（遗传学专业论文）人类grb10基因和hppb基因的克隆及功能研究.pdf

摘要 细胞凋亡是多细胞生物调节机体结构和功能的重要途径。在生理情况下，细 胞凋亡可能为默认的途径。细胞通过感受细胞因子和周围环境的的刺激而使细胞 脱离凋亡过程。该过程的障碍可能是退行性疾病和肿瘤发生的基本相关因素。 本实验通过酵母双杂交得到与线粒体凋亡途径中重要功能分子b i m 相互作 用的蛋白g r b l o 。g r b l o 蛋白为生长因子受体结合蛋白，是酪氨酸受体的分子伴 侣，参与多种信号转导与调节。其家族保守功能域包括n 端的富含脯氨酸的区 域，中间g m 区的r a 结构域和p h 结构域，以及c 端的s h 2 结构域。酵母双杂 交结果提示，g r b l o 可能参与b i m 介导的凋亡信号通路。我们对g r b l 0 进行全长 蛋白的基因克隆，g s t 融合蛋白的表达和纯化，对其与b i m 进行p u l l - - d o w n 和 免疫共沉淀等体内体外结合实验，以及检测细胞凋亡观察g r b l o 对b i m 功能的 影响。p l l l l d o w n 体外结合实验显示g r b l 0 与b i m 有相互作用。细胞凋亡检测 显示g r b l o 对b i m 过表达引起的凋亡有抑制作用。 在对a d 2 9 3 和h e k 2 9 3 进行差减杂交实验以探索两者在黏附和凋亡特性的差 异时，在a d 2 9 3 的高表达文库里分离得到一段新的e d n a 片段。我们从人类胎脑 文库克隆得到该基因，全长2 7 4 5 b p ，编码的蛋白含5 1 8 个氨基酸，被预测为磷 酸泛酰巯基乙胺结合蛋白一h p p b 。该基因定位在2 p 2 2 3 ，包含8 个外显子。该 e d n a 序列编码的蛋白序列含有一个凋亡抑制蛋白5 结构域，外皮蛋白重复片断 和铜结合辛肤重复片断。r t p c r 分析显示该基因在人类正常组织和癌组织中均 广泛表达，但在癌组织中表达量相对较低。该基因在进化过程中高度保守。 关键词：g r b l 0 ，b i m ，细胞凋亡，g s t 融合蛋白，泛酰巯基乙胺结合蛋白，凋亡 抑制蛋白5 结构域，外皮蛋白重复片段，铜结合辛肽重复片段 a b s t r a c t w eh a v ei d e n t i f i e dt h eg r b l 0a st h ei n t e r a c t i n gp a r t n e ro fb i mi nay e a s tt w o h y b r i d 印p r o a c hi nt h ep a s t g r o w t hf a c t o rr e c e p t o rb i n d i n gp r o t e i n1 0 ( g r b l h a sb e e n i d e n t i f i e da sac e l l u l a rp a r t n e ro fan u m b e ro fr e c e p t o rt y r o s i n ek i n a s e sa n do t h e r s i g n a l i n gm e d i a t o r s t h ef u l l l e n g t he d n a o fg r b l 0w a si s o l a t e da n dc l o n e di n t o p g e x 4 t - 1v e c t o r t h eg s tf u s i o ng r b l 0p r o t e i nw a sp u r i f i e da n du s e df o rt h e p u l l ，d o w na s s a y t h er e s u l tw a sp o s i t i v ea n ds ow e n to nt h ec o - i m m u n o p r e c i p a t i o n e x p e r i m e n t t h ee f f e c to ft h ei n t e r a c t i o no nc e l la p o p t o s i sw a si n v e s t i g a t e db y c o e x p r e s s i n gt h es h 2d o m a i no fg r b l 0a n db i m o2i nh e k 2 9 3c e l l s ：t h ec e l l a p o p t o s i sw a ss u b s t a n t i a l l yd e c r e a s e di nc e l l se x p r e s s i n gb o t ht h es h 2d o m a i no f g r b l 0a n db i mo2c o m p a r e dt ot h ec e l l so n l ye x p r e s s i n gb i mo2 i nas u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o