（食品科学专业论文）咸味香基中美拉德反应产物的体外抗氧化性研究.pdf

摘要 咸味香基中美拉德反应产物的体外抗氧化性研究 学科、专业：工科、食品科学 硕士研究生签名：于汐洋 指导教师：钱和教授、汪何雅副教授 摘要 入学时间：2 0 0 7 年9 月1 日 答辩时间：年月日 授予学位时间：年月日 咸味香精广泛应用于各类食品中，通过美拉德反应( m a i l l a r dr e a c t i o n ) 制备得到的 香精肉香味逼真，在香精领域中的应用日益广泛。然而，由于美拉德反应反应的复杂性， 目前有关美拉德反应产物( m r p s ) 对健康的影响尚未有定论，争议性较大；特别是对 于咸味香精，目前基本没有关于其功能性或安全性方面的研究。本论文选取了咸味香精 调配前的成味香基为研究对象，通过一系列分离纯化的手段对其中的m r p s 进行了初步 分离，同时通过体外脂质体氧化体系和人淋巴细胞的氧化应激水平综合考察了咸味香基 中m r p s 的抗氧化作用，探讨了其组成特性与其抗氧化效果之间的关系。 体外脂质体氧化体系研究结果显示，咸味香基对a a p h 诱导、f e 3 + v e 诱导的脂质 体以及脂质体自动氧化有抑制能力，其抗氧化能力随反应物浓度的增加而增强；人淋巴 细胞实验结果显示，高浓度的咸味香基能促进人淋巴细胞的增殖，抑制人淋巴细胞脂质 过氧化。 利用膜分离手段从咸味香基中分离得到三种分子量范围的m r p s ，体外脂质体氧化 体系及人淋巴细胞模型体系研究均显示，抗氧化能力随分子量的增加而增强，即：高分 子量m r p s ( h m r p s ) 中分子量m r p s ( m m l 冲s ) 小分子量m r p s ( l m r p s ) 。 利用硅胶柱层析方法对h m r p s 进一步分离，得到h m a 、h m b 、h m c 三类组 分，组分极性由弱到强分别为：h m a h m c 。 测定各m r p s 的可见光吸收强度，结果显示m r p s 的抗氧化能力与其吸光强度具有 相关性。利用热裂解气质联用技术分析高分子量m r p s 以及分离后得到的各类组分的 结构组成，结果表明高分子量m r p s 中含有醇、酸、胺、吡咯、吡嗪、酚类等基团，其 中对抗氧化性贡献较大的基团主要是吡咯、吡嗪、双酚类基团。 关键词：美拉德反应产物；卵磷脂脂质体：人淋巴细胞；抗氧化 a b s t r a c t a b s t r a c t m a i l l a r dr e a c t i o ni sm o r ea n dm o r ew i d e l yu s e di ns a v o r yf l a v o r s b e c a u s eo ft h e c o m p l e x i t yo ft h i sr e a c t i o n ，l i t t l e i sk n o w na b o u tt h ee f f e c t so fm a i l l a r dr e a c t i o n p r o d u c t s ( m r p s ) o nh u m a nh e a l t h m e a tf l a v o r i n gi sa k i n do fm r p s ，r a r ei n f o r m a t i o nw a s k n o w na b o u tt h ep h y s i o l o g i c a le f f e c t so fi t i nt h i sr e s e a r c h ，w es e p a r a t e dm r p sf r o mm e a t f l a v o r i n g t od i f f e r e n tf r a c t i o n sa c c o r d i n gt ot h e i rm o l e c u l a rw e i g h ta n dp o l a r i t y t h e i n h i b i t i o n so fm r p sa n dd i f f e r e n tf r a c t i o n sa g a i n s to x i d a t i o no fl i p o s o m ea n dh u m a n l y m p h o c y t e sw e r ei n v e s t i g a t e d l a s t l y , t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns t u c t u r eo fm r p s a n dt h e i r a n t i o x i d a n tc a p a c i t yw a ss t u d i e d i nt h e l i p o s o m e o x i d a t i o nm o d e l