（化学工程专业论文）高效液相色谱分离硝基甲苯同分异构体.pdf

摘要 邻硝基甲苯是合成香料的主要原料，对硝基甲苯是合成药物及染料等中 间体，它们都有着广泛的用途。对它们的分离一赢以来都在研究，传统的方 法有凝固点法、气相色谱法，但是分离效果均不理想。 本文利用高效液相色谱法对邻硝基甲苯和对硝基甲苯两种同分异构体的 分离作了系统的研究，确定了邻硝基甲苯和对硝基甲苯分离的最佳色谱条件。 通过比较我们选择十八烷基键合相色谱柱，选择甲醇和水的混合物作为流动 相。通过对水，甲醇水溶液和甲醇三种样品溶剂的溶解效果比较，选择甲醇 作为样品溶剂。固定其他色谱条件，改变流动相组成分别为甲醇：水( v v ) = 2 0 ： 8 0 ；3 0 ：7 0 ；4 0 ：6 0 ；5 0 ：5 0 ；6 0 ：4 0 ；7 0 ：3 0 ；8 0 ：2 0 ，结果表明当甲醇： 水= 8 0 ：2 0 的时候，分离度r 达到2 4 4 。可以实现基线分离。另一方面也考察 了流速对分离效果的影响，分别取流速为0 8 ，0 9 ，1 0 ，1 1 ，1 2 m l m i n 结果表明随流速增大，保留值减小，提高了分析速度，但是随着流速增大， 分离度较低，且柱压增大，不利于延长柱子的寿命。 综合各种因素的影响，我们得到邻硝基甲苯和对硝基甲苯分离的最佳色 谱条件为：甲醇：水= 8 0 ：2 0 ( v v ) 、检测波长2 7 8 n m 、流动相流速1 o m l m i n 、 室温、色谱柱：c o s m o s i l5 c , , - a r i i ( 6 o m m 2 5 0 m m ) 。 另外，本文对所建立的方法进行了回收率验证，结果显示该方法线性关 系，准确度和灵敏度均符合分离要求。 关键字：高效液相色谱： 邻硝基甲苯；对硝基甲苯 a b s t r a c t n n i t r o t o l u a n ei sm a i nm a t e r i a lo fs y n t h e t i c a l s p i c e o - n i t r o t o l u e n e i s i n t e r m e d i a t eo fs y n t h e t i c a lm e d i c i n ea n dd y e s t u f f t h e ya r eb o t he x t e n s i v e l y u s e d t h es e p a r a t i o no ft h e mi ss t u d i e da l lt h ew h i l e t r a d i t i o n a lm e t h o d si n c l u d e f r e e z i n gp o i n ta n dg a sc h r o m a t o g r a p h y , b u tt h ee f f e c to fs e p a r a t i o ni sn o ts og o o d i nt h i st h e s i s ，t h es e p a r a t i o no fn n f f r o t o l u e n ea n do n i t r o t o l u e n ei ss t u d i e d c o m p r e h e n s i v e l yb yh i g h p r e s s u r el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t h eo p t i m a lc o n d i t i o n s o fs e p a r a t i o na r e c o n f i r m e d b yc o m p a r a t i o n w es e l e c tc ls b o n d e d p h a s e c h r o m a t o g r a p h yc o l u m na n dm i x t u r eo fm e t h a n o la n dw a t e ra sm o b i l ep h a s e w e c h o o s em e t h a n o la ss o l v e n to fs p e c i m e nb yc o m p a r i n gw a t e r , m i x t u r eo fm e t h a n o l a n dw a t e ra n dm e t h a n 0 1 w es e t u p m e t h a n o l ：w a t e r r e s p e c t i v e l y a s 2 0 ：8 0 ；3 0 ：7 0 ；4 0 ：6 0 ；5 0 ：5 0 ；6 0 ：4 0 ；7 0 ：3 0 ：8 0 ：2 0 ( v v i t h t h eo t h e rc o n d i t i o n s i n v a r i a b l e t h er e s u l ts h o wt h a tw h e nm e t h a n o l ：w a t e r 2 8 0 ：2 0b a s e l i n es e p a r a t i o n i so b t a i n e