（细胞生物学专业论文）海带中岩藻黄质、岩藻甾醇、甘露醇和褐藻糖胶的综合提取纯化工艺研究.pdf

中文摘要 海带中含有多种有效成分。目前，除了利用海带提取褐藻酸钠、碘及少量的 甘露醇外，很少涉及褐藻糖胶、岩藻甾醇和岩藻黄质的利用，褐藻糖胶、岩藻甾 醇和岩藻黄质往往作为废弃物被丢弃掉，所以开展对海带资源的深度j j n - r _ 和综合 利用，可以带来很大的经济效益。 为了提高我国海带资源的利用率，提高海带的附加值，发展我国的海带加工 业，我们对海带的综合利用进行了研究，开发了海带联产褐藻糖胶、岩藻甾醇和 岩藻黄质的生产工艺。 第一步，先用混合溶剂从海带中提取岩藻黄质和岩藻甾醇( 以岩藻黄质的提 取效果为考察指标) ，通过正交试验对提取工艺进行优化，结果显示：影响岩藻 黄质提取率的因素主次顺序为：溶剂配比 料液比 温度 提取时间，其中提取时 间、料液比和温度对提取率影响不明显。提取岩藻黄质最佳工艺为：在4 0 下 用4 0 倍体积的4 ：1 ：1 的无水乙醇、丙酮和石油醚混合溶剂提取两次，每次l h 。 提取的浸膏皂化后，用硅胶柱层析将岩藻黄质和岩藻甾醇分离纯化，最终得到了 岩藻黄质和岩藻甾醇的高纯度产品。 第二步，从提取岩藻甾醇和岩藻黄质后所得的海带渣中提取甘露醇，用单因 素和正交实验优化了提取条件，结合操作可行性，最终确定在海带粉中加入海带 重1 0 倍的8 5 乙醇，9 0 浸提1 h 提取两次，效果较好。提取两次的总提取率可 达9 一1 0 ，用重结晶法对提取的甘露醇进行了纯化，纯化后的纯度是9 7 3 。 第三步，从提取甘露醇后所得的海带废渣中提取褐藻糖胶，用单因素和正交 实验优化了提取条件。结合操作可行性，最终确定在4 0 目的海带粉中加入海带重 1 0 倍的提取溶剂，6 0 。c 浸提1 5 h ，效果较好。在最优条件下做重复试验，每l o o g 海带粗提后可得褐藻糖胶粗品5 2 9 9 ，其中褐藻糖胶纯度为2 6 ；纯化后可得褐藻 糖胶粗品3 2 9 9 ，其中褐藻糖胶纯度为3 4 。褐藻糖胶去蛋白方法以酶解法效果较 好；褐藻糖胶脱色方法综合考虑，采用a 1 2 0 3 较好。 按上述工艺路线进行实验，每l o o g 海带可提取褐藻糖胶3 2 9 9 ( 纯度为3 4 ) 、 甘露醇9 一l o g ( 纯度9 5 以上) 、岩藻黄质0 0 6 9 ( 纯度为9 1 6 ) 、岩藻甾醇0 2 6 甙纯度 为9 2 1 ) 。 关键词：海带；提取；纯化；褐藻糖胶；甘露醇；岩藻黄质；岩藻甾醇 a b s t r a c t l a m i n a r i aj a p o n i c ai sf u l lo fv a l i dc o m p o s i t i o n s a tt h em o m e n t ，m o s to f s c h o l a r sf o c u so ns o m ev a l i dc o m p o n e n t si nt h el a m m a h a j a p o n i c a ，a n df e wo f s c h o l a r sr e s e a r c ho nt h ec o m p r e h e n s i v eu t i l i z a t i o no fl a m m a h aj a p o n i c a o nt h e i n d u s t r y ， f u c o i d a n 、f u c o x a n t h i na n df u c o s t e r o la l es e l d o mu t i l i z e d e x c e p t f o rs o d i u ma l g i n a t e 、i o d i n ea n dm a n n i t o ，a n da r er e g a r d e da si n d u s t r i a lw a s t e i no r d e rt or a i s eu t i l i z a t i o nr a t i oo f l a m i n a r i a j a p o n i c ar e s o u r c e s ，i n c r e a s ev a l u e o fl a m i n a r i aj a p o n i c aa n dd e v e l o pp r o c e s s e st r a d ei no u rc o u n t r y ，w eh a v e r e s e a r c h e di nt h ec o m p r e h e n s i v eu t i l i z a t i o no ft h el a m i n a r i aj a p o n i c a ，a n dd e s i g n e d t h ec r a f tw h i c he x t r a c tf u c o i d a n 、f u c o x a n t h i n 、f u c o s t e r 0 1a n dm a n n i t of r o m l a m i n a r i a j