（植物学专业论文）喜树悬浮培养细胞生理特性的初步研究.pdf

摘要 喜树碱是一种色氨酸一萜类生物碱，具有抗癌、清热、杀虫功能，是继紫杉 醉之后的第二个从植物提取的衍生抗癌药物，具有积极的丌发前景。但目前的 研究情况和国内外的研究趋势来看，喜树碱及类似物主要是从喜树中分离获 得，其产量必受到喜树生长发育和环境因素的影响，因此通过高等植物细胞培 养生产次生代谢物质喜树碱将是一个很好的选择。本文以喜树( 凸印捌 e f a a c 一，一抬d e c s n ec p a ) 愈伤组织为材料，比较系统的研究了悬浮培养条件下光 照、激素以及多种理化因子喜树细胞悬浮培养生长、生理生化特性的影响，使 喜树细胞培养生长速度有明显提高，为迸一步研究积累了资料。 1 植物生长调节物质的影响 不同种类、不同浓度的激素及其组合对细胞生长效应不相同。n a a 浓度为 0 5 m g l 时最有利于细胞生长；在n 从与k t 组合中，以n 从o 5 m g l + k t o 1 m g 1 的效果最佳，细胞生长速度最快。 2 生理生化特性的研究 在光照条件下，细胞生长周期为3 0 天；而在黑暗条件下，生长周期为2 7 天，细胞增殖曲线均呈“s ”型，可大致分为延迟期、指数生长期和静止期： 在两种光照条件下，其培养液的p h 先下降后都呈上升趋势；培养细胞中可溶 性蛋白质含量变化曲线相似，在1 2 天和2 l 天出现两个高峰，黑暗条件下的含 量低于光照条件下的含量：培养细胞的过氧化物酶活性变化曲线相似，均出现 两个高峰，第一个高峰均出现在第3 天，光照条件下的第二个高峰出现在1 5 天，而黑暗条件下出现在1 8 天；培养细胞超氧化物歧化酶活性变化曲线相似， 均出现两个峰值，光照条件下的第一个高峰出现在1 8 天，而黑暗条件f 出现 在2 l 天，两种情况下的第二个高峰均出现在第2 7 天。 3 不同理化因子的影响 在喜树细胞悬浮培养中，b 5 培养基和w h i t e 培养基较有利于细胞的生长； 适宜的接种量为3 4 9 鲜重1 0 0 m 1 培养基：随着蔗糖和葡萄糖浓度的升高，细 胞生长速度呈上升趋势，且在浓度为3 乃4 g l 时最有利于细胞生长：添 加适宜的琼脂糖能促进细胞生长：n 0 ；和n 。+ 的比例不同，细胞生长效应也不同。 最后，对作为药用资源的植物细胞悬浮培养进行了总结，对细胞悬浮培养 的丌发，出现的问题以及对这些问题的探索进行了讨论。同时对今后的研究方 向也作了展望。 关键词：光照激素化学因子细胞悬浮培养细胞生长喜树 a b s t r a c t c a n l d t o t h e c i ni s ak i n d o fa n t i c a n c e rm e d i c i n eh a v i n gg o o dp r o s p e c to f ：x p l o i t a t i o n ，c p ta n da n a l o g u ea r eg e tf r o mc p a a t t h em o m e n t ， o u t p u to fc p t 、v a se f k c t e db yt h eg r o 、v t ha n de n v i m n m e n to fc p a s op r o d u c t i o no fc p tb y c e l ic u l t u r e m a yb e a p r o m i s i n g c h o i c ei nt h e p a p e r ，b a s e d o nc a l l u so f ( 力疗卿，d ，抛c 口口c “m f 门口幻d e c s n e ，t h ei n n u e n c e so fl i g h t 、h o n n o n e sa n ds e v e r a l r a c t o r so nt h e 掣o 、v t h 、 p h y s i 0 1 0 9 i c a l 、 b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r so fs u s p e n s i o n ( ，u l t u r e o f ( 勿一鲜，o f 向e c 日口c “，”f d f 口d e c s n e w e r es y s t e m a t i c a l l ys t u d i e d ，c e l l g r o 、v t hs p e e d w a so b v i o u s l yi m p r o v e d ，i tw o u l d g i v er e f e r e n c e sf o rf u t u r es t u d i e s 1 e f f e c t so fh o r m o n e s d i 仃宅r e n tk i n d s 、d i m r e n tc o n c e m r a t i o na n dc o m b i n a t i o n so fh o r m o n e sh a d ( 1 i 腑r e n te 腩c t so