滤膜法检测粪大肠菌群方法.doc

滤膜法检测粪大肠菌群方法 摘要：在水质分析中，采用粪大肠菌群滤膜法所需的仪器简单，操作简便快捷，适用于地表水、地下水等杂质较少水样。对此实验方法易产生的问题及影响测定值的因素进行分析，提出了几个关键的问题及改进措施，以提高粪大肠菌群测定的效率及精度。 关键词：粪大肠菌群 滤膜法 注意事项 c35 a 大肠菌群是卫生防疫和环境保护监督执法的重要评价指标。多年来大肠菌群作为卫生环境评价的指标，在传染病防治、食品卫生质量监测、污水综合排放控制评价、水资源生态环境变化等方面发挥了巨大作用。目前国内的粪大肠菌群检测方法有多管发酵法、滤膜法、酶法、ltse法和纸片法等。其中，滤膜法检测粪大肠菌群，是利用微孔滤膜过滤一定量水样，将水样中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜贴在选择性培养基上，经培养和证实试验后，直接计数滤膜上生长的典型粪大肠菌群菌落，并计算出每升水样中含有的粪大肠菌群数。 本研究主要是针对滤膜法再实际监测工作中的可行性，利用实际水样对滤膜法与发酵法监测结果进行对比，并对滤膜法的重复性和准确性进行统计与评价。 一、概述 粪大肠菌群是总大肠菌群的一个亚种，直接来自粪便，它除了耐热，在4444.5的高温条件仍可生长繁殖并将色氨基酸代写成吲哚处，其他特性均与总大肠菌群相同。 总大肠菌群中的细菌除了生活在肠道中，在自然环境中的水与土壤也经常存在，但在这些自然环境中生活的大肠菌群培养的最适合温度为25，如在37培养则仍可生长，但如果将培养温度上升至44则不可生长，而直接来自粪便的大肠菌群，习惯于37左右生长，如将培养温度升高至44.5仍可继续生长。因此，可用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开。在37培养生长的大肠菌群，包括粪便内生长的大肠菌群成为 总大肠菌群 total colifrom，在44.5仍能生长的大肠菌群称为 粪大肠菌群 fecal colifrom，粪大肠菌群细菌在卫生学上具有重要的意义。 二、滤膜法检测的测定方法原理 2.1测定方法原理 滤膜是一种微孔性薄膜。将水样注入已灭菌的滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于m-fc培养基上，在44.5下进行培养，粪大肠菌群在滤膜上长出具有特征性的菌落，直接计数，通过公式计算每1l水样中含的粪大肠菌群数。 滤膜法具有高度的再现性，可用于检验体积较大的水样，能比多管发酵法更快地获得肯定的结果。不过在检验浑浊度高、非大肠菌细菌密度大的水样时，有其局限性。 2.2培养基 m-fc培养基 胰胨10g、蛋白胨5g、酵母浸膏3g、氯化钠5g、乳糖12.5g、胆盐三号1.5g、琼脂12g、1%苯胺蓝水溶液10ml、1%玫瑰色酸溶液 溶于0.2mol/l氢氧化钠溶液中 10ml、蒸馏水1000ml。 将上述培养基中的成分 出苯胺蓝和玫瑰色酸外，置于蒸馏水中加热溶解，调节ph为7.4分装于小烧瓶内，每瓶100ml，于115灭菌20min储于冰箱中备用。临用前，按上述配方比例，用灭菌吸管分别加入已煮沸灭菌的1%苯胺蓝水溶液1ml，及新配制的1%玫瑰色酸溶液 溶于0.2mol/l氢氧化钠溶液中 1ml。玫瑰色酸度高压后会分解，配好的试液应在210保存不超过2周，如颜色由暗红变成棕色沉淀时就不能使用，如培养物中杂菌不多，则培养基中不加玫瑰色酸亦可。 2.3 步骤 2.3.1 水样过滤 （1）滤膜及滤器的灭菌。将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水中煮沸灭菌3次，每次15min。前两次煮沸后需要换水洗涤23次，以去除残留溶剂。也可在121下灭菌10min，10min一到，迅速将蒸汽放出，这样可以尽量减少滤膜上凝集的水分。