（遗传学专业论文）拟南芥质体和细胞核之间协调机制的初步分析.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 在植物细胞的质体与细胞核之间存在着协调关系，核基因产物可以调控质 体基因的转录和翻译，质体的代谢及发育状态也能影响核基因编码的质体蛋白 的表达。已有的研究认为，质体的代谢及发育状态以质体因子的浓度变化作为 信号。质体中进行的四毗咯代谢的中间产物镁一原卟啉i x ( m g p r o t o p o r p h y r i n i x m p ) 就是这样一类质体信号。在模式生物拟南芥中，此类信号转导突变体 已经得到，称作“g u n ”，g e n o m eu n c o u p l e d ( 基因组解偶联) ，目前，已有5 种 g u n 座位被报道过，分别为g u n l 、g u n 2 ( h y lj 、g u n 3 ( h y 2 ) 、g u n 4 和 g u n 5 ，除了g u n 其余均已完成基因克隆。 细胞内质体与细胞核间的协调更多地体现于细胞核对质体发育的调控。叶 片花斑突变体是研究这一过程的极好材料。在已报道的若干花斑突变体( i m 、 v a t 2 、v a t l 和c h i n ) 的研究中发现引起花斑的是一些核基因。叶绿体内的基 因突变引起花斑比较容易理解，其机理也已经比较清晰了。但是，细胞核基因 突变引起花斑的机理比较难解释，因为每个细胞的基因型是一样的，但不同细 胞的质体发育状态则呈现出不同，这些花斑突变体本身的存在能很好地说明在 细胞核与质体之间存在着复杂的协调机制。 在本实验中，我们用r b c s ? ? g f p 报告株系，在引起质体光氧化的除草剂诺 氟拉呈( n f ) 和质体翻译抑制剂林可霉素( 1 3 4 ) 的处理下共筛选到3 个g u n 突变体，等位性测验表明，没有发现新的g u n 位点，但是发现引入质体翻译 抑制剂作为筛选压，是一个寻找核质失调突变位点的新方法；制作了g u n 双突 变体，观察到了g u n 基因间有明显的相互作用；药物学实验证明质体氧化还 原状态也会影响细胞脱分化与分化相关的核基因的表达；并且对质体因子m p 的下游信号作了些初步分析，认为c g m p 是位于m p 下游的信号传递物质。 此外，我们还从e m s 突变体库中以及通过t - d n a 插入失活的方法，筛选 到了4 个质体发育突变体，绿黄花斑a d l 一1 和绿白花斑v a r - a 突变基因分别与 已知基因c u e l 和i m 等位；叶色偏淡突变体p a g 和绿白花斑v a r - b ，表型都比 较有特色，以往文献未见报道，我们推测可能会是新基因。目前，p a g 与v n p b 的克隆工作正在进行中。 浙江大学硕士学位论文 关键词：拟南芥突变体核质协调基因组解偶联质体发育花斑 6 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h e r ei sa ni n t r a c e l l u l a rc o o r d i n a t i o nb e t w e e nn u c l e u sa n dp l a s t i di nt h ep l a n t c e l l s n u c l e a rg e n ep r o d u c t sc o n t r o lt h et r a n s c r i p t i o na n dt r a n s l a t i o no fp l a s t i dg e n e s ， b u t t h em e t a b o l i co rd e v e l o p m e n t a ls t a t eo ft h ep l a s t i dc a na l s oi n f l u e n c et h e e x p r e s s i o no fn u c l e a rg e n e se n c o d i n gp l a s f i dp r o t e i n s r e c e n ts t u d i e sh a v ei n d i c a t e d t h a tp l a s t i d sa r ea b l et oc o m m u n i c a t et h e i rf u n c t i o n a ls t a t u st ot h en u c l e u sb ys e n d i n g a “p l a s t i ds i g n a l ”w h i c hd e r i v e si nt h ec h a n g eo ft h ec o n c e n t r a t i o no ft h ep l a s f i d f a c t o r sa n dt h a tt h en u c l e u sr e s p o n d sb ym a k i n ga p p r o p r i a t ec h a n g e si ng e n e e x p r e s s i o n m g - p r o t o p o r p h y f i