nc e l lg r o 州h o 5 m g ln a aw a so p t i m a lf o rt h ec e l lg r o 叭h ； a m o n g t h ec o m b i n a t i o no f n a aa n dk t ，o 5 m g l n a a + 0 1 m g l k tw a so p t i m a lf o r i h ec e l lg r o w t h 2 s t u d yo fp h y s i o l o g i c a i a n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r s w h e nc p aw a sc u l t u r ei nt h el i g h ta n di nt h ed a r k ，b o t ho ft h e i rc e l lg r o w t h c u r v e sw e r el i k e “s ”， b u tt h e i r g r o 、v t h c i r c l e sw e r ea b o u t3 0a n d2 7d a y s t e s p e c t i v e l y ，i tc o u l db ed i v i d e di n t ol a gp h a s e 、e x p o n e n t i a lg r o w t hp h a s ea n d s t a t i o n a l _ yp h a s e t h ec e l lg r e wm o r er a p i d l yi nt h ew h i t el i g h tt h a ni nt h ed a r k ；t h e p hv a l u e so fc u l t u r em e d i u m sl o w e r e da n dt h e ns h o w e du p g r a d u a l l y ；1 w op e a k so f s o l u b l ep r o t e i nc o n t e n t sa n dp e r o x i d e sa n d s u p e r o x i d ed i s m u t a s ea c t i v i t i e s o f c u l t u r ec e l l w e r es h o w e du p ，b u tt h e yw e r eo nt h ed i 舒；r e n t d a y s ；t h e s o l u b l e p m t e i n c o n t e n tw a s h i g h e r i nt h ew h i t e l i 曲t 3 e f k c t so fd i f f e r e n tp h y s i c a la n dc h e m i c a lf a c t o r s i nt h es u s p e n s i o nc u l t u r e ，b 5 m e d i u ma n dw h i t em e d i u mw e r eo p t i m a lf o rc e l l 酎。蚍h；t h e i n o c u l u r l l s q u a n t i t y o f 3 4 9 f w l 0 0 1w a sb e t t e rf o r t h ec e i i i i i 硕士学位论文 m a s t r st i i e s i s g r o w t h ；t h eg r o w t hr a t e i n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n gc o n c e m r a t i o n so fs u c r o s e a n dg l u c o s e ；t h em e d i u mw i t hc e r t a i nc o n c e n t r a t i o no f a g a r o s ec o u l di n c r e a s et h e g r o w t hr a t e ；e f f e c to f c u l t u r a lc e l lg r o w t hw a s d i f k r e n tw i t hd i f r e r e n tp r o p o r t i o no f n 0 3 a n dn h 4 + f i n a l l y ，t h ec o n d i t i o n si nc e l ls u s p e n s i o nc u l t u r eo fs o m e m e d i c i n ep l a n t sw e r e a n a l y z e d ；r e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n t 、 p r o b l e m sa n dr e s o