s ，m e a tf l a v o r i n g i n h i b i t e da a p h i n d u c e d ， f e 3 + v c i n d u c e dl i p o s o m eo x i d a t i o na n dl i p o s o m ea u t o o x i d a t i o n t h ea n t i o x i d a n tc a p a c i t y i i l c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo fi t sc o n c e n t r a t i o n m e a tf l a v o r i n ga l s oi n h i b i t e dt h eo x i d a t i o no f h u m a nl y m p h o c y t e s m e a tf l a v o r i n gw i t hh i g hc o n c e n t r a t i o np r o m o t e dt h ep r o l i f e r a t i o no f h u m a nl y m p h o c y t e sa n di n h i b i t e dt h el i p i dp e r o x i d a t i o no fh u m a nl y m p h o c y t e s t h r e em a i l l a r dr e a c t i o np r o d u c t s ( m r p s ) w i t hd i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h tw e r ep r e p a r e d b ym e m b r a n es e p a r a t i o no fm e a tf l a v o r i n g h i g hm o l e c u l a rw e i g h tm r p s ( h - m r p s ) h a d t h e h i g h e s ta n t i o x i d a n tc a p a c i t yi nl i p o s o m ea n dh u m a nl y m p h o c y t e s ，a n dl o wm o l e c u l a rw e i g h t m r p s 阻m r p s ) h a st h el o w e s ta n t i o x i d a n tc a p a c i t y t h eh m r p sw e r ef u r t h e rf r a c t i o n a t e db ys i l i c ag e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y t h e p r o c e s sy i e l d e dt h r e ef r a c t i o n s ( h m a ，h m b ，h m c ) w i t h d i f f e r e n tp o l a r i t y h - m ar e v e a l e d t h eh i g h e s ta n t i o x i d a n tc a p a c i t yi nl i p o s o m ea n dh u m a nl y m p h o c y t e s ，w h e r e a sh - m c a n t i o x i d a n tc a p a c i t yw a st h el o w e s t t h ec o l o u ro fd i f f e r e n tm r p sw a sm e a s u r e d t h ea n t i o x i d a n tc a p a c i t yo fm r p sw a s d e p e n d e n to ni t sc o l o u ri n d e x t h eg r o u p so fh m r p s ，h m a ，h m ba n dh _ m c w e r e a n a l y s e db yp r o l y s i s g c m s t h er e s u l t si n d i c a t e da l c o h o l s ，a c i d s ，a m i n e s ，p y r r o l e ，p y r a z i n e ， p h e n o l sa n do t h e rg r o u p s ；p y r r o l e ，p y r a z i n ea n db i s p h e n o lg r o u p s c o n t