a p o n i c a e x t r a c t i o no ff u c o x a n t h i na n df u c o s t e r o lf r o ml a m i n a r i aj a p o n i c aw a s s t u d i e d e x t r a c t i n g c o n d i t i o n so ff u c o x a n t h i nw e r e o p t i m i z e db yo r t h o g o n a l a n a l y s i s a m o n gt h ef o u re x t r a c t i o nf a c t o r sc o n c e r n e d ，i n c l u d i n ge x t r a c t i o nt i m e ， t e m p e r a t u r e ，r a t i oo fs a m p l ew e i g h tt os o l v e n tv o l u m e ，a n dr a t i oo fs o l v e n tv o l u m e r a t i oo fs o l v e n tv o l u m ew a st h em o s ts i g n i f i c a n tf a c t o rt h a ta f f e c t e dt h ee x t r a c t i n g r a t e t h eo p t i m i z e de x t r a c t i n gc o n d i t i o no ff u c o x a n t h i nw a st oe x t r a c tt w ot i m e sa t 4 0 。cf o r1h ，a n da4 0s a m p l es o l v e n t w e i g h tv o l u m er a t i o ，w i t ht h es o l v e n tw h i c hi s c o n s i s to f a l c o h o l ，a c e t o n ea n d p e t r o l e u m e t h e r ，t h es o l v e nv o l u m er a t i oi s4 ：1 ：1 e x t r a c t i o no fm a n n i t of r o mu t i l i z e dl a m i n a r i aj a p o n i c aw i t ha l c o h o lw a s s t u d i e d i no r d e rt og a i no p t i m i z a t i o ne x t r a c tc o n d i t i o n ，w eh a v eo p t i m i z e dc o n d i t i o n b yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t w ep u r e f i e dm a n n i t ot h r o u g hh e a v yc r y s t a l l i z e p r o d u c t i v e r a t eo fc r u d em n a n i t oi s9 t o10 t h r o u g he x t r a c t i o nt w ot i m e s ，b e h i n dp u r e l yt h e p u r e n e s si s9 7 3 0 f u c o i d a nw a se x t a r c t e df r o mu t i l i z e dl a m i n a r i a j a p o n i c ab yh y d r o c h l o r i ca c i d w h i c hi sm i x e dw i t hc a c l 2 i no r d e rt og a i no p t i m i z a t i o ne x t r a c tc o n d i t i o n ，w eh a v e o p t i m i z e dc o n d i t i o nb yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，p r o d u c tr a t eo ff u c o i d a nw a s 5 2 9 9 ( p u r e n e s s2 6 ) f r o m10 0 9l a m i n a r i aj a p o n i c a p r o d u c tr a t eo ff u c o i d a nw a s 3 2 9 9 ( p u r e n e s s3 4 ) b e h i n dp u r e f y s e v e r a ld e p r o t e i na n d d e c o l o r i n gm e t h o d so f t h