（急诊医学专业论文）不同剂量乌司他丁对感染性休克兔肺损伤的保护作用及其机制探讨.pdf

徐州医学院硕士学位论文缩略词a l ic s fd a b缩略词表a b b r e v i a t i o n英文全称a c u t el u n gi n j u r yc o l o n y - s t i m u l a t i n gf a c t o rd i a m i n o b e n z i d i n ed x md e x a m e t h a s o n ee d t ae l i s ae th ei li n o sm a pm o d sm r n an f r d 3n oo dp b sp k cp m nr rs i r st n f au t ie m y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i de n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a ye n d o t o x i nh e m a t o x y l i na n de o s i ni n t e r l e u k i ni n d u c i b l en i t r i co x i d es y n t h a s e sm e a na r t e r i a lb l o o dp r e s s u r em u l t i p l eo r g a nd y s f u n c t i o ns y n d r o m em e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i dn u c l e a rf a c t o r - k a p p a bn i t r i co x i d eo p t i c a ld e n s i t y ep h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n ep r o t e i nk i n a s ecp o l y m o r p h o n u c l e a rn e u t r o p h i l sr e s p i r a t o r yr a t es y s t e m i ci n f l a m m a t o r yr e s p o n s es y n d r o m et u m o rn e c r o s i sf a c t o r au l i n a s t a t i n中文全称急性肺损伤集落刺激因子3 ，3 二氨基联苯胺地塞米松乙二胺四乙酸酶标记免疫吸附测定法内毒素苏木素伊红白介素诱导型一氧化氮合成酶平均动脉血压多器官功能障碍综合症信使核糖核酸核转录因子r b一氧化氮光密度磷酸盐缓冲液蛋白激酶c多形核中性粒细胞呼吸频率全身炎症反应综合症肿瘤坏死因子一a乌司他丁o 。- 、徐州医学院硕士学位论文不同剂量乌司他丁对感染性休克免肺损伤的保护作用及其机制探讨中文摘要目的观察内毒素( e t ) 致感染性休克兔血浆中肿瘤坏死因子- a ( t n f - a ) 、自介素6 ( i l 6 ) 和肺组织核转录因子1 出( n f k b ) 水平变化，研究不同剂量乌司他丁( u t i ) 对感染性休克兔肺损伤的保护作用及其机制。方法将5 0 只健康同本长耳大白兔随机分为内毒素致休克模型组( 对照组) ，地塞米松( d x m ) 干预组( d x m 组) 及三种不同剂量u t i 干预组( u 1 组、u 2 组、u 3 组3 个亚组) ，每组1 0 只。采用e t ( 2 m g k g ) 一次性静脉注射方法复制兔感染性休克模型，造模成功后对照组应用0 9 氯化钠溶液2 m l ，d x m 组用d x m ( 1m g k g ) 、u 1 组用u t i ( 2 5 x 1 0 4 ) u k g 、u 2 组用u t i ( 5 x 1 0 4 ) u k g 、u 3 组用u ti ( 1 0 x 1 0 4 ) u k g 分别溶于2 m lo 9 氯化钠溶液静脉注射进行干预，监测兔的平均动脉血压( m a p ) 和呼吸频率( r r ) 的变化，检测休克o h 和干预后2 h 、4 h 、6 h 和1 2 h 等时间点血浆中的t n f a 、i l 6 水平，h e 染色观察肺组织病理形态学变化，免疫组化染色检测肺组织n f k b 的表达。结果在o h ，5 组兔的m a p 、r r 及t n f 。