n ( m p ) ，at e t r a p y r r o l ei n t e r m e d i a t ei nt h ep l a s t i d a c ta sap l a s t i ds i g n a l t h ep l a s t i d t o n u c l e u ss i g n a l i n gm u t a n t so fa r a b i d o p s i sh a v e b e e no b t a i n e d t h e s em u t a n t sa r ec a l l e d “g u n ”，f o rg e n o m eu n c o u p l e d f i v eg u n l o c i h a v eb e e nr e p o r t e d ，a n da l lt h ef i v eg u ng e n e se x c e p tg u n lh a v eb e e na l r e a d y c l o n e d t h ec o o r d i n a t i o nb e t w e e nn u c l e u sa n dp l a s t i di s m a i n l yi n v o l v e di n t h e a n t e r o g r a d ep a t h w a yt h a tn u c l e a rg e n e sc o n t r o lt h ed e v e l o p m e n to ft h ep l a s t i d f r o m t h es t u d i e si nt h ev a r i e g a t e dm u t a n t s ( i m ，v a r 2 ，v a r la n dc h m ) ，ak i n do fm u t a n t s d e f i c i e n ti np l a s t i dd e v e l o p m e n t ，w ek n o wi ti st h em u t a t i o n si nn u c l e a rg e n e st h a t i n d u c et h e s ep h e n o t y p e t h em e c h a n i s mo fv a r i e g a t i o ni nc h l o r o p l a s th a sb e e nc l e a r l y , b u to n ei n d u c e db yn u c l e a rg e n e ss t i l lp u z z l e du s t h eg e n o t y p eo ft h ec e l li sa 1 1t h e s a m e ，b u tt h es t a t u s i n p l a s t i dd e v e l o p m e n ta p p e a r sd i f f e r e n t t h e s ev a r i e g a t e d m u t a n t st h e m s e l v e se x p l a i n e dt h ee x i s t e n c eo fc o o r d i n a t i o nb e t w e e nn u c l e u sa n d p l a s t i d i nt h i sp a p e r , w eh a v es c r e e n e dt h r e eg u nm u t a n t su s i n gt h et r a n s g e n i cp l a n t s t h a tc o n t a i naf u s i o no ft h er b c sp r o m o t e rt ot h ea f t , g e n e ( r b c s ：g f p ) w h e nt r e a t e d w i t hn o r f l u r a z o na n dl i n c o m y c i nw h i c hi n f l u e n c ep l a s t i dd e v e l o p m e n tg r e a t l y w e h a v e n td i s c o v e r e dn e wg u nl o c u s ，b u tw ef i n di ti san e wm e t h o dt h a tg u nm u t a n t s a r es c r e e n e du n d e rt h et r e a t m e n tw i t hl i n c o m y c i n am e t a b o l i ci n t e r a c t i o nb e t w e e n g u n g e n e sc a nb ei n f e r r e dt h r o u g ht h eo b s e r v a t i o no ft h ep h e n o t y p eo fd o u b l eg u n m u t a n