dw i t ha2 4 4r e s o l u t i o n o nt h eo t h e rh a n dv e l o c i t yo ff l o wi si n v e s t i g a t e e d w es e tu pr e s p e c t i v e l yv e l o c i t yo f f l o wa s0 8 ，0 9 ，1 0 ，1 1 ，1 2 m l m i n t h er e s u l t a r ew i t hv e l o c i t yo ff l o wi n c r e a s i n gr e t e n t i o nt i m em i n i s hb u tr e s o l u t i o nd i m i n i s h t o o t h eb e s tc h r o m a t o g r y p h yc o n d i t i o n sa r em e t h a n o l ：w a t e r = 8 0 ：2 0 ；d e t e c t e d w a v e l e n g t h i s 2 7 8 n m ；v e l o c i t y o ff l o wi s 1 o m l m i n ；r o o mt e m p e r a t u r e ； e h r o m a t o g r y p h yc o l u m n ：c o s m o s i l5 c l s a r l i ( 6 0 m m 2 5 0 m m ) i na d d i t i o n ，t h em e t h o di sv a l i d a t e db yr e c o v e r i e se x p e r i m e n t t h er e s u l t s s h o wt h i sm e t h o di s r e p r o d u c i b l e a n ds e n s i t i v ee n o u g hf o rs e p a r a t i o no f n n i t r o t o l u e n ea n do n i t r o t o l u e n e k e y w o r d s ：h i g h - p r e s s u r el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ：n - n i t r o t o l u e n e ；o n i t r o t o l u e n e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得叁注盘鲎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：圈曲 签字日期：达年 f 月占日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤注盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫洼盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：芦前 导师签名： 签字日期：翘年f月$ 日 签字目期：心 年f月届日 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 色谱和色谱分析 色谱法又称为色层法或层析法，是一种物理化学分离和分析方法。这种 分离方法是基于物质溶解度、蒸汽压、吸附能力、立体结构或离子交换等物 理化学性质的微小差异，使其在流动相和固定相之间的分配系数不同，当两 相做相对运动时，组分在两相间进行连续多次分配，从而达到彼此分离。色 谱法能将分子的各种性质差异用于分离分析，并且只需要极少量的样品即可。 没有任何一种单一分离技术能比色谱法更有效、更普遍适用。色谱法是现代 分离科学的基础，正是由于色谱学的发展，色谱理论的形成，导致了色谱分 离技术发展成“分离科学”。 早期色谱法只是一种分离方法，类似于萃取、蒸馏等分离技术，不同的 是分离效率高得多。许多不能或很难用萃取或蒸馏等方法分离的混合物及性 质极为相近的化合物，都能用色谱法分离。随着色谱检测技术的发展，色谱 法已不仅是一种分离技术，也是一种分析方法。在色谱流程中，利用物质的 物理或化学性质，例如光学性质，电学性质，化学显色反应或微量自动酸碱 滴定等，设计各种检测装备，对分离组分进行连续检测。当今的色谱法，包 括分离和检测两个部分，同时实现分离和分析，因而通常称为色谱分析。 近3 0 年来，各种色谱方法，如气相色谱、高效液相色谱、薄层色谱等在 化学、生物学、医药学及相邻学科领域得到了广泛应用，特别是分离和分析 各种复杂的混合物，解决了大量其他分析方法所不能解决的课题。在工业上， 色谱法是自动分析和自动控制的重要技术。因此，色谱是现在分离科学和分 析化学中发展最快、应用最广、潜力最大的领域之一。 1 2 色谱图及相关的一些常见术语 为了规范色谱图中出现的一些术语，国家标准局制定了有关色谱图的一 些术语1 ，现介绍如下： 色谱图：色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流 动相流出体积的曲线图。