a 、i l 6 水平差异无统计学意义( 矿0 0 5 ) ，3 个u t i 亚组与对照组及d x m 组，在休克后不同干预时问点m a p 、r r及t n f a 、i l 6 的水平比较，差别有统计学意义( p o 0 5 ) ，肺组织病理变化在对照组肺损伤最强，u 3 组最轻，差别有统计学意义( p o 0 5 ) ；n f k b 在肺组织的表达在对照组最强，u 3 组最轻，差别有统计学意义( p o 0 5 ) ，h o w e v e r ,t h el e v e l so fm a p 、r ra n dt n f a 、i l 6a t2 h 、4 h 、6 h 、12 hi nt h et h r e eu t ig r o u pw e r es i g n i f i c a n td e c r e a s e da sc o m p a r e dw i t hg r o u pc o na n dg r o u p d x m眵 o 0 5 ) ，a n dg r o u p u 3w e r el o w e rt h a ng r o u p u1a n dg r o u p u 2 o 0 5 ) ；t h em o r p_ h o l o g i c a lc h a n g e so fl u n g si ng r o u pc o nw e r et h em o s to b v i o u s ，g r o u p u 3w e r et h el i g h t e s ta sc o m p a r e dw i t ho t h e rg r o u p s 0 0 5 ) t h ee x p r e s s i o no fn f - k bi ng r o u pc o nw a st h em o s to b v i o u s ，g r o u p u 3w a st h el i g h t e s ta sc o m p a r e dw i t ho t- h e rg r o u p s 如 o 0 5 ) t h el e v e l e so fm a p 、r ra n dt n f a 、i l 一6a n dt h ee x p r e s s i4徐州医学院硕士学位论文- o no fn f 一诏w e r ed e g r a d e dw i t ht h ei n c r e a s i n gd o s e so fu t i o 0 5 ) c o n c l u s i o nu t ic a l li m p r o v et h ec h a n g e so fm a p 、r ra n dt n f a 、i l - 6i ns e p t i cs h o c ki n d u c e dd ye ti nr a b b i t sa n dt h el u n gp r o t e c t i v ef u n c t i o ni st h ep o s i t i v ec o r r e l a t i o nw i t ht h ed o s a g e i n h i b i t i n gn f r d 3s i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y st oi n h i b i tt h ee x p r e s s i o no ft n f - aa n di l - 6i so n eo fu t il u n gp r o t e c t i v ef u n -c t i o ni m p o r t a n tm e c h a n i s m s k e yw o r d su l i n a s t a t i n ；s e p t i cs h o c k ；t u m o rn e c r o s i sf a c t o r - a ；i n t e r l e u k i n - 6 ；n u c l e a rf a c t o r - k a p p a b ；d o s e 5徐州医学院硕士学位论文，1 t 刖青在全球范围内，每年有成千上万的严重脓毒症和感染性休克( s e p t i cs h o c k )患者，其中四分之一以上患者死亡，并且病死率仍然在不断增加。感染性休克具有发病率高、病死率高、住院费用高等“三高现象 ，是危重症医学研究的热点和难点。2 0 0 8 感染性休克指南【l 】预测全球范围内每年有1 8 0 0 万人发生严重的感染。感染性休克是在各种感染性病原的基础上，出现全身炎症反应综合症( s i r s ) 、组织灌注不足及多器官功能障碍综合症( m o d s ) 。感染性休克时最先受攻击的靶器官是肺，急性肺损伤( a l i ) 、s i r s 和m o d s 是一个相互关联、互为因果的复杂过程，目前认为其损伤机制是肺组织失控性炎症反应的结果，以肺血管内皮细胞及肺泡上皮细胞广泛损伤为其病理特征。在致病因素作用下炎症细胞和多种细胞因子相互作用形成十分复杂的网络，经过启动、放大、不断放大，炎症介质和细胞因子失控性释放，形成失控性炎症反应。目前认为，t n f a 是引起感染性休克的关键介质，对网络起触发作用，是细胞因子爆发的中心【2 】；i l 6 是网络中的关键成分，与感染性休克的病死率有最好的相关性【3 1 ，可敏感地反应组织损伤的程度。编码t n f a 、i l 6 等炎性细胞因子的基因是由n f r b 控制表达，由此，n f r b 参与多种细胞因子及炎症介质基因的转录调控，在急性肺损伤中取着关键作用【4 】。乌司他丁( u l i n a s t a t i n ，u t i ) 是一种蛋白酶抑制剂，能抑制炎症反应、改善循环与器官灌注、阻断s i r s m o d s 的进展，已被广泛应用在急危重症及脓毒血症时的脏器保护方面【5 卅，但其保护机制仍不是很清楚。