ne x p e r i m e n t ，w h i c hp r o c e e d e dt or e v e a l a d h e s i o na n da p o p t o s i sc h a r a c t e rd i f f e r e n c eb e t w e e na d 2 9 3a n dh e k 2 9 3 ，w e i s o l a t e dae d n af r a g m e n tf r o ma na d 2 9 3h i g he x p r e s s i o nl i b r a r y , w h i c he n c o d e sa p u t a t i v eh u m a np h o s p h o p a n t e t h e i n eb i n d i n gp r o t e i n ( h p p b ) i n f e r r e db ye l e c t r o n i c a n n o t a t i o n t h e2 7 4 5 b pf u l l - l c n 舒hc d n a w a si s o l a t e df r o mh u m a nf e t a lb r a i nl i b r a r y , w h i c he n c o d e sap r o t e i no f5 1 8a m i n oa c i d s n ep r o t e i nc o n t a i n sa na p o p t o s i s i n h i b i t o r yp r o t e i n5 ( h e r s ) d o m a i n ，a ni n v o l u c r i nr e p e a t , a n dac o p p e rb i n d i n g o c t a p e p t i d er e p e a t b l a s ta l i g n m e n ta g a i n s th u m a ng e n o m i cd a t a b a s er e v e a l e dt h a tt h e g e n ec o n t a i n se i g h te x o u s ，a n di sa s s i g n e dt oh u m a nc h r o m o s o m e2 p 2 2 3 am u l t i p l e t i s s u ee d n ab a s e dr t - p c rs h o w e dt h a th p p bi su b i q u i t o u s l ye x p r e s s e di nh u m a n n o r m a lt i s s u e sa n dh u m a nt u m o rt i s s u e s 弧et r a n s c r i p ti sh i g h l yc o n s e r v e dd u r i n g e v o l u t i o n k e y w o r d s ：g r b l o ，b i m ，c e l la p o p t o s i s ，g s tf u s i o np r o t e i n p h o s p h o p a n t e t h e i n e b i n d i n gp r o t e i n ，a p l 5 ，i n v o l u c r i nr e p e a t ，c o p p e rb i n d i n go c t a p e p t i d er e p e a t 2 英文缩略词 b l a s t ：b a s i cl o c a la ii g n m e n ts e a r c ht o o l ，同源性检索工具 o r f ：o p e nr e a d i n gf r a m e ，开放阅读框 a a ：a m i n oa c i d ，氨基酸( 残基) b p ：b a s ep a i r ，( d n a ) 碱基对 g s t ：g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e ，谷胱甘肽s 一转移酶 p b s ：p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e ，磷酸盐缓冲液 p c r ：p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，多聚酶链式反应 r t p c r ：r e v e r s et r a n s c r i p tp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，逆转录p c r m t cp a n e l ：m u l t i p l et i s s u ec d n ap a n e l ，多组织c d n a 板 p