r i b u t e dt ot h e a n t i o x i d a n tc a p a c i t yi nm r p s k e yw o r d s ：m a i l l a r dr e a c t i o np r o d u c t s ；l i p o s o m e ( l p s ) ；h u m a nl y m p h o c y t e s ；a n t i o x i d a n t 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是芬人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：二雩j 啦日期：勾l 业 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 立猃立辜 导师签名：登叠 日 期： 2 1 竺全：i 全：f 兰 一引言 一引言 1 1 美拉德反应 1 1 1 美拉德反应简介 美拉德反应( m a i l l a r dr e a c t i o n ) 是氨基酸、肽链、蛋白质等氨基化合物与含有羰基 的化合物之间发生的非酶催化的褐变反应，该反应是法国化学家l o u i s c a m i l l em a i l l a r d 于1 9 1 2 年在将甘氨酸与葡萄糖混合加热时发现的，也称为羰氨反应( a m i n o c a r b o n y l r e a c t i o n ) 。自此之后m a i l l a r d 反应在食品领域得到了广泛的应用，它广泛存在于食品中， 是引起食品、果汁类非酶褐变的主要因素之一。从营养学角度看，由于反应使食品中的 有效成分如氨基酸类和糖类有所损失以及引起食品褐变，故食品营养价值有所降低。但 是，美拉德反应产物又是食品产生色泽( 如焙烤类食品的色泽) 和各种风味的主要来源， 这在食品生产上具有特殊的意义【1 1 。 1 1 2 美拉德反应的机理 1 9 5 3 年食品化学家h o d g e 提出了非酶褐变概略图，对m a i l l a r d 反应机理作出了初 步解释，主要分为以下三个反应阶段【2 】：在起始阶段，醛糖与氨基化合物进行缩合反应 形成希夫碱( s c h i f fb a s e ) ，经环化形成相应的n 取代醛糖基胺，然后经a m a d o r i 重排形 成a m a d o r i 化合物( 1 氨基1 脱氧2 酮糖) 。在中间阶段，a m a d o r i 化合物主要通过3 条 路线进行反应：第一条是在酸性条件下进行的1 ，2 一烯醇化反应，生成羟甲基呋喃醛； 第二条是在碱性条件下进行的2 ，3 烯醇化反应，产生还原酮类及脱氢还原酮类；第三 条是继续进行裂解反应，形成含羰基或双羰基化合物以进行最后阶段的反应，或是与氨 基进行s t r e c k e r 分解反应，产生s t r e c k e r 醛类。最终阶段的反应较为复杂，其反应机制 还不清楚，中间阶段产物与氨基化合物进行醛基一氨基反应，最终生成类黑精，即褐变 的呈色物质。美拉德反应产物除类黑精外，还有一系列的中间体组分，如还原酮及挥发 性杂环化合物【3 】。 1 2 美拉德反应产物的抗氧化性 1 2 1 脂质过氧化及抗氧化剂 生物体系中的细胞膜和细胞器膜含有大量不饱和脂肪酸侧链。由于不饱和脂肪酸双 键电子云密度大，化学性质很不稳定，很容易受到过氧化作用的损伤，产生有细胞毒性 的脂质过氧化物。这些化合物能破坏人体细胞正常生理功能，促使人体衰老和诱发癌症。 近年来研究证明脂质过氧化与某些疾病的病理过程，如肿瘤、化学中毒、感染、炎症、 自身免疫疾病、动脉粥样硬化( a s ) 及心脑血管疾病等均有密切联系。目前许多生物抗氧 化剂( 如：a v e 、抗坏血酸、p 胡萝卜素、茶多酚、类黄酮、番茄红素等) 通过抑制链 引发、打断链增长、加速链终止等方式抑制体内脂质氧化反应，从而起到保护人体细胞 组织、保护心脑血管循环系统、抗癌及延缓衰老等生理作用【4 j 。 江南大学硕士学位论文 食品中的脂质也能发生氧化，因此在食品中就需要添加抗氧剂来防止脂类的氧化和 腐败，延长食品的贮藏期。在食品中添加的抗氧化剂，有合成和天然两大类，合成的抗 氧化剂主要是一些酚类化合物，例如叔丁基对苯二酚( t b h q ) 、丁基羟基茵香醚( b h a ) 、 二丁基羟基甲苯( b h t ) 和生育酚( a h 2 ) 等。但是，b h a 、b h t 和a h 2 被认为有潜在的毒 副作用已被许多国家禁止使用1 5 j 。t b h q 虽没有被完全禁用，但其使用范围和使用量也 受到严格的限制。目前天然的抗氧化剂越来越受到人们的青睐，而大量研究的天然抗氧 化活性物( v c 、d 胡萝卜素及药材提取物等) ，成本较高，且溶解性能差，光、热、氧 的稳定性差，一定程度也限制了其的应用。 