t s p h a r m a c e u t i c a le x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h er e d o xs t a t eo fp l a s t i dc a na l s o 7 塑垩奎兰堡主兰壁婆苎 i n f l u e n c et h e e x p r e s s i o n o fn u c l e a r g e n e s i n v o l v e di nd e d i f f e r e n t i a t i o na n d d i f f e r e n t i a t i o n ，a n dt h a tc g m pm a ya c ti nt h es i g n a l i n gt r a n s d u c t i o nd o w n s t r e a mo f m p f u r t h e r m o r e ，w eh a v es c r e e n e df o u rm u t a n t sd e f i c i e n ti np l a s f i dd e v e l o p m e n ti n t h ee m sm u t a t i o np o o l s t h ea f f e c t e dl o c ii nt h ev a r i e g a t e dm u t a n t sa d l 一1a n dv a t - a a r ea l l e l i ct oc u e la n d1 mr e s p e c f i v e l yb u tt h ep h e n o t y p eo ft h em u t a n t sp a g0 a l e g r e e n ) a n d 肼一bh a si t so w n f u t u r ed i s t i n c t i v e l y , n o tr e p o r t e di np u b l i c a t i o n sb e f o r e w ec o n s i d e rt h e mm a yb en e wg e n e s a n dn o w , t h ew o r k i n go nt h et w og e n e sc l o n i n g i sc a r r y i n go u t k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i s ；m u t a n t ；c o o r d i n a t i o nb e t w e e nn u c l e u sa n dp l a s t i d ； g e n o m eu n c o u p l e d ( g u n ) ；p l a s t i dd e v e l o p m e n t ；v a r i e g a t i o n 8 浙江大学硕士学位论文 第一部分文献综述 植物质体与细胞核之间的信息交流 高等植物的叶绿体一般只有1 0 0 多个基因，但它的蛋白质至少有3 0 0 0 多个， 这是因为在生物的长期进化过程中，质体的大部分基因转移进入了核中，只有一 小部分它自己保留着。( m c f a d d e n ，2 0 0 1 ) 质体基因组是多拷贝环状d n a ，且 在高等植物中，一个细胞往往有多个质体。基因在细胞核和质体间的分散现象， 以及两者基因拷贝数的不一致，就需要有一个机制去协调核中叶绿体基因和质体 自身基因的表达，使叶绿体蛋白质的最终组成和丰度能有条不紊。( s u s e k e la l ， 】9 9 2 ) 9 浙江大学顿士学位论文 第一章质体向细胞核的信号转导通路及其研究进展 早期的一些实验证明了在细胞核与质体之间存在着信号通路，通过这一信号 转导途径，核基因产物可以调控质体基因的转录和翻译。然而近来的实验显示， 除了这一顺向的信号通路外，还存在逆向的，即质体的代谢及发育状态能影响核 基因的表达，这些核基因通常编码质体蛋白。( g r a y e ta l ，2 0 0 3 ) 以光系统所需 要的蛋白质为例，细胞质给它的组份和丰度必须与叶绿体自己合成的组份和丰度 相匹配，即细胞核能根据叶绿体实际的需求调节核中叶绿体基因的转录。 ( m a y f i e l d e ta l ，1 9 8 7 ) 例如，当叶绿体受损伤时，细胞核就能感受，不再转录 核中叶绿体基因。因此，存在着一些质体因子( 质体信号) 让细胞核感受叶绿体 的状态( j a r v i s ，2 0 0 1 ) 。本章将就当前这一质体向细胞核的信号转导通路及其研 究进展作一综述，着重讨论已被证明存在的一类质体信号，它们是质体中进行的 四吡咯代谢的中间产物，以及这一质体信号介导的信号转导通路作用机理。 一、质体信号的产生及其对核基因的调控 在植物细胞的质体中进行着四吡咯代谢：谷氨酸通过两条不同的分支途径， 最终分别合成叶绿素和光敏色素生色团( 图1 ) ，四吡咯是合成这两种最终产物 的结构骨架。( b r u s s l a n e ta l ，2 0 0 2 ) 有大量实验显示在这一代谢过程中产生的 中间产物在质体向核的信号转导通路中充当着质体信号的角色。