a g e ：p o l y a c r y l a m i d eg e le i e c t r o p h o r e s i s ，聚丙烯酰胺凝胶电泳 g r b l o 1 4 7 ：g r o w t hf a c t o rr e c e p t o rb i n d i n gp r o t e i n1 0 1 4 7 生长因子受 体结合蛋白1 0 1 4 7 i r ：i n s u li nr e c e p t o r 胰岛素受体 i g f ：i n s u l i n - 1 i k eg r o w t hf a c t o r 胰岛素样生长因子 e g f r ：e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r 表皮生长因子受体 h p p b ：h u m a np h o s p h o p a n t e t h e i n eb i n d i n gp r o t e i n 人类磷酸泛酰巯基乙胺结 合蛋白 a c p ：a e y lc a r r i e rp r o t e i n 酰基载体蛋白 g h r ：g r o wh o r m o n er e c e p t o r 生长激素受体 s c f r ：s t e mc e l lf a c t o rr e c e p t o r 干细胞因子受体 f g f r ：f i b r o b l a s tg r o w t hf a c o rr e c e p t o r 纤维母细胞生长因子受体 p d g f ：p l a t e l e t d e r i v e dg r o w t hf a c t o r 血小板衍生生长因子 t e k ：t u n i c ae n d o t h e li a lk i n a s e 膜内皮激酶 t k ：t y r o s i n ek i n a s e s 酪氨酸激酶 f a k ：f o c a la d h e s i o nk i n a s e 黏着斑激酶 t n f ：t u m o rn e c r o s i sf a c t o r 肿瘤坏死因子 3 第一部分：人类生长因子受体结合蛋白g r b l o 基因的 克隆及功能研究 引言 g r b l 0 综述 生长因子受体结合蛋白g r b 7 ，g r b l o ，g r b l 4 是缺乏内在酶活的接头蛋白， 有共同的多结构域结构，组成一个有多种细胞功能的结构上相关联的多结构域接 头蛋白家族。这些接头蛋白可以和许多受体或非受体酪氨酸激酶以及多种细胞内 蛋白结合，在包括调节细胞生长，代谢，凋亡和细胞迁移等多种细胞过程中发挥 功能( d a l y ，r j 1 9 9 8 ，m o r r i o n ea 2 0 0 0 ，h a n ，d c e ta l2 0 0 1 ，s h e n ，t l ： g u a n 。j l 2 0 0 4 ，l i m ，m a ：r i e d e l ，h ；l i u ，f 2 0 0 4 ，r i e d e lh 2 0 0 4 ， c a r i o ub e ta l2 0 0 4 ) 。g r b l o 和g r b l 4 特异性的参与调节胰岛素受体信号通 路，g r b 7 主要参与到黏着斑激酶介导的细胞迁移。 g r b t l o 1 4 家族最初是通过用表皮生长因子受体( e g f r ) 自磷酸化的c 端 为探针对a d n a 文库进行受体靶点克隆( c o r t ) 筛选鉴定相互作用的蛋白而得到 的。g r b l o 是在对n i h 3 t 3 文库的筛选中发现的( o o ij e ta l1 9 9 5 ) ，与之前鉴 定发现的g r b 7 和c e l e g a n t 蛋白f l o e 9 6 m i g 一1 0 结构上相似，有一个相似的中 部区g m ( g r b s 和m i g ) ( s t e i nd e ta l1 9 9 4 ，m a r g o l i sb 1 9 9 4 ) 。这个g m 区有个类r a s 关联( r a s - a s s o c i a t i o n - l i k e ) 结构域和普列克底物蛋白同源( p h - - p l e c k s t r i nh o m o l o g y ) 结构域。靠近c 端的s h 2 结构域在哺乳动物家族成员 中保守。b p s 结构域和s h 2 结构域是g r b t l o 1 4 家族所特有的( h ew e ta l 1 9 9 8 ) 。g r b t l o 1 4 家族和m i g l o 均有一个靠近n 端的富含脯氨酸的区域。( 图 2 ) g r b 7 l o 1 4 家族结构和功能的关系 g r b l o 在结构和功能方面是该家族中被研究的最多的。g r b l o 的各种亚型由 于选择性剪接和翻译起始不同在n 端区域产生差异。结晶和突变分析认为g r b l o 最可能以由s h 2 结构域自联接调节的延长式的二聚体形式存在。 