美拉德反应产物中由于含有类黑精、还原酮及一系列含n 、s 的挥发性杂环化合物， 这类物质具有一定的抗氧化性，其中某些物质的抗氧化作用可以与食品中常用的抗氧化 剂相媲美，因此，美拉德反应及其产物受到越来越多的关注。 1 2 2 美拉德反应产物的抗氧化性 早在1 9 5 3 年h o d g e 和砒s t l 6 j 首先报道了有关美拉德反应产物( m a i l l a r dr e a c t i o n p r o d u c t s ，m r p s ) 具有防止植物油氧化的效果，f m a c k e 和1 w n a c k y s l 7 在1 9 5 4 年也注意到 m r p s 具有抗氧化性，并发现，人造奶油中添加甘氨酸一葡萄糖反应产物后可以提高人 造奶油的氧化稳定性。但是在以后的二、三十年中，人们对美拉德反应的研究主要集中 与其反应条件和反应产物在食品储藏和力n - r _ 过程中对食品的色泽和风味的影响，以及食 用香精香料的开发研究，而忽略了对其抗氧化性能的研究。直到上个世纪八十年代， m r p s 抗氧化性研究才逐渐增多。目前许多研究表明氨基酸一还原糖模拟体系的反应产 物、面包皮咖啡提取物或热处理的膳食中的美拉德反应产物( m a i l l a r dr e a c t i o np r o d u c t s ， m r p s ) 具有抗氧化功能【s - l o ，它能调节化学保护酶谷胱甘肽s 转移酶的合成，并且有强 螯合f e 2 + 能力，从而抑制o h 。另有研究发现m r p s 还具有很强的消除活性氧的能力1 1 1 j 。 美拉德反应主要经历三个阶段进行，通过三个阶段反应产生一系列复杂的初期、中 期和晚期产物，这些产物在光学吸收、分子量方面都存在差异引。m r p s 中含有类黑精、 还原酮及一系列含n 、s 的杂环化合物，这些产物都具有一定的抗氧化性，其中有些与 常用的抗氧化剂相媲美。因此m r p s 具有较大的开发潜力，受到学者越来越多的重视。 目前不少学者利用蛋白质和还原糖类制备具有抗氧化作用的m r p s 产物，并将其加入食 品体系中，从而提高产品的稳定性【l3 1 。 虽然人们对m r p s 的抗氧化性展开了大量研究，但是这一领域中还存在许多空白， 对于m r p s 的抗氧化机理尚未研究清楚。目前已有的关于m r p s 的研究中，所用研究对 象大多是氨基酸一还原糖模拟体系的反应产物以及面包皮咖啡提取物等，尚没有关于咸 味香精中m r p s 的抗氧化作用的研究。再者，目前关于m r p s 的抗氧化功能研究基本上 是体外研究，对于m r p s 的体内效果人们还知之甚少。 1 2 3 类黑精物质的抗氧化性及其结构 类黑精是一类聚合度不等的高分子混合体，主要以短肽或蛋白复合物的形式存在， 其亲水性强，被认为是美拉德反应产物中主要抗氧化成分。近年来，国外对类黑精物质 2 一引言 的抗氧化作用进行了较多研究，通过研究营养及生理功能特性，人们发现其具有抗氧化 性、抗自由基作用【l 7 】。据日本媒体报道，类黑精作为非消化性高分子化合物，它能够 发挥食物纤维素的类似生理功能，促进血清胆固醇的降低，同时可抑制血糖值的升高。 j i n g 1 8 等学者研究发现，赖氨酸与葡萄糖或果糖反应生成的美拉德反应产物能够有效抑 制f e n t o n 反应中自由基的生成，其中高分子量的类黑精具有的抗氧化能力最强。 到目前为止，人们对于类黑精物质的结构还不是很清楚，由于反应条件的差异及反 应原料的不同，类黑精的组成也有所差异。目前尚无或极少对类黑精中抗氧化成份进行 结构分析研究【1 9 】。关于类黑精的结构，主要存在三种观点：( ! ) h e y n s 和t r e s s l 2 0 ，2 1 】等先 后提出类黑精聚合物主要是由重复单元的吡咯或呋喃组成，通过缩聚反应最终形成美拉 德反应产物( 如图1 一1 ) 。h o f m a n n 拉2 j 认为类黑精根据分子量可以被分为两部分：一类 是低分子量的有色物质，分子量低于1 0 0 0 ；另一类是分子量达到1 0 0 0 0 0 的大分子， h o f m a n n 发现低分子量的生色团通过赖氨酸的- n h ：或精氨酸和蛋白质交联而形成高分 子量的有颜色物质。c a m m e r e r 2 3 】等认为主要是由美拉德反应第一阶段的糖降解产物通 过a l d o l 缩合聚合而形成的。氨基酸可能是后连上的。 h 图1 - 1 类黑精的结构 f i g 1 - 1s t r u c t u r eo fm e l a n i d i n s 1 2 4 美拉德反应产物中挥发性物质的抗氧化性及其结构 食品发生美拉德反应时，除生成类黑精外，还会生成使食品具有特殊香味的杂环类 挥发性物质，这些物质在碱性条件下( p h = 9 ) 下，同样表现出很强的抗氧化能力【2 4 1 。 经学者研列2 4 , 2 5 】，这类挥发性杂环化合物主要为噻吩、噻唑、嗯唑、呋喃、吡嗪、吡咯 等。