( 如图1 - i ) 第一章文献综述 峰：色谱柱流出组分通过检测器系统时产生的响应信号的微分曲线a 峰底：峰的起点与终点之间的连接直线( 图中的c d ) 。 峰高：从峰高最大值到峰底的距离( 图中的8 e ) 。 峰宽：在峰两侧拐点( 图中的f ，g ) 处所作切线与峰底相交两点间的距 离( 图中的k l ) 。 半高峰宽：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交， 两交点间的距离( 图中的h j ) 。 图1 - 1 标准色谱图 峰面积：峰与峰底之间的面积( 图中的c h e j d c ) 。 基线：在正常操作条件下仅有流动相通过检测器系统时产生的相应信号 的曲线。 基线漂移：基线随时间定向的缓慢变化。 基线噪声：由于各种因素所引起的基线波动。 在色谱图中可以通过测量或某些计算得到以下一些与定性和定量分析有 关的色谱参数，通过这次参数可以进行色谱的定性和定量分析。国家标准局 对这些参数定义如下： 死时间( t 一) ：不被固定相滞流的组分，从进样到出现峰最大值所需的时 间( 图中的t w ) 。 保留时间( t 一) ：组分从进样到出现峰最大值所需的时间( 图中t 。) 。 2 第一章文献综述 调整保留时间( t 一) ：减去死时间的保留时间( 图中t * ) 。 死体积( v 。) ：不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流 动相体积。 保留体积( v 一) ：组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积。 调整保留体积( v 一) ：减去死体积的保留体积。 保留指数( i ) ：定性指标的一种参数，通常以色谱图上位于待测组分两 侧的相邻正构烷烃的保留值为基数，用对数内插法求得。每个正构烷烃的保 留指数规定为其碳原子数乘以1 0 0 。 分配系数( k ) ：在平衡状态时，组分在固定相与流动相中的浓度比。 k ：工 c 。 式中 c 组分在固定相中的浓度，g m l ： c 。组分在流动相中的浓度，g m l 。 容量因子( k ) ：在平衡状态时，组分在固定相与流动相中的质量比。 j j ：k 旦 式中置分配系数： 柱内固定相体积，札： 圪柱内流动相体积，m l 。 分离度( r ) ：两个相邻色谱峰的分离程度，以两个组分保留值之差与其 平均峰宽值之比表示。 r ：2 出二垒、 胁2 未甍 式中 r ，k 峰l ，峰2 的保留时间，m i n ： 暇，峰1 ，峰2 的峰宽。 响应值：组分通过检测器系统所产生的信号值。 校正因子( f ) ：相对相应值的倒数，它与峰面积的乘积正比于物质的量。 灵敏度( s ) ：通过检测器的物质量变化q 时，响应信号的变化率。 s ：a r q 第一章文献综述 式中 q 物质变化量，g ： 五响应信号值变化量。 检测限( d ) ：随单位体积的流动相或在单位时间内进入检测器的组分所 产生的信号等于基线噪声二倍时的量。d = 2 n s 式中s 灵敏度： n 基线噪声。 线性范围：检测信号与被测物质的量呈线性关系的范围。 1 3 高效液相色谱法的分类 高效液相色谱法依据溶质在两相分离过程的物理化学原理分类可分为以 下5 类 3 。 1 - 3 1 吸附色谱 用固定吸附剂作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各组分 在吸附剂上吸附能力的差别来实现分离。 1 3 2 分配色谱 用载带在固定相基体上的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相， 依据样品中各组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。根据固定相和流 体流动相相对极性的差别，又可分为正相分配色谱和反相分配色谱。当固定 相的极性大于流动相的极性时。可称为正相分配色谱或简称正相色谱；如固 定相的极性小于流动相的极性时。可称为反相分配色谱或简称反相色谱。 1 3 3 离子色谱 用高效微粒离子交换剂作固定相，以具有一定p h 值的缓冲溶液作流动 相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可 逆性离子交换能力的差别而实现分离。 1 3 4 体积排阻色谱 用化学惰性的多孔性凝胶作固定相，按固定相对样品中各组分分子体积 4 第一章文献综述 阻滞作用的差别来实现分离。以水溶液作流动相的体积排阻色谱法，称为凝 胶过滤色谱；以有机溶剂作流动相的体积排阻色谱法，称为凝胶渗透色谱法。 1 3 5 亲和色谱 在不同基体上，键合多种不同属性的配位体作固定相，用具有不同p h 值 的缓冲溶液作流动相，依据生物分子与基体上键连的配位体之间存在的特异 性亲和作用能力的差异，而实现对具有生物活性的生物分子的分离。 