蒋京京等研究发现在发生a l i后，早期应用u t i 能够在一定程度上抑错i j n f k b 活化，从而减轻肺损伤，具有较好的肺保护作用【7 - 9 1 。a o s a s a 等【1 0 】的实验证实u t i 对内毒素( e t ) 刺激人单核细胞引起的t n f a 的翻译或分泌有直接抑制作用，而非通过抑韦f j n f r d 3 信号转导通路减少t n f a 的表达。k o b a y a s h i 等【1 1 】研究发现u t i 通过抑制巨噬细胞内信号传导通路，如蛋白激酶c ( p k c ) 来实现凋节作用的，抑制t n f am r n a 的翻译和分泌朱减少6l i 。徐州医学院硕士学位论文t n f a 的产生，但不影响t n f am r n a 的表达。u t i 还同时促进i l - 1 0 等抗炎因子的释放来抑制t n f a 的合成和释放，从而减少t n f - a 的产生。由于u t i 不良反应少，疗效与剂量呈线性正相关【5 1 ，其合理的临床用药剂量仍在进一步的探讨中，因此本研究通过静脉注射e t 建立感染性休克兔动物模型，造模成功后给予不同剂量的u ti f g 治疗干预，通过观察不同剂量u t i 对感染性休克兔m a p 、r r 的影响，对血浆中t n f a 、i l 6 水平及组织中n f k b 的表达情况的影响，研究不同剂量u t i 对感染性休克兔肺损伤的保护作用及其机制。徐州医学院硕士学位论文材料和方法1 材料1 1 实验动物健康级日本长耳大白兔5 0 只，4 月龄，雄性，质量( 2 2 5 - 4 - 0 2 5 ) k g ，由徐州医学院动物实验中心提供。批号：s c x k ( 苏) 2 0 0 9 0 0 0 8 。1 2 主要药物和试剂乌司他丁( 1 0 万单位支)广州天普生化医药股份有限公司内毒素( ec o l i0 5 5 ：b 5 )地塞米松磷酸钠注射液( 1m g 支)普通肝素( 1 2 5 0 0 单位支)兔t n f ae l i s a 检测试剂盒兔i l - 6e l i s a 检测试剂盒即用型抗兔n f r j 3 p 6 5 多克隆抗体生物素化山羊抗兔i g gs a b c 免疫组化染色试剂盒浓缩型d a b 试剂盒甲醛溶液枸橼酸钠缓冲液p b s 磷酸盐缓冲液1 3 主要仪器及器械j a 2 0 0 3 型电子天平( 生产批号：0 3 0 9 0 5 1 5 )美国s i g m a 公司天津市津津药业有限公司( 生产批号：0 3 0 9 0 31 2 )天津市津津药业有限公司( 生产批号：0 3 0 9 0 2 2 2 )美国r & d 公司美国r & d 公司武汉博士德生物工程有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司上海中秦化学试剂有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司上海精密科学仪器有限公司徐州医学院硕士学位论文心电监护仪( 型号c a r d i o c a p 5 )酶标仪( 型号5 5 0 )低温离心机( 型号t g l 1 6 0 )8 0 c 超低温冰箱( 型号m d f 1 9 2 )b l 4 0 0 型烘箱n i k o n d s 2 m v 图像分析仪e d t a 抗凝管动静脉套管穿刺针各种微量加样仪2 方法美国g ed a t e x o h m e d a 公司日本b i o r a d 公司日本s a n y o 公司日本s a n y o 公司上海实验仪器厂尼康仪器上海有限公司广州阳普医疗科技股份有限公司广州阳普医疗科技股份有限公司芬兰l a b s y s t e m 公司2 1 实验分组随机将5 0 只兔分为5 组：内毒素致感染性休克模型组( 对照组) ；地塞米松干预组( d x m 组) ；u t i 干预1 组( u 1 组) ，u t i 干预2 组( u 2 组) ，u t i 干预3 组( u 3 组) ，每组1 0 只。实验前禁食1 2 h ，自由饮水。2 2 模型制作日本长耳大白兔以5 水合氯醛( 3 m l k g ) 耳缘静脉注射麻醉，固定于兔台，分离右股静脉，用于输液；分离右侧股动脉，动脉套管针穿刺，普通肝素( 8 0 0 u k g )全身肝素化抗凝，连接心电监护仪用于监测平均动脉压( m a p ) ；皮下插电极监测呼吸频率( r r ) 。将e t 按2 m g k g 溶于2 m lo 9 氯化钠溶液中，于5 m i n 内经右股静脉缓慢注射，同步监测m a p ，一旦m a p 下降至基础血压的3 0 时，即认为感染性休克模型复制成功【1 2 】，此时问点即为0 h ，记录达到此时间点所需的时间。随即给予干预药物，d x m 组、u l 组、u 2 组和u 3 组分别使用地塞米松( 1 m g k g ) 、u t i ( 2 5 x 1 0 4 ) u k g 、u t i ( 5 x 1 0 4 ) u k g 和u t i ( 1 0 x1 0 4 ) u k g ，溶于2 m l0 9 氯化钠溶液中，经股静脉5 m i n 内缓慢推入，6 h 后重复用药一次；对照组在相应时间点给予o 9 氯化钠溶液2 m l 。