当叶绿体受到损 伤而使四吡咯代谢受影响时，中间产物的浓度就会发生变化，这种变化就作为一 种信号去改变核中相关基因的表达。( p a p e n b r o c k e ta l ，2 0 0 1 ；s u p i n e ta l ，2 0 0 2 ) 下面就高等植物及藻类中研究得较多的这类信号对核中光合作用基因及热激蛋 白( h e a ts h o c kp r o t e i n ，h s p ) 基因表达的影响分别作一介绍。 1 0 浙江大学硕士学位论文 g 如拓4 旃砒e 蚪，上油硼。 煳上一一 3 玉p t 舯c 虹m 曲圳血 + 擗p h 毋0 c 打洲溅 ( p 0b ) m g p 耐。p 口憎h y 黼l x 6 一”n n t h y le s t e r 汩】i i 【) p r o t o c n o r o p h y u i d e ( pc f 】n 哟 0 c h l o r o p 娜i a e ( c h 蚪0 c h l m o p h y l l 图l 质体中的四吡咯代谢途径( s u p i n e ta l ，2 0 0 2 ) 1 四毗咯对l h c b 基因的抑制 l h c b ( 互曲th a r v e s t i n g _ c h l o r o p h y l a bb i n d i n g ) 是核中与光合作用有关的基 因，编码光合系统i i 中的光捕获叶绿素a b 结合蛋白，也叫c a b 基因。( s u s e k e t a l ，1 9 9 3 ) 在对高等植物的研究中，发现四吡咯代谢的一些中间产物，如果浓度 比正常提高，则会抑制l h c b 的转录。用金钟柏素破坏原叶绿素酸酯 ( p r o t o c h l o r o p h y l l i d e ，p c h l i d e ) 的合成，则p c h l i d e 上游步骤中的四吡咯物质尤 其是镁一原卟啉单甲基酯( m g - p r o t o p o r p h y r i n 6 - m o n o m e t h y le s t e r ，h i p m ) 就会累积( 见图1 ) ，此时检测到l h c bm k n a 水平的下降：此外，用除草剂氨基 浙江大学硕士学位论文 二唑阻止质体中原片层体的正常发育，影响叶绿素的正常合成，会引起镁一原卟 啭( m g - p r o t o p o r p h y r i n ，m p ) 的浓度升高( 见图1 ) ，也发现了l h c b 转录被 抑制。因此，认为能影响核基因转录的四吡咯物质主要是m p 和m p m ( p a p e n b r o c k e ta l ，2 0 0 1 ：s t r a n d e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 2 四吡咯对h s p t o 基因的诱导 质体信号m p 和m p m 浓度提高对核基因的转录不仅可以抑制，也可以诱导。 在对藻类的些研究中，发现m p 和m p m 会诱导h s p t o 基因的转录。( k r o p a t e t a l ，1 9 9 7 ；2 0 0 0 ) 当暗培养的莱茵哈德衣藻被转移至光照下，m p 和m p m 浓度 会升高，随之h s p 7 0 a 和h s p t o b 基因的表达也上调了。在四吡咯代谢异常的突 变体中，四吡咯水平下降，对这些突变体在暗培养时，加入外源m p 或m p m ， 会提高h s p 7 0 a 和h s p 7 0 bm r n a 水平，但当加入原卟啉( p r o t o p o r p h y r i n p r o t o ) ，p c h l i d e 和叶绿素酸酯( c h l o r o p h y l l i d e ，c h l i d e ) 这些物质时，虽然也 会促使m p 和m p m 浓度升高，但此时对h s p 7 0 a 的转录却没有影响。以上这些 实验结果说明了，m p 和m p m 激活h s p 7 0 启动子不仅需要热刺激还需要光，因为 光是m p 和m p m 这些物质从质体被释放到细胞质中所必需的，这些物质只有进 入到细胞质中才能起信号传递的作用。在暗培养条件下，外加p r o t o i x ，p c h l i d e 和c h l i d e 这些物质，虽然也能生成m p 和m p m ，但只是让其累积在质体中，信 号不能被传到核中，因此，对h s p 7 0 a 的转录也就无影响；然而加入外源的m p 和m p m ，就使得这些物质直接积累在细胞质中，所以即使没有光刺激，也能诱 导h 铲加的转录。 二、质体向细胞核信号转导的具体机制 对四毗咯代谢中间产物介导的核质信号转导机制的研究，主要是通过对一些 核质信号转导突变体的研究来进行。s u s e k 等人在拟南芥中筛选得到了一系列核 质信号转导突变体( s u s e k e ta i ，1 9 9 3 ) 。将转有l h c b 启动子加 u s 基因的转基 因植株，用e m s 诱变后，在诺氟拉呈( n o r f l u r a z o n ) 处理下，筛选到能表达g u s 即仍能表达l h c b 基因的植株，即为信号转导突变体。