年6 月够日 引言 1 引言 大豆( g l y c i r c e m a x ) 蝶形花科，大豆属，别名黄豆，一年生草本植物。大豆是世界上栽培 最为广泛的作物之一，作为一种经济作物，大豆有多种独特的优点：从农业特征上看，大豆 对土壤和气候适应范围广，是理想的轮作作物：从组成成分上看，大豆约含2 0 的油脂、4 0 的蛋白质，是含油和蛋白质量较高的作物。我国做为大豆的故乡，大豆的生产至今已有5 0 0 0 多年的历史，随着中外文化的交流，大豆于公元7 世纪传至日本，1 7 世纪传至欧洲，1 9 世 纪传至美国，渐而遍布世界。目前，世界上己有5 2 个国家和地区种植大豆，年产量超过一 亿吨，品种有5 0 0 余种。我国是主要的大豆生产国，年产量居世界第三( 位于美国j 巴西之后) ， 达2 0 0 0 多万吨，过去我国8 0 以上的大豆都作为油料加以使用，提油后的豆粕主要用于肥 料和饲料，近年来，随着人们对大豆及其制品的营养作用和保健功效研究的深入，发现大豆 除不含胆固醇，是优质蛋白质和油脂的重要来源外，还含有许多有益的生物活性物质。在这 些生物活性物质中，大豆异黄酮因具有明显的生物学活性己引起社会和学术界的普遍关注， 是近年来世界各国科学家研究的热点。 自然界中异黄酮的资源十分有限，大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次生代谢产物， 是生物黄酮中的一种，由于它是从植物中提取且与雌激素有相似结构，因此也称其为植物雌 激素。大豆异黄酮在大豆种子中的含量较低，仅为种子重量的千分之一左右，主要分布于大 豆种子的子叶和胚轴中，其中8 0 , - 9 0 的异黄酮存在于子叶中，浓度为0 1 - 0 3 ；胚轴中 所含异黄酮种类较多且浓度较高为1 q ，但由于胚轴只占种子总重量的2 ，因此尽管浓 度很高，所占比例却很少( 1 0 0 0 2 0 ) 。 1 1 大豆异黄酮的结构、组成 大豆异黄酮是一种多成分的混合物，大豆中的异黄酮分为游离型的苷元( a g l y c o n ) 和结合 型的糖苷( g l y c o s i d e s ) 两类，其结构如图1 1 。苷元占总量的2 3 ，包括染料木黄酮( g e n i s t e i n , g e ) ，黄豆苷元( d a i d z e i n ，d e ) 和黄豆黄素( g l y e i t e i n ) 。糖苷占总量的9 7 0 o - - - 9 8 ，以染料木苷 ( g e n i s t i n ，g ) 、大豆苷( d a i d z i n ，d ) 、黄豆苷( g 1 y c i t i n ) 和丙二酰染料木苷( 6 - o - m a l o n y g e n i s t i n ) 、 丙二酰大豆苷( 6 - o m a l o n y d a i d z i n ) 、丙二酰黄豆苷( 6 ”o m a l o n y g l y c i t i n ) 形式存在，约占总糖 苷的9 5 。其中起到生理功效的主要是染料木苷( g e n i s t i n ) 、大豆苷( d a i d z i n ) 和黄豆苷( g l y c i t i n ) ( a b d u lf a r a ja n dt h a v av a s a n t h a n2 0 0 4 ) 。 东北农业大学丁学硕士学位论文 基盟 黄豆苷元 hh 粢科木黄酮ho h 黄豆黄素h 苷基 图1 1 大豆异黄酮结构 f i g 1 - 1t h es t r u c t u r e so fs o yi s o f l a v o n e 1 2 大豆异黄酮的性质 1 2 1 大豆异黄酮的理化性质 大豆异黄酮为淡黄色的粉末，具有苦味、收敛性和干涩感觉，是产生大豆苦涩为的因子 之一。