表1 1 列出了依据分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法比较 吸附色谱分配色谱离子色谱体积排阻色谱亲和色谱 固定相全多孔性固定液载 高效微粒具有不同孔径多种不同 固体吸附带在固相离子交换 的多孔性凝胶属性的配 剂基体上剂位体键连 在固相基 体上 流动相不同极性不同极性不同p h有机溶剂或一不同p h 值 有机溶剂有机溶剂值的缓冲定p h 值得缓的缓冲溶 和水 溶液冲溶液液，可加入 改性剂 分离原吸附 溶解牟可逆性的多孑l 凝胶的渗具有钥匙 理解析挥发离子交换透或过滤结构络合 物的可逆 性离解 平衡常吸附系数分配系数选择性系分布系数k d稳定常数 数k a k p数磁 k c 1 4 高效液相色谱法的发展史n 1 1 9 0 3 年俄国植物学家t s w e t t 在波兰华沙大学研究植物叶子的组成时，把 干燥的碳酸钙粉末装到一根细长的玻璃管中，然后把植物叶子的石油醚萃取 液倒到管中的碳酸钙上，萃取液中的色素就吸附在管内上部的碳酸钙里，再 用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素，在管内的碳酸钙上就形成了3 种颜色的6 5 第一章文献综述 个色带，这就是色谱的由来。玻璃管相当于色谱柱，碳酸钙相当于固定相， 纯净的石油醚相当于流动相。m a r t i n 和s y n g e 在1 9 4 0 年提出了液液分配法； 1 9 4 1 年，他们二人又提出用气体代替液体作流动相的可能性，1 1 年之后j a m e s 和m a r t i n 发表了从理论到实践比较完整的气液色谱方法，因而获得了1 9 5 2 年的诺贝尔化学奖。高效液相色谱法的发展始于2 0 世纪6 0 年代中后期，在 经典液相色谱的基础上，引入气相色谱的理论和技术，用于液相色谱系统的 设计，同时机械，光学和电子等技术的进步，也促进了液相色谱技术的发展， 出现了具有高效色谱柱，高压输液泵和高灵敏度检测器的近代高效液相色谱 装置和仪器，在柱效，速度和灵敏度方面大大超过了经典液相色谱。7 0 年代 中后期，微机处理用于液相色谱，进一步提高了仪器的自动化水平和精度。 8 0 年代的智能色谱仪，不仅是全自动化的色谱仪，丽且能在1 2 2 4 h 内自动 代替人们一周或一个月的劳动，进行定性，定量分析，使色谱仪向自动化又 迈出了一步。目前高效液相色谱己成为医药、药学、化学、环保、生化等领 域中重要的分离分析技术。 1 5 高效液相色谱的优点瞄3 及局限性 高效液相色谱法以其高超的分离能力为特点，它的分离效率远远高于其 他分离技术如蒸馏、萃取等方法。于其他分离技术相比，高效液相色谱法的 优点主要表现在如下几方面： 1 分离效率高由于新型高效微粒固定相填料的使用，液相色谱填充柱的 柱效可达5 x1 0 3 _ 3x1 0 4 块m 理论塔板数，远远高于气相色谱填充柱1 0 3 块，m 理论塔板数的柱效。 2 选择性高由于液相色谱柱具有高效柱，并且流动相可以控制和改善分 离过程的选择性，因此，高效液相色谱法不仅可以分析不同类型的有机化合 物及其同分异构体，还可分析在性质上极为相似的旋光异构体，并己在高疗 效的合成药物和生化药物的生产控制分析中发挥了重要作用。 3 应用范围广“1高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥发的，受热不稳 定易分解的，分子量大，不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然 产物；合成的和天然的高分子化合物等。它们涉及石油化工产品、食品合成 药物、生物化工产品及环境污染物等，约占全部有机化合物的8 0 。其余2 0 6 第一章文献综述 的有机化合物，包括永久性气体、易挥发、低沸点及中等分子量的化合物， 只能用气相色谱法进行分析。 4 分析速度快由于高压输液泵的使用，相对于经典液相色谱，其分析时 间大大缩短。当输液压力增加时，流动相流速会加快，完成一个样品的分析 时间仅需几分钟到几十分钟。近年来发展起来的小内径柱、短毛细管柱比原 来的方法提高5 1 0 倍的速度 5 样品用量少高效液相色谱的进样量是按儿计，需要配置的样品溶液 也只需要极少的量即可 6 灵敏度高随着液相色谱检测技术的成熟和完善，液相色谱检测的灵敏 度也得到提高。例如广泛使用的紫外检测器灵敏度可达0 0 0 1 a u f s ；且噪声低， 可降至1 0 4 a u 。对于具有中等强度紫外吸收的物质，最小检测量可达到1 0 1 2 9 的数量级，最低检测浓度可达1 0 - i o g m 1 ，因此对紫外光吸收不强的样品也可 检测。线性范围宽，应用广泛。用于痕量分析的荧光检测器，最小检出量可 达1 0 1 2 9 。 7 分离和测定一次完成可以和多种波谱分析仪器联用。 8 易于自动化现在制备色谱和半制备色谱的应用越来越广泛，制备色谱 是制备色谱纯物质的色谱技术，即分离、收集一种或多种色谱纯组分，供进 一步定性鉴定、作为色谱标样或用于合成等。它与分离分析色谱法的主要区 别是色谱柱尺寸更大、柱容量高、分离样品量高几个数量级。 高效液相色谱法除具有上述特点以外，它的应用范围也日益扩展。由于 它使用了非破坏性检测器，样品被分析后，在大多数情况下，可除去流动相， 实现对少量珍贵样品的回收，亦可用于样品的纯化制备。 高效液相色谱法虽具有上述一些的优点，但也有一些局限性。 i 在高效液相色谱法中，使用多种溶剂作为流动相，当进行分析时所需成 本高于气相色谱法，且易引起环境污染。 2 高效液相色谱中缺少如气相色谱法中使用的通用性检测器。