s h 2 结构域是g r b t 1 0 1 4 家族中最高度保守的结构域。这个磷酸酪氨酸结 合模块在与受体酪氨酸激酶和其它细胞内信号蛋白结合中起重要作用。但是 g r b l o ，g r b l 4 和g r b 7 有不同的结合参数选择。g r b l o 与i r 和i g f r 结合力显著。 虽然典型的s h 2 结构域为单体形式，但g r b l o 的s h 2 结构域结晶为二聚体。该二 4 聚体的接触面由s h 2 结构域的c 端a 螺旋内和外侧的残基组成，这一结构在 g r b 7 l o 1 4 家族中保守。( 图1 ) g r b l o - - s h 2 结构域的结构特点使其更易与含 有旋转结构的磷酸酪氨酸序列结合，例如i r 和i g f r 中被磷酸化活化的环结构， 而不像别的s h 2 结构域更易于和伸展的结构结合。 图1g r b l o 的s h 2 结构域二聚体结构图( a d o p tf r o ms t e i n ，e g e ta l2 0 0 3 ) b p s 结构域最初是在g r b l o 中被鉴定的，它的命名是因为它的位置在p h 和 s h 2 结构域中间( h ew ，r o s ed w e ta l1 9 9 8 ) 。该结构域被单独分离出来后 依然可以保留它的生理活性：和i r 受体及i g f r 受体相互作用( h ew e ta l1 9 9 8 ) 。 它可以抑制胰岛素受体的催化活性( s t e i n ，e g e ta l2 0 0 1 ，b e r e z i a tv e ta l 2 0 0 2 ) 和抑制胰岛素引起的非洲爪蟾卵母细胞中的胚泡破裂( m o n c o q ，k e ta l 2 0 0 3 ) 。并且加热处理后仍然不会影响b p s 结构域的生理活性( m o n c o q ，k e ta l 2 0 0 3 ) 。b p s 结构域是一个重要的受体结合决定因素。p h 结构域也是g r b 7 l o 1 4 家族中较为保守的结构域。普遍认为p h 结构域通过与磷脂作用促进与膜的结合 ( l e m m o n 。m a e ta l2 0 0 0 ) 。g r b 7 的p h 结构域被证明与特异的磷脂结合，这 种作用在g r b l o 和g r b l 4 中尚未肯定( s h e n ，t l e ta l2 0 0 2 ) 。在g r b 7 l o 1 4 家族的n 端区域有一段保守的富含脯氨酸的序列。ra 结构域是通过序列分析和 生物信息学手段被鉴定的，在g r b 7 l o 1 4 家族蛋白中间的g m 区( w o j c i kj e ta l 1 9 9 9 ) 。很多是r a s g t p 效应器的信号蛋白中包含r a 结构域。g r b 7 l o 1 4 家族的 r a 结构域被推测可能与r a s 超家族结合。( 图2 ) 黼7 g r b l 9 a 出1 4 h 嘲m g 岫 s i m c o m m n m g p “m f i b b i 捌l “棼价舢p h h y 黼to r g f o h _ | i l mr “q h i w w 艄：l l u l a r 孳，”h m gf n # c 嬲 叠d d l l i o | 博il 敏a t 堪 l j f rb , t 啦h n g l 羊亨 l 图2g r b 7 l o 1 4 家族蛋白图示( a d o p tf o r mh o l tl j ，s i d d l ek2 0 0 5 ) g r b 7 l o 1 4 家族的基因和不同亚型 人的g r b l o 基因在7 号染色体上占据1 9 0 k b ，有2 2 个外显子( d o n g ，l q e t a l1 9 9 7 。a n g r i s tm e ta l1 9 9 8 ，b l a g i t k on e ta l2 0 0 0 ) 。g r b l o 的不同 亚型是利用不同的外显子进行选择性剪接使n 端扩展不同造成的。这些结构域的 部分缺失带来的功能意义尚不明确，可能与g r b l o 抗凋亡的能力有关( n a n t e la e ta l1 9 9 9 ) 。除了在编码区的差异，5 非翻译区外显子也可以进行选择性剪接 ( b l a g i t k on e ta l2 0 0 0 ) 。虽然5 非翻译区可能影响m r n a 的翻译效率，但 人类g r b l o 在这个非翻译区的差异的意义尚不明确。 g r b 7 l o 1 4 家族的组织分布和相关表达 人类的g r b l o 在例如骨骼肌，脂肪组织，心，肾和胰腺等胰岛素靶组织中高 表达。在骨骼肌和胰腺中都有多种r n a 转录物，这和这些组织中存在不只一种的 剪接变体相一致，同时也反映了在非编码区的差异和变化。人类的g r b l o 在心肌 和脑中中等程度表达，在其它组织包括胎盘，肺，肝，肾，脾，前列腺，睾丸， 卵巢，小肠和结肠中表达量较低。g r b l 4 和g r b l o 的表达谱相似，都是广谱表达， 在胰岛素靶组织中相对优势表达。