l u t i o n sw e r ed i s c u s s e d ； p r o s p e c t so ff m u r e r e s e a r c h e sw e r ea l s og i v e n ， k e yw o r d s ：l i g h t 、h o r m o n e 、p h y s i c a la n dc h e m i c a lf a c t o r 、 c e l is u s p e n s i o n c u l n l r e 、c e l lg r o w t h 、c 白，妒f o ，向p c 口口c “，”f 门d f 口【) e c s n e 第一章前言 喜树( 国印f o f 厅e c aa c 伽加a d e c s n e ) 属珙桐科( n y s s a c e a e ) 旱莲属植 物。落叶乔木。分郝于我国长江流域及西南各省和印度部分地区，台湾、广西 等也有栽培。1 9 6 6 年美国的m o n r o ee w a l l 等从喜树的树皮中分离出喜树碱 ( c a m p t o t h e c i n ，c p t ) ，并确定了它的化学结构，经肿瘤试验证明这种色氨酸萜 烯类生物碱具有抗癌活性，从而引起人们的广泛关注”1 。7 0 年代初用c p r 进行 人体胃肠癌的实验性治疗，对部分病人的症状有所缓解。由于c p t 的毒性和令 人难以忍受的副作用如恶心、呕吐，以及制成水溶液的钠盐后抗癌活性有所降 低等原因，使试验受阻，c p t 的研究由此进入低潮阶段”。1 9 8 5 年，y 1 ls a n g “ 等发现c p t 能阻断拓扑异构酶i ( t o p o i s o m e r a s ei ，t o p oi ) 的合成。t o p of 是一种与细胞分裂密切相关的一种酶，阻断这种酶的产生即可阻止癌细胞的生 长，说明c p t 作用靶是t o p oi 而不是拓扑异构酶i i ( t o p o i i ) ，这i f 是c p t 独特 的抗癌机理。这一发现掀起了喜树与c p t 研究的新高潮。自1 9 8 j 年以来，尤 其是进入9 0 年代后，美国、只本、加拿大和英囤等国家积极投入大量的人力、 物力进行喜树研究与c p t 的开发，使喜树成为红豆杉之后第二个重要的木本抗 癌药用植物，已成为世界性热门研究课题。 喜树体外培养始于7 0 年代初。】9 7 3 年m i s a w a 等”1 进行了喜树的组钐 培养。 他们从喜树茎、时等得到的愈伤组织及培养细胞。分别培养1 月和1 5 天后能 积累c p t ，但含量低，仅为原始植物的十分之。s a k a t o ”“”等于1 9 7 4 年报道 了喜树愈伤组织和悬浮培养细胞的生长情况以及从悬浮培养细胞中分离年1 1 鉴 定c p t 的方法。1 9 9 2 年a r j o n 1 又试验了不同培养基上喜树愈伤组织诱导和细 胞悬浮培养的情况。1 9 9 6 年a s h o k 等“”又成功地通过项芽培养，实现了喜树的 克隆繁殖，且移栽成活率超过9 0 。 近年来关于喜树细胞培养的研究主要在以下几个方面。 硕士学位论文 m a s t e r st i 怔s i s 1 喜树化学成分及药理学的研究 1 1 喜树碱及其衍生物 喜树碱( c a m p t o t h e c in ，简称c p t ) 是从广泛分布在我国南方和印度的喜树 的根、皮、茎和种子中分得的生物碱。1 9 6 6 年美国北卡罗来纳大学、伊利诺伊 大学和n c i 的研究人员首次从喜树茎中提取分离得该生物碱并确定了它的化学 结构。由于该生物碱在体外对h e l a 细胞和。细胞及啮齿类动物显示较强的 抗癌活性，引起人们的极大关注。7 0 年代进入临床应用后，出于其对消化系统 和泌尿系统的毒性和副作用太大，几乎使其临床研究陷于停顿。1 9 8 5 年美国 h is a n g 等发现喜树碱抗癌机制是抑制拓朴异构酶i ( t o p oi ) ，这一重大发现使 它又重新受到广泛的重视。此后几年中，美、闩、英、加拿大等国合成了数百 个喜树碱的衍生物，有的已经或者即将进入临床研究。喜树碱终于成为继紫杉 醇之后的第二个从植物提取衍生的抗癌药物，成为又一个世界性的热门课 题。 依莲洛特肯( i r i n o t e c a n ，c p t 1 1 ) 为喜树碱的半合成品，其化学结构为7 乙基一l o ( 哌啶基一1 一哌啶基) 羧氧喜树碱，其水溶性优于喜树碱。由同本 y a k u l t d a i i c h i 公司丌发，对小鼠s 。，、l e w 】s 肺癌、胰癌o 。、黑色素瘤、 结肠癌3 8 及多种人癌裸鼠移植瘤均有效。用量1 0 0m g m j 周或3 j om g m 3 崩， 临床上对非小细胞肺癌、结直肠癌、卵巢癌、淋巴癌等有效。 拓朴特肯( t o p o t e c a n ，t p t ) ，又一一喜树碱的半合成品，其化学结构为( s ) 一9 ：二甲氨基一1 0 羟基喜树碱盐酸盐。对一系列小鼠肿瘤均有明显抗癌作用。对。 白血病、l e w i s 肺癌能治愈。