9徐州医学院硕士学4 - 壶- 论文2 3 标本采集和处理各组均在造模成功后即刻( 0 h ) ，以及休克后2 h 、4 h 、6 h 和1 2 h 等时间点采集动脉血2 m l ，置e d t a 抗凝管，4 c 低 温t x 3 0 0 0 9 离心1 5 m i n ，取上清液置8 0 c 超低温冷藏备检。每次采血后都补充同容量的o 9 氯化钠溶液。于休克后1 2 h 末放血处死动物，右肺中叶用1 0 甲醛固定，制成石蜡切片。3 观察指标3 1m a p 和r r 监测各组实验动物均连续监测m a p 和r r 指标，分别在o h ，以及给药后2 h 、6 h和1 2 h 等时问点记录m a p 和r r 。3 2 血浆t n f - a 、i l 。6 的测定取8 0 低温保存的血浆，常温解冻后，采用双抗体夹心e l i s a 法测定，用酶标仪在波长4 5 0 n m 处测定其o d 值。3 2 1 血浆t n f - a 的检测步骤( 1 ) 实验前将试剂盒及待测标本放置室温( 1 8 。c 2 8 c ) 平衡，并确定本次检测所需酶标板孔数目。( 2 ) 将标准品各1 0 0 1 x l 依次加入一排孔中，处理后的标本按1 0 0 i - t l 每孔加入，并做好标记。( 3 ) 在标准品孔和待测样本孔分别加入5 0 9 l 酶联亲合物，充分混匀。( 4 ) 3 7 温育6 0 m i n 后充分弃尽各孔内液体，用稀释好的洗涤液反复冲洗5 次，扣干孔内剩余水分。( 5 ) 每孔依照次序，分别加入显色液a 和显色液b 各5 0 9 l ，充分混匀，在室温( 1 8 2 8 ) 下避光反应1 5 m i n 。( 6 ) 反应过后( 正常情况下为蓝色并带有明显的梯度) 每孔加入终止液5 0 9 l ，充分混匀( 正常情况下应转变为黄色) ，终止反应。( 7 ) 用酶标仪在4 5 0 n m 测定o d 值。1 0徐州医学院硕士学位论文( 8 ) 结果计算：分别计算各标准品及样本的s s o 数值( s = 标准品或样本o d值；8 0 浓度为1 2 p g m l 的标准品的o d 值) ：以标准品浓度作为横坐标，s i s o 数值为纵坐标，在对数坐标纸上绘制标准曲线；在绘制好的标准曲线图上查找每个样本对应的浓度。3 2 2 血浆i l 6 的检测步骤( 1 ) 实验前将试剂盒及待测标本放置室温( 1 8 0 2 8 。0 ) 平衡，并确定本次检测所需酶标板孔数目。( 2 ) 将标准品各1 0 0 1 上1 依次加入一排孔中，处理后的标本按1 0 0 1 d 每孔加入，并做好标记。( 3 ) 在标准品孔和待测样本孔分别加入5 0 1 1 1 酶联亲合物，充分混匀。( 4 ) 3 7 温育6 0 m i n 后充分弃尽各孔内液体，用稀释好的洗涤液反复冲洗5 次，扣干孔内剩余水分。( 5 ) 每孔依照次序，分别加入显色液a 、显色液b 各5 0 1 d ，充分混匀，在室温( 1 8 - 2 8 ) 下避光反应1 5 m i n 。( 6 ) 反应过后( 正常情况下为蓝色并带有明显的梯度) 每孔加入终止液5 0 1 d ，充分混匀( 正常情况下应转变为黄色) ，终止反应。( 7 ) 用酶标仪在4 5 0 n m 测定o d 值。( 8 ) 结果计算：分别计算各标准品及样本的s s o 数值( s = 标准品或样本o d值：s o 浓度为2 4 p g m l 的标准品的o d 值) ；以标准品浓度作为横坐标，s s o 数值为纵坐标，在对数坐标纸上绘制标准曲线；在绘制好的标准曲线图上查找每个样本对应的浓度。3 3 肺组织h e 染色及病理形态学检查右肺中叶用1 0 e 0 醛固定、石蜡包埋、连续切片，厚度为4 9 m ，苏木素伊红( h e ) 染色。然后，在普通光镜下观察肺组钐 组织形态学改变。依据炎症和上皮细胞脱落程度将炎症分为4 等级，“”= 未见炎症细胞浸润；“+ ”= 少量炎症细徐州医学院硕士学位论文胞浸润；“卅 = 见大量炎症细胞浸润，并可见管壁破坏、红细胞浸润及( 或)上皮脱落；“+ + 力介于“+ 和“卅之间。3 4n f - r d b 免疫组化右肺中叶用1 0 甲醛固定，常规切片。采用s a b c 免疫组化法染色，d a b 显色。完成后干燥、封片，普通光镜下观察。3 4 1n f - k b 免疫组化方法( s a b c 法)( 1 ) 切片将兔肺组织石蜡块连续切片，厚度为5 9 m 。( 2 ) 切片脱蜡二甲苯常规脱蜡2 次，每次1 0 m i n 。脱蜡后切片依次放入1 0 0 、9 0 、8 0 、7 0 乙醇中各5 m i n ，p b s 漂洗2 次，每次5 m i n 。( 3 ) 每张切片滴加0 3 i - 1 2 0 25 0 9 l ，室温( 18 。c - 2 8 。c ) 下孵育1 0 m i n ，以灭活内源性过氧化物酶，p b s 漂洗3 次，每次5 m i n 。( 4 ) 热修复抗原将切片浸入0 0 1 m 枸橼酸缓冲液( p h6 o ) 中，微波炉加热至沸腾后断电，间断( 5 1 0 ) m i n 后再重复加热至沸腾，共2 次。自然冷却，p b s( p h7 2 7 6 ) 漂洗2 次，每次5 m i n 。( 5 ) 滴加5 b s a 封闭液，室温( 1 8 2 8 。c ) 2 0 m i n ，甩去多余液体，不洗。( 6 ) 滴加一抗即用型抗兔n f r , b p 多克隆抗体( 1 ：1 0 0 ) ，湿盒内4 。