有数据表明，g r b l 4 在成人肝脏中比g r b l o 较 丰富，g r b l o 在骨骼肌和脂肪细胞中，比g r b l 4 含量丰富。相反，g r b 7 的分布较 局限，这和它不同的功能相一致。据报道，g r b 7 在胰腺，前列腺，小肠和肝中 有表达( f r a n t z ，j d e ta l1 9 9 7 ) 。 g r b l o 和g r b l 4 在i r 和i g f 一1 活动中的作用 虽然g r b 7 l o 1 4 家族成员最初是通过与自磷酸化的e g f r s 结合被发现的， 但人们很快又认识到和别的s h 2 结构域介导的相互作用相比，这些接头蛋白可以 和许多其它的受体和酪氨酸激酶结合。g r b l o 和g r b l 4 与i r 的相互作用以及与 i g f r 较少程度的相互作用已经被研究的比较清楚了。g r b 7 l o 1 4 与干细胞因子 受体，成纤维细胞生长因子受体，血小板衍生生长因子b 受体，膜内皮激酶等的 相互作用也都有报道。( 见表1 ) 这些相互作用被包括酵母双杂交筛选，过表达 系统，p u l l d o w n 分析等各种方法进行了证明。 g r b 7 与i r i g f - 1 的相互作用比g r b l o g r b l 4 要弱。g r b l o 的s h 2 结构域明 显的更易于和转弯处多磷酸化的结构域作用( s t e i n ，e g ，g h i r l a n d o ，r a n dh u b b a r d 。s r 2 0 0 3 ) 。g r b l o 和g r b l 4 的作用能力可以极大的被b p s 结构 域调节，这方面可以特别参照它们与i r 高度亲和的结合。 g r b l o 和i r 的联系是依赖于受体的自磷酸化的。在细胞中，这种相互作用 发生在胰岛素结合后( h a n s e nh e ta l1 9 9 6 ，l i u ，f a n dr o t h ，r a 1 9 9 5 ) ， 酪氨酸激酶受体的a t p 结合位点中关键的赖氨酸残基的突变会废除这种结合 ( 0 ，n e i l l ，t j e ta l1 9 9 6 ) 。g r b 7 和g r b l 4 与i r 的结合条件与g r b l o 非常 相似。( k a s u s j a c o b ia e ta l1 9 9 8 ，k a s u s j a c o b ia e ta l2 0 0 0 ) 很多研究支持，在与i r 的相互作用中，s h 2 结构域起了重要作用。独立的 g r b l o 的b p s 结构域和s h 2 结构域都可以和磷酸化的胰岛素受体作用。b p s 与突 变的s h 2 一起可以和胰岛素受体激酶结构域在体外作用，说明b p s 和i r 的酪氨 酸激酶区域有结合。可能这种结合并不是b p s 直接与活化的磷酸酪氨酸残基结 合，而是自磷酸化改变了i r 的构像保露了b p s 结合表位( s t e i n ，e g ， 7 g h i r l a n d o 。r a n dh u b b a r d ，s r 2 0 0 3 ，s t e i n ，e g e ta l2 0 0 1 ) 。在与 i r 的结合中b p s 结构域与s h 2 结构域同等重要( h ew e ta l1 9 9 8 ) 。 表lg r b t l o 1 4 家族成员与细胞表面受体的相互作用( a d o p tf o r mh o l tu j ，s i d d l ek2 0 0 5 ) 各种细胞表面受体与g r b 7 1 0 1 4 家族相互结合的用表示，结合强弱如表所示，g h r 为生 长激素受体。n s 未研究过的，x 未检测到结合作用 r e c e p t m g r b 7gr b i og r b t 4p r e f er e n c e c - k i v s c f r、 1 1 , s g 鹕 、 g r b 7 g r b l 4 e p h l a m i l y 、 n s 。 e i b b 2 xx e 啦b 3 1 1 s n s e b 8 4 ns n s f g f r 0、?、?g r b t t 4 * g b l o g 酎 r 1 s ，r i , s 。 g h rn s j l n s ， i g f rn s 1 1 s 1 r 、 厂 p d g f # r00 、 g r b 7 一g r b l 4 r e t n s8 r 略g r b l o t e k 飘e 2 、 n s v e g f rn 毫 n s g r b l o 1 4 的s h 2 和b p s 结构域与i r i g f r 的酪氨酸激酶结构域的结合被预 测可能影响激酶的活性，并且这一点被确实证实了。体外实验表明全长的 g r b 7 l o 1 4 或包含b p s 的g r b 7 l o 1 4 片断能抑制i r 和在部分情况下抑制i g f r 对肽底物的催化活性( s t e i n ，b g e ta l2 0 0 1 ，b e r e z i a tv e ta l2 0 0 2 ) 。 