这类物质之所以具有较强的抗氧化性，主要表现在【2 6 】：具有芳香特性的五元和六元 杂环化合物中六个兀电子非定域分布于环上，使碳原子上7 【电子云密度提高而有助于自 由基的加层。硫醇类杂环化合物抗氧化机理表现在三个方面：亲核的硫醇基作为单电 子的还原剂清除过氧或环氧自由基；通个二电子还原作用分解过氢化物，生成二硫化 物；五元杂环可清除活性自由基。 1 3 咸味香精 1 3 1 成味香精的研究历史和现状 肉类一直是人们饮食的重要组成部分，它能够作为蛋白质的一种来源，并且它的感 官特性也深受人们的青睐。尤其在我国，饮食传统的沿袭使得肉香味食品深受人们喜爱， 具有肉香味的咸味香精被广泛应用于各类食品中，满足人们对肉风味的需要。随着技术 的进步和时代的发展，模拟不同肉香味的咸味香精产品也不断问世，咸味香精是包括猪 江南大学硕士学位论文 肉香精、牛肉香精、鸡肉香精、火腿香精、各种海鲜香精等在内的一系列具有动物肉类 制品香味的食用香精的总称，主要用于方便面调料、鸡精、罐头、熏肉、酱肉、香肠、 火腿肠、香辣酱等食品以及动物饲料和宠物食品【27 1 。咸味香精的研究可追溯到2 0 世纪 5 0 年代，当时人们已经开始尝试寻求和确定生肉中的肉香前体物质。2 0 世纪5 0 年代后 期到6 0 年代早期，随着波谱技术的成熟，人们借助先进的分析仪器分析得到肉类在烹 调加工中产生的挥发性香味成分。2 0 世纪6 0 年代以后，人们通过对m a i l l a r d 反应的不 断深入研究，发现生肉加热后之所以会产生理想的肉类风味，是因为肉中的葡萄糖、核 糖、果糖和氨基酸、肽、蛋白质等物质发生m a i l l a r d 反应的缘故。从此，人们建立了烹 调天然肉的m a i l l a r d 模拟体系1 2 引。 目前，许多科学家开始利用各种还原糖和氨基酸作为前体物进行反应，来制备肉味 香精，所用原料也从单纯的还原糖、氨基酸发展到以植物水解蛋白、动物水解蛋白、酵 母抽提物等为原料，通过改变原料和工艺条件可以制备出不同的香味物质。国内已有通 过m a i l l a r d 反应制备肉味香精的相关研究报道，如上海应用技术学院肖作兵等人1 2 9 ，3 0 j ， 以猪骨素、糖类物质、辛香料等为原料，通过美拉德反应制备出了高品质的天然肉味香 精；宋焕禄利用鸡肉酶解物等原料制备了肉香化合物；张彩菊等人【3 2 】利用鱼的酶解产 物、谷氨酸、糖类等物质制备鱼味香料；张谦益等【3 3 1 以牛肉酶解物、木糖和半胱氨酸盐 酸盐为主要原料，制备出了强烈而协调的带有烤牛肉味的香物质；李宏梁等人【3 4 j 研究了 以牛肉、大豆蛋白粉、葡萄糖和半胱氨酸等为原料，制备出牛肉味香物质。 1 3 2 成味香基在成味香精中的作用 在我国，具有肉香味的咸味香精广泛地被用于方便面、汤料、肉制品、膨化食品、 饼干、罐头、冷冻食品以及快餐等加工食品中，以增加或赋予食品肉风味，满足人们对 肉风味的需要。通过氨基酸或植物蛋白水解物与还原糖高温加热所发生的m a i l l a r d 反应 制备得到的反应型咸味香基香味逼真，成本低廉，是开发咸味香精必不可少的配料。本 实验中采用的咸味香精调配前的咸味香基，是直接的美拉德反应产物。其抗氧化评价对 于指导该类香精的应用具有重要意义。 1 4 目前存在的问题 近年来，美拉德反应产物的研究与应用有很大进展，但是由于其反应的复杂性，在 这一研究领域还存在许多疑问或空白，主要表现在： ( 1 ) m r p s 的功能性与安全性 人们通过多年的研究，发现由于反应工艺条件的差异，美拉德反应产物的生物功效 有差异。大量研究表明，美拉德反应产物具有显著的抗氧化、抗诱变性和抗菌性，一些 细胞和动物实验研究发现，面包皮、咖啡提取物中的m r p s 能够调节化学保护酶谷胱甘 肽s 转移酶的合成，同时能够激活肝脏解毒酶n a d p h 细胞色素c 还原酶的解毒作用1 8 1 。 然而，一些体外细胞模型研究也显示，糖基化酪蛋白和氨基酸糖模型体系产生的 m r p s 具有氧化还原相关的细胞毒性，能增加细胞的氧化损伤，促发炎症【3 5 , 3 6 。一些针 4 一引言 对面包皮提取物、高热加工膳食所做的体内研究更是发现，m r p s 具有加重或诱发糖尿 病、肾功能损伤程度的恶化，同时会诱发炎症和动脉粥样硬化【3 7 4 2 1 。因此可以说，目前 关于m r p s 的功能性或安全性评价还没有一个定论。 ( 2 ) m r p s 的结构 目前，人们对美拉德反应产物的研究主要还是集中在致香挥发性成份及其抗氧化性 上。虽然有部分科研工作者探讨了美拉德反应产物中类黑精类物质的抗氧化性研究，得 出了美拉德反应产物的抗氧化性主要集中在类黑精中的结论，但是尚无或极少对类黑精 中抗氧化成份进行提取分离及结构分析研究，一般仅存在对类黑精中抗氧化成份的推 测。所以对于m r p s 中哪一类确切化合物具有抗氧化作用，人们还知之甚少。 1 5 立题背景和意义 自从1 9 1 2 年法国化学家m a i l l a r d 发现非酶褐变之后，m a i l l a r d 反应就开始被人们用 于食品加工、贮藏等过程。