近年来蒸发 激光散射检测器的应用日益的增多，有望发展成为高效液相色谱法的一种通 用型检测器。 3 高效液相色谱法不能替代气相色谱法，去完成要求柱效高达1 0 万块理 论板数以上，必须用毛细管气相色谱法分析组成复杂的具有多种沸程的石油 7 第一章文献综述 产品。 4 高效液相色谱法也不能代替中，低压色谱柱，在2 0 0 k p a 至l m p a 柱压 下去分析受压易分解、变性的具有生物活性的生化样品。 5 高效液相色谱法对所分析对象的鉴别功能差，一般来说高效液相色谱的 定性是靠保留值定性，但在一定的色谱条件下，一个保留值可能对应许多个 化合物，所以高效液相色谱方法要和其他的方法配合才能发挥更大的作用。 为了分离和鉴定一个有机物，常常把高效液相色谱的高效分离能力和光谱方 法的鉴别能力结合在一起，发展了各种各样的联用技术，如典型的液质联用 技术。 综上所述可知，高效液相色谱法也和任何一种常用的分析方法样，都 不可能十全十美，作为使用者在掌握了高效液相色谱法的特点、使用范围和 局限性的前提下，充分利用高效液相色谱法的特点，就可在解决实际分析任 务中发挥重要的作用。 1 6 高效液相色谱法的分析应用 高效液相色谱法经过3 0 年的发展，在色谱理论研究、仪器研制水平、分 析实践应用等方面，已取得长足的进步。现在高效液相色谱法已在生物化学 和生物工程研究中、制药工业研究和生产中、食品工业分析中、环境监测、 石油化工产品分析中获得了广泛的应用。 1 6 1 生物化学和生物工程中的应用 当前随着生命科学和生物工程技术的迅速发展，人们对氨基酸、多肽、 蛋白质等生物分子的研究兴趣日益增加。这些生物活性分子是人类生命延续 过程所必需摄取的成分，因此涉及它们的分离、分析问题也日益重要。 高效液相色谱法中的反相色谱法、体积排阻色谱法、亲和色谱法和离子 色谱法都可用于上述多种生物分子的分离和分析。 摩尔( m o o r es ) 等人提出了用离子交换法分离氨基酸，并发展成氨基酸自 动分析仪油“1 。此法利用经硫化的阳离子交换柱，可分离2 0 多种氨基酸，再 经柱后与茚三酮反应，在可见光范围( 5 7 0 n m ) 测定吸光度，从而完成检测和 定量测定。此法使用的树脂粒度已由4 0 减小至6 ，分析时间由几小时减少 8 第一章文献综述 约为1 h ，此技术已经日趋完善“。 采用高效液相色谱进行氨基酸的分析也已经行大量的研究工作，由于仅有 少量氨基酸，如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、组氨酸具有紫外吸收性 质，可用紫外吸收检测器吸收外，其他氨基酸皆需在柱前或柱后衍生后，使用紫 外吸收或荧光检测器进行测定。 在多肽分离中，当固定相确定后，常使用具有一定p h 值的缓冲溶液( 如 磷酸盐、甲酸盐) 作流动相，且向缓冲溶液中加入盐( 如氯化钠) ，保持一定 的盐浓度可以减小峰形扩散，改善分离度。向流动相中加入改性剂，可改善 色谱分离的选择性。 由于肽键在紫外光2 0 0 2 2 0 n m 具有光吸收特性，因此对大多数肽的分离， 都可使用u v d 在此波长范围内进行测定。若多肽的肽链中含有可吸收紫外光 的酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸时，可直接用2 5 4 n m 检测，当检测灵敏度低时， 先进行柱前衍生，然后用荧光检测器检测。 作为生物大分子的蛋白质“。，不仅分子量大，而且它们在溶液中的扩 散系数比较小、粘度大，易受外界温度、酸度、有机溶剂的影响而发生变性， 并引起结构变化。蛋白质的上述特性使它们的色谱分离行为远离理想情况， 对实现它们的h p l c 分离带来了实际困难。 对一般蛋白质分子，其分子内由疏水侧链组成的疏水核心，在其分子表 面上分布许多亲水基团，形成表面亲水区，这就是蛋白质分子结构的特点。 进行蛋白质分离时，可使用体积排阻色谱法、离子交换色谱法、反相键合相 色谱法和亲和色谱法。当使用反相键合相色谱法时应考虑蛋白质变性问题， 蛋白质分子接触到有机溶剂或吸附在反相固定相时，会引起变性，并丧失生 物活性。若使用中等极性反相键合柱，以磷酸盐的异丙醇一水体系为流动相， 保持p h = 3 7 范围，许多蛋白质经反相h p l c 分离后，仍能保持生物活性。 1 6 2 在医药研究中的应用1 3 】 高效液相色谱法由于具有高选择性和高灵敏度等特点，已成为医药研究 的有力工具。人工合成药物的纯化及成份的定性、产量测定，中草药有效成 分的分离、制备及纯度测定、临床医药研究中人体血液和体液中药物浓度、 药物代谢物的测定、新型高效手性药物中手性对应体的测定等等，所有这一 9 第一章文献综述 切都需要用到高效液相色谱法来解决。 解热镇痛药中主要含有阿司匹林、非那西丁和咖啡因。使用反相键合相 柱为一b o n d d a p a kc 1 8 ( 1 0 胁，3 9 m m 3 0 0 m m ) ，流动相为3 8 的已腈的0 0 1 碳 酸胺溶液，流量为l m l m i n ，使用紫外吸收检测器( 2 5 4 n m ) ，在9 分钟内可以 实现样品中相关组分的分离。 镇静药中以巴比妥类药物应用最多。巴比妥类是丙二酰脲的衍生物，具 有镇静、催眠、止痛作用。巴比妥类可用反相离子对色谱法分离。