这种抑制作用是通过非竞争性机制的，并且对i r 的效应大小排序为g r b l 4 g r b l o g r b 7 。在正常细胞中过表达g r b l o 1 4 会相似的抑制胰岛素刺激的内源性 底物的磷酸化。在酵母三杂交实验中g r b l o 的b p s - - s h 2 片断可以打断胰岛素受 体底物与胰岛素受体的结合，说明g r b l o 对胰岛素受体底物磷酸化的抑制作用至 少部分是由于空间位阻( w i c k ，k r e ta l2 0 0 3 ) 。这样g r b l o 与g r b l 4 的抑制 作用可以解释为激酶受体自身活性的下降和底物结合受体通路受限的共同效应。 ( 图3 ) 8 ic r b l o _ 埘g 捕1 4 蛔h i 蝴撤e # 嘲”k 删脚耐l lp r t 摊吐e t 黼f s - b ”嘲抽也- c b v t l 列i rl 图3g r b l o 和6 r b l 4 在胰岛素受体水平调节胰岛素作用机制模型( a d o p tf o r m h o l tl j ，s i d d l ek2 0 0 5 ) 和观察到的对胰岛素诱导的i r 底物磷酸化的抑制作用相一致，g r b l o 和 g r b l 4 的过表达会抑制下游胰岛素信号通路级联的活化。许多研究对代谢终端调 查后肯定在培养细胞中过表达g r b l o 和6 r b l 4 抑制胰岛素诱导的糖原合成 ( k a s u s j a c o b ia e ta l1 9 9 8 ，m o u n i e rc e ta l2 0 0 1 ) ，e l k l 转录因子的磷酸 化( l a n g l a i sp e ta l2 0 0 4 ) ，d n a 合成( k a s u s j a c o b ia e ta l1 9 9 8 ) 和细胞 周期进程( m o r r i o n e ，a e ta l1 9 9 7 ，k a i r o u zr e ta l2 0 0 4 ) 。不同实验室的 多个研究结果共同支持6 r b l o 有能力对1 6 f 信号通路发挥抑制作用。这种作用不 依赖于细胞环境而是源于当6 r b l o 与自磷酸化的i r 结合时对受体激酶活性的抑 制。 尽管许多的研究详述了6 r b l o 对胰岛素受体激酶和信号通路的抑制作用，另 一些研究发现，g r b l o 也可以在调节胰岛素和其它生长因子的活动中起积极作 用。不同实验研究的数据表明，6 r b l o 能通过胰岛素受体对对信号系统产生正向 和负向影响。g r b l o 过表达对胰岛素作用的相反效应在不同研究中的相同的细胞 系都有报道( h o l tl j 。s i d d l ek2 0 0 5 ) ，说明6 r b l o 发挥作用是不依赖细胞环 9 境的。进一步的研究表明了g r b l o 1 4 能在胰岛素信号通路中发挥正向活化调节 作用的另外的机制。在c o s 一1 细胞中共同过表达g r b l 0 和a k t 发现g r b l o 组成性 的与a k t 相结合( 图4 ) ( j a h n ，t e ta l2 0 0 2 ) 。这种相互结合可能是通过g r b l o 的n 端而不是依靠s h 2 或p h 结构域。重要的是，这种相互结合是g r b l o 独立于 p 1 3 k 通路而显著的增加了a k t 的活性。该g r b l o a k t 复合物对c k i t 受体的激 活在c k i t 受体信号通路中发挥重要作用。迄今为止，这个有趣的结果还未在任 何其它细胞系或受体体系中被重复出来。相反的，在c h o i r 细胞中，就未检测 到g r b l o 与a k t 的相互结合。过表达g r b l o 表现出对胰岛素诱导a k t 活化的抑制 作用( w i c k ，k r e ta l2 0 0 3 ) 。 6 d h 如r 一 _ 目” _ 啼一 q q _ 一 d 州埘m l t “l f a k t i ：n 呻捌_ 琅n 目i d ” 敝f | l t 耐i i i 抖l s k 啊 s l ” i 瑚 。“”“”登巴，麟m j k 州装嘲 叼埘m 搬招h 聱矗d f 锄h 珂 图4g r b 7 l o 1 4 家族细胞内结合配体( a d o p tf o r mh o l tl j ，s i d d l ek2 0 0 5 ) 在对基因敲除的小鼠的研究为g r b l o 和g r b l 4 的生理作用提供了重要证据。 缺乏g r b l o 的老鼠表现出了胚胎和胎盘的过度生长，与正常出生的老鼠相比突变 老鼠大了3 0 。过度生长是不成比例的，肝脏被显著的影响而脑确没有，成年动 物的脂肪组织减少了。这些观察显示了g r b l o 是一个潜在的组织选择性生长抑制 因子，尤其在生长的胚胎阶段。