大豆异黄酮苷元比糖苷具有更强的不愉快风味，尤其是黄豆苷元和染料木黄酮。豆制 品中的风味与大豆异黄酮的味道相关，但同时也受到加工条件的影响。大豆异黄酮作为异黄 酮类化合物，具有异黄酮类化合物所共有的理化性质。( k a z u n a ok o n d oa n dy a s u h i r os u z u k i ， 2 0 0 2 ) 1 2 1 1 显色 异黄酮类化合物与其他黄酮类化合物相比，苯环之间的确共轭程度较小，因此呈微黄色、 灰色或无色，紫外线下多显紫色，如大豆异黄酮中的染料木黄酮呈灰白色结晶，紫外灯下无 荧光；黄豆苷元呈微白色结晶，紫外灯下无荧光。 2 引言 1 2 1 2 旋光性 异黄酮的苷元不具有旋光性，但对于染料木苷和大豆苷而言，由于结构中引入了糖基， 因而具有旋光性。 1 2 1 3 热不稳定性 大豆异黄酮中丙二酰基异黄酮糖苷不耐热，在加热的情况下容易转化成相应的乙酰基异 黄酮糖苷。异黄酮糖苷能被水解产生1 分子异黄酮苷元和1 分子葡萄糖。 1 2 i 4 溶解性 大豆异黄酮苷元一般难溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱 中。大豆异黄酮的结合型糖苷易溶于甲醇、乙醇、吡啶、乙酸乙酯及稀碱中，难溶于苯、乙 醚、氯仿、石油醚等有机溶剂，对水溶解度较强，可溶与热水。 1 2 1 5 酸碱性 由于异黄酮分子中有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶性水溶液及吡啶中。由于染料 木黄酮的7 和4 位含有两个羟基，黄豆苷元的4 位只有一个羟基，所以染料木黄铜的酸性大 于黄豆苷元的酸性。 1 2 2 大豆异黄酮的生理特性 大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的次级代谢产物，是一种生物类黄酮，除了具有黄酮 类化学物共有的理化性质以外，还具有其特殊的生理特性。主要表现在抗氧化性、类雌激素、 抗雌激素活性以及酶抑制剂活性等方面( w a n gh ja n dm u r p h yp a 。1 9 9 4 ) 。 1 2 2 1 抗氧化性 在有氧的条件下，自由基中间物泛醌h ( 半醌型) 、偶氮和硝基离子可以向氧转移一个 电子，形成超氧阴离子，进一步产生羟基自由基和单线态氧，这些反应性很强的物质统称为 活性氧( 1 的s ) 。r o s 可以损伤几乎所有的细胞成分，如蛋白质、酶、d n a 、r n a 等生物大 分子及细胞器，甚至引起细胞的氧化应激损伤，导致细胞突变。因此，人体中的活性氧自由 基是引发衰老、癌变和细胞损伤的重要原因。从图1 1 中我们可以看到大豆异黄酮的苷元， 尤其是主要的活性成分黄豆苷元和染料木黄酮具有多酚羟基结构，此结构是二者具有抗氧化 性的关键。因为这个酚羟基上的氢原子就容易在外来的吸引力作用下与氧原子脱离，形成氢 离子，发挥还原效应，这就是大豆异黄酮能够抗氧化、具有还原性的结构基础( s e l c h e l lk d a n db r o w nnm ，2 0 0 2 ) 。 大豆异黄酮抗氧化特性首先是通过清除活性氧自由基，预防脂质过氧化的产生和阻断脂 质过氧的链式反应来发挥起作用。但就大豆异黄酮的不同种类而言，苷元抑制脂质过氧化活 性明显高于糖苷。其次，大豆异黄酮不仅本身有抗氧化作用，还可诱导集体器官或细胞的抗 氧化酶活性增高。大豆异黄酮对整体动物也有明确的抗氧化作用。 