该反应在香精领域中的应用打破了传统的香精调配和生产工 艺范畴，成为一种新的香精香料生产应用技术。同时，近年来膳食m r p s 的功能性研究 引发了广泛的关注，许多体内、体外研究发现，美拉德反应产物具有显著的抗氧化效果， 其中有些可以与常用的抗氧化剂相媲美，因此美拉德反应产物的抗氧化性越来越得到学 者的关注。但是这一领域还存在许多空白：首先，在目前已有的关于m r p s 研究中，所 用研究对象大多是氨基酸还原糖模拟体系的反应产物、面包皮咖啡提取物以及热处理 的膳食，尚没有关于咸味香基中的m r p s 抗氧化性的研究。其次，m a i l l a r d 反应是一系 列复杂的化学反应，生成大量复杂化合物，并且绝大多数化合物还是未知，特别是对于 m r p s 中哪一类化合物具有抗氧化性，目前尚无或极少有报道；第三，目前关于m r p s 的抗氧化性研究大多使用的是体外实验，对于m r p s 的体内效果尚没有定论。 本课题通过一系列分离纯化的手段对咸味香精中美拉德反应产物进行初步分离，同 时通过体外脂质体氧化体系和细胞的氧化应激水平两方面综合考察咸味香精中美拉德 反应产物的抗氧化性，探讨其组成特性与其抗氧化效果之间的关系。这为进一步研究咸 昧香精对生物体内产生的作用机理提供数据基础，也为进一步研究发挥这些生物效果的 确切化合物结构提供理论依托，同时对于咸味香精n - v _ 业的生产加工过程有非常重要的 指导作用。 1 6 主要研究内容 选取某公司咸味香精调配前的咸味香基为研究对象，通过体外脂质体氧化体系和细 胞的氧化应激水平两方面综合考察咸味香精中美拉德反应产物的抗氧化活性，同时通过 一系列分离纯化的手段对咸味香精中美拉德反应产物进行初步分离，探讨其组成特性与 其生物效果之间的关系。主要研究内容包括： ( 1 ) 利用膜过滤、色谱分离法对m r p s 进行初步分离； ( 2 ) 采用三种促脂质体氧化模型，研究比较各类m r p s 产物对卵磷脂脂质体氧化水平的 影响； 江南大学硕士学位论文 ( 3 ) 利用体外细胞模型研究各类m r p s 产物对细胞氧化还原水平的影响； ( 4 ) 初步分析m r p s 产物的可见光吸收性质、结构组成性质与其抗氧化作用之间的关系。 6 二实验材料与方法 二实验材料与方法 2 1 材料与设备 2 1 1 实验材料与主要试剂 咸味香基国内某香精公司；透析袋( m w c o8 0 0 0 1 4 0 0 0 )国药集团化学试剂有 限公司；超滤膜片( m w c o1 0 0 0 ) 无锡赛普膜科技有限公司；大豆卵磷脂( 纯度9 8 ) 、 2 ，2 盐酸脒基丙烷( a a p h ，纯度9 8 ) 均购于s i g m a a l d r i c h 公司；淋巴细胞分离液 ( f i c o l l - h y p a q u e1 0 7 7 9 m 1 ) 上海华精生物高科技有限公司；r p m i 1 6 4 0 ( 生化试剂) 上海钰森生物技术有限公司；肝素钠( 生化试剂) 上海生工生物工程技术服务有限公 司；超级新生牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司；谷氨酰胺( 纯度9 8 ) 上 海生工生物工程技术服务有限公司；乙醇( 分析纯) 天津南开大学化学工厂；抗坏血 酸( v c ，分析纯) 、硫代巴比妥酸( t b a ，生化试剂) 、三氯乙酸( t c a ，分析纯) 、台 盼蓝( 纯度9 8 ) 、噻唑蓝( m t t ，纯度9 8 ) 、二甲基亚砜( d m s o ，分析纯) 、谷胱甘 肽( g s h ，纯度9 8 ) 、5 ，5 一二硫硝基苯甲酸( d n t b ，纯度9 9 ) 、g f 2 5 4 薄层硅胶板、 硅胶( 1 0 0 2 0 0 目) 均购于国药集团化学试剂有限公司。 2 1 2 主要仪器 u f 2 0 1 超滤设备 r 一5 0 1 旋转蒸发器 y d 9 0 0 l 超声波细胞粉碎机 t h z 8 2 恒温水浴振荡器 w f j 7 2 0 0 可见分光光度计 c 0 2 细胞培养箱 c k s 4 1 倒置显微镜 全自动酶标分析仪 9 6 孔平底细胞培养板 h h 4 数显恒温水浴锅 台式离心机t d l 一5 2 4 孔平底细胞培养板 层析柱( 0 2 5m m x 2 0 0m m ) d b s 1 0 0 电脑全自动部分收集器 d h l a 型恒流泵 p y r o p r o b e5 0 0 0 热裂解器( 配有吸附解析池) t r a c e2 0 0 0g c d s qm s 气质联用仪 7 无锡赛普膜科技有限公司 上海申顺生物科技有限公司 上海之信仪器有限公司 常州国华电器有限公司 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 t h e r m of o r m a 公司 o 删p u s 公司 m u l t i s k a nm k 3 上海晶睿生物科技有限公司 江苏省金坛市荣华仪器制造厂 上海安亭科学仪器厂 上海晶睿生物科技有限公司 上海肯强仪器有限公司 上海青浦沪西分析仪器厂 上海青浦沪西分析仪器厂 美国公司c d s 公司 美国热电公司 江南大学硕士学位论文 2 2 实验方法 2 2 1 成味香基中美拉德反应产物的初步分离 称取肉味香基原样，用水稀释、抽滤得澄清液体。