研究表明在i g f 一2 缺陷型小鼠( c h a r a l a m b o u s ， m e ta l2 0 0 3 ) 和i g f r 缺陷型小鼠中g r b l o 的缺失引起成比例的相似的生长效 应，驳斥了i g f r 下游一个位点作用的说法。 1 0 g r b l 0 和g r b l 4 的其它潜在作用 胰岛素受体中酪氨酸残基的磷酸化是g r b l o 与胰岛素受体相互关联的决定 因素。与g r b l o 的结合可能保护了这些位点脱磷酸同时也潜在的抑制了其它结构 域的磷酸化。因此g r b l o 对整个受体磷酸化的网络影响是很难预计的。过表达 g r b l o 产生的明显不一致的结果可能是因为g r b l o 对各种不同受体磷酸化位点的 影响是不同的。 g r b l o 被提出在细胞凋亡的调节中起作用并且不依赖于和受体的直接相互 作用。据报道，在胰岛素作用后，g r b l o 的s h 2 结构域与m e k i ( m a p 激酶e r k 激酶) 结合以及组成性的与r a f - 1 结合。( 图4 ) 表达s h 2 突变的g r b l o ，因为不 能与r a f - 1 或m e k l 作用而诱导凋亡，如果同时共表达野生型g r b l o 可以逆转凋 亡效应。( n a n t e la e ta l1 9 9 8 ) 但现在仍然不清楚g r b l o 的这种抗凋亡作用 是如何调节的。 g r b t l o 1 4 家族蛋白与线虫的m i g l o 共有一个同源序列一g m 结构域。在胚 胎发育中的神经细胞长距离迁移中需要m i g l o ( m a n s e r ，j a n dw o o d ，w b 1 9 9 0 ) ， 这样提示了g r b 7 l o 1 4 家族在调节哺乳动物细胞迁移中可能的作用。细胞迁移 对多种生物过程很重要，包括胚胎发育，炎症免疫反应，创伤愈合，肿瘤转移等。 f a k 在被整合素激活后对调节这些反应起重要作用。f a k 定位在黏着斑，g r b 7 也 在黏着斑上被发现，并且g r b 7 通过它的s h 2 结构域与酪氨酸磷酸化的f a k 结合 ( h a n ，d c ，s h e n ，t l a n dg u a n ，j l 2 0 0 0 ，h a n ，n c a n dg u a n ，j l ) 。许 多研究表明g r b 7 参与生长因子诱导的细胞迁移( h a n ，d c e ta l2 0 0 1 ，s h e n ， t l ：g u a n ，j l 2 0 0 4 ) 。 g r b l o 和g r b l 4 作用的调节 g r b 7 l o 1 4 接头蛋白家族显然不太可能只是简单的在细胞中发挥酪氨酸激 酶受体的抑制剂作用，它们的作用当然可能超越简单的对激酶活性和下游信号通 路的抑制作用。g r b l o 和g r b l 4 作为胰岛素活性的明确调节者，它们自身也是被 调节的。对接头因子功能的调节基本上是通过翻译后修饰或表达水平的修饰。 g r b t l o 1 4 家族的丝苏氨酸和酪氨酸残基能在体内被磷酸化，但这种修饰 的功能意义尚不清楚。在完整细胞中，g r b l o 和g r b l 4 的丝氨酸残基都被基础的 磷酸化。g r b l o 的丝氨酸磷酸化在多种生长因子的刺激后会增加，包括e g f ，p d g f ， f g f 和胰岛素，该现象伴随着蛋白在s d s p a g e 上迁移率的改变( o o ij e ta l 1 9 9 5 ，d o n g ，l q e ta l1 9 9 7 ) 。 抑制剂研究表明基础的和胰岛素刺激的磷酸化是被p 1 3 k 和m a p k 信号通路调 节的，至少是部分调节( d o n g ，l q e ta l1 9 9 7 ) 。此外，有报导说g r b l o 与r a f 一1 和m e k l 激酶有直接结合( n a n t e la e ta l1 9 9 8 ) ，还可以被m a p k 在体内磷酸化( l a n g l a i s ，p e ta l2 0 0 2 ) 。可能这些胰岛素调节激酶对g r b l o 的磷酸化是作为其在胰岛素信号通路中作用的反馈机制。但是磷酸化位点和磷酸 化作用对g r b l o 功能的影响尚不清楚。g r b l 4 的丝氨酸磷酸化能在p d g f 和f g f 引起的细胞刺激下增加，但e g f 则无这种作用。值得注意的是，g r b l 4 的磷酸化 增加了其在体内作为胰岛素酪氨酸激酶抑制剂的潜能。 g r b 7 1 0 1 4 家族成员的酪氨酸磷酸化比丝苏氨酸磷酸化更加神秘难解。虽 然g r b l o 和g r b l 4 与i r 结合良好，但很清楚的是他们并不是其酪氨酸激酶活动 的直接底物。有报道说g r b l o 和胞内酪氨酸激酶t e c 作用并被其磷酸化( 1 l a n o ，h e t a l1 9 9 8 ) 。( 图4 ) 这样，g r b l o 的酪氨酸磷酸化被设想参与在受体水平终止 g r b l o 的功能或者可能在非受体酪氨酸激酶信号中发挥作用。 g r b l o 和g r b l 4 的功能基本被控制的另一机制是通过在细胞中这些蛋白水平 进行的调节。