3 东北农业大学丁学硕十学位论文 1 2 2 2 选择性雌激素受体调节剂 雌激素是维持女性生理与心理健康所必须的内源性活性物质。妇女由于各种原因所引起 的雌激素水平低下，可造成内分泌变化，进而表现出各种临床症状。雌激素补充疗法可提高 妇女体内雌激素水平，治疗由于雌激素缺乏所引起的各种症状。但长期应用雌激素会导致某 些疾病的危险性增高，如阴道不规则出血、乳腺癌和子宫膜癌等疾病，这就限制了雌激素长 期应用的依从性。在科研工作者寻找一种既能够补充妇女体内的雌激素，又不会出现副作用 的方法过程中，选择性雌激素受体调节剂受到了重视，并且在应用上也得到了发展( t a k e h i k o u e s u g ia n d y u t a k af u k u i ，2 0 0 2 ) 。选择性雌激素受体调节剂是一类化合物，其结构多样，与雌 激素受体有高度结合特性，并与体内激素水平有关，在不同靶组织可以表现为雌激素激动剂 和拮抗剂的作用。大豆异黄酮是一组与雌激素类固醇有密切关系的异环酚类物质，大量报道 证实大豆异黄酮是一种很弱的植物激素，其生物效应相当于雌二醇的1 0 1 0 一，与此同时， 大豆异黄酮又具有选择性雌激素受体调节剂的特性，因而越来越受到人们的重视。 1 2 2 3 酶抑制剂活性 生命活动离不开酶的催化作用。在酶的催化作用下，机体内的物质代谢有条不紊地进行。 同时又在许多因素的影响下，酶对机体代谢发挥着巧妙的调节作用。人体的许多疾病与酶的 异常密切相关。大豆异黄酮能抑制人体内多种控制甾体激素合成与代谢的重要的酶的活性， 从而达到调节多种生理功能的目的( b r e i n h o l tvl a u r i d s e nsta n dd r a g s t e dlo ，2 0 0 0 ) 。 1 3 大豆异黄酮的吸收代谢及生理保健作用 大豆异黄酮在人体中的消化、吸收途径，根据从人体的血液和尿液中分离、鉴定出的大 豆异黄酮代谢中间体的结构，可以推断出大豆异黄酮在人体内的吸收代谢途径他动物的应该 基本相同。 1 3 1 大豆异黄酮的吸收 人体实验表明，大豆异黄酮主要在肠道中被吸收，吸收率为1 0 - 4 0 。大豆异黄酮的 吸收根据其结构的不同分为两种吸收途径。脂溶性的苷元可从小肠直接吸收，机理尚不清楚， 估计是由于苷元的脂溶性以及分子空间结构较小，使得苷元可被小肠壁上的绒毛上皮细胞被 动扩散直接吸收，也有人认为大豆异黄酮在小肠的吸收是通过主动转运，涉及的主要蛋白质 是糖基转运蛋白质及乳糖脱氢酶( s e t c h e l lkd ，b r o w nnm a n dz i m m e r - n e c h e m i a sl ，2 0 0 2 ) 。 1 3 2 大豆异黄酮的代谢 动物实验表明，黄酮类化合物在肝脏中参与i i 型反应，o h 基团与葡萄糖醛酸、硫酸结 合，此外也可能发生去甲基化。研究表明：肝脏在大豆异黄酮的代谢过程中起关键作用，在 家兔身上发现肝脏微粒体内的u d p 葡萄糖醛酸转移酶对异黄酮类成分具有葡萄糖醛酸化、 4 引言 硫酸化或甲基化的作用。有研究认为大豆异黄酮主要是与葡萄糖醛酸结和，相对而言与硫酸 结合形成的化合物含量较少。苷元和结合型产物可随胆汁分泌到肠腔中，在结肠微生物产生 的脱结合酶作用下，水解产生苷元再重新入血。与此同时，大部分黄酮类化合物被肠腔内微 生物通过杂环裂解方式降解和代谢，产物可吸收入血液，再从尿中排出，但尿排出量只占吸 收量的7 - 3 0 ，未被吸收的另一部分随粪便排出。近年来关于染料木黄酮在大鼠体内的药 代动力学研究推测，膳食中的大豆异黄酮也可以通过胆汁分泌，因为在口服染料木黄酮后， 其在很短的时间内可以在胆汁中检测到。