诺氟拉呈会导致质体光氧 浙江大学硕士学位论文 化，在正常情况下，如果质体结构遭到破坏，核中光合相关基因l h c b 的表达应 被抑制，但是这类突变体将质体的发育状态与核基因的转录解偶联，所以被命名 为“g u n ”细胞核基因组与质体基因组间解偶联( g e n o m eu n c o u p l e d ) 。到目 前为止，已有5 种g u n 座位被报道( r o d e l m e l ，2 0 0 1 ) ，除了g u n l ，其余均已 完成基因克隆，g u n 2 ，g u n 3 和g u n 5 均为核编码的质体四吡咯代谢所需的 酶，g u n 4 编码叶绿素合成的调控蛋白。 通过对这些基因功能的研究，试图来了解核质信号通路的机制。以下就对这 些基因的功能研究以及在此基础上建立的信号转导通路作一介绍。 1 g u n 5 基因及其作用模型 g u n 5 基因是一系列g u n 基因中研究得较为透彻的一个，它编码叶绿素合 成分支中所需的镁离子鳌合酶的c h l h 亚基，该酶的作用是催化p r o t o 结合m g 离子生成m p 。( m o c h i z u k i e ta l ，2 0 0 1 ) 在g u n 5 突变体中，检测到m p 浓度下 降，根据上述，当质体内m p 或m p m 浓度上升时，会使l h c b 基因的转录下调。 所以g u n 5 基因的突变，会引起肌曲转录的去抑制。基于以上研究，有人得出 以下关于g u n 5 基因的作用模型( 图2 ) 。 在正常情况下，四吡咯代谢途径正常，叶绿素能正常合成，没有中间产物 m p 或m p m 的大量累积，即浓度正常，核中l h c b 基因能正常转录。如果叶绿体 结构受到破坏，叶绿素不能正常合成，在g u n 5 基因未突变也即核质信号通路 正常情况下，造成m p 和m p m 的累积，c h l h 亚基相当于一个感受器，能感受到 这两类物质的浓度变化，并将其整合成一个信号，通过接下来的调控通路传递给 核( 见图2 ) ，去抑制l h c b 基因的转录。( m o c h i z u k i e ta l ，2 0 0 1 ) 如果，g u n 5 基因突变，镁离子鳌合酶催化m p 生成的能力受到影响，则即使在叶绿素不能合 成情况下，m p 和m p m 也不能大量累积，这时的浓度就和正常的叶绿素能合成 情况下的浓度一样，也就导致了在叶绿素不合成的情况下，l h c b 也能正常表达。 浙江大学硕士学位论文 l h c b h 惦与i p 1 a s t i d 图2g u n & 基因作用模型 2 g u n 4 基因功能及其在核质信号通路中的作用 g u n 4 基因于2 0 0 3 年完成克隆，它编码质体中叶绿素合成的调控蛋白，能 够与镁离子鳌合酶的底物p r o t oi x 结合，来激活该酶，从而促进m p 的合成，也 能与该酶的产物m p 结合，帮助其运输。( l a r k i n e ta l ，2 0 0 3 ) m p 作为质体信号，在大量累积时，只有当其离开质体到细胞质中，与细胞 质中的信号通路相互作用时，才能把信号传递给核。所以，认为g u n 4 基因在 质体到核的信号通路中所起的作用是通过与大量累积的m p 结合并将其运到质 体膜上，来促进质体信号的外运。 3 g u n 2 h y l 和g u n 3 h y 2 基因光形态建成与核质信号转导途径相关联 缈j 和衄2 是拟南芥中的光形态建成突变体，其表型为在光照条件下生长时， 呈现长胚轴( 1 0 n gh 虹p o c o t y l ) 。( p a r k s e ta l ，1 9 9 1 ) 有报道衄突变体也具有g u n 表型，上述的一系列g u n 突变体中，g u n 2 即砂i ，g u n 3 即h y 2 。h y l 和h y 2 是 光敏色素生色团合成分支中的两个酶，h y l 编码血红色素加氧酶( d a v i s e ta l ， 1 4 南 浙江大学硕士学位论文 1 9 9 9 ) ，h y 2 编码光敏色素生色团合成酶( k o h c h i e ta l ，2 0 0 1 ) 。 这两个基因的突变，均能引起血红素的累积，而四吡咯代谢途径的最初步骤 会受到代谢中间产物的反馈调节，血红素的累积抑制了最初几步，使得叶绿素合 成分支中四吡咯中间产物的浓度下降。缈j 和g u n 5 双突变体研究，显示h y l 和 g u n 5 位于同一信号通路上，也是通过c h l h 亚基作为感受器，来感受到m p 或 m p m 浓度并没累积，因而l h c b 的转录不受抑制。 y j ， y 2 是光敏色素突变体，同时也是g u n 突变体，可见，光形态建成途 径和核质信号转导途径之间存在相互关联。 4 l a f 6 基因及其功能 f 理彤( 1 0 n g 业e r f a r - - r e d ) 也是拟南芥中的光形态建成突变体，在远红外光照 射时，下胚轴伸得很长，也是由于缺乏光敏色素而不能感受远红外光造成。 ( r o d e l m e l e ta l ，2 0 0 1 ) 研究显示，l a f 6 也是四吡咯代谢中涉及到的一个基因， 它编码一个a b c ( t p - - b i n d i n g _ c a s s e a e ) 蛋白a t a b c l ，负责跨膜运输。 在l a f 6 突变体中，检测到p r o t o 浓度提高很多，认为a t a b c l 蛋白的功能是 把p r o t o 从膜上运回到质体中，去参与接下来的代谢。( m o i l e r e ta l ，2 0 0 1 ) 原卟啉原氧化酶位于质体膜上，所以原卟啉原i x ( p r o t o p o r p h y r i n o g e n p r o t o g e n x ) 要先运到膜上，在膜上这个酶的催化下，生成p r o t o ，再由l a f 6 蛋白负责把它运回到质体中( 见图2 ) 。如果l 4 f 6 突变，那么p r o t oi x 就不能被 运回质体而从膜上流入到了细胞质中，使得p r o t oi x 在细胞质中累积，而质体中 接下来的代谢过程则受到了阻碍。 在此晒突变体中，叶绿素的生物合成过程受到干扰，造成了中间产物p r o t o 的积累，而四吡咯代谢中间产物的浓度提高，会抑制核中l h c b 基因的转录，所 以有人认为l a f 6 可能也是一个影响核质信号通路的基因，是否和g u n 5 位于同 一信号通路上，可以通过上4 尉和g 删，制作双突变体来进行研究。 1 5 浙江大学硕士学位论文 三、结语 质体和细胞核之间的信号转导通路十分重要，随着质体代谢及发育状态的改 变，通过这一核质信号通路，核基因就能作出相应的反应而准确表达核编码的质 体蛋白基因。这一信号转导途径不仅对叶绿体的光合作用具有重要意义，而且对 细胞代谢和发育的其他方面都起了一个关键的作用。因为，脱落酸合成，赤霉素 合成，氮同化，硫同化等许多过程，都是一部分反应在质体中进行，一部分反应 在细胞质( 由细胞核控制) 中进行。我们以核质信号转导突变体g u n l j 、g u n 4 g u n 5 1 ，h y 和 v 2 为研究材料，通过观察其离体细胞脱分化和再分化的动态过 程，发现核质协调性对植物细胞愈伤组织诱导和植株再生也有显著的影响( 未发 表资料) 。目前，质体和细胞核信号转导机制的研究主要是以光和合作用为实验 体系展开的，今后，在其他体系上研究质体和细胞核的信号转导机制，可能也会 得到发展。 目前，g 功v 2 一g 叭5 基因已被克隆。尽管g u n 5 基因所在的核质信号通路 已被初步描述，但是实际的机制远比己描述的要复杂，只有找出g u n 5 的一系 列下游基因才能进一步把这一信号通路描述完整。此外，g u n l 基因还未被克隆， 它所在的信号通路还完全未知。因此，这些方面也会成为研究质体和细胞核信号 转导机制的热门话题。 四吡咯代谢中间产物是研究得较为清楚的一类质体信号，另外，质体的氧化 还原状态也被猜测可能起着质体信号的作用( s u r p i n e ta l ，2 0 0 2 ) ，是否还有其 他质体信号的存在，它们的作用机制如何，也是进一步研究质体和细胞核信号转 导机制的重要方面。 浙江大学硕士学位论文 第二章研究质体和细胞核之间信息交流的材料 植物叶片花斑及其产生机理 所谓植物叶片的花斑( v a r i e g a t i o n ) 表型，指的是叶片的一些区域是黄色或 白色，而另一些区域是正常的绿色。在园林绿化中，叶片花斑是一种经常可以观 察到的遗传现象，主要由基因突变，嵌合体，转座，病毒感染等几种方式引起。 从基因突变的发生过程讲，可以是自发突变，也可以是诱发突变。从基因突变的 发生部位讲，可以是细胞质基因，也可以是核基因突变。( r o d e l m e l ，2 0 0 2 ) 叶绿体内的基因突变引起花斑的机理已经比较清晰了。高等植物的一个叶肉 细胞含有多个叶绿体，每个叶绿体含有几十到一百多个拷贝的环状d n a 。如果 其中的一个或几个环状d n a 发生突变，在以后的d n a 复制和新叶绿体形成中， 大体上就会产生三种叶绿体，一种含有正常d n a ，决定绿色；一种含有突变d n a ， 决定白色；还有一种是混合d n a ，决定黄色。( s a k a m o t o ，2 0 0 3 ) 细胞核基因突变引起花斑的机理比较难解释，因为每个细胞的基因型是一样 的。本章重点介绍拟南芥菜1 m 、v a r l 、v a r 2 、c h m 、c u e l 、p a c 和a t d 2 等 7 个细胞核基因突变引起的叶片花斑，主要包括这些基因所编码的蛋白以及它们 突变以后引起花斑的机理。 一、i m m u t a n s 基因 i m m u t a n s 基因突变引起的拟南芥菜叶片花斑是目前研究得最深入的一种 叶片花斑。1 9 6 3 年，r e d e i 最早发现了这种花斑并在后来为它命名，在拉丁文中， i m m u w n s 是不可变的意思。该基因被定位在拟南芥第4 号染色体上c e r 2 和 a g 两个标记之间( w u e ta l ，1 9 9 9 ) 。 i m m u t a n s 蛋白是细胞核编码给质体的末端氧化酶，参与电子传递和氧化 还原状态的调节。