对小鼠结肠癌3 8 及5 l 、5 0 7 6 网状细胞肉瘤、乳 癌1 6 c 及人结肠癌裸鼠移植h t 2 9 等均很有效。用量1 5m g ( m 。d ) 5 ，静滴。 临床上对非小细胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌有效。 美国超基因公司( s u p e rg e n ) 最近又从中国喜树中新获得一种抗癌有效成 分( 类似c p t1 1 和t p t ) ，命名为r f s 一2 0 0 0 ，也是拓朴异构酶i 抑制剂，据说 这是又一个紫杉醇，用它治疗胰腺癌( 一种死亡率极高的癌症) ，确诊后存活时 问平均为4 5 个月。目前r f s 一2 0 0 0 已给6 0 名胰腺癌患者使用，结果较为乐 观，存活率提高了1 倍，该药口服副作用很小。该公司还对4 2 名各种固体瘤 患者进行试用，认为该药将全面超过紫杉醇，预测2 年内将r f s 一2 0 0 0 推向市 场1 。 1 2c p t 及类似物的应用 国内外对喜树碱及其类似物的药理作用进行了大量的研究，结果表明这类 药物具有抗肿瘤、抗病毒和治疗皮肤病_ 三方面的作用。 1 21 抗肿瘤作用 c p t 及其类似物抗恶性肿瘤研究从7 0 年代丌始，虽然中间有所停顿，仍 取得了巨大的成就。动物试验表明c p t 对小鼠l 6 15 白血病、吉田肉瘤、肉瘤 j 8 0 、肉瘤3 7 及艾氏腹水癌等肿瘤均有一定的抑制作用，其中对小鼠白血病及 大鼠吉嗣肉瘤的疗效较为显著。前期临床试验表明，c p t 及其类似物对膀胱癌、 脑癌、乳癌、宫颈癌、结肠癌、神经腹质瘤、何杰金氏病( 淋巴网状细胞瘤) 、 白血病、肺癌、淋巴癌、黑色素瘤、卵巢瘤、胰腺瘤、儿科癌瘤、前列腺癌 u 肝癌等部有不同程度的疗效”“，周军等对c p t 和1 0 一o hc p t 抗肿瘤活性和毒性 进行比较，认为l o o hc p t 较c p t 的毒性小、“等毒性”抗肿瘤活性强。林国 础等对这种经转化得到的羟基c p t 进行了临床应用，现其在治疗涎腺肿瘤上与 天然羟基c p t 的疗效及副作用相似”。国内外众多学者对c p t 及其类似物的抗 肿瘤活性及作用机制、药代动力学、临床应用、与其它抗肿瘤药物的联合使用、 毒性反应和使用方法都进行了大量研究。 硕士学位论文 m a s t e r s t i 正s i s 1 22 抗病毒作用 作为t o p oi 抑制剂的c p t 及其类似物的研究已经完成或即将完成，科学家 们的注意力已逐步转向这些物质的抗病毒性能，特别是与h i v 有关的艾滋病领 域“。以色列b e ng u r i o n 大学的p r i e l 和其他同事发现d n a 拓扑异构酶i 在 h i v 复制中非常活跃“，低剂量的c p t 能阻断被感染细胞h i vi 的复制。c p t 类药物不仅对h i v1 有效“，而且对其它与义滋病有关的病毒也有效。 1 23 对其它疾病治疗作用 喜树碱的二甲基砜溶液治疗银屑病，疗效快、使用方便，且无副作用“。 针剂治疗的有效率达7 5 7 ，但有些头晕、膀胱炎等副作用。i 临床应用表明， c p t 有希望成为一种抑制青光眼滤过性手术后瘢痕形成的药物”“。其它应用c p t 被认为是一种光化学活性成分。浓度为1 l o m o l 儿的c p t 溶液能阻碍烟草和 玉米的生产，但对大豆和高粱生长没有表现出影响o ”。 1 3 c p t 的人工合成与药物开发 自喜树碱被证实具有抗肿瘤活性以来，便丌始了喜树碱及其类似物人工合 成的研究工作。美国北卡州三角研究所以w a ll 博士为首的研究组，近3 0 年来 一直从事喜树碱及其类似物的合成、结构与活性等方面的研究，对喜树碱的丌 发研究起着重要的作用”“。早在7 0 年代初期，s t o r k 和t a n g 根据喜树碱具有 扛元环的结构特点，分别以吡咯烷酮和比环酮酸为原料，先通过经典的 f r 沁d l a n d e r 缩合反应建立a 、b 环，然后在现成的d 环位置上连接构造e 环的 适当原子，经环合、氧化两步，制得( ) 一喜树碱。w a n i 等对喜树a 、c 、d 、 e 环的结构进行了初步修饰，提出e 环的d 羟基内酯部分是保持抗肿瘤活性的 必需结构”“。这样以吡啶酮为原料先合成d 、e 坏，得到重要的三环衍生物， 再与n ( o 氨基卞叉基) p 甲苯进行f r j e n d l a n d e r 的缩合反应，生成2 0 支氧喜 树碱，再进一步氧化成喜树碱。在喜树碱的化学结构中，a 、b 环的平面性是抑 制d 局部异构酶i 的重要因素，e 内酯环是活性的必需基因，c 1 4 位上的空 硕士学位论文 m a s | r e r st 王e s i s 问要求也直接影响内在活性”。因此在合成上不仅要考虑引入的取代基，同时 要考虑环系与取代基之间的关系，并注意取代基的性质。这种结构与治疗效果 之间的关系有待于今后进一步研究。 由于喜树碱的毒副作用，人们开发出了许多喜树碱的类似物或衍生物， 以及这些衍生物的衍生物。美国r t i 的研究人员将其分为3 代。第一代为喜树 中天然的8 种喜树碱类似物。