( k i mj o n g - s o n ga n dc h o n g s u kk w o n 2 0 0 1 ) 。 大豆异黄酮类物质的血液浓度与日常摄入量有关，在高摄入量的亚洲中大部分人血中染 料木黄酮浓度达到较高水平。k e l l y 等检测1 2 名志愿者摄入大豆膳食后尿中异黄酮代谢产物， 证实尿中有染料木黄酮、黄豆苷元、黄豆黄素及其代谢产物，说明部分经肾排出，也有部分 从肝脏分泌到胆汁，形成肝肠循环及排泄。 1 3 3 大豆异黄酮的流行病学研究 大豆制品中的豆腐、豆乳、豆酱、纳豆等，虽然早已经摆上了普通市民的餐桌，但人们 对于这些豆制品是否具有防治癌症、骨质疏松、心血管等疾病的效果还持一定的观望态度。 近年来，各研究机构以及大豆制品生产企业的研究开发人员对此却坚信不移，十分认真地在 探讨大豆功能成分与人体健康的相关问题。流行病学调查发现，亚洲人( 尤其是日本人、韩 国人) 乳腺癌、心血管疾病、更年期潮热的发病率明显低于欧美等国家，尽管这种差异被认 为与欧美的高脂膳食和亚洲的高纤维膳食有关，但随着研究的深入，大豆异黄酮在预防这些 疾病发生中的作用却越来越引起研究者的重视。( 李里特，王海，2 0 0 2 ) 1 3 3 1 大豆异黄酮与癌症 亚洲国家如中国、韩国和日本，乳腺癌、前列腺癌和结肠癌的发病率较西方国家低，其 原因一直被认为是由于其典型膳食中总脂肪和饱和脂肪含量较少及膳食纤维含量较多的缘 故。近年来一些研究者提出大豆摄入量较多也可能是其原因之一。1 9 9 0 年美国国立癌症研究 院的一个研究组证明，大豆中有几种具有抗癌性物质，其中最引人注目的是大豆中含有丰富 的异黄酮类物质。w a t a n a b e 等研究表明，由于日本居民传统膳食结构上每日的早、晚均食用 大豆制品，大豆异黄酮的摄入量约为4 0 m g d 1 ，对于预防癌症很有效。( b r e i n h o l tva n d l a u r i d s e nst ，1 9 9 9 ) 。 最近美国纽约激素研究中心的科学家发现，中国和日本妇女乳腺癌发病率之所以比西方 妇女低得多，是由于它们常吃大豆的缘故。( s u z a n n eca n ds i e ug c ，2 0 0 1 ) 调查表明，每1 0 万 妇中，每年乳腺癌的发病率为：中国6 人，日本2 1 人，北欧4 8 人，美国9 1 人。h i r a y a m a 花费1 7 年对1 4 2 8 5 7 名日本妇女进行前瞻性研究，结果显示大豆制品摄入与乳腺癌呈明显负 相相关，这些结果与l e e 等人的研究结果一致。l e e 等对生活在新加坡的中国女性进行膳食 与乳腺癌的病例对照研究，结果表明，大豆对绝经前妇女乳腺癌的发生有明显预防作用，作 者推测大豆中的植物雌激素( 即大豆异黄酮) 可能与这种作用有关，较大量摄入该制品可保 护青年妇女，预防乳腺癌的发生。 5 东北农业大学工学硕士学位论文 日本和其他亚洲国家前列腺癌死亡率低于西方国家，流行病学调查显示前列腺癌死亡率 与脂肪和肉制品摄入呈正相关，与豆制品和谷物的摄入呈负相关。植物雌激素特别是大豆异 黄酮被认为是抑制前列腺癌发生和死亡的主要膳食因素，一周食用豆腐5 次的日本男子其前 列腺癌的发病仅为一周食用豆腐少于一次者的5 0 。s e v e r s o n 对生活在美国夏威夷的日本裔 男性进行了膳食与前列腺癌的遗传性。作者认为这一结果可能是因为日本裔男性的膳食习惯 与传统日本人相似，即大豆摄入量较高，也可能是遗传因素起了定的作用。 大豆产品中大豆异黄酮的摄入同结肠癌的死亡率有显著相关。s t e i n m e t z 等通过病例对照 研究发现大豆的摄入量与结肠癌发病率没有影响。