突变体的白色部分有很少的类胡萝h 索和很多的八氢番茄红素 ( 类胡萝p 素的前体) 。p d s ( p h y t o e n ed e s a t u r a s e ，八氢番茄红素去饱和酶) 负 浙江大学硕士学位论文 责催化八氢番茄红素向类胡萝h 素的转化。在突变体的白色部分，p d s 蛋白失去 活性，而在绿色部分，p d s 具有活性。( a l u m e ta l ，2 0 0 1 ) 因此，白色叶片和 白色部分的产生机理是：i m m u t a n s 缺少导致叶绿体内氧化还原不正常，从而 导致p d s 失活；p d s 失活导致类胡萝h 素缺失，类胡萝h 素缺失导致叶绿索光氧 化，最终叶片的白化。( j o s s e e ta l ，2 0 0 0 ；a l u m e ta l ，2 0 0 4 ) 关于i m m u t a n s 基因已经有两种突变体，分别称之为i m l j 和o n l 2 。 番茄的g h o s t 基因与拟南芥i m m u t a n s 基因具有同源性的。g h o s t 突变番 茄表现出叶片的光漂白特征，并且在花和果实中有类胡萝h 素缺少的特征。 二、v a r l 基因 v a r l ( y e l l o wv a r i e g a t e d l j 花斑突变体最早是在拟南芥菜组织培养中获得的， 突变体含有很多不正常的质体并出现绿黄白花斑。v a ? 基因被定位在拟南芥第5 号染色体上，由5 个全长为2 4 k b 的外显子组成。它编码了一个分子量为7 5 2 千道尔顿的蛋白质，与一个f t s h ( a t p 依赖的金属蛋白质酶) 有高度的同源性。 ( s a k a m o t o e ta l ，2 0 0 2 ) 该蛋白含有2 个跨膜区和一个锌结合区。 v a r l 基因的表达与光照条件有十分密切的关系( s a k a m o t o 。e ta l ，2 0 0 3 ) 。 经过实验，人们发现野生型拟南芥的植株在不同的光照强度下经过1 2 小时的照 射，它们的v a r lm r n a 含量是不同的。v a r lm r n a 的含量会随着光照强度的 增加而增加。当光照强度从l o 升到1 5 0 9 m o l ，m 2 s ，v a f 7 的转录水平大约有3 倍 的增幅。与此相对，当光照强度到达3 5 0 9 r a o l m s 时，反而产生抑制效应，这 可能与拟南芥是喜阴植物有关。与光依赖表达模式相一致，人们发现拟南芥在黑 暗环境中v a r 7 的转录水平就明显减少。 由于v a r l 与v a r 2 有较高的同源性，导致在功能及作用机制方面也有许多 相似之处，因此，有关v a r l 的作用机制，可参看下面v a r 2 的作用机制。 三、v a r 2 基因 翰船基因被定位在拟南芥第2 号染色体上。近期的研究表明，v a r 2 是细胞 浙江大学硕士学位论文 核编码给叶绿体的一个f i s h ( a t p 依赖的金属蛋白酶) 。( c h e n e ta l ，2 0 0 0 ) 其 功能可能是负责降解光氧化了的d 1 蛋白，从而影响类囊体的生物合成和光合作 用的正常开展。人们发现v a r 2 仅在植物的绿色部分有表达，而且它的表达受到 光照的调控，这就暗示了v a r 2 在黄花质体到叶绿体的转变过程中起到了作用。 ( s a k a m o t o e ta l ，2 0 0 3 ) 关于v a r 2 基因，目前至少有l o 种突变体，分别命名 为v a r 2 1 到v a r 2 1 0 。它们突变在同一基因的不同位置，表现出不同的花斑程度， 是深入研究核基因功能的重要材料。 四、其它花斑基因 拟南芥c h m l j 和c h m t 2 ( c h l o r o p l a s tm u t a t o r ) 突变体最早是在1 9 7 3 年发 现的。后来又发现了它的第三种和第四种突变体。c h m 基因突变产生花斑的机 理在于核基因突变导致线粒体基因组缺失再导致叶绿体功能不正常并产生白化 表型( m a t i n e z z a p a t e r , e ta l ，1 9 9 2 ) 。研究表明，c h m 是细胞核编码给线粒体的 d n a 稳定蛋白，与酵母的m s h l p 有同源性。另有研究表明，玉米n c s ( n o n c h r o m o s o m a l s t r i p e ) 突变体的花斑原理同于拟南芥c h m 突变体的花斑原理。 拟南芥c u e l ( c a bu n d e r e x p r e s s i o n 突变体的叶肉组织呈亮黄色，叶脉呈绿 色。c u e l 是细胞核编码给叶绿体的磷酸烯醇式丙酮酸转运体，它的缺失可以引 起叶绿体内抗氧化剂合成的不足，从而促进了叶绿体的降解。( l o p e z 1 u e z e ta l ， 1 9 9 8 1k n a p p e e ta l ，2 0 0 3 ；v o l l ，e ta l ，2 0 0 3 ) 拟南芥p a c ( p a l ec r e s s ) 突变体叶绿体含量严重减少，但细胞核还在表达一 些叶绿体基因，p a c 可能作用于叶绿体m r n a 的稳定性，从而影响叶绿体的生 物发生。