滤器、接液瓶和垫圈分别用纸包好，在使用前先经121高压蒸汽灭菌30min，也可以用点燃的酒精棉球火焰灭菌。 （2）水样量的选择。水样量的选择是根据所预测的细菌受检验的特性而和水样中预测的细菌密度而定。如未知水样中粪大肠菌的密度，就应该按下表所列体积过滤，以得知水样中的粪大肠菌群数密度。先估计出适合在滤膜上计数所应使用的体积，然后再取这个体积的1/10和10倍，分别过滤。理想的水样体积是一片滤膜上生长2060个粪大肠菌群落，总菌落不得超过200个。使用的水样量可参考表1。 表1 检测水样量 （3）水样的稀释方法。将水样用力振摇2050次，使可能存在的细菌凝团成分离状。以无菌操作方法吸取10ml，充分混匀的水样，注入盛有90ml，灭菌水的三角瓶中混匀成1：10稀释水样。吸取1：10的稀释液1ml注入盛9ml灭菌水的试管中，混匀成1:100稀释液。按同方法依次稀释成1:1000、1:10000稀释液。注意：吸取不同密度的稀释液时，必须更换吸管。 （4）水样的过滤。用灭过菌的镊子夹取灭菌滤膜边缘，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将适量的水样注入滤器中，开动真空泵即可抽取滤除菌。 2.3.2 培养 水样抽滤完后，再抽约5s后，关上真空泵取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分移放在m-fc培养基上，滤膜截留细菌面朝上，滤膜应与培养基完全贴紧4，两者间不得留有气泡。然后将平皿倒置，放入44.50.5的恒温培养箱或恒温水浴锅中，经242h培养。若用恒温水浴培养，则需用防水胶带贴封每个平皿，将培养皿成叠入防水袋或容器内，浸没在44.50.5恒温水浴中。在培养时间内，装培养皿的防水袋必须用重物坠入水面之下，以保持所需的严格温度。所有已制备的培养物都应在过滤后30min内浸入水浴内。 三、计算及报告结果 粪大肠菌群菌落在m-fc培养基上成蓝色或蓝绿色，浅蓝色菌落或浅蓝色菌落中心较深的菌落也应挑取，其他非粪大肠菌群落呈灰色、淡黄色或无色。正常情况下，由于温度和玫瑰酸盐试剂选择性作用，在m-fc培养基上很少能见到非粪大肠菌群菌落。必要时可将可疑菌落接种于ec培养液，44.50.5培养242h，如产气则证明为粪大肠菌群。 记数呈蓝色或蓝绿色的菌落，计算出每1l水样中的粪大肠菌群数。 粪大肠菌群落数（个/l）= 四、检验前后的注意事项 4.1 采样后水样的正确保存很重要，如保存不当可使样品中的大肠菌群细菌死亡或在一定条件下在生长，这些都将影响检验结果的准确性。检验室接到水样后，应立即检验。如因故不能检验时，应立即置于冰箱内并于2h内检验。 4.2 生活饮用水通常都是经氯处理消毒的，水中含有一定量的余氯，使大肠菌群处于受损或受抑制状态，在采集水样时应加硫代硫酸钠脱氯，使此受损的细菌得以复苏与修复，从而避免计数结果偏低甚至假阴性出现。 4.3 制备大量培养基时，除玻璃器皿外，还可用铝锅等容器加热融化，但不可用铜锅或铁锅，以免金属离子进入培养基中影响细菌生长。 4.4 将调整ph后的培养基按需要趁热分装于三角瓶或试管内，以免琼脂冷。分装量不宜超过容器的2/3，以免灭菌时外溢。分装时应注意勿使用培养基粘附于管口和瓶口部位，以免沾染棉塞而滋生杂菌。 4.5 在使用国产的苯胺蓝配制的苯胺蓝溶液时建议加入2ml，显色的效果好些，使用进口的苯胺蓝配置的苯胺蓝溶液时加入1ml就可以。 粪大肠菌群是水质污染的重要指标之一，对于水源如湖水、池水和溪水，一旦被污染，就可能也被肠道病原菌污染而引起肠道传染病甚至流行病，如霍乱、伤寒、细菌性痢疾和阿米巴性痢疾以及脊髓灰质炎和传染性肝炎等病毒疾病。因此，精确、快速、可靠的粪大肠菌群检测方法对于准确及时地监测水源水粪大肠菌群的污染状况有效预报和控制流行性疾病的发生与传播有重要意义。 参考文献： 1 国家环境保护总局水和废水检测分析方法编委会.水和废水监测分析方法m.4版。北京：中国环境科学出版社，2002. 2 张少锋，刘国强.粪大