目前正在研究和有限制的临床应用的为第2 代， 第三代是r t i 声称要开发的新产品。我国在6 0 7 0 年代曾对许多种类的中草药 进行筛选，于7 0 年代成立了全国的喜树研究协作组，在湖北黄石市召丌了“抗 癌药物羟基喜树碱鉴定会”( 1 9 7 5 ) ，也进行了大量的药理和临床研究，证实喜 树碱对肝癌、肠癌、膀胱癌和白血病等有一定疗效，但也有较大副作用”“，此 后由于种种原因无论是喜树碱还是l o o hc p t 的研究都没得到进一步的发展。 近年来，在药理、临床和栽培上开始有少量报道，但与国际形势相比，速度非 常缓慢，在中国专利中仅检索出3 5 条与喜树碱有关的内容，且许多专利权人 不是中国人。 2 喜树组织培养的研究 2 1 喜树愈伤组织的诱导 一般而言，植物组织培养可分为细胞培养和器官培养两大类。其中，细胞 培养法因具有相对快速的繁殖率，培养条件易于优化和控制，产物分离较容易 等优点而受到人们的关注。 用细胞培养法生产喜树碱的一般步骤为：诱导愈伤组织一继代培养一建立 悬浮培养一扩大培养。生产喜树碱由于珙桐科植物本身所具有的特殊性质，如 为木本，被子植物等，因此诱导喜树植物的愈伤组织是比较困难的。不同种属 或不同器官、组织及生长部位，外殖体内喜树碱含量不等，对应的诱导愈伤组 织的培养基组成以及培养条件均对愈伤组织的诱导产生不同程度的影响。 硕士学位论文 m a s t e r s l h e s i s 2 1 1 外殖体 由于细胞系的生长和喜树碱的生产受到多种因素的影响，各外殖体的诱导 能力存在很大的差异，而且诱导出的细胞进一步培养及生产次生代谢物的能力 砟i 尽相同。 喜树各器官中c p t 的含量存在着较大差异”“。近年来的研究结果表明组织 越幼嫩，c p t 的含量越高；枝( 叶) 龄越小，含量越高；皮部较木质含量高”。 喜树的幼叶、茎、芽等部分诱导愈伤组织都取得了成功。 2 1 2 培养基 喜树组织培养中愈伤组织的最佳诱导培养基和细胞悬浮培养的最适培养 基都是m s ( 盐类) + b 5 ( 有机类) 。喜树克隆繁殖中试管苗的最适培养基 是b 5 “。 2 1 3 植物激素 n a a 和2 、4 一d 是喜树组织培养中必要的激素因子。以叶片作为外殖体，当 2 、4d 为2 m g 1 叶片脱分化效果最好，其次为4 、1 、o 5 m g l 。以茎为外殖体 诱导愈伤组织的最佳激素组合为2 、4 一d o 1 m g l + k t o 1 m g 1 + n a a o 1 m g 】1 。在 喜树的克隆繁殖中，认为最适生芽培养基中的植物激素是b a ，最适生根培养基 中的植物激素是i b 。 2 1 4 培养条件 在喜树组织培养中，光照和温度对愈伤组织的生长和发育、不定芽和不定 根的产生、代谢物的积累等都有不同程度的促进或抑制作用。喜树叶片在离体 培养过程中，最适宜的光质为蓝光和黄光，其次为绿光和黑暗。红光与白光条 件下的脱分化率最低：同时发现蓝光有利于促进p o d 和s o d 活性的提高。最适 叶片脱分化温度为2 5 一2 7 。r 照时间1 4 1 0 h 。固体培养基d h 6 ，5 ，而悬 浮培养中最佳p h 为4 ，3 。 6 硕士学位论文 m s 1 e r st i e s i s 2 2 愈伤组织继代培养 由外殖体诱导形成的愈伤组织开始比较紧密，只有经过较长时间的多次继 代培养，愈伤组织变得较疏松时，j 唷进行悬浮培养。并非愈伤组织形成越快 越好，其早期生长时间对培养将产生显著的影响。g i b s o n 在研究短叶红豆杉细 胞时发现，较早期形成( 2 周内) 的愈伤组织在继代培养时，细胞并不增殖， 组织发生褐化以至坏死。而在诱导培养基上4 周一4 个月形成的愈伤组织，以 卜2 个月的间隔进行继带培养时，愈伤组织可以持续生长。 23 喜树细胞悬浮培养 植物细胞悬浮培养是工业化生产的必经步骤。它的特点是培养规模较大， 细胞增殖速度快和能提供较大量均匀一致的培养物”“。 s a k a t o 和a r j o n 分别于1 9 7 4 年和1 9 9 2 年报道了喜树细胞的悬浮培养。 s a k a t o “”1 研究表明外殖体的大小是决定悬浮培养细胞开始生长的关键因子，但 提高接种细胞量并不一定能提高最终的产物。接种量以2 m g l ( 以细胞于重计) 为佳，分别用o 1 1 5 m m o l l 的色氨酸和苯丙氨酸可促进细胞的生长。o 0 5 的 酶水解酪蛋白较其它氨基酸混合物如胨、酵母提取物和酸水解酪蛋白能更好促 进细胞的生长，并确认悬浮培养中培养基的最佳p h 为4 3 0 ，对于初始的p | 1 较高的培养基，细胞很难生长，最终培养基的p h 向酸性方向降低。培养过程 q t 波长为5 2 0 4 0 n m 的红光对细胞的生长有极大的促进作用。a r j o n 研究表 明液体培养基中蔗糖含量限制细胞的生长和c p t 的产量，蔗糖用完时细胞停止 生长，及时加入蔗糖，细胞生长可恢复。 通过t l c 和h p l c 提取和分析，喜树茎干中含有的c p t 相当于细胞干重的 o5 9 细胞干重最大时，c p t 含量不可能最大7 。