ef u o c i d a nw e r ea l s oc o m p a r e dt o d e t e r m i n et h em o s te f f e c t i v ee x t r a c t i o np r o c e d u r eo ff u o c i d a n i nd e p r o t e i nm e t h o d s ， e f f e c to fe n z y m ei sp r e t t yg o o d i nd e d e c o l o r i n gm e t h o d s ，r e s u l to f a 1 2 0 3i sp r e t t y g o o d k e yw o d r s ：l a m i n a r i aj a p o n i c a ；e x t r a c t i o n ；p u r e f y ；f u c o i d a n ；m a n n i t o ；f u c o x a n t h i n ； f u c o s t e r o l 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。 本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研 究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它 相关数据库。 霎差蓑妻篙篓裹霎于墅指导教师签名：勉学位论文作者签名：仨! 塾指导教师签名：z 皇! 翌 2 f 年莎月9e l加g 年月口e t 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：一坷象 o 年6 只彳e t 第一章文献综述 1 1 课题研究的意义 海带别名昆布、纶布，作为食品和中药原料，不仅含有丰富的蛋白质、维生 素和矿物质，还含有如褐藻酸、甘露醇、褐藻糖胶、海带氨酸、高不饱和脂舫酸、 岩藻黄质、有机碘、细胞激动素、多卤多菇类化合物、甾醇类化合物、褐藻淀粉、 膳食纤维等具有独特生理活性的成分。 我国是最大的海带化工产品出口国之一，但我国的海带工业面临着严重的困 难，己严重制约了海带养殖业的发展。造成这种现象的主要原因是：目前海带除 少部分鲜销和开发成各种食品外，大部分作为海带化工的主要原料，用于传统工 艺生产褐藻酸、碘和甘露醇【l 】，而很少涉及到褐藻糖胶、海带氨酸、岩藻甾醇和 岩藻黄质的利用，这导致提取了褐藻酸、碘和甘露醇后剩余的残渣中的褐藻糖胶、 岩藻甾醇、岩藻黄质等物质被丢弃掉，既污染了环境，又浪费了资源。 如果我们开展对海带资源的深度加工和综合利用，便可降低海带天然产物提 取工艺的成本，减少海带加工废弃物的污染，提高海带的附加值，最终促进我国 海带养殖业和加工业的发展。 1 2 课题研究的任务和思路 我们对以褐藻糖胶生产工艺为中心的海带综合利用工艺进行研究：通过分析 海带中各种成分的组成、性质、存在形式和一系列探索性的实验，尝试设计出联 产褐藻糖胶、岩藻黄质、甘露醇和岩藻甾醇的海带天然产物联产工艺。 我们的研究思路如下： 海带中含有大量的弱极性物质如蛋白质、色素、甘露醇等，它们的存在会影 响到褐藻糖胶的产率和纯度，因此首先要对海带进行预处理：将海带粉末用有机 溶剂浸提，溶出海带中的岩藻黄质、岩藻甾醇和一些蛋白质及甘露醇，然后晾干 备用；用高浓度乙醇提取出海带中剩余的甘露醇，海带粉术晾干备用；褐藻糖胶 易溶于水，因此我们选择加热水提，考虑到海带中的褐藻酸在酸性条件下不易溶 出，因此我们尝试用稀盐酸提取；褐藻酸在低浓度乙醇( 2 0 3 0 ) 中发生沉淀， 而褐藻淀粉可溶于较高浓度乙醇( 8 0 以上) ，因此我们用乙醇进行分步沉淀以除 去部分杂质。 我们设计的提取工艺路线如下： 海带_ 清洗_ 干燥_ 粉碎一过筛一有机溶剂浸提_ 海带粉末烘干备用一高 浓度乙醇浸提_ 海带粉末烘干备用_ 酸性溶剂浸提_ 离心_ 取上清液调节p h 至 中性一3 0 乙醇沉淀- 7 0 乙醇沉淀_ 乙醚、丙酮洗涤一干燥_ 褐藻糖胶粗品。 1 3 研究概况 1 3 i 海带概述 海带( l a m i n a r i a p o n i c aa r e s c h ) 又名昆布、纶布，是海藻门褐子纲海带目海 带科海带属的一种大型藻类。其叶片似宽带，一般长2 4 米，宽2 0 - - 3 0 厘米( 在 海底生长的海带较小，长1 - - - 2 米，宽1 5 - - 2 0 厘米) ，海带通体呈橄榄褐色，干燥 后变为深褐色、黑褐色，上附白色粉状物( 即甘露醇) 。海带起源于太平洋北部沿 海水域，原产白令海峡和日本北海道一带，由于在海中生长，形状如带，故名海 带。半个世纪以来，栽培区逐步向南扩展。上世纪四五十年代，扩展到山东烟台、 青岛沿岸，1 9 5 7 年扩大到浙江、福建沿海。目前，我国海带的产量和养殖量居 亚洲之最【3 】。 1 3 1 1 海带中主要含有的化学成分 1 糖类 海带的诸多保健功能很大程度上与海带中的生理活性多糖有关。海带多糖是 存在于海带细胞间和细胞内的一类天然生物大分子物质。