c 冰箱过夜，p b s 漂洗3 次，每次5 m i n 。( 7 ) 滴加生物素标记的二抗生物素化山羊抗兔i g g ，3 7 。c 孵育2 0 m i n ，p b s 漂洗3 次，每次5 m i n 。( 8 ) 滴加试剂s a b c ，3 7 孵育2 0 m i n ，p b s 漂洗4 次，每次5 m i n 。( 9 ) d a b 显色取l m l 蒸馏水，加入d a b 试剂盒中a 、b 、c 液各一滴，依次混合，避光，半小时内使用。在显微镜下显色( 5 1 0 ) m i n ，自来水终止反应。( 1 0 ) 苏木素复染，盐酸酒精分色( 1 2 ) s e c ，充分水洗，依次7 0 、8 0 、9 0 、1 0 0 乙醇中脱水各5 m i n ，二甲苯透明，中性树胶封片。3 4 2n f k b 免疫组化镜检徐州医学院硕士学位论文每张切片在高倍镜下选择5 个视野，黄染者为阳性；并观察着色部位，细胞核阳性者表示存在核移位。每个视野记数每1 0 0 个肺泡细胞中阳性细胞个数，取其平均值作为该标本的n f r d 3 染色阳性率。n f 1 出细胞阳性率分为4 个等级：“为未见阳性细胞或阳性率 7 5 。阳性染色率的4 个等级分别记为1 分、2 分、3 分和4 分。4 统计学处理应用s p s s l 6 0 统计软件进行统计，计量资料采用多因素方差分析，先行方差齐性检验，方差齐，各组间两两比较采用s n k - q 检验。数据均用朋如埘士- s 掰表示，等级资料采用半定量非参数检验，u t i 三亚组剂量关系与肺损伤评分作s p e a r m a n 相关分析，p 0 0 5 认为有统计学意义。徐州医学院硕士学位论文结果1 达到休克所需时间及平均动脉压( m a p ) 的变化各实验组基础m a p 差异无统计学意义。静注e t 后，5 组兔达到休克标准所需时间差异无统计学意义。静注e t 后，各组m a p 均显著下降，约5 0 m i n 达到感染性休克标准。在造模成功即刻( o h ) 各组问m a p 差异无统计学意义；随后2 h内对照组、d x m 组及u 1 组、u 2 组m a p 继续下降，于2 h 时m a p 达到最低点，随后逐渐上升；o h 后u 3 组m a p 未见继续下降；组内各时间点两两比较差异都有统计学意义( 萨0 0 5 ) 。组间比较显示：在休克后2 h 、6 h 和1 2 h 等时间点，d x m组和u t i 组的m a p 显著高于对照组( 萨o 0 5 ) ；3 个u t i 亚组又显著高于d x m组，差异有统计学意义( 压o 0 5 ) ；3 个u t i 亚组之间比较显示u 3 组m a p 高于u 2 组，u 2 组又高于u l 组，差异有统计学意义( p 0 0 5 ) 。见表1 和图1 。表1 休克前后不同时间点m a p 的比较( m e a n s 士s t d ，n = l o )与对照组比较，肇 o 0 5 ；与d x m 组比较，k o 0 5 ；与u l 组比较，7 k o 0 5 ；与u 2 组比较a p 0 0 5 。2 呼吸频率( r r ) 的变化各实验组基础r r 的差别无统计学意义。静注e t 后，5 组兔r r 开始加快，达休克标准( o h ) 时r r 达高峰，各组问差异无统计学意义；在给予干预药物后，r r 丌始下降，各组在2 h 、6 h 和1 2 h 等时间点的r r 均小于o h ，差异有统计学意义( p o 0 5 ) 。在2 h 、6 h 、1 2 h 时问点，与对照组相比，d x m 组和3 个u t i 亚组1 4徐州医学院硕士学位论文的r r 均显著低于对照组，差异有统计学意义( 正o 0 5 ) ；3 个u t i 亚组的r r 又显著低于d x m 组；3 个u t i 亚组之间比较显示u 3 组和u 2 组r r 显著低于u l 组，差异有统计学意义萨o 0 5 ) 。在2 h ，u 3 组的r r 显著低于u r 2 组，差异有统计学意义( o 0 5 ) 。见表2 和图2 。此外，在注射e t 之后l h 内各组动物均出现不同程度口唇、耳缘紫绀，腹泻。表2 休克前后不同时间点r r 的比较( m e a n s 士s t d ，n = l o )注：与对照组比较，毫f o 0 5 ；与d x m 组比较，红o 0 5 ；与u 1 组比较，0 o 0 5 ；与u 2 组比较，萨o 0 5 。3 血浆中t n f - a 的水平变化在休克o h ，各组兔的血浆t n f a 水平无显著差异。对照组、d x m 组、u 1 组和u 2 组的血浆t n f a 水平呈先升高后下降的变化趋势，第4 h 达高峰，第2 h 和第4 h 血浆t n f a 水平显著高于o h ，差异有统计学意义( 西o 0 5 ) ；随后逐渐下降，对照组及d x m 组在休克6 h 虽未下降致o h 水平，但差异仍有统计学意义( 萨o 0 5 ) ，在1 2 h 又显著低于休克o h 的水平，差异有统计学意义( 正0 0 5 ) 。d x m 组t n f a 水平较对照组各对应时间点水平低，差异有统计学意义( 萨o 0 5 ) ；3 个u t i 亚组又较d x m 组低，差异有统计学意义( p o 0 5 ) 。