c p t 是在细胞内积累的，所 以培养基中也不含c p t ，在细胞悬浮培养中测得c p t 最高含量是细胞干重的 o0 0 4 ，比外殖体中少l o o 倍。s h a k a t o ”发现细胞分裂素没有促进c p t 的生产。 然而植物生长调节物质定性或定量的改变或许能提高产量。因而，加入n a a 可 以提高c p t 的含量。另外用m s ( 盐类) 加b 5 ( 有机类) 也有类似的效果。c p t 的含量随培养时间而变化，并决定于所用培养基。c p t 含量与细胞生长f 相关， 当细胞生长减慢时，c p t 的含量随着降低，但是a r j o n 3 提出在3 0 天额外增加 蔗糖不仅可以促进细胞生长，还可以提高c p t 的产量。另外，通过其它一些方 法也可以提高c p t 的产量，例如：利用生物反应器、选择最适培养基、加入代 谢中问物或者通过细胞转基因( 如毛状根培养) 。 悬浮培养中喜树碱分离与纯化方法是利用m ir a c l o l h 过滤器从培养基中将 细胞分离出来，用足量的去离子水洗净后进行真空冷冻干燥，再经9 5 乙醇【叫 流、超速离心、最后经硅胶柱层析，得到的白色小颗粒即为纯化的喜树碱。 24 喜树碱的提取与分析 c p t 及其类似物的提取与分离主要是利用这些物质不溶于水而溶于乙醇、 氯仿等有机溶剂方面的特性，通过渗透使其溶于这些溶剂中。此后回收溶剂、 结晶即可得到最终产品。 渗透提取与萃耿分离提取是常用的提取方法。首先是将经粉碎过的原料用 乙醇或石油渗透，然后将渗透液减压浓缩，再用氯仿提取，蒸干氯仿即可得到 c p t 的粗提物。卡h 提物用甲醇氯仿( 1 ：l v v ) 混合液溶解后，在水浴上进行 凹流；此后回收甲醇氯仿混合液至结晶析出为止，将结晶滤出、干燥即可得 到c p r 精致品“1 。 此外还有两种方法可以提取c p t ：柱层析提取与分离”1 和树脂吸附提取。 相比而苦，这两种方法所得产品的纯度高，得；车稍低，步骤烦琐。而重结晶法 所得产品的纯度稍低，颜色较深，但步骤简单，回收率高，后处理方便。 目前对c p t 生产的工艺研究较少，其成品的主要质量指标有：c p t 含量 9 2 ，干燥失重 o 5 ，熔点2 5 9 2 6 3 其中最主要的指标是含量。c p t 含量的测定方法有分光光度计法”o3 、荧光法、红外法、高效液相色谱法( p l c ) 。”1 四种。以高效液相色谱法先进、方便、准确，它是目前公认的c p t 及类似物 硕士学位论文 m a s t e r s1 i l e s i s 的分析方法。 3研究进展与工业化生产 从目前的研究情况和国内外的研究趋势来看，c p t 及类似物主要是靠从喜 树中分离获得，而喜树碱是喜树中一种天然次生代谢产物，其产量必将受到喜 树生长发育和环境因素的影响。而过去人们一直着力于提取和产品的丌发，随 着以c p t 市场的扩大，生产c p t 及其类似物所需的原料将成为这一产业的基础。 今后应以c p t 及其类似物的代谢为核心，开展如下几方面的研究工作，为c p l 的生产提供理论基础“。( 1 ) 喜树基础生产代谢研究。主要包括光和、呼吸及 水分和矿质营养代谢的基本规律，特别是与c p t 代谢有关的n 代谢研究。( 2 ) 环境因子对喜树生长发育、基础生理代谢的影响及相互关系。因为c p t 是一种 吲哚生物碱，为喜树的次生代谢产物，一般认为它的作用是植物抵御不良环境 条件的产物。因此开展胁迫生理的研究，将有助于为获得高含量的原料提供理 论基础。( 3 ) 以c p t 为核心的系数次生代谤 规律及其与基础生理代谢之间的关 系。从目前植物生理研究的情况来看，次生代谢生理的研究远远滞后于基础生 理代谢之问的关系。因此对喜树碱合成的途径、调控、运输、转移和积累与分 解有待进行深入的研究。( 4 ) 高喜树碱含量无性系和种源选育。喜树碱广泛分 布于长江流域，近年来各地都有引种，广在种源选择的基础上进行无性系选择， 尽快为生产提高喜树碱含量的优良喜树种源或无性系。 喜树的工厂化技术研究方面的报道较少，应借鉴其它物种的细胞工程技术， 进一一步丌展喜树的愈伤组织培养、悬浮培养技术、高含量细胞系筛选和喜树碱 分离提纯技术研究。 总之，通过喜树细胞培养生产喜树碱的研究虽然已经取得进展，但喜树碱 的生产率还远远满足不了商业化生产的要求。因此如果结合基因工程、酶工程、 硕士学位论文 m a s t e r st 王e s i s 发酵j 程，在加上生物反应器的使用，将会取得更大的突破。 本文以喜树幼叶为材料，通过光照、激素以及多种理化因子对喜树细胞悬浮 培养影响的研究，对其悬浮培养细胞的生长量、生理生化特性进行了比较系统 的眼，为获得高水平的喜树细胞生物量打下一些基础。 硕士学位论文 m a s t e r s 咖s l s 第二章不同植物生长调节物质对 喜树悬浮培养细胞生长的效应 1 材料与方法 1 。1 实验材料 供试植物材料喜树( 国印 d 拍e c aa c 啪j 门a ad e c s n e ) 属珙桐科旱莲属植 物，取自华中师范大学校园内春天初发的幼嫩叶片。 l 2 愈伤组织的诱导 取春天3 月份初发的喜树幼嫩叶片，清水冲洗干净后，滤纸吸干，7 0 乙 醇浸泡3 0 秒后用o 1 升汞溶液消毒5 分钟，无菌水冲洗数遍，切成4 4 m m ? 