目前，从海带中已发现 的海带多糖主要是褐藻糖胶( f u c o i d a n ) 、褐藻酸( a 垮n ) 和褐藻淀粉( 1 a m i n a r a n ) 4 1 ， 此外还有海带纤维、甘露醇半乳聚糖等。褐藻酸和褐藻糖胶是细胞壁的填充物质， 海带淀粉则存在于细胞质中。 2 褐藻酸是褐藻酸、褐藻酸盐类以及褐藻酸有机衍生物的统称。但市场上多以 其钠盐出售，故褐藻酸通常是指褐藻酸钠( 也叫海藻酸钠) 。它们是多糖高分子碳 水化合物，是一种呈颗粒或粉末状的乳白色或淡黄色固休。褐藻酸是由。一1 ，4 l 一 古罗糖醛酸和b 一1 ，4 一d 一甘露糖醛酸为单体构成的嵌段共聚物。海带干品中褐藻 酸的含量高达2 4 。 褐藻淀粉又称昆布糖，分为水溶性和水不溶性两种，由葡萄糖组成的葡聚糖， 主要由p d ( 1 ，3 ) 糖苷键连接而成。这种聚合物主要存在于海带属的叶部。 如北极海带，掌状海带和糖海带，褐藻的柄部基本不含褐藻淀粉。海带淀粉至今 尚未进行工业规模生产，所有的分离方法都是实验室规模的。海带干品中褐藻淀 粉的含量约为1 左右。 海带中还含有少量的粗纤维，结构上也是以纤维二糖为分子的重复单位。 2 氨基酸 海带氨酸( 1 m i n i n e ) 、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、组氨酸和半胱 氨酸等。 3 微量元素和维生素【5 】 海带( 以每百克干品计) 含碘0 3 4g 、钾4 3 6 9 、钙2 2 5 9 、铁o 1 5 9 、磷2 2 m g 、 钠、钾、镁和铝等元素。还含有胡萝卜素0 5 7 m g 、维生素b 1 0 6 9 m g 、维生素 b e 0 3 6 m g 、烟酸1 6 m g 、维生素c 等。 4 其他 海带中含有脂肪酸类( 棕榈酸、油酸、亚油酸、十八碳四烯酸) 和色素类、 粗蛋白、甘露醇、牛磺酸等物质。 海带各成分含量参见表1 1 。 表1 1 海带成分表( 以每百克干品计) 名称含量 水分( 克) 脂肪( 克) 蛋白质( 克) 碳水化合物( 克) 甘露醇( 克) 碘( 克) 热量( 千卡) 钾( 克) 钠( 毫克) 镁( 毫克) 铜( 毫克) 锰( 毫克) 锌( 毫克) 硒( 微克) 磷( 毫克) 钙( 克) 铁( 克) 维生素a ( 毫克) 维生素c 维生素b l ( 毫克) 维生素b ：( 毫克) 胡萝b 素( 毫克) 烟酸( 毫克) 核黄素( 毫克) 4 8 4 ； 6 7 6 4 ； 5 5 9 6 7 6 勰 j 2 7 7 烈 舶 石 5 肿 m m m 筋 胚 鹏 瓢 邡 石 舶 l 0 8 5 o 2 4 8 2 - o o 9 2 2 0 - n 0 o l n 1 3 1 2 海带的药理作用 海带( 1 a m i n a r i a j a p o n i c aa r e s c h ) ，中药名称为“昆布”，具有软坚散结、利水泄 热等功效【6 1 ，始载于汉末的名医别录。嘉佑本草记载海带能“去瘿行水，下 气化痰”。随着现代科学技术的发展，人们逐渐发现海带在医疗保健方面，有更 多的功用，如调节血脂、降血糖、降血压、抗凝血、抗肿瘤、抗突变和防辐射、 抗病毒、增强免疫功能等。 海带的药理作用取决于海带所含的天然活性物质：褐藻糖胶( 又名褐藻多糖 硫酸酯、岩藻聚糖硫酸酯) 具有抗凝血、抗肿瘤、抗氧化、调节血脂、抗病毒、 抗辐射和抑制补体激活、解重金属中毒和抗h 的作用；海藻酸( 又名褐藻酸 钠、海藻胶) ，能选择性滤除锶、镉等重金属，降低肿瘤的危险性；海带氨酸， 是一种特殊氨基酸，它具有降低血压的功效，可预防高血压和脑溢血；甘露醇， 可降低颅内压和眼内压、消除脑水肿、治疗乙型大脑炎和青光眼，对防治肾功能 衰竭有特殊疗效，也可用作糖尿病人代用糖等；岩藻甾醇，可保持生物内环境稳 定、控制糖原和矿物质的代谢、调节应激反应、防治癌症、明显降低血中胆固醇， 也可作为甾体药物( 如雄性激素、雌性激素、肾上腺皮质激素等) 的重要原料；岩 藻黄质有良好的抗氧化作用，还可以消除脂肪堆积，是很好的减肥药物；海带提 取的脂肪酸对强心作用有贡献、也可能具有抗菌活性【7 】，多不饱和脂肪酸 ( p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ，p u f a ) 具有独特的生物活性，p u f a 的缺乏会导致某 些疾病1 8 ，海带制取的p u f a ，具有无鱼腥味、脂肪酸组成简单、易分离纯化及 价格偏低的优点；牛磺酸对维持人和动物正常生理机能具有重要作用，可清热消 炎、抗癫痫、解除疲劳、治疗心血管疾病、促进脑发育【9 】。 1 3 1 3 我国海带开发现状 目前，我国已经形成了以褐藻酸、甘露醇、碘为主要产品的海带工业产品体 系。但是，按干物质计，海带的工业利用率仅为3 0 ，还有约2 3 的可以带来很 大经济效益的海带成分，如：褐藻糖胶、岩藻黄质等尚未得到利用，被作为废弃 物排放掉了，浪费了大量的自然资源。所以，对海带进行合理的综合利用既可提 高海带资源的利用率，又可以明显降低废物排放量。 