色谱条件 为：色谱柱为涂布丁腈的l i c h r o s o r br p 一2 柱( 1 0 m ，3 2 m m 1 5 0 m m ) ，流动 相为0 o l m o l l 四丁基胺，p h = 7 7 ，流量为0 8 m l m i n ，检测器为紫外光谱检 测器( 2 5 4 n m ) 。 安定药物是一类中枢神经抑制剂，使用最广泛的是三环体系安定药。三 环体系安定药可用吸附色谱分离。色谱条件为：色谱柱为r a d i a l p a k 硅胶 ( 1 0 p m ，5 m m l o o m m ) ，流动相为含0 o l m o l l 丁胺的9 0 甲醇水溶液，流量 为3 o m l m i n ，使用紫外检测器( 2 5 4 n m ) “。 心血管药有多种类型，其中普鲁卡因酰胺为抗心律不齐药，可用反相色 谱分析。色谱条件为：色谱柱为p x s 1 0 2 5o d s ( 1 0 m ，4 6 m m 2 5 0 m m ) ，流动 相为4 0 甲醇一磷酸盐缓冲溶液，流量为1 o m l m i n ，使用紫外检测器( 2 8 0 n m ) i s 1 6 3 在食品分析中的应用 近年来高效液相色谱分析法在食品分析中的应用日益增多，它比化学分 析法操作简便、快速、并能提供更多的有用信息。 食品中糖含量是产品质量控制的一个指标。糖类可分为单糖、寡糖和多 糖，它们可使用离子交换色谱或胺基键合相柱进行分离。色谱条件为：色谱 柱为胺丙基硅胶柱( 5 帅，4 6 m m 2 5 0 m m ) ，流动相为7 5 乙腈水溶液，流量为 2 o m l m i n ，使用紫外检测器( 1 8 8 n m ) “。使用反相键合相色谱柱及示差折光 检测器也可实现对淀粉水解产物的单糖和麦芽多糖的分离“。 1 6 4 在环境污染分析中的应用 高效液相色谱方法适用于对环境中存在的高沸点有机污染物的分析，如 1 0 第一章 文献综述 大气、水、土壤、和食品中存在的多环芳烃、多氯联苯、有机氯农药、有机 磷农药，含氮除草荆等等。 多环芳烃是可引起癌症的有毒物质，是环境监测中的重要监测对象。多 环芳烃可用反相键合相色谱柱进行分离。色谱条件为：色谱柱为v y d a ec i 8 ( 5 帅 4 6 m m x2 5 0 m m ) ，流动相为乙腈和水溶液( 体积比为4 0 ：6 0 ) ，流量为1 5 m l m i n ， 使用可变波长紫外吸收二极管阵列检测器。当样品中多环芳烃浓度很低时， 可以考虑使用荧光检测器进行检测。 1 6 5 在精细化工分析中的应用 在精细化工生产中所使用的具有较高分子量和较高沸点的有机化合物， 如商碳数脂肪族或芳香族的醇、醛和酮、醚、酸、酯等化工原料，以及各种 表面活性剂、农药、炸药等工业产品，都可使用高效液相色谱进行分析。 邻苯二甲酸酯可用反相键合相色谱分离。色谱条件为：色谱柱为 m i c r o p a k c h ( 1 0 x m ，2 2 m m 2 5 0 m m ) ，柱温5 0 流动相为甲醇和水溶液( 体积 比为4 0 ：6 0 ) 。梯度洗脱程序o l o m in 以5 m i n 梯度，增加至9 0 甲醇水溶 液，并保持1 2 m i n 。使用紫外检测器( 2 5 4 n m ) “。 高碳酸脂肪酸也可用反相键合相色谱分离。色谱条件为：色谱柱为 l i c h r o s o r br p 一8 ( 1 0 p m ，4 6 m m 2 5 0 m m ) ，流动相为含0 1 乙酸的四氢呋喃+ 乙腈+ 水( 体积比为3 ：6 7 ：3 0 ) 。使用示差折光检测器”1 。 1 7 高效液相色谱仪简介他” 高效液相色谱仪包括以下主要部件：贮液罐，在线脱气装置，高压输液 泵，进样装置，色谱柱，检测器，记录仪和数据处理装置。 1 7 1 贮液罐 贮液罐的材料应耐腐蚀，可为玻璃，不锈钢，氟塑料或特种塑料聚醚醚 酮。溶剂约为0 5 2 o l 。贮液罐放置位置要高于泵体，以便保持一定输液静 压差。使用过程贮液罐应密闭，以防溶剂蒸发引起流动相组成的变化，还可 以防止空气中0 。，c o 。重新溶解于己脱气的流动相。所有溶剂在放入贮液罐之前 必须经过0 4 51 1i l l 滤膜过滤，除去溶剂中的机械杂质。以防输液管道或进样阎 1 1 第一章文献综述 产生阻塞现象。 1 7 2 在线脱气装置 流动相在使用前必须进行脱气，以除去其中溶解的气体，防止在洗脱过 程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡的存在 会增加基线噪音，严重时会造成分析灵敏度下降，而无法进行分析。在线脱 气装置把真空脱气装置串接到贮液系统中，并结合膜过滤器，实现了流动相 在进入输液泵前的连续真空脱气。 1 7 3 高压输液泵 对高压输液泵的要求是： 1 泵体材料能耐化学腐蚀： 2 能在连续高压下操作； 3 输出流量范围宽； 4 输出流量稳定，重复性高。 高压输液泵可分为恒流泵和恒压泵。目前在高效液相色谱中应用最广泛 的也是最重要的输液泵是往复泵。往复泵属于恒流泵。往复泵的优点是： 1 可在高压下连续以恒定的流量输液。 2 此泵的液缸容积很小只有几十至几百“l ，其柱塞尺寸小易于密闭。柱 塞，单向阀和阀座造价低廉，更换溶剂方便，特别适用梯度洗脱。 缺点是： 1 输出流动相虽然是连续的恒流量的，但存在脉动。