的小方块，接种于含n 从1 0 m g l + 2 、4 一d o 5 m g l + k t o 5 m g 1 的b 5 培养基上 ( p h 5 8 ，高压灭菌) ，于黑暗条件下诱导形成愈伤组织，培养温度为2 5 2 。 1 3 愈伤组织的筛选及细胞悬浮培养 诱导出的愈伤组织接种于含2 0 m 1 固体培养基的5 0 m 1 三角瓶中，每瓶接种 量约为2 9 ，愈伤组织每3 0 天继代一次，经3 5 次继代后，选择生长均一、质 地疏松、分散性好的愈伤组织转入液体培养基中培养，每2 5 0 m l 三角瓶中分装 1 0 0 m l 液体培养基( 同上的固体培养基去掉琼脂，以下实验没有特别既明的都 用的是该种培养基) ，每瓶接种量约为2 9 ，悬浮培养采用旋转式摇床，转速为 1 2 0 r m i n ，置于光照条件下培养，每日光照1 0 一1 2 小时，光强为1 0 0 0 r u x ，温 度为2 5 2 。 1 4 细胞干鲜重及生长速率的测定 细胞悬浮培养周期为3 0 天，培养结束后，经减压过滤后测其鲜重，然后 将收集培养物置于6 0 的烘箱中烘干至恒重，称其干重，换算成每天每升培养 基增加的细胞干重毫克数，即m g 1 ，表示细胞生长速率。实验重复3 次 取其平均值计算结果。 2 结果 不同种类的植物生长调节物质对培养细胞生长的效应是不同的，即使同一 种激豢的不同浓度对培养细胞的生长效应也是不同的。本实验设计了单独使用 n 从、k t 、2 、4 一d 、6 一b a 四种激素以及激素组合对喜树细胞悬浮培养( 培养基 为b 5 液体培养基) 中细胞生长效应的影响。结果如下： 2 1n 从对细胞生长的效应 本实验设计了七种不同的n a a 单因子浓度，其对悬浮培养细胞生长的效应 结果如下： 表1 ：n a a 对培养细胞生长的效应 t a b l el ：e f f e c to fn a ao nc u lt u r a lc e ll g r o w t h n a a 浓度 oo 1o 2o 51 o2 o5 0 ( m g 1 1 ) 干重增加 2 1 78 4 51 0 6 52 3 0 01 1 6 41 0 3 09 8 4 ( m g d w 1 。1 ) 生长速度 7 22 8 23 5 59 0 o3 8 83 4 33 2 8 ( m g d w 1 1 ) 由表l 可以看出，在选择的浓度范围内，有利于细胞生长的n 从适宜浓度 为o 5 m g 1 ，而在0 5 m g l 以上时，随着浓度的增加，其细胞生长速度却趋于 f 降。这可能是因为高浓度n a a 促进了细胞的分裂而抑制了细胞的生长所造成 的。 2 26 一b a 对细胞生长的效应 本实验设计了七种不同的6 一b a 单因子浓度，其对悬浮培养细胞生长的影 响结果如下： 1 2 表2 ：6 一b a 对培养细胞生长的效应 t a b l e2 ：e f f e c to f6b ao nc u l t u r a lc e l lg r o w t h 6 一队浓度 0o 1o 2o 51 0 2 05 o ( m g 1 。) 干重增加 2 1 71 4 2 99 4 19 7 39 7 35 5 54 2 l ( m g d w 1 1 ) 生长速 7 24 7 63 1 33 2 43 0 11 8 51 7 3 ( m g d w 1 。) 由表2 可以看出，不同浓度6 一b a 对细胞生长效应不同，其中以6 一b a o 1 m g 1 最有利于培养细胞的生长。 2 3k t 对细胞生长的效应 本实验设计了七种不同的k t 单因子浓度，其对悬浮培养细胞生长的影响 结果如下： 表3 ：k t 对培养细胞生长的影响 t a b l e3 ：e f f e c to fk to nc u l t u r a lc e l lg r o w t h k t 浓度( m g 1 1 ) o0 1o 2 10 51 o2 05 0 干重增加 2 1 72 0 2 81 0 4 8l8 4 88 5 68 3 28 1 9 n g d w 1 1 ) 生长速度 7 27 4 23 4 9l2 8 22 8 42 7 72 7 3 m g d w 1 1 ) 从表3 可以看出，k t 的浓度为o 1 m g l 时，最有利于喜树细胞的生长。而 在0 1 m g 1 时以上时，随着浓度的增加，其细胞生长速度却趋于下降。这可能 是因为低浓度的k t 促进了细胞分裂，从而增加生长量，而高浓度k t 因为细胞 分裂过于频繁而导致营养物质消耗过大反而抑制了细胞生长量的增加。 2 42 、4 一d 对细胞生长的效应 本实验设计了七种不同的2 、4 一d 。单因子浓度，其对悬浮培养细胞生长的 影响结果如下： 表4 ：2 、4d 对培养细胞生长的效应 t a b l e4 ：e f f e c to f2 、4 一do nc u l t u r a lc e l lg r o w t h 2 、4 一d 浓度 oo 10 2o 5 1 o2 o5 0 ( m g 一) 干重增加 2 1 71 0 1 86 8 95 6 8 8 4 45 3 l4 9 1 ( m g d w 1 1 ) 生长速度 7 23 3 92 2 91 8 92 8 11 7 7 1 6 4 ( m g 1 ) w 一) 从表4 可知，在所选择范围内，有利于细胞生长的2 、4 一d 适宜浓度为 0 1 m g 1 。