1 3 2 褐藻糖胶 1 3 2 1 褐藻糖胶的化学组成 褐藻糖胶是指含有相当数量的岩藻糖和硫酸基多糖，或含有s u l f a t e d 0 t l f u c o s e 的多糖。1 9 1 3 年k y l i n 首次提取出这种多糖并其命名为f u c o i d i n ，现 根据国际命名原则统一称为f u c o i d a n ( 褐藻糖胶或褐藻聚糖) ，也有人称其为f u c a n 和f u c o s a n 1 0 1 。 k y l i n 在1 9 1 3 年首先报道褐藻多糖硫酸酯中含有【广岩藻糖。此后，h o a g l a n d 和l i e b 在1 9 1 5 年发现其中含有与钙结合的硫酸酯，n e l s o n 等在1 9 3 1 年报道从 巨藻中得到的褐藻多糖硫酸酯由几乎等量的岩藻糖和硫酸酯组成，同年b i r d 和 h a s s 发现从海带属中得到的类似物质还含有糖醛酸。l u n d e 等采用更纯的掌状海 带褐藻多糖硫酸酯发现硫酸基一面与岩藻糖或其它糖结合，另一面与金属离子结 合。在日本，m i w a 在1 9 4 0 年从去除褐藻淀粉的e i s e n i ab l c y o l i s 褐藻多糖硫酸酯 的水溶液中鉴定出d 葡萄糖，p e r c i v a l 等在1 9 5 0 年从h i m a n t h a l i al o r e a ( l i n n a e u s ) l y n g b y e 中分离的褐藻多糖硫酸酯含有半乳糖、木糖、岩藻糖和糖 醛酸。l a r s e n 等在1 9 7 0 年从泡叶藻分离到的产物中含有d 甘露糖和d 一葡萄糖醛 酸、l 古罗糖醛酸、d 甘露糖醛酸。n i s h i n o t l l 】等在1 9 9 4 年对美国s i g m a 公司从 墨角藻中生产的商品褐藻多糖硫酸酯的分析结果表明，其中含有大约o 4 的氨 基葡萄糖。n i s h i d e 等【1 2 i 对2 1 种日本产褐藻的褐藻糖胶的单糖及糖醛酸组分进行 了研究，发现其单糖组分以l 岩藻糖为主，均含有木糖、甘露糖、半乳糖、葡 萄糖和鼠李糖，少数含有阿拉伯糖，其糖醛酸以葡萄糖醛酸或甘露糖醛酸为主， 有的含有半乳糖醛酸。 上述结果表明褐藻糖胶是一种化学组分和结构十分复杂的大分子多糖化合 物，以l 岩藻糖和硫酸基团为主，并且发现随着藻的种类、生长季节和藻体部 位不同以及提取分级手段不同，褐藻糖胶的化学组分还有较大的差异。 有人曾主张，褐藻多糖硫酸酯( f u c o i d a n ) 只指含岩藻糖和硫酸根的多糖， 6 但由于纯粹由岩藻糖和硫酸根组成的褐藻多糖很少，因此这儿所指的褐藻多糖硫 酸酯包含了除岩藻糖和硫酸根外还还含有其它组分的多糖。 1 3 2 2 褐藻糖胶在海带中的分布及含量 褐藻糖胶存在于所有褐藻中的细胞间多糖，藻问组织或粘液基质中，能从叶 片表面分泌出来。海带中褐藻糖胶的含量一般在0 3 1 5 t 1 3 】。褐藻糖胶的含量 与植物部位有密切关系，纪明侯、徐祖洪【1 4 】等对中国人工养殖的海带叶片中褐 藻多糖硫酸酯的分布研究表明：海带叶片中的含量比茎部多，叶片含量自基部向 尖部逐渐升高，叶片边缘比中间部位多。褐藻糖胶的含量也随褐藻种属和产地的 变化而变化，产地为大连、福建、青岛的海带的得率分别为5 5 、2 8 和2 6 ， 岩藻糖含量分别为2 4 o 、2 9 3 和2 8 8 【15 1 。此外，海藻的生长时间与季节对 含量也有影响，7 1 2 月份较高，3 ，4 月份较低【1 6 , 1 7 j 。2 0 0 3 年，t a t i a n i a 1 8 】等作了这 方面的研究也得到了一致的结果。褐藻糖胶的分子量同样变化较大，具有种属差 异性，不但受海藻生长时间、地点和提取方法的影响，而且不同的测定方法得到 的结果也不同【19 1 。 1 3 2 3 褐藻糖胶的结构 褐藻糖胶主要是以c 1 ，2 键合的。一l 一岩藻糖4 一硫酸酯聚合物( 少数则以c 1 ，3 和c 1 ，4 键合) ，常伴有少量半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖和蛋白质，是一 种高度不均一的多糖。 1 9 5 0 年，c o n c h i e 和p e r c i v a l 等提出了褐藻糖胶的结构式( 图1 1 中的a 、b ) ， 但近年来p a t a n k a r t 2 0 1 等根据对s i g m a 公司生产的商品褐藻糖胶( 岩藻多糖) 的甲 基化与g c m s 分析结果，提出了修正的平均结构模型( 图1 1 中的c ) 。结构c 与结构a 、b 的不同之处在于多糖核心区主要由a 2 ( 1 _ 3 ) 连接的l 2 岩藻糖组成， 部分岩藻糖残基的c 4 位被硫酸根取代。在分子链内，每2 - 一3 个岩藻糖残基就有 一个由岩藻糖形成的支链点。 7 图1 1 褐藻糖胶的结构式( 图中f u c 表示岩藻糖) f i 9 1 1t h e s t r u c t u r a lf o r m u l ao ff u c o i d a n s o i i 5 - 一2 f u ca l - - 2 f u ca 1 - 2f u c 口卜4f u ca l - - , 2f u c 卅一 三。