每年食用9 k g 豆制品，如豆芽、水豆腐和 干豆腐的中国男子直肠癌的发病率仅为每年豆制品摄入少于2 k g 者直肠癌发病率的1 3 。 w a t a n a b e 等对6 5 名直肠癌患者、1 3 8 名结肠癌患者机器对照者进行调查分析，发现每周至少 摄入一次大豆制品者其直肠癌发病率明显降低，但对结肠癌发病率没有明显的影响。在日本 进行的流行病学调查也显示大豆制品可预防结肠癌的发生。 1 3 3 2 大豆异黄酮与骨质疏松 大量的流行病学资料显示东西方妇女骨折和骨质疏松发生率不同，日本妇女发病率明显 低于欧美等国家。这至少部分依赖于膳食摄入的植物雌激素一大豆异黄酮的作用。日本居民 每日大豆异黄酮的摄入量约为4 0 m g ，而欧美居民摄入含大豆异黄酮的豆制品的数量极低。 这种饮食习惯的区别导致日本妇女尿中异黄酮的排泄量比美国、芬兰妇女高百倍之多，也造 成东西方雌激素依赖性疾病的发病率的极大差异，同时也为骨质疏松的防治提供了新的途 径。 研究者通过回顾性调查和干预实验等方法研究了大豆异黄酮与骨质疏松的关系，结果显 示大豆异黄酮对骨质疏松有一定的预防作用。对绝经后高胆固醇血症妇女进行的一项膳食干 预实验，6 6 位女性分为3 组，一组为对照组，一组每天摄入5 6 m g 大豆异黄酮，第三组每天 摄入9 0 m g 大豆异黄酮。持续6 0 天后测定受试者第1 4 腰椎矿物质含量和骨密度，发现第 三组受试者骨矿物质含量和骨密度增加2 ，与对照组相比有显著性差异。t a k e h i k o 研究也证 明大豆异黄酮可有效的改善绝经后妇女的骨密度。s u z a n n e 对2 7 3 名妇女三年追踪队列研究 发现大豆异黄酮对3 0 , - 一4 0 岁的妇女的腰椎骨密度的维持有显著作用。k e n i c h i 长期对妇女骨 质的研究中也发现膳食异黄酮能抑制腰椎骨矿丢失和骨密度下降( 崔洪斌，2 0 0 5 ) 。 1 3 3 3 大豆异黄酮与高血脂和心血管疾病 随着人类生活水平的提高，心血管疾病己成为危害人类生命的高发性疾病，据统计，心 血管疾病是绝经后妇女死亡的主要原因，所谓高血脂症是指血胆固醇、甘油三酯和低密度脂 蛋i 刍( l d l ) 浓度过高，而高密度脂蛋白( h d l ) 浓度过低。一些学者通过研究发现大豆异黄酮可 通过降低血脂和血浆胆固醇来防治心血管疾病。p o t t e r 等进行了大豆蛋白和异黄酮对绝经后 妇女血脂和骨密度影响的人群实验。他们将受试对象随机分为3 组：每人每天摄入4 0 9 大豆 分离蛋白，分别是分离大豆蛋白中含有中等浓度的大豆异黄酮( 1 3 9 m g 大豆异黄酮g 大豆 蛋白) 组；分离大豆蛋白中含有高浓度的大豆异黄酮( 2 2 5 m g 大豆异黄酮儋大豆蛋白) 组； 酪蛋白无脂肪干酪组，实验共进行2 4 周。结果证明中等浓度的大豆异黄酮在2 4 周前可显著 改善血脂，而高浓度的大豆异黄酮直到试验末期( 1 8 2 4 周) 才表现出对血脂的改善作用。 6 引言 曼! 詈皇! ! 曼詈詈皇皇富詈皇詈皇皇鼍皇量皇皇皇曼l i曼 i_i i 皇皇皇曼! ! 苎皇巴! ! ! ! ! 曼詈! ! 詈詈詈詈皇詈詈詈量詈鼍暑 t a k e h i k o 等所做的平行对照研究也证明大豆异黄酮可降低血清中总胆固醇和l d l 胆固醇的 含量。 1 4 加工过程对大豆异黄酮结构功能的影响 各种大豆制品中异黄酮含量和种类分布不同，这不仅与大豆品种和载培环境有关，还与 加工密切相连。水处理、热处理、凝固、发酵及添加非大豆成分等加工环节和方法显著地影 响了大豆制品中异黄酮的含量和种类分布，特别是生产大豆浓缩蛋白和大豆分离蛋白的不同 提取加工方法对其中异黄酮含量影响极大。 