其中u 2 组低于u l 组，差异有统计学意义( 0 0 5 ) ；u 3 组在给药后t n f a 水平未见上升，各时间点t n f a水平明显低于其他各组对应时间点t n f a 水平，差异有统计学意义( p 0 0 5 ) ，见表3 和图3 。表3 休克前后不同时间点t n f a 水平的比较( m e a n s j ：s t d ，n = l o )徐州医学院硕士学位论文注：与对照组比较，母0 0 5 ；与d x m 组比较，“垮o 0 5 ；与u 1 组比较，萨o 0 5 ；与u 2 组比较，p 0 0 5 。4 血浆中i l 6 的水平变化在休克0 h ，各组兔的血浆i l 6 水平无显著差异。对照组、d x m 组及u 1 组i l 6水平在2 h 达高峰，比休克0 h 明显升高，差异有统计学意义( 正o 0 5 ) ，随后逐渐降低；在休克4 h ，对照组及d x m 组下降接近o h 水平，但差异仍有统计学意义( 庐o 0 5 ) ，3 个u t i 亚组血浆i l 6 水平下降休克0 h 水平以下，差异有统计学意义( p 0 0 5 ) 。在6 h 、1 2 h ，对照组、d x m 组及3 个u t i 亚组则显著低于休克o h 的水平，差异有统计学意义( 胙o 0 5 ) 。其中，d x m 组和u 1 组较对照组各对应时间点水平低，差异有统计学意义，u 1 组又较d x m 组低，差异有统计学意义( o 0 5 ) 。u 2 组、u 3 组在给药干预后i l 6 水平未见上升，各时间点血浆i l 一6 水平均低于休克o h 的水平，u 3 组各时间点i l 6 水平又明显低于u 2 组及其他各组对应时间点i l 一6 水平，差异有统计学意义( 西o 0 5 ) ，见表4 和图4 。表4 休克前后不同时间的i l 6 水平的比较( m e a n s 士- s t d ，n = l o )注：与对照组比较，毫f o 0 5 ；与d x m 组比较，红o 0 5 ；与u 1 组比较，a p o 0 5 ；与u 2 耋f l 比较，p 0 0 5 。5 肺组织病理形态学改变及肺损伤评分徐州医学院硕士学位论文对照组大体形态见肺组织明显水肿、出血( 见图5 ) ，病理形态可见广泛性肺不张、肺水肿，肺泡腔内出血、大量炎性细胞浸润，肺泡壁破坏，肺泡间质有炎性浸润、上皮脱落，血管周围有明显的水肿套，微血管内皮细胞肿胀等( 见图1 0 ) 。d x m 组大体形态仍见肺组织水肿、出血( 见图6 ) ，病理形态可见局灶性肺不张及肺水肿、出血、炎性细胞浸润、管壁破坏( 见图1 1 ) 。给予u t i 干预后肺组织病理改变明显较对照组及d x m 组明显减轻，u 1 组见少量肺不张、肺水肿、肺泡管壁破坏明显减少，肺泡腔内少量炎性细胞浸润及出血灶( 见图7 和图1 2 ) ；u 2组未见肺不张，轻度肺水肿，少许炎性细胞浸润，较u 1 组减轻( 见图8 和图1 3 ) ；u 3 组肺泡壁无明显破坏，未见肺泡水肿，无出血、渗出，肺泡间质无炎性浸润，纤维结缔组织无增生，支气管黏膜上皮完整( 见图9 和图1 4 ) 。各组损伤程度评分后转化成多个独立样本非参数秩和检验两两比较，d x m 组和u t i 组肺损伤评分较对照组显著减轻，差异有统计学意义( 尸 0 0 5 ) ；u t i 组又较d x m 组进一步减轻，其中以u 3 组肺损伤最轻，差异有统计学意义( 尸 o 0 5 ，见表5 ) 。u t i 三亚组剂量关系与肺损伤评分作相关分析，s p e a r m a n 相关系数( 以一0 4 6 1 ) ，k e n d a l l 相关系数( 珞一0 4 0 5 ) ，均为p 0 0 1 ，提示u t i 剂量关系与肺损伤评分呈负相关关系，即：剂量越大，肺损伤越小。表5 各组兔肺组织损伤评分白= j d )注：与对照组比较，毫萨o 0 5 ；与d x m 组比较，k o 0 5 ；与u 1 组比较，a p o 0 5 ；与u 2 组比较，o 0 5 。6 肺组织n f - k b 表达对照组肺组织n f k b 表达明显增强，表现为着色范围最广、颗粒颜色最深，多1 7徐州医学院硕士学位论文表达在肺泡上皮细胞、血管及支气管肺泡壁，阳性染色率达9 0 ，阳性率积分为4分。d x m 组肺组织n f r b 表达仍较强，着色范围大、染色深，阳性染色率达8 0 ，阳性率积分为3 分。3 个u t i 亚组肺组织n f r , b 表达明显减少，u 1 组阳性染色率4 5 ，阳性率积分为2 分；u 2 组阳性染色率3 0 ，阳性率积分为2 分；u 3 组阳性染色率2 0 ，阳性率积分为1 分。将阳性率等级积分转换为多个独立样本非参数秩和检验两两比较，d x m 组和u t i 组阳性率积分较对照组低，差异有统计学意义( 户i o 0 5 ) ；3 个u t i 亚组又较d x m 组低，其中以u 3 组积分最低，差异有统计学意义( 氏o 0 5 ) ，见表5 和图1 5 1 9 。表6 各组兔肺组织n f r , b 阳性率评分锄= j 功注：与对照组比较，奎尸o 0 5 ；与d x m 组比较，勺k o 0 5 ；与u 1 组比较，萨o 0 5 ；与u 2 组比较，正o 0 5 。徐州医学院硕士学位论文讨论感染性休克是当前重症医学面临的主要焦点及难点，感染性休克所导致的a l i 、s i r s 及m o d s 是一个相互关联、互为因果的复杂过程。