4 。c 去离子水透析( 透析袋截留 分子量8 1 4i a ) ，直到透出液呈无色透明，收集未透出液。将透出液浓缩，利用截留 分子量1k d a 的超滤膜进行超滤分离( 使用压力o 5m p a ) ，收集滞留液及滤液。将上述 三种不同分子量范围的液体分别记为h m r p s ( 1 4l a ) 、m m r p s ( 1 1 4k d a ) 及 l m r p s ( 9 8 ，利用r p m l l 6 4 0 完全培养液调 整细胞浓度至l o x1 0 6 个m l ，待加9 6 孔板用m ，4 7 1 。 2 2 3 2 实验分组 空白组：只加培养基不加细胞( 含l o d 、牛血清的r p m l l 6 4 0 培养液1 0 0 此) 对照组：只加淋巴细胞悬液而不加样品( 细胞悬液8 0 “l + 不含血清的培养液2 0 此) 给样组：分别加入终浓度为2 、1 、0 2 、0 1 、o 0 2m g m l 美拉德反应产物( 细胞悬 液8 0 l + 样品2 0 肛l ) 2 2 3 3m t t 法测定细胞增殖率 按照上述方法制备人淋巴细胞悬液，混匀细胞悬液，向9 6 孔板中加样，每孔8 0 “l 细胞悬液。用无血清r p m l l 6 4 0 培养液将各样品稀释成不同浓度，按设计好的顺序加样 ( 每孔加样2 0 此) ，每个浓度6 个重复孔。将培养板置于5 c 0 2 ，3 7 培养箱中培养 7 2h ，培养结束前4h ，向各孔中加入m t t 溶液( 5m g m l 2 01 t l ) ，继续培养4h 。培养 结束后，1 0 0 0r p m m i n 离心1 0m i n ，小心弃上清。再向各孔中加入d m s 0 1 3 0 此，振荡 1 0m i n ，十来分钟之后观察结晶充分溶解后，用酶标仪以5 7 0n n l 处读取o d 值。计算细 胞增殖率【4 8 1 。 细胞增殖率( ) = 丝羔鳖筹豢云半1 0 0 2 2 4 美拉德反应产物对人淋巴细胞g s h 含量影响的测定 2 2 4 1 标准曲线的制作 将标准的g s h 用三蒸水溶解，配成6 种不同浓度的测定液，参考文献【4 9 1 ，采用t i e t z e 还原酶法进行g s h 含量测定，得到光密度一g s h 浓度的标准曲线。 2 24 2z d , i - 周血淋巴细胞g s h 含量测定 按上述方法进行人外周血淋巴细胞的分离，利用r p m l l 6 4 0 完全培养液调整细胞浓 度至1 0 6 个m l ，待加2 4 孔板用。分别加入终浓度为2 、1 、o 2 、o 1 、0 0 2m g m l 美拉 德反应产物，每个浓度6 个重复孔。细胞培养7 2h 后，参考文献1 3 6 j 的方法进行谷胱甘 肽含量的测定。根据4 1 2n l l 处测定的o d 值，在标注曲线上找出相应的g s h 浓度，再 利用下列公式计算淋巴细胞内g s h 含量。 g s h ( m m o l c e l l ) = s 1 0 。3 细胞数 s 为标准曲线上查得的g s h 值( m m o l l ) 2 2 5 美拉德反应产物对人淋巴细胞脂质过氧化的影响测定 按上述方法进行人外周血淋巴细胞的分离，利用r p m l l 6 4 0 完全培养液调整细胞浓 度至1 0 1 0 6 个m l ，待加2 4 孔板用。分别加入终浓度为2 、1 、o 2 、o 1 、o 0 2m g m l 美 9 江南大学硕士学位论文 拉德反应产物，每个浓度6 个重复孔。细胞培养7 2h 后，参考文献【3 6 】的方法进行 t b a r s ( 硫代巴比妥反应物质) 的测定。根据5 3 2n i 1 处测定的o d 值，以t b a r s 的消光 系数_ 1 5 6 x 1 0 5 ( m o l l ) 1 c m o 计算脂质过氧化产物t b a r s 的含量。 2 2 6 高分子量美拉德反应产物的分离 。 利用硅胶柱层析分离纯化高分子量美拉德反应产物( h m i 冲s ) ，具体方法如下：称 量1 0 0 2 0 0 目硅胶1 0 0g ，加入一定量的9 5 乙醇充分搅拌硅胶成匀浆。将硅胶边搅拌 边缓缓倒入层析柱( 2 5m m x 2 0 0m m ) 中，待硅胶沉积后，加入更多的9 5 乙醇以使 床层压实。 称取一定量的高分子量美拉德反应产物，配成浓度为1 0m g m l ，利用湿法上样法 上样2 3m l 。