1 4 1 热水处理的影响 浸泡使1 0 的大豆异黄酮流失于浸泡水中，且水处理后的大豆中游离型异黄酮增加，这 是因为豆类自身存在的内源性1 3 葡萄糖苷酶水解异黄酮葡萄糖苷的结果。大豆在水泡2 4 后， 糖苷含量下降7 ，而苷元的增加量小于糖苷的减少量，这是由于异黄酮糖苷可溶与水，水 煮加热增加了异黄酮向外渗透速率，使大量异黄酮因渗入加热水中而丢失( w a n ga n dm u r p h y 1 9 9 6 ) 。如在丹贝生产过程中，水煮使异黄酮丢失了约4 9 ；但在豆腐和豆奶生产过程中， 由于热水最后成为产品的组成部分，所以热处理未造成产品中异黄酮的显著丢失( m a _ c s u d a ， 1 9 9 4 ) ；热处理还显著地改变了豆制品中各类异黄酮的分布，如经过热处理的大豆分离蛋白、 组织蛋白和炒大豆等制品中的乙酰基葡萄糖苷型异黄酮含量很高，占总异黄酮含量的 3 0 * 旷5 0 ，这是因为丙二酰型异黄酮具有热不稳定性，在热处理时丙二酰型异黄酮转化为乙 酰型异黄酮；此外，熟处理时1 3 葡萄糖苷酶活性增强，使异黄酮糖苷水解为游离型异黄酮， 因而制品中游离型异黄酮较原料大豆或大豆粉中的有所增加。 1 4 2 凝固 在豆腐生产中，凝固使一部分异黄酮丢失于乳清中，丢失率为4 4 ( w a n ga n dm u r p h y 1 9 9 6 ) ，如果不去掉乳清，则豆腐制品中的异黄酮不会减少，反之，则会因凝固生产工艺丢 失大量的异黄酮。 1 4 3 发酵 发酵不影响异黄酮的含量，但改变了异黄酮种类的分布( m a t s u d ae ta l ，1 9 9 4 ) ，发酵后的 产品以游离型异黄酮为主要存在形式( s l a v i n ，1 9 9 6 ) ，如丹贝和发酵豆凝乳中的游离型异黄酮 含量为4 0 。o - 1 0 0 。这是因为在发酵过程中，真菌产生的大量d - 葡萄糖苷水解酶使异黄酮葡 萄糖苷大量水解，从而导致游离型的异黄酮显著增加( b a l t l e $ c ta l ，1 9 9 4 ) 。 7 东北农业大学工学硕十学位论文 1 4 4 加工提取方法 提取方法对大豆浓缩蛋白和大豆分离蛋白中异黄酮含量的影响很大，如用湿热水洗法去 除可溶性碳水化合物所得浓缩蛋白的异黄酮含量与原料豆中的相似，而用6 0 , - 6 5 的酒精水 溶液洗涤大豆浓缩蛋白的异黄酮仅为原料中的1 l 肛1 2 0 或更低；用碱溶酸沉法提取大豆分 离蛋白，异黄酮的损失也很大，异黄酮含量丢失率达5 3 ( w a n ga n dm u r p h y ，1 9 9 6 ) ，产品中 的异黄酮仅为原料的1 5 1 3 ( s e t c h e l l ，1 9 9 8 ) 。这是因为碱性环境改变了异黄酮和蛋白质的 电荷状态，扰乱了其结合，造成异黄酮丢失在碱不溶部分( m a h u n g u ，1 9 9 9 ) 。 1 5 大豆异黄酮的应用 对大豆异黄酮产品的开发已经成为世界大豆加工企业投资的热点，现已有纯度较高的大 豆异黄酮产品及强化异黄酮的大豆制品，还有的公司开发了富含大豆异黄酮的大豆胚芽和胚 芽提取物，以下主要介绍大豆异黄酮在食品中的应用概况。 ( 1 ) 保健食品 由于大豆异黄酮具有植物雌激素的特点，对体内雌激素失调引起的病症和衰老有一定的 预防和治疗作用，且不会引起副作用。因此，开发利用大豆异黄酮作为保健食品具有较好的 市场前景。 日本市场上己出现较多此类产品，其主要生理功能是以预防骨质疏松症为主，将大豆异 黄酮与矿物质、维生素等相配合，对于预防闭经后女性的骨质疏松症特别有效，也可作为年 轻女性等普通人群的补钙食品( 夏剑秋，刘宇峰，2 0 0 2 ) 。