在致病因素作用下，炎症介质和多种细胞因子相互作用形成十分复杂的网络，即使原发致病因素消除或减弱，炎症反应仍可继续。目前认为，t n f c c 是感染性休克早期最主要的炎性细胞因子，是引起感染性休克的关键介质，是炎性细胞因子爆发的中心【2 】；在炎性反应初期，t n f a 可动员血循环中的多形核中性粒细胞( p m n ) 向炎症部位聚集，并能动员骨髓白细胞进入血液循环，同时激活内皮细胞释放e 选择素、l 选择素、细胞间黏附分1 和血管黏附因子1 等黏附因子，进一步诱导i l 1 、i l 6 、i l 8 、集落刺激因子( c s f ) 等细胞因子的分泌，共同参与炎性反应。当p m n 被激活后，t n f q又能增强p m n 的吞噬能力，促进p m n 脱颗粒和释放溶酶体，增强p m n 呼吸爆发，产生大量脂质代谢产物，介导毛细血管内皮细胞损害，破坏毛细血管内皮细胞的屏障功能，刺激内皮细胞释放大量组织因子，同时抑制纤溶活性，损害毛细血管的抗凝功能，引起微血管舒缩异常和微血栓形成。在此过程中，t n f 0 【又能激活单核巨噬细胞及p m n 自身再次释放t n f a 、i l 1 等炎性介质，形成正反馈进一步释放大量促炎因子，放大和延续全身或局部炎性反应，最终导致炎症失控【1 3 1 。t n f 0 【还通过直接抑制血管平滑肌诱导内皮细胞诱导型一氧化氮合酶( i n o s ) 产生大量n o ，引起血管扩张、血压下降、组织灌流减少，使毛细血管通透性增加、血浆外渗、回心血量减少，最终导致休克不可逆的发生。i l 一6 是t 细胞和b 细胞活化的辅助细胞，与t n f 0 【协同作用促进t 细胞的增殖，机体在严重的感染和创伤等应激状态下产生的儿茶酚胺能使虹浆中i l 6 的浓度显著上升。i l 一6 与败血症患者的病死率有最好的相关性【3 1 ，可敏感地反应组织损伤的程度，血浆i l 6 和t n f a水平均很高的败血症患者一般预后不良，相反若血浆i l 6 水平迅速下降，即使t n f 0 【水平很高，病人的存活率也较高。1 9徐州医学院硕士学位论文目前已经明确，编码t n f a 、i l - 6 和i l - 8 等炎性细胞因子的基因是由n t r , b控制表达，静息状态下n f - r b 多以p 5 0 和p 6 5 二聚体的形式与其抑制蛋白相结合而存在于胞浆中，呈无活性状态。外源性刺激如e t 、缺血再灌注等通过一系列信号转导引起抑制蛋白降解，导致n f r b 抑制蛋白复合物解体，n f r b 活化进入细胞核，在核内与靶基因的特异序列结合并启动转录发挥其调控作用。n f k b 活化的细胞因子激活途径：细胞因子通过磷脂酞肌醇特异性蛋白激酶c 途径、丝苏氨酸激酶等信号转导途径活化n f 一1 毋；反过来n f k b 的调节产物，如t n f a ，i i _ , - 1 1 3又能激活n f r b ，从而形成一个能放大且延续炎症反应的复杂调节环路，导致“瀑布效应”的发生。许多基因的启动子、增强子都有功能性的n f 1 出接合位点，n f r b活化后能调控一系列基因的表达，影响t n f - a 、i l - 1 、i l 6 、i n o s 以及细胞间黏附分子1 等炎性因子和介质的产生和释放，这些物质都能直接或间接地参与感染性休克及后续多器官功能损伤的发生、发展。既往制作兔肺损伤模型，内毒素剂量多采用( 5 0 0 7 0 0 ) u 眺g ，但这- - n 量在2 h 内很难或者根本就不能达n m a p 下降致3 0 的感染性休克模型成功的标准。本实验按n - s 宏博【1 2 1 的实验方法复制兔感染性休克模型，采m e t 2 m g , k g 静脉注射，实验中发现在给予e t 后，呼吸频率开始加快，5 0 m i n 内m a p 下降3 0 达到复制感染性休克的标准，1 h 内出现口唇、耳缘紫绀，腹泻。虽然对感染性休克的病理生理学机制和临床治疗进行了大量研究，然而迄今为止其死亡率仍然居高不下【1 4 】。临床上尚无有效而特异的药物或治疗方法，尽管有一些抗内毒素抗体、抗细胞因子抗体，如抗t n f o 【、i l 1 、i l 6 、i l 8 等抗体在实验中被应用，实验也证实这类抗体能降低感染性休克的死亡率，但由于细胞因子数量及其种类繁多相互作用复杂，形成了一个级联的网络系统，仅针对几种细胞因子或介质的治疗难以阻止感染性休克的发展，目前仍以祛除病囚、控制感染和非特异治疗为主。u t i 是一种尿胰蛋白酶抑制剂，能广谱、高效地抑制多种蛋白酶、脂水解酶、2 0徐州医学院硕士学位论文糖水解酶和不良刺激所引起的炎性因子的稀放，抑制炎症反应，阻断s i r s m o d s的进展，抑制多种蛋白酶对器官损害；u t i 还能减轻氧自由基、炎症介质和细胞因子等引起的血管内皮细胞破坏，具有保护修复毛细血管内皮细胞的作用；u t i 具有糖皮质激素样作用，但无激素的副作用，在急危重症的救治中，可在一定程度上代替糖皮质激素【1 5 】；临床已广泛应用于急危重症及脓毒血症时的脏器保护。临床研究证实u t i 对多脏器损伤有很好的保护作用【5 】，邵义明等【1 6 1 研究显示u t i 能有效地改善s i r s 所导致体温、呼吸、心率、脉搏等临床体征的改变，降低脓毒血症患者t n f a 、i l 1 、i l - 6 、i l 8 的水平【1 7 1 ，抑制炎症反应，增加抗炎症因子释放。