( g r e v e l s i n g e ta l ，1 9 9 6 ；m e u r e r e ta l ，1 9 9 8 ) a t d 2 ( g i u t a m i n e5 印 o s p h r i b o s y l p y r o p h o s p h a t ea m i d o t r a n s f e r a s e 2 螂c i e n t ) 是一种t - d n a 插入突变引起的花斑。a t d 2 编码谷氨酰胺5 一磷酸核糖焦磷酸转酰 胺酶。由于它是嘌呤生物合成的第一个酶，它的突变导致叶绿体生物发生的异常。 ( s a k a m o t o ，2 0 0 3 ) 浙江大学硕士学位论文 五结语 作为模式植物，拟南芥菜的叶片花斑研究是所有植物中最深入的。上述花斑 基因都是近段时间人们已经克隆的基因。正在克隆的突变体还有r e ( r e t i c u l a t a 网格状叶片) 和d o v ( d i f f e r e n t i a ld e v e l o p m e n to f v a s c u l a ra s s o c i a t e dc e l l s ，维管相 关细胞的差别发育) 。利用模式植物的花斑突变体，可以有利于我们研究植物细 胞中质体和细胞核之间的信息交流和协调机制。 浙江大学硕士学位论文 第二部分实验研究 第一章报告株系法制作拟南芥核质失调突变体 及其初步分析 前言： 在植物质体与细胞核之间存在着协调关系，核基因产物可以调控质体基因 的转录和翻译，近来的实验显示，质体的代谢及发育状态也能影响核基因的表 达，这些核基因通常编码质体蛋白。( g r a y e ta l ，2 0 0 3 ) 质体的代谢及发育状 态以一些质体因子( 质体信号) 的形式让细胞核感受到，这些质体中发出的信 号，是些生化物质，通过在细胞质中，这些生化物质浓度的变化，来将信号 传递给核，调节核基因的表达，( j a r v i s ，2 0 0 1 ) 最近的一些研究认为，质体中 进行的四吡咯代谢的中间产物镁一原卟啉( m g - p r o t o p o r p h y r i n ，m p ) 是一 类质体信号。( s t r a n d e ta l ，2 0 0 3 ) 正是因为质体在代谢状况与发育状态发生改 变时，能发出信号，所以使得核基因的表达能与质体发育同步，因此，这信 号转导途径十分重要。 模式生物拟南芥信号转导突变体已经得到，这些突变体被称作“g u n ”， g e n o m e u n c o u p l e d ( 基因组解偶联) 。( s u s e k e ta l ，1 9 9 3 ) 在拟南芥中，通过对 含有c a b 启动子和g u s 基因的融合子的转基因株系进行突变，然后筛选出在 诺氟拉呈( n o r f l u r a z o n ，n f ) 处理下也能产生g u s 蛋白，即也能表达c a b 基 因的植株。目前，拟南芥中已经有5 种g u n 座位被报道过( r o d e l m e l ，2 0 0 1 ) ， 分别为g u n l 、g u n 2 ( h y l ) 、g u n 3 ( h y 2 ) 、g u n 4 和g u n 5 ，除了g u n l 其 余均已完成基因克隆，g u n 2 ，g u n 3 和g u n 5 均为核编码的质体四吡咯代谢所 需的酶，g u n 4 为代谢所需的调控蛋白。 在本章中，我们采用含有绿色荧光蛋白( g f p ) 的报告株系经n f 和林可 霉素( 1 i n c o m y c i n ，l n ) 处理的方法，来筛选核质失调( g u n ) 突变体，以希望 发现毅的g u n 位点；并且利用杂交的方法制作g u n 双突变体，来观察g u n 基 因间是否有相互作用：此外，还用药物学方法就质体氧化还原状态对核质协调 性的影响以及质体向细胞核信号转导中质体因子m p 的下游信号组分这些问题 开展了一些研究。 新江大学硕士学位论文 第一节用g f p 报告基因制作g u n 突变体 1 引言 在本节中，我们制作了含有r b c s ；：6 移融合子的报告株系，然后分别用诺 氟拉呈( n f ) 和林可霉素( i n ) 处理，通过检测绿色荧光的方法，筛选出仍 旧表达核基因r b c s 的植株，制作g u n 突变体，以希望发现新的g u n 位点。r b c s 是一个核基因，编码质体中与光合功能有关的r u b p 羧化酶( r u b i s c o ) 的小亚 基s s ，其大亚基l s 则由质体基因自身编码。( m a y f i e l d e ta l ，1 9 8 7 ) n f 是一 种除草剂，会导致质体光氧化，产生光漂白效应，严重影响叶绿素合成；l n 是 一种质体翻译抑制剂。这两种药品的处理，都会使得叶绿体的发育受阻。 2 材料与方法 2 1 农杆菌介导法将r b c s ：6 f p 转入拟南芥获得报告株系3 r 1 2 材料： 质粒p c a m b i a l 3 0 2 ；大肠杆菌d h 5 0 株系；农杆菌g v 3 1 0 1 株系；拟 南芥w s 品系； 2 1