按实验要求加入配好后的洗脱剂进行洗脱。洗脱条件为：流速：o 5m l m i n ， 收集体积：5m i n 管。利用紫外可见分光光度计扫描判断是否有组分流出。根据分析的 结果，将含有较纯部分收集，冷冻干燥成粉末以备用。 2 2 7 美拉德反应产物可见光吸收强度的测定 用可见分光光度计在4 2 0n l n 处测定。 2 2 8 热裂解气质联用在线分析( p y g c m s ) 热裂解条件 s o , s l l ：裂解温度7 0 0 ，裂解时间2 0m s 。 色谱分离条件：进样口温度2 8 0 ，h p 5 m s 色谱柱( 3 0m x 0 3 2i l n l ，0 2 5 岬) ， 载气恒流流速( 高纯h e ) 1 2m l m i n ，柱始温3 5 ( 3m i n ) ，第一阶段升温速率5 m i n 1 ， 终温度6 0 ，第二阶段升温速率1 5 m i n ，终温度2 8 0 ( 保持5m i n ) 。 质谱条件：e i + 源：7 0e v ，2 0 0 ；扫描质量范围3 3 - - 6 0 0d a 。 基团组成鉴定：将m r p s 的p y g c m s 图谱经计算机和人工把每个峰与r e p l i b ， m a i n l i b 标准谱图库进行匹配，按s i ( 相似度) 8 0 0 ( 最大值1 0 0 0 ) 的原则作为鉴定结 果。 1 0 三结果与讨论 三结果与讨论 3 1 美拉德反应产物对卵磷脂脂质体氧化水平的影响 生物体系中的细胞膜和细胞器膜含有大量不饱和脂肪酸侧链，很容易引起脂质过氧 化，很多疾病和衰老现象都与脂质过氧化有关。脂质体是天然磷脂在水中分散形成的磷 脂双分子层结构，与生物膜的结构类似，具有生物膜的许多特性与功能，被广泛用于模 拟研究天然物质对生物膜的抗氧化、促氧化作用。所以美拉德反应产物对脂质体氧化程 度的影响水平是对其生物效果评价的重要指标。 3 1 1a a p h 诱导的卵磷脂脂质体氧化条件的确定 偶氮类化合物a a p h ( 2 ，2 a z o b i s ( 2 - a m i d i n o p r o p a n e ) d i h y d r o c h l o r i d e ) 是一种热不 稳定、水溶性自由基引发剂，在水相中，a a p h 以恒定的速度产生水溶性过氧自由基， 在多个位点同时攻击脂质，引起脂质氧化【5 2 1 。由于所采用的卵磷脂和a a p h 性质的差 异，人们对a a p h 引发卵磷脂脂质体氧化的实验条件并不确定，需通过实验找出最适脂 质体氧化的条件。不同脂质体浓度、a a p h 浓度和反应时间对脂质体氧化的影响见图 3 1 3 3 。 1 3 1 1 0 9 星0 7 咖0 5 蟹0 3 舌0 1 _ o 1 - 0 3 浓度( m g m 1 ) 图3 1 不同浓度脂质体的氧化作用 ( 反应1h ，a a p h 为5m m o l l ) f i g 3 1o x i d a t i o na c t i o no fl i p o s o m e o nd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s 1 4 1 2 ：1 兰o 8 删0 6 甥o 4 盖0 2 0 加2 浓度( m m l 1 ) 图3 - 2 不同浓度a a p h 对脂质体的氧化作用 ( 反应lh ，脂质体为1 0 m g m l ) f i g 3 2t h ee f f e c to fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f a a p ho nt h e o x i d a t i o no fl i p o s o m e s l 时间( h ) 图3 3 不同反应时间对脂质体的氧化作用 ( 脂质体为1 0m g m l ，a a p h 为5m m o l l ) f i g 3 - 3t h e e f f e c to fd i f f e r e n tr e a c t i o nt i m eo no x i d a t i o no fl i p o s o m e s 5 2 5 l 5 o 2 1 0 一_i_12jv嘲妞誊_ 江南大学硕士学位论文 由图3 1 可见，当脂质体浓度为1 0m g m l 时，其氧化所生成的t b a r s 量为最大， 而浓度为15m g m l 的脂质体，由于其本身在5 3 2h i l l 有较大吸收，且乳状液静置有沉淀， 故最佳卵磷脂脂质体浓度为1 0m g m l 。由图3 2 可见，a a p h 浓度在1m m o l l 到5 m m o u l 之间t b a r s 量的变化有波动，且1 0m m o l 1a a p h 引发脂质体氧化所生成的 t b a r s 量相比较5m m o l 1 差异不显著( p 0 0 5 ) ，故最佳a a