i三。i三。； l 。f 曼。i3 0 io ； ! o f i a l s o ； - - - 4 f u ca l 1 2f u ca 1 - - - 2 f u cn 1 2f u ca 1 - , 3 f u c a l - - - 童。i量。?兰。f量阱 3f u cq 1 - - - 3 f u c 4 f s o ； 1 3 2 4 褐藻糖胶的生物活性研究进展 - 3 f u c n 3 日本、美国、挪威等国家从我国传统中药昆布受到启发，特别是从我国沿海 居民食用海藻后能软化血管、抗肿瘤，增强人体免疫功能等方面受到启示，从褐 藻中提取分离得到了褐藻糖胶，并且证明了这种多糖具有抗肿瘤、抗凝血、降血 脂、解重金属中毒和抗h i v 的作用。目前，对褐藻糖胶的研究已经成为研究天 然海洋药物的热点和主攻方向，我国科学家主要从褐藻糖胶的免疫调节作用、抗 凝血和降血糖作用等方面对其进行了研究。 ( 1 ) 免疫调节作用 1 9 9 4 年，王文涛等 2 1 1 报道，褐藻糖胶( 5 l o m g k 9 1 ) 能恢复由环磷酰胺引 起的免疫低下小鼠的免疫功能，它是一种对巨噬细胞和t 细胞有直接作用的免 一 叫 耐 c ： )； 也 ， 眦4 ， r 川口 疫调节剂。1 9 9 5 年，杨晓林等2 2 1 研究了从渤海湾海带中提取的褐藻糖胶对小鼠 免疫功能的影响，结果，褐藻糖胶在体外可诱导白细胞介素一l ( i l 1 ) 和干扰素 丫( 礤n 吖) 产生，体内给药可增强t 细胞、b 细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞 ( n k 细胞) 功能，促进对绵羊红细胞( s r b c ) 的初次抗体应答。 ( 2 ) 抗病毒 2 0 0 3 年，p o n c e 等2 3 1 研究了褐藻中褐藻糖胶的抗病毒活性和结构之间的关 系。在室温下提取制备的褐藻糖胶( g a l a c t o f u c a n ) 对疱疹单纯病毒( h e r p e ss i m p l e x v i r u s ) 1 和2 有很强的抑制作用，在7 0 下提取制备的褐藻糖胶( u r o n o f u c o i d a n ) 则没有抗病毒活性。g a l a c t o f u c a n 主要由f u c 、g a l 和s u l f a t e 构成，而 u r o n o f u c o i d a n 主要由f u c 和糖醛酸构成，s u l f a t e 含量低，由此推测，s u l f a t e 可 能是抗病毒活性所必需的。 1 9 9 5 年，李凡等报道，从渤海湾海带中提取的褐藻糖胶具有抗r n a 和 d n a 病毒的作用。实验表明，它对脊髓灰质炎病毒i i i 型、腺病毒i i i 型、埃可 型病毒均有明显的抑制作用，表现为能显著抑制细胞病变的发生，使组织培养细 胞得到保护。 ( 3 ) 抗凝血作用 自1 9 5 7 年，s p r i n g e rg f 等2 5 1 首次报道从岩藻中提取的岩藻聚糖具有抗凝血 作用以来，大量的报道己经证实很多褐藻中的岩藻聚糖硫酸醋具有显著的抗凝血 和抗血栓活性。 褐藻糖胶的抗凝血活性作用与岩藻聚糖中硫酸盐浓度及分子质量有关，分子 质量越高，硫酸盐浓度越高，抗凝血活性越甜2 6 1 。 褐藻糖胶的抗凝血活性作用还随褐藻糖胶浓度的增加而增强，但由于多糖 的相对分子质量大而不易被吸收，所以抗凝效果不及肝素，只适用于血粘度较高 的病人，仅可作为预防血栓形成的药物或保健品。 褐藻糖胶的抗凝血效果还跟摄取方式有关，静脉注射的效果明显高于腹腔 注射。 ( 4 ) 降血糖作用 海带多糖町降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的血糖，且发现随多糖纯度提高 其降糖作用增强。给经四氧嘧啶诱导生成的糖尿病小鼠注射l o m g k g 。1 及 9 5 0 m g k g - 1 褐藻糖胶后，其血糖水平分别为注射前的8 0 4 、6 0 6 ，患病小鼠饮水 量分别比阳性对照低约3 6 2 、5 0 6 ，表明褐藻糖胶对缓解糖尿病小鼠症状，减少 饮水量具有一定作用，糖耐量明显改掣2 7 1 。 ( 5 ) 调血脂 李德远等【2 8 2 9 1 报道，口服海带褐藻糖胶能有效地降低小鼠的高胆固醇血清 t c 水平，最佳剂量为1 5 0m g k g ，而对正常小鼠血清t c 无明显影响。 1 9 9 4 年，王素贞等【3 0 1 观察了褐藻糖胶治疗1 5 例高脂血症患者的疗效，结果 显示，褐藻糖胶能明显降低血清胆固醇和甘油三酯的含量，且无肝、肾功能损害 等毒副作用。 ( 6 ) 其它作用 褐藻糖胶还有防辐射、抗氧化、抑制肠腔对重金属的吸收、以及阻止哺乳动 物精卵结合的作用。 1 3 2 5 褐藻糖胶的提取纯化方法 ( 1 ) 提取方法 褐藻糖胶是一种水溶性多糖，可用热水或稀酸提取，然后向提取液中加入乙 醇、氢氧化铅、氢氧化铝或季胺盐类阳离子表面活性剂，使褐藻糖胶沉淀出来。 为了减少脂类、色素、甘露醇、蛋白质等的溶出，在提取褐藻糖胶之前可先用高 浓度醇或甲醛溶液处理藻体。 ( a ) 水提法 k e i k o ( 1 9 9 1 ) 将2 6 7 k g 三石昆布( 水分含量7 1 4 w w ) 用5 4 m l 沸水浸提 2 0 m i n - - * 过滤一滤渣再用相同条件提取1 次_ 过滤_ 滤液中加入2 倍乙醇，沉淀用 乙醇和乙醚浸洗后干燥，得褐藻糖胶粗品1 9 1 8 9 。 陈绍瑗( 1 9 9 8 ) 将7 5 9 羊栖菜粉先用3 0 0 m l 9 5 z _ _ , 醇在水浴上加热回流2 4 h ，使 极性较小的成分溶出一过滤_ 滤渣加2 5 0 m l 水回流提取4 h ，冷却至室温，抽滤_ 滤渣按相同方法再提取3 次- 合并提取液，旋转蒸发至粘稠状液体_ 加氯仿、正 丁醇( 5 ：1 ) 1 0 0 m l 与粘稠液体混合振摇，离心除去蛋白质_ 反复处理5 遍_ 加3 倍 9 5 乙醇_ 抽滤_ 沉淀依次用无水乙醇、丙酮和乙醚浸洗一干燥后得褐藻糖胶粗 l o 品6 4 9 。 ( b ) 酸提法 利用褐藻酸在较低p h 下难以溶解的性质，用稀盐酸的水溶液将褐藻糖胶提 取出来。由于大部分的褐藻酸未被溶出，因而提取物中褐藻糖胶的纯度较高。 k i m i k o ( 1 9 6 6 ) 将藻粉用甲醇预处理后_ 取1 0 0 9 预处理物_ 用1 3 1 倍 o 1 7 m o l l h c i ( p h 2 ) 在6 5 - 7 0 。c 提取l 离心_ 沉淀再次提取，重复3 次_ 合并上 清液，用n a o h 中和- 真空蒸发至干后溶于o 5 l 水- 离心除去不溶物一加2 倍体 积乙醇一沉淀用乙醇和乙醚浸洗- 真空干燥_ 得褐藻糖胶粗品1 7 8 9 ，岩藻糖含 量为2 3 7 。 ( c ) 氯化钙法 利用褐藻酸钙不溶于水的性质，用c a c l 2 的水溶液进行提取，可避免褐藻酸的 溶出。 t a i e h i ( 1 9 8 0 ) 将5 0 0 9 藻粉( e i s e n i a b i c y c l i s ) 用2 5 l 8 0 7 , 醇抽提- 过滤，滤渣浸 在4 5 l 3 5 甲醛中过夜一倒出甲醛，空气干燥_ 加入2 c a c l 2 水溶液，室温搅拌 提取4 h 一离心一沉淀再于7 0 。c 提取2 h 一离心一合并两次上清液，减压浓缩_ 透 析- 冷冻干燥，得褐藻糖胶粗品8 9 9 。 ( d ) 超声波提取法 超声波法提取多糖是一种很有希望的多糖提取新方法。将超声波应用予对中 药苷类成分的提取中可以提高苷类的提出率并缩短提取时间。 取适量干海带粉，加入蒸馏水适量，然后用超声波发生器处理一定的时间， 提取液经过滤、浓缩、去蛋白、乙醇沉淀等处理后可得粗品多糖。超声波法提取 海带多糖时，超声时间不易过长。超声处理4 5 m i n 时提取率达到最大，随着处理 时间的延长，可能是由于超声波具有较强的机械剪切作用，长时间的作用会使大 分子的多糖断裂，从而在后处理的过程中的损失增大而影响多糖的提出率。 ( 2 ) 纯化方法 经上述方法提取得到的褐藻糖胶粗品通常还含有部分水溶性褐藻酸、海带 淀粉、蛋白质、色素等杂质，需要进一步纯化。纯化方法主要有以下两种。 ( a ) 乙醇分步沉淀法 利用褐藻酸在低浓度乙醇( 2 0 - - - 3 0 ) 中发生沉淀，而褐藻淀粉可溶于较高 1 1 浓度乙醇( 6 0 ) 的性质，将褐藻糖胶粗品用乙醇进行分步沉淀，从而除去杂质。 ( b ) 季胺盐沉淀法 利用季胺盐如十六烷基氯化吡啶( c p c ) 或十六烷基三甲基溴化铵( c t a b ) n v , 与褐藻糖胶形成沉淀的性质，使褐藻糖胶沉淀出来，而这一沉淀又可溶于高浓度的 c a c l 2 或n a c l 溶液。 t a k a s h i ( 1 9 8 9 ) 曾将热水提取物配成1 水溶液_ 用3 c p c 沉淀 - * 3 0 0 0 r m i n 离心_ 沉淀溶于4 m o l lc a c l 2 ，在3 7 。c 静置2 0 h - - - - 功i3 倍乙醇 - - * 1 0 0 0 0 r m i n 离心一沉淀溶于水_ 透析一冷冻干燥。由季胺盐法纯化制备的褐藻 糖胶纯度较高，但操作步骤较多，褐藻糖胶的回收率较低。而乙醇分步沉淀法较为 简单，但选择性不如前者。 1 3 3 甘露醇 1 3 3 1 甘露醇的理化性质 甘露醇( d m a n n i t 0 1 ) 又名d 一甘露糖醇、已六醇、木蜜醇，是山梨醇的同分 异构体，为六元醇，为白色或无色结晶性粉末，无臭、味甜( 甜度为蔗糖的7 0 ) 。 其天然品广泛存在于植物的叶、茎、根中，如海藻、柿饼表面的白粉即为甘露醇。 尤以海带类含量最高，个别含量高达3 0 ，一般含量在7 左右【3 。 甘露醇分子式为c 6 h 1 4 0 6 ( 结构式如图1 2 ) ，分子量为1 8 2 。7 8 ，熔点为1 6 6 - 1 7 0 。c ，密度为1 4 8 9 ，易溶于水、热甲醇和乙醇，水溶液稳定，溶解度( 2 0 。c ) 1 8 9 l o o g ，随温度上升甘露醇溶解度增大( 表1 2 ) ，微溶于冷甲醇、乙醇，不溶 于乙醚，2 0 水溶液的p h 为5 5 - 6 5 ，不被空气氧化，对稀酸、稀碱稳定，是多 元醇中唯一一种不吸湿性的晶体【3 2 】。 