正常情况下，体内本身就有一定量的u t i ，同时u t i 进入体内后会迅速分解成低分子量的成分，这些低分子量的成分仍有很强的活性，且与u t i 的结构类似。测定u t i 的血药浓度存在一定的难度，从安全性上来看，中国军事医学科学院用兔模型【1 8 1 测定的u t i 安全剂量大于( 3 7 5 x 1 0 1 1 ) u k g ，本实验予以( 1 0 x 1 0 4 ) u k g u t i符合大剂量初步标泄18 1 。u t i 的临床常规用量为( 1 0 x 1 0 4 ) k u d ( 2 0 x1 0 4 ) k u d ，多项试验研究证实u t i 的疗效与其用量呈剂量正相关性【5 】，在感染性休克的治疗中，u t i 的使用剂量问题尚无定论，景炳文等【5 1 多推荐超大剂量的使用，其合理的、最佳用药剂量仍在探讨中。本实验采用e t 诱导感染性休克模型，通过观察兔m a p 、r 等生命体征的变化和血浆t n f a 、i l 6 水平变化及肺组织病理形态学改变和肺组织n f k b 表达情况，研究u t i 对e t 诱导的感染性休克兔肺的保护作用及其机制。结果显示u t i 能显著改善e t 所致感染性休克兔的血流动力学指标，效果明显优于地塞米松组，与文献【1 6 】报道一致。且随着剂量的加大，作用效果更加明显；大剂量u t i 能明显改善肺组织病理形态学变化，肺损伤评分显示，肺损伤评分与剂量呈负相关性，亦表明u t i能很好的改善感染性休克对肺的损伤、攻击，与文献报道一致【17 1 。且随着剂量越大加大，作用效果越明显。本实验显示u t i 能明显的抑制感染性休克血浆中t n f a 、i l 6 水平，降低感染2 l徐州医学院硕士学位论文性休克发病过程中的关键炎性介质，同时在n f - r b 表达方面，给予u t i 后，肺组织中n f 心的表达明显低于对照组和d x m 组，且随着剂量的加大，着色范围、着色深度逐渐减轻。说明u t i 可通过抑锖i n f r , b 信号转导通路减少t n f a 、i l 6 的表达，阻断t n f a 、i l 6 等炎症因子引起的炎性失控反应，回缩血管，回升血压、改善组织灌流，减少毛细血管通透性、增加回心血量，抑制休克不可逆的发生。且随着剂量的加大，作用越明显。2 2徐州医学院硕士学位论文结论本实验条件下：1 u t i 能改善e t 所诱导的感染性休克兔的m a p 、r r 和t n f a 、i l 一6 的变化，尤以大剂量改善效果更明显。2 u t i 对e t 所诱导的感染性休克兔肺损伤有明显的保护作用，且u t i 的肺保护作用与剂量成正相关性。3 通过抑制n f r b 信号转导通路抑制t n f a 和i l 6 的表达是u t i 肺保护作用的重要机制之一。1 一耋7 0羞卯徐州医学院硕士学位论文论文图片基础嘶抽曲1 矗时鲥f h l图1 各组各时间点m a p 变化曲线图2 各组各时间点呼吸的变化曲线图3 各组各时间点t n f a 变化曲线图4 各组各时间点i l 6 变化曲线2 4徐州医学院硕士学位论文图5 对照组肺组织明显水肿、出血。图6 d x m 组肺组织仍有水肿、出血。图7 u l 组肺组织水肿出血较对照组明显减少。图8 u 2 组肺组织少量水肿、出血。图9 u 3 组肺组织未见明显水肿、出血。徐州医学院硕士学位论文图1 0 对照组病理变化( 肛染色，l o x l 0 倍)f i 9 10t h ec h a n g e so fm o r p h o l o g i c a li ng r o u pc o n( h e 1 0 x 1 0 )广泛性肺不张、肺水肿、肺泡壁破坏、增宽、融合成片、出血，大量炎性细胞浸润。图1 1d x m 组病理变化( 既染色，1 0 x 1 0 倍)f i g llt h ec h a n g e so f m o r p h o l o g i c a li ng r o u pd x m( h e 1 0 x 1 0 )肺泡壁破坏、肺泡腔内出血，大量炎性细胞浸润，较对照组稍有减轻。图1 2u 1 组病理变化( 髓染色，1 0 x 1 0 倍)f i g l 2t h ec h a n g e so f m o r p h o l o g i c a li ng r o u pu 1( h e 1 0 x 1 0 )肺泡壁破坏、肺泡腔内少量出血，少量炎性细胞浸润，较d x m 组减轻。徐州医学院硕士学位论文图1 3u 2 组病理变化( 既染色，1 0 x 1 0 倍)f i 9 1 3t h ec h a n g e so f m o r p h o l o g i c a li ng r o u pu 2( h e ，1 0 x 1 0 )肺泡壁破坏减少、少许炎性浸润，肺泡腔内未见明显出血。图1 4 u 3 组病理变化( 髓染色，1 0 x 1 0 倍)f i g l 4t h ec h a n g e so f m o r p h o l o g i c a li ng r o u pu 3( h e 1 0 x 1 0 )肺泡壁基本正常、肺泡腔内无出血、浸润。图1 5 对照组n f r b 表达( s a b c 法，d a