虽然胰岛素效应在g r b l o 蛋白水平没有报道，但血管内皮生长因子 ( v e g f ) 可以刺激g r b l o 的表达( g i o r g e t t i - p e r a l d is e ta l2 0 0 1 ) 。在这个环 境中，g r b l o 明显参与了正反馈回路，引起内皮细胞中v e g f 受体( v e g f r 2 k d r ) 数量的增加。事实上，在内皮细胞中v e g f 可能和肝细胞生长因子协同的上调了 g r b l o 和g r b l 4 的表达( g e r r i t s e n ，m e e ta l2 0 0 3 ) 。是否胰岛素和i g f _ l 在 g r b l o 蛋白水平对其进行调节有待研究。考虑到g r b l 4 是胰岛素信号通路的抑制 剂，胰岛素对g r b l 4 表达的作用将会是负反馈的，与v e g f 对g r b l o 表达的影响 相反。 尽管在生长因子剥夺导致细胞凋亡与b i m 启动j n k 介导的细胞凋亡以及胰岛 素，n g f 等激素通过调节g r b 使细胞避免凋亡命运已经阐明，但是b i m 与g r b 的 相互关系并为明确。探讨该机制可以丰富细胞因子调节细胞凋亡的指示，也可能 加深对有关疾病的认识，指导有关疾病的研究。本研究试图验证酵母杂交提示的 b i m 与g r b 的相互关系及确定该相互作用对细胞凋亡影响。 材料和方法 1 材料与试剂 1 1 实验材料 p v d f 膜( h y b o n d p ) ，美国a m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h 公司产品 m u l t i p l et i s s u ec d n ap a n e li 、i i 、f e t a lp a n e l ，美国c l o n t e c h 公司产 品 a n n e x i n - vp e 凋亡检测试剂盒，美国b e c t o nd i c k i n s o n 公司产品 1 2 主要试剂、酶类 寡聚核苷酸引物，上海生工生物工程公司产品 q i a p r e ps p i n 质粒抽提试剂盒，德国q i a g e n 公司产品 q i a q u i c kp c r 纯化试剂盒，德国q i a g e n 公司产品 q i a q u i c k 胶回收试剂盒，德国q i a g e n 公司产品 t 。d n a 连接酶，英国b i o l a b s 公司产品 各种d n a 分子量m a r k e r ，英国b i o l a b s 公司产品 中分子量蛋白标准，洛阳华美公司产品 各种限制性内切酶，英国b i o l a b s 公司产品 t a qp l u sid n a 聚合酶，上海生工生物工程公司产品 p f ud n a 聚合酶，上海生工生物工程公司产品 t a q 酶，复旦大学遗传学国家重点实验室产品 细菌d n a 提取液，复旦大学遗传学国家重点实验室产品 d n t p s ，上海生工生物工程公司产品 所有引物都由上海生工公司合成 i p t g ，美国p r o m e g a 公司产品 氯化钙，美国a m r e s c o 公司产品 t r i s 碱，分析纯，美国b o e h r i n g e rm a n n h e i m 公司产品 乙二胺四乙酸( e d t a ) ，分析纯，安徽合肥工业大学化学试剂厂 氨苄青霉素，上海四药股份有限公司 n ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺( t e m e d ) ，美国f l u k a 公司产品 n ，n 一亚甲双丙烯酰胺，美国b b i 公司产品 丙烯酰胺，美国b b i 公司产品 过硫酸胺，美国s i g m a 公司产品 考马斯亮蓝r 2 5 0 ，美国a m r e s c o 公司产品 十二烷基磺酸钠( s d s ) ，美国s e r v a 公司产品 滤器，g e l m a nl a b o r a t o r y 的a e r o d i s es y r i n g ef i l t e r 滤器( 0 2 pm 孔径) l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 真核转染试剂，美国i n v i t r o g e n 公司产品 h r p 酶联羊抗兔二抗，美国s a n t ac r u z 公司产品 h r p 酶联羊抗小鼠二抗，美国s a n t ac r u z 公司产品 小鼠a n t i - g f p 单克隆抗体，美国b i o l a b 公司产品 兔a n t i g r b l o 多克隆抗体，美国s a n t ac r u z 公司产品 兔a n t i - b i m e l 多克隆抗体，美国s a n t ac r u z 公司产品 1 3 菌株、质粒和细胞株： 大肠杆菌菌株 d h 5 菌株：基因型s u p e 4 4 ，