图1 2 甘露醇结构式 f i g 1 2t h es t r u c t u r a lf o r m u l ao fm a n n i t o l hho h o h i |i l i o l l 2 ( 卜一c 一( 一( ”( c 1 1 2 0 h l l ； o ho h hh 1 2 表1 2 甘露醇在水中的溶解度 温度02 03 04 05 06 08 01 0 0 溶解度 l o1 92 53 54 8 6 4 1 1 51 9 7 1 3 3 2 甘露醇的应用 ( 1 ) 药用价值 甘露醇无吸湿性、干燥快、化学稳定性好，且具有爽口、造粒性好的特点， 可作为片剂的赋形剂及固体、液体的稀释剂；甘露醇的衍生物六烟酸甘露醇酯可 用作降低胆甾醇药物，六硝酸甘露醇可用作冠状动脉血管扩张药；甘露醇也是常 用的渗透性利尿剂，经常使用的为2 0 的注射液，可使血液中的渗透压增高， 组织中的水分迅速进入血液，经肾排出体外，可降低颅内压，减轻脑水肿等；甘 露醇对急性肾功能衰竭、肺水肿、乙型脑炎、急性青光眼等也有一定的疗效；特 别近年研究的甘露醇与氨基酸等配置的复合输液及其衍生物可用作抗癌、抗肿瘤 及降血脂、降胆固醇的药物。 ( 2 ) 食品工业中的应用 甘露醇硬脂酸脂可防止食品中的油脂分离，可使饼干松脆，不易受潮，用于 糖果可起定型作用；由于甘露醇在糖及糖醇中的吸水性最小，常用于食品防粘； 甘露醇用于储藏水果及果脯生产，可提升香味；尤其是它被允许制作低热值食品 ( 糖尿病患者食品及健美食品) 及低糖食品的甜味剂。 ( 3 ) 其它方面的应用 甘露醇可用作乳化剂，替代甘油生产牙膏；以甘露醇为原料与环氧丙烷合成 的甘露醇环氧丙烷聚醚，可制作聚氨酯硬质泡沫塑料；甘露醇缩水后与油酸脂合 成甘露醇醉油酸酯是一种性能良好的乳化剂和缓蚀剂，广泛用于农药、化工、纺 织、机械加工。在农业生产中，可用作植物生长调节剂，还可用作苹果贮藏保鲜 剂，以减慢苹果酸氧化，提高维生素c 含量。在饲料工业中，甘露醇作添加剂 可改善其味道和生物效价。 1 3 3 3 甘露醇的生产方法 ( 1 ) 天然物提取法 在海带提取碘及海藻酸钠后的废水中提取甘露醇是我国目前生产甘露醇的 主要方法。该法可得到单一的甘露醇，免去了与山梨醇分离这一工序，但收率低， 精制手续麻烦，生产成本高，原料来源受地区、季节的限制。 ( 2 ) 电化学法 直接电合成法：该法采取的是电解加氢，加氢条件温和，易于操作控制。电 介质n a e s 0 4 重复利用，生产过程中无三废产生，有利于环境保护。但该电合成 过程只在其中一个电极上得到的产物，总电流效率比较低。 成对电合成法：成对电合成法是在直接电合成法的基础上，充分利用电的氧 化过程获得一个产品。该方法同时在阴阳两极得到产物，从理论上讲，电流效率 几乎提高一倍。但该方法要求两电极的电极效率一致，过程不易作控制。 ( 3 ) 以蔗糖为原料的催化氢化法 蔗糖水溶液加酸水解成葡萄糖和果糖，进行催化氢化反应，葡萄糖转化为 山梨醇，果糖转化为大致等量的山梨醇和甘露醇。该法以充足价廉的蔗糖为原料， 工艺可靠，后提取精制容易，设备不复杂，原料利用率高；与海带提取法相比， 成本低，产品质量好，且原料不受地区季节限制。但该方法催化氢化的条件要求 较高，副产大量山梨醇。 ( 4 ) 微生物发酵合成甘露醇 法国火箭兄弟公司的专利报道，利用微生物发酵合成甘露醇。在氧的条件下， 使用微生物，特别是结合酵母发酵主要含有葡萄糖、蔗糖、糖或山梨醇等底物的 培养基，然后回收培养基中积聚的甘露醇。 目前，工业生产甘露醇的方法主要是天然物提取法和蔗糖水解化学加氢法。 我国主要还是采用以海带或海藻制碘后的废碘水为原料生产甘露醇的传统工艺， 近年来也新建了部分蔗糖水解化学加氢生产甘露醇的工业装置。 1 4 1 3 4 海带氨酸 1 3 4 1 海带氨酸的理化性质 海带氨酸即n 6 - 三甲基赖氨酸( 1 a m i n i n e ) ，分子式c 9 h 2 0 n 2 0 2 ，分子量为1 8 8 ， 分子结构式为( c h 3 ) 3 矿一( c h 2 ) c h ( n h 2 ) 一c o o ，它不仅是一种可形成肽键的胆碱样 的a 氨基酸，还是一种季胺衍生物。 1 3 4 2 海带氨酸的药理作用 海带氨酸具有明显的降血压、调节血脂平衡、抑制结核菌、止血、保护消化 道粘膜及防治动脉粥样硬化的作用 3 3 , 3 4 。制成的海带氨酸二草酸盐，在临床上降 压效果能维持4 h 以上。与现畅销的阿斯匹林( a s p i r i n e ) 和洛伐他订( l o v a s t a t i n ) 亚硝酸制剂相比，前者易出现过敏，后者易产生白内障不良反应，而海带氨酸无 不良反应，又可分解产生人体必需的氨基酸，是合成蛋白质的原料，而且还可以 降脂减肥，防止心脑血管病的发生。 1 3 5 岩藻甾醇 1 3 5 1 岩藻甾醇的理化性质 岩藻甾醇( f u c o s t e r 0 1 ) ，又称2 4 亚乙基胆甾一5 一烯3 p 醇，结构式如图1 3 ，是大 量存在于海藻中的一种植物甾醇