位于美国伊利诺斯州的a d m 公司 也于1 9 9 8 年建成世界上最大规模的大豆异黄酮生产厂，并向美国食品和药品管理局呈交申 请大豆异黄酮为g r a s ( 公认安全狒4 品。美国食品和药品管理局己于19 9 9 年1 1 月正式批准 大豆异黄酮可作为膳食补充剂，建议每日大豆异黄酮的摄入量应为3 0 - - 5 0 m g ，国内一些厂家 也己生产出类似的产品，产品中除含有大豆异黄酮外，还含有碳酸钙和其它成分( 崔洪斌，李 百祥。刘颖，2 0 0 1 ) 。 我国保健食品的研究和生产正朝深度和广度发展，大豆异黄酮作为一种优良的保健品添 加剂在保健食品生产和开发等领域具有良好的应用前景。 ( 2 ) 药品 近年来相继开发出大豆异黄酮的系列药品，其中包括颗粒剂、粉剂、片剂、口服液等。 随着对大豆异黄酮功能和作用机制研究的逐步深入，会有更多的产品投放市场，由于大豆异 黄酮的疗效较显著，一些科研单位和厂家开始关注这一领域。据报道，用大豆异黄酮与碳酸 钙、维生素b 3 做成片剂，可用于防治骨质疏松( 王龙梓，刘兆平，张帕美，2 0 0 5 ) 。随着现 代药理研究的深入，大豆异黄酮在心血管系统和内分泌系统表现出具有临床意义的药理作 用，某些以大豆异黄酮为主要成分的制剂经临床试用有效，己作为成药上市。 ( 3 ) 饲料添加剂 大豆异黄酮广泛存在于豆类作物和牧草中，研究表明大豆异黄酮是一种有实用价值的生 8 引言 理调节剂，主要通过神经和内分泌系统调控机体的生殖和营养过程，改善动物的生产性能， 且能明显改善畜产品质量，在畜禽饲料中添加适量的大豆异黄酮，能够在促进动物生长、降 低饲料成本、提高动物繁殖力和增强机体免疫力等方面发挥显著的生理作用( 李玉珍，林亲 录，肖怀秋，2 0 0 5 ) 。大豆异黄酮作为新型饲料添加剂具有广阔的发展前景。 1 6 大豆异黄酮糖苷水解方法的研究进展 近年来国外研究发现大豆中异黄酮存在形式主要是结合型糖苷，约占大豆中异黄酮含量 的9 5 以上；虽然游离苷元含量不足5 ，但它们表现出活性要比结合型糖苷高得多。因此， 将结合型糖苷水解成游离型苷元是提高大豆异黄酮生理活性一个有效的手段，这也成为近年 来研究大豆异黄酮的一个热点。 大豆异黄酮属于氧苷类，是酚羟基与糖缩合而成b 葡萄糖苷，水解反应使苷键裂解得到 大豆异黄酮苷元和葡萄糖配基。目前常用水解方法主要有酸水解、碱水解、s m i t h 水解、酶 水解( 韩锋，翟桂香，2 0 0 4 ) 。 ( 1 ) 酸水解法 糖苷能被酸催化水解，如醋酸、硫酸等均可使其发生水解，但从实际生产和经济实用角 度考虑，多采用较浓盐酸( 如l - 3 m o l l d ) ，较高温度( 8 0 1 0 0 。c ) ，糖苷键首先发生质子 化，然后糖苷键断裂成苷元和糖的阳碳离子中间体，水解后阳碳离子经溶剂化，再脱去氢离 子而形成糖分子，酸催化水解关键是o 苷基的苷质子化程度。 ( 2 ) 碱水解法 糖苷键具有缩醛结构，对碱较稳定，但异黄酮糖苷键具有酯苷性质，可用碱对其进行水 解，分解为大豆异黄酮苷元和葡萄糖；在碱性条件下水解所得大豆异黄酮苷元很不稳定，容 易降解。 ( 3 ) s m i t h 降解 该法是一种氧化开裂法，比酸水解温和，能完整保持苷元结构，先用n a l 0 4 将糖的二羟 基氧化开裂为二元醛结构；第二步用n a b h 4 将二元醛结构还原成二元醇结构；第三步在室温 条件下与酸作用使其水解。 ( 4 ) 酶水解法 酶的专属性很强，酶水解条件温和，多采用弱酸性缓冲溶液，大豆异黄酮苷元不易变性， 是工业上制备富含大豆异黄酮苷元保健食品十分有前途的途径。