为了克服脉动的影 响，通常使用具有2 个泵头的往复式泵。 2 对于柱塞式往复泵，柱塞直接与流动相接触造成污染。使用隔膜式往 复泵可克服这点。 3 长期运转后，因流动相所含有的机械杂质会造成单向阀的阻塞，或因 单向阀的阀球磨损而不能关闭单向阀。 1 7 4 进样装置 进样分为手动进样和自动进样两种。手动进样使用的最多的是6 通阀进样 1 2 第一章文献综述 装置。先将进样阀置于“取样“位置， 环中，再将进样阀至于“进样“位置， 用特制的平头注射器将样品注入定量 流动相将样品携带进入色谱柱。此种 进样重现性好，能耐2 0 m p a 的高压。自动进样器是由计算机自动控制定量阀 按照预先编制注射样品的操作程序工作。取样、进样、复位、样品管路清洗 和样品盘的转动，全部按照预定程序自动进行，一次可以进行几十个甚至上 百个样品的分析。自动进样器的样品量可连续调节，进样重复性高，适合做 大量样品分析，节省人力，可实现自动化操作。 1 7 5 色谱柱 高效液相色谱的核心之一是色谱柱，把经典液相色谱改造成现代高效液 相色谱的重要内容之一就是色谱柱的“现代化”，而色谱柱“现代化”的关键内 容就是制备出高效的填料。近年来的高效填料是使用了小颗粒的无机氧化物， 如硅胶，三氧化二铝和有机多孔共聚微球作基质。在这些基质上键合各种化 学基团或涂渍各种聚合物，形成各种具有选择性的高效固定相。这些填料装 成的色谱柱既要有好的选择性，又要有高的柱效。要提高柱效是现代高效液 相色谱的又一重要问题。 高效液相色谱柱大致分为3 类：内径小于2 m m 的细管径柱；内径在2 5 m m 范围的常规高效色谱柱；内径大于5 m m 的称半制备或制备柱。 1 7 6 检测器 评价检测器时，应强调以下几点： 1 _ 噪声噪声的存在会降低检测灵敏度，严重时使其无法工作。 2 基线漂移漂移在较长时间内可观察到，可以掩蔽噪声和小峰，影响分 析的精度和准度。 3 ，灵敏度( 最小检出浓度或最小检出量) 灵敏度即指信号与噪声的比值 等于2 时，在单位时间内进入检测器的溶质的浓度和质量。 4 线性范围在进行定量分析时，希望检测器有宽的线性范围，以便在一 次分析中可同时对主要组分和痕量组分同时进行检测。 5 检测器的池体积它应小于最早流出的死时间色谱峰的洗脱体积的 1 l o ，否则会产生严重的柱外谱代扩展。 1 3 第一章文献综述 紫外吸收检测器是使用最广泛的一种检测器，分为固定波长，可变波长 和二极管阵列检测器。实验中采用的是光电二极管阵列检测器。光电二极管 阵列检测器是8 0 年代发展起来的一种新型紫外吸收检测器，与普通紫外检测 器的区别在于进入流通池的不再是单色光，获得的信号不是在单一波长上的， 而是在全部紫外光波长上的色谱信号。光电二极管阵列检测器可绘制出随时 间t 的变化进入检测器液流的光谱吸收曲线吸光度( a ) 随波长x 变化的曲 线，因而可由获得的a ， ，t 信息绘制出具有三维空间的立体色谱图。 1 7 7 记录仪和数据处理装置 随着科技的发展，现在所使用的数据记录和处理的都为色谱工作站，主 要功能有： 1 自行诊断功能可对色谱仪的工作状态进行自行诊断，并能用模拟图 形显示诊断结果，可帮助色谱工作者及时判断仪器故障并予以排除。 2 全部操作参数控制功能色谱仪的操作参数，如柱温、流动相流速、流 动相比例、最大吸收波长、进样量、运行时间等等都可以预先设定，并实现 自动控制。 3 智能化数据处理和谱图处理功能可由色谱分析获得色谱图，打印出 各个峰的保留时间、峰面积、峰高、半峰宽等等。并可按归一化法、内标法、 外标法等进行数据处理。 1 8 影响反相高效液相色谱保留值的主要因素 影响反相高效液相色谱保留值的主要因素是流动相的性质和组成，其次 是固定相的性质和表斌覆盖率。实际应用中，改变流动相的组成和性质是控 制反相色谱保留值，提高分离选择性、色谱柱效的主要手段。 1 8 1 溶剂性质 溶剂的表面张力、介电常数和粘度对溶质保留和色谱柱效起重要作用。 对容量因子影响最大的是表面张力，k 随表面张力增加而增大。常用反相色谱 溶剂中水具有最大表面张力，因而水是最弱溶剂。水一有机溶剂随有机溶剂含 量升高，表面张力减小，k 值下降。 1 4 第一章文献综述 溶剂粘度与溶质在流动相中扩散系数有关，它影响柱效和分析速度。对 于甲醇一水系统而言，最大粘度在甲酵：水为3 8 ：6 2 ( v v ) 左右。 溶剂介电常数对简单偶极分子溶质的保留值影响很小，若为电离溶质， 因为低介电常数溶剂抑制溶质电离，对保留值影响较大。 1 8 2 盐的影响 无机盐加入水溶液流动相，溶剂表面张力随盐浓度增加而增加。而有机 溶剂使表面张力下降。无机盐除了影响表面张力以外，还影响静电效应，加 入盐能减小溶质分子间的静电排斥力。对于非离子性溶质，由于溶剂表面张 力增加，k 值随盐浓度增加而增大；对离子性溶质则正好相反。 1 8 _ 3 缓冲溶液 对于离子性溶质，用缓冲溶液保持流动相的离子强度和p h 值一定，促进 离子平衡，有利于获得对称色谱峰和重现的分离结果。 1 8 4 温度的影响 液相色谱温度可变范围较小，温度对液相色谱保留的影响一般可以忽略， 对反相色谱保留的影响相对显著，通常情况下温度升高i o 。c ，保留值降低2 - 3 倍。反相色谱的一般温度范围1 5 8 0 。c ，随温度升高，流动相粘度下降，柱效 提高，色谱峰对称性提高。 