在大于o 1 m g 1 浓度时，细胞的生长速度都降低。造成这种现象可 能是因为高浓度2 、4 一d 促进了细胞的分化而抑制了细胞的生长所造成的。 2 5n 从与k t 组合对培养细胞生长的效应 表5 ：n a a 与k t 组合对培养细胞生长的效应 t a b l e5 ：e f f e c to fn a aa n dk to nc u lt u r a lc e l1 g r o w t h n a a ( o 5 ) + k t xo 0 50 1o 2o 30 51 o2 0 ( m g 1 1 ) 干重增加 4 9 77 8 79 6 41 2 5 02 5 4 03 1 0 01 5 3 2 ( m g d w 1 。) 生长速度 1 5 62 6 23 2 14 1 78 4 71 0 3 35 0 1 ( m g d w 1 1 ) 从表5 可以看出，当组合中k t 浓度在o 0 5 一1 o m g 1 范围内，细胞生长速 度随着浓度增加而增加；在k t l o m g l 时，细胞生长速度最快；而在大于 1 o m g 1 时，其细胞生长速度降低。同时我们可以看出，n a a 和k t 组合使用比 单独使用更有利于细胞的生长，其中以n 从0 5 m g 1 + k t l o m g 1 最有利于细胞 的生长。 2 6n 从与6 一b 组合对培养细胞生长的效应 表6 ：n 从与6 一b a 组合对培养细胞生长的效应 硕士学位论文 m s t e r s t 璐f 5 t a b l e6 ：e f f e c to fn a aa n d6 一b ao nc u lt u r a lc e l1 g r o w t h n a a ( o 5 ) + 6 一b a x0 0 5o 1o 20 3o 51 o2 o ( 雌1 1 。) 干重增加7 5 0 9 0 31 5 5 11 8 6 82 7 0 01 2 7 07 6 4 ( m 出d w 1 1 ) 生长速度2 53 0 15 1 76 0 39 0 o4 2 32 5 5 ( m g d w 1 - 。) 由表6 可以得知，当组合中6 一b a 浓度在o 0 5o 5 m g l 范围内，细胞生长 速度随着浓度的增加而增加：在6 一b a 浓度为o 5 m g 1 时，细胞生长速度最快； 而在6 一b a 为o 5 m g 卜2 o m g l 时，随着6 一b a 浓度的增加，其细胞生长速度不 断下降，同时也可以看出，n a a 与6 一b a 组合也比单独使用效果更好。 3 讨论 从以上实验部分可以看出，不同化学因子对喜树培养细胞有很大的影响 其中植物生长调节物质是培养基中的关键物质，对植物细胞培养起着重要而明 显的调节作用，本实验的结果也得到了验证，植物生长调节物质的种类以及浓 度对不同的植物有不同的效果。在喜树细胞悬浮培养中单因子以n a a 的效果最 好，其中n a a 最佳浓度为o 5 m g 1 组合因子比单因子更有利于细胞的生长， 以n a a 0 5 m g 1 + k t 0 1 m g l 的效果最佳，细胞生长速度最快。从结果可以看出， 植物生长调节物质并不是浓度越高，种类越多效果就越明显，对不同的植物应 选择相应的种类和适宜的浓度。 外源激素的添加对于植物组织生长、分化及次生代谢产物的调控具有重要 作用。目前，对于激素作用机理的研究不太少，不过通过添加不同种类和浓度 外源激素来调控生长、分化和代谢已取得了一定规律性认识“。一般来讲，低 浓度的生长素有利于次生代谢，而2 、4 d 则会抑制次生代谢，赤霉素很少用 于培养基，但其对于某些萜类的产生确实必要，青蒿毛状根培养基添加适量的 赤霉素可明显的促进发根生长和青蒿素的产生。细胞激动素的作用也不明确， 硕士学位论文 m a s t e r s 1 【e s i s 但秋水仙碱在未分化的培养物中可导致多倍体生成，细胞体积增大，使香叶天 竺葵中单萜的产量明显提高。除生长素和激动素外，乙烯对欧亚唐松草培养中 小蘖碱的积累起明显促进作用，而且通过调节4 一氢小蘖碱氢化酶的活性来达 到。随着人们对激素作用机理的深入了解i 在应用激素进行生长、代谢的调控 上将逐步走向必然。 1 6 硕士举住论文 m s t e r st l 怔s i s 第三章不同光照对喜树悬浮培养细胞 生长效应及生理生化特性的效应 l材料与方法 1 1 喜树愈伤组织的诱导 供试植物材料喜树( ( 1 a 印f d e c aa c 啪j 加招d e c s n e ) 取自华中师范 大学校园。取喜树幼嫩叶片，清水洗净后，滤纸吸干，7 0 酒精浸泡3 0 秒后用 0 1 升汞消毒5 分钟，无菌水冲洗数遍，切成o 5 0 5 c m 2 的小块，接种于含 n 从1 0 m g 1 、2 、4 一d o 5