不过目前高活性大豆异黄酮 糖苷酶还在试验阶段，也没有进行工业化。研究最多的大豆异黄酮糖苷水解酶就是b 葡萄糖 苷酶，大豆自身含有内源p 萄糖苷酶水解活性不强，水解效率只有2 2 2 9 ：而添加足量高 活性酶( 如乳酸菌中提取p 萄糖苷酶) 可使水解达到8 0 以上，水解大豆异黄酮糖苷的酶还 有葡萄糖酸酶、乳糖苷酶、生物乳糖酶、真菌乳糖酶和乳糖酶f 等，它们都有很强水解大豆 异黄酮糖苷的能力。 ( 4 ) 微生物法水解 该法利用微生物发酵使糖苷型大豆异黄酮转变成游离型异黄酮，尽管目前已报道的微生 物所产生的游离型大豆异黄酮的产量并不是很高，但是我们通过菌种的选育，特别是通过现 9 东北农业大学工学硕上学位论文 代生物技术来选育优良菌种。如果能够找到并克隆生物转化基因，如果能找出最优的发酵条 件和提取、分离、纯化操作，就可以通过微生物发酵法来大量生产游离型大豆异黄酮。 1 7 大豆异黄酮的检测方法 大豆提取物中大豆异黄酮的含量是产品质量的关键指标之一，也是大豆异黄酮产品研究 开发中首先必须解决的问题，其分析方法主要有以下几种： 1 7 1 质谱定性法 异黄酮的紫外吸收是由苷元部分决定的，受糖苷的影响不大，丙二酰和乙酰形式异黄酮 的摩尔消光系数和异黄酮糖苷的相同，其含量可以根据异黄酮苷元的响应因子来计算，而对 没有标样的异黄酮，一般都采用质谱进行定性。 1 7 2 紫外分光光度法 大豆异黄酮结构中羟基和芳环形成较强的共轭体系，在2 5 0 2 7 0 n m 紫外区有特征吸收， 采用紫外分光光度法测定大豆异黄酮含量，此方法可以定量计算出样品中总异黄酮的含量， 但无法判断样品中各组分的构成情况，如果样品中含有葛根黄酮或其他黄酮类化合物，紫外 分光光度法将无法检出。 1 7 3 色谱法 1 7 3 1 薄层扫描法 采用硅胶g 薄层板，以甲苯甲醇1 0 甲酸( 7 ：3 ：o 0 2 ) 年n 醋酸乙酯甲醇5 0 甲酸( 8 ：2 ： o 2 ) 为展开剂分离了黄豆苷元、大豆苷等四种成分，采用双波长反射锯齿扫描法可测定4 种 成分的含量，运用这种检测方法，样品的处理及检测过程简单，可适用于大豆异黄酮生产过 程的中间物料和无精度要求的产品检测，能较好地进行定性分析，但定量检测精度不高。 1 7 3 2 气相色谱法 气相色谱具有进样量少、高敏感性、高选择性、高特异性等突出优点，但在测定大豆黄 素和染料木黄酮时需制备衍生物，样品制备步骤较多，耗时长且仪器较为昂贵，从而限制了 该法的推广应用，另外气相色谱法只能测定苷元，无法测定糖苷，且上机分析前需要衍生化 处理，衍生效果直接关系到检测分析结果，因此此方法较适合苷元含量分析。 1 7 3 3 高效液相色谱法 高效液相色谱法是目前测定大豆异黄酮研究工作中应用最为广泛的一种方法，此法具有 l o 引言 皇皇詈鼍曼鼍暑量詈量詈詈霉m i。, 一一m i i 鼍 测定样品范围广、样品制备步骤少、成本低、分离效率高、灵敏度好，测定结果准确等特点， 且有多种检测器可供选择。 1 8 研究的目的意义 人们在比较东西方饮食和公共健康时发现食用大豆较多的中国人及日本人息心血管疾 病及癌症的比例明显低于西方人。动物实验和问卷调查也证实了大豆异黄酮在此方面的功 能。大豆制品不再被视为单纯的营养性食品，而是作为一种健康的食品受到越来越多的重视。 但是，大豆制品中大豆异黄酮的含量很少，游离型的大豆异黄酮含量更是极少，仅占大豆异 黄酮总量的2 3 。研究发现，糖苷型大豆异黄酮不具有最佳的生理活性状态，糖苷型大 豆异黄酮只有通过相应的反应转化成游离型大豆异黄酮才能被吸收。游离型大豆异黄酮在抑 制癌症、预防骨质疏松方面都有