1 9 高效液相色谱方法的选择 1 9 1 色谱模式的选择 1 样品性质 商效液相色谱方法有多种模式，选择哪种模式能满足分析的要求，首先 要考虑分析对象的物理和化学性质。也就是要考察： 样品大分子还是小分子? 分子量在什么范围? 样品是水溶性还是有机溶剂可溶的? 样品是离子状态还是非离子状态? 1 5 第一章文献综述 2 根据样品性质选择适当的模式。色谱模式包括体积排阻色谱，键合相 色谱，离子交换色谱，离子对色谱，亲和色谱，手性色谱等等。要根据样品 的分子量大小，溶解性等性质来选择最适合得色谱模式， 1 9 2 色谱条件的选择 在色谱模式选定之后，就要确定色谱分离的最佳条 牛。各种色谱模式的 条件虽各有特点，但是不外乎是：色谱柱，流动相，梯度或等度洗脱，流动 相流速等。下图是色谱条件选择的一般流程。 r 丽j 图3 - 2 色谱条件选择流程图 1 6 第二章实验部分 第二章实验部分 2 1 邻对硝基甲苯简介【2 1 1 邻硝基甲苯是黄色可燃液体，熔点一9 5 ，沸点2 2 1 7 ，相对密度 1 1 6 2 9 ( 2 0 ) ，闪点1 0 6 1 ，不溶于水，溶于氯仿和苯，可与乙醇乙醚混 溶。邻硝基甲苯是一种重要的有机合成中间体。主要用于生产邻甲苯胺等农 药和燃料中间体，以及涂料、塑料、和医药产品等。另外邻硝基甲苯也可作 为指示剂使用。 对硝基甲苯是浅黄色晶体，具有硝基苯气味。熔点5 1 4 ，沸点2 3 7 7 ，相对密度1 1 2 2 6 ( 5 5 ) ，微溶于水，可溶于乙醇乙醚氯仿苯和四氯化 碳，能随水蒸气蒸发。邻硝基甲苯和对硝基甲苯均有毒，最大允许浓度 0 0 0 5 m g l ，能通过人的呼吸系统及皮肤引起中毒。对硝基甲苯广泛应用于染 料、医药、农药和其他有机合成等方面。如用于生产d s d 酸、对硝基甲苯酸、 对硝基苯乙酸、对硝基甲苯邻磺酸、对硝基苯胺以及2 ，4 - 二硝基甲苯。是生 产聚氨酯和染料的重要中间体，也有少部分被直接用作炸药，或进一步硝化 生产烈性炸药2 ，4 ，6 - - - - 硝基甲苯。对硝基甲苯经氯化、还原得3 一氯一4 一甲 基苯胺，与光气反应，再与二甲胺反应制得绿麦隆，这是一种麦田除草剂。 其他方面，还用于生产对氨基苯甲醛，进而可以制得羟基苯甲醛，为生产染 料、香料和磺胺增效剂提供中间体原料。对硝基甲苯在乙醇钠的作用下，用 亚硝酸戊酯处理，可得到对硝基苯甲醛；与草酸二乙酯缩合，可制得对硝基 苯基丙酮酸，经氯化，可制得不同的氯化产物，广泛应用于医药、农药工业 以及其他精细化学品等。 邻硝基甲苯和对硝基甲苯的分离颇为困难。一般的方法是先减压精馏， 蒸出邻位产物，随后再冷却结晶来达到分离目的。此外，在室温下用碱性还 原剂( 如硫化钠) 进行还原，对位产物被还原为对甲苯胺，对甲苯胺具有碱 性，易于分离。第一种方法是目前工业上最常用的方法。经过干燥和脱焦的 混合硝基甲苯在内装理论塔板为1 0 块m 的c y 型丝网波纹填料的对硝精馏塔 中进行精馏。将对硝基甲苯与邻硝基甲苯分离开。加料在塔的中部，邻硝基 甲苯连续由塔顶馏出，经流量计流入贮槽。塔顶设冷凝器，塔内负压由汽水 1 7 第二章实验部分 喷射泵来实现，真空泵通过缓冲罐、捕集器、补充冷凝器与塔顶相连，塔底 与降模式再沸器相连，物料经循环泵一部分扬入再沸器，一部分作为对硝基 甲苯成品通过调节阀扬入对硝基甲苯贮槽。 第二种方法实质上是一种化学衍生法，因为出来的产物是对甲苯胺，需 要再处理才能得到对硝基甲苯，所以应用不多。 实验室中邻硝基甲苯和对硝基甲苯的分离方法根据文献报道，传统的方 法有凝固点法、气相色谱法“1 。但是，凝固点法要求严格控制温度和平衡 情况，稍有杂质存在就会对结果产生影响；气相色谱法的文献报道中，分离 效果不好，存在严重拖尾现象，明显的影响组分的定量测定。 高效液相色谱分离邻位和对位硝基甲苯与减压精馏再结晶的方法相比能 耗低，环境污染小；与还原法相比，色谱法直接得到邻硝基甲苯和对硝基甲 苯的产物，而不用再进行后续处理。与凝固点法和气相色谱法相比，分离效 果较好。实验中我们采用高效反相键合相色谱，通过邻硝基甲苯和对硝基甲 苯在固定相中的分配能力差异来实现分离。 2 2 本文主要研究内容 本文主要建立高效液相色谱的装置系统，掌握高效液相色谱分析和分离 的基本原理，并熟练操作液相色谱。在此基础上，以分离硝基甲苯同分异构 体为例进行色谱分离条件优化的确认。为下一步利用高效液相色谱分离氧同 位素奠定一个基础。 2 3 实验仪器和试剂 2 _ 3 1 实验仪器 半制备高效液相色谱仪一套美国w a t e r s 公司 a s 3 1 2 0 a 超声波清洗器天津奥特赛恩斯仪器有限公司 a p 一0 l p 真空泵天津奥特赛恩斯仪器有限公司 溶剂过滤器天津奥特赛恩斯仪器有限公司 玻璃仪器气流烘干器巩义市荚峪予华仪器厂 f a 2 0 0 4 n 电子天平上海精密科学仪器有限公司 1 8 第二章实验部分 微孔滤膜上海医药工业研究所亚东核级树脂有限公司 样品过滤器 上海医药工业研究所亚东核级树脂有限公司 进样针菲罗门( 天津) 科技发展公司 色谱柱美国w a t e r s 公司 石英自动双重纯水蒸馏器江苏省金坛市医疗仪器厂 2 3 2 实验试剂 甲醇 邻硝基甲苯 对硝基甲苯 高纯水 色谱纯天津大学科威公司 分析纯上海天莲精细化工有限公司 分析纯天津市大茂化学试剂厂 高纯蒸馏水经过石