（遗传学专业论文）优质大豆球蛋白gy7基因克隆及转化烟草的研究.pdf

致谢 首先感谢导 师李建粤老师在三年中 给予我的悉心指导 本论文是在李建粤老师的精心指导下完成的， 在文献调研、论文设计、试验 操作、 论文整理直至完成都凝聚了李老师的心血和智慧。 李老师渊博的学识和丰 富的科研经验把我带入了植物分子遗传学这一充满奥秘和挑战的领域， 李老师对 科学事业的执着追求、 严谨治学的态度和爱岗敬业的工作作风是我毕生学习的典 范， 将使我受益终身。 不仅如此， 李建粤老师在生活上还给予了我们最悉心的照 料，谨此致以诚挚的敬意和衷心的感谢 衷心感谢中科院植物生理研究所研究员洪孟民老师和王宗阳老师为我们提 供 质 粒p c a m b i a 1 3 0 0 和p c a m b i a 1 3 0 1 . 感谢 遗 传 学 硕士 点 周 根 余 教 授 和 杨 仲 南教授在学习和生活上的关怀以 及在论文试验上给予的支持和帮助! 此外， 还要感谢陈立琼同学在本试验的分子克隆和构建方面给予的帮 助。 感 谢植物分子遗传学实验室的同学在论文的试验和整理阶段给予我热情的帮助和 精神上的鼓励。 最后，感谢我的家人和亲友对我三年研究生学习生涯的支持，他们的理解、 关怀和鼓励是我不断前进的动力! 再次衷心地感谢给过我帮助的老师、同学和朋友们1 优 质 大 豆 球 蛋 白 g y 7 基 因 克 隆 及 转 化 烟 莫 的 研 究_ _ _ _ _ _ 第一部分文献综述 大豆球蛋白研究以及在改良 稻米营养品质中的应用 摘要大豆含有丰富的蛋白 质，既是人类和动物蛋白质营养的直接来源，又是 改良 缺乏蛋白质的其他重要农作物营养品质的资 源物种， 所以 涉及大豆球蛋白方 面的研究总是受到人们的重视。1 l s 大豆球蛋白是大豆贮藏蛋白的重要成分，目 前己发现六种有功能的大豆球蛋白， g 1 , g 2 , g 3 , g 4 , g 5 和g 7 ，编码这些大豆 球蛋白的基因家族分别是g y l , g y 2 , g y 3 , g y 4 , g y 5 和g y 7 。本文在简要介绍大 豆球蛋白 组分、 结构及基因家族后， 采用生物信息学方法分析比较了不同种类大 豆球蛋白基因之间的序列同源性，并对不同大豆球蛋白基因的遗传距离作了分 析; 本文还重点比较分析了不同大豆球蛋白的氨基酸序列和组成， 以及不同酸性 肤和碱性肤中重要氨基酸的含量， 基于对前人工作的总结和我们的分析结果， 本 文提出了 利用大豆球蛋白 基因进行水稻营养品质改良 研究的新思路和新策略。 关键词 大豆球蛋白; 基因家族; 同源性; 重要氨基酸; 水稻营养品质改良 优质人豆球蛋白g y 7 基因克隆及转化烟草的研究 g l y c i n i n s t u d i e s a n d a p p l i c a t i o n t o i mp r o v i n g r i c e n u t r i t i o n a l q u a l i t y a b s t r a c t s o y b e a n s e e d s a r e n u t r i t i v e s o u r c e o f p r o t e i n s t o p e o p l e o r a n i m a l s a n d a l s o fi n e n a t u r a l r e s o u r c e s u s e d i n i m p r o v i n g n u t r i t i v e q u a l i t i e s o f m a j o r c r o p s t h a t a r e s h o r t o f p r o t e i n s , f o r t h e r e a r e p l e n t i f u l p r o t e i n c o n t e n t s . t h e t 1 s g l y c i n i n i s o n e o f t h e m o s t im p o r t a n t c o m p o n e n t s o f s t o r a g e p r o t e i n s i n s o y b e a n s e e d s . s ix k i n d s o f f u n c t i o n a l g l y c i n i n w e r e d i s c o v e r e d , t h e y a r e g 1 , g 2 , g 3 , g 4 , g 5 a n d g 7 , c o d e d b y t h e c o r r e s p o n d i n g g e n e s o f g y l 、 g y 2 , g y 3 , g y 4 , g y 5 a n d g y 7 .t h i s p a p e r s u m m a r i z e s t h e s t u d i e s o n g l y c i n i n i n c l u d i n g c o m p o n e n t s , s t r u c t u r e a n d g e n e f a m i l i e s . t h e h o m o g e n e i t y o f t h e g l y c i n i n g e n e s e q u e n c e s w a s c o m p a r e d b y b i o i n f o r m a t ic s . h e r e d it y d i s t a n c e s o f t h e s ix g l y c i n i n g e n e s w e r e a n a l y z e d . s p e c i a l e m p h as i s i s l a i d u p o n c o m p a r i n g t h e s e q u e n c e s a n d c o m p o n e n t s o f a m i n o a c i d s i n t h e g l y c i n i n . t h e c o n t e n t s o f m a j o r a m i n o a c i d s i n t h e i n t a c t g l y c in i n a n d i n t h e a c i d a n d b a s i c p e p t i d e s w e r e a n a l y z e d . i n v i e w o f o t h e r s a n d o u r r e s e a r c h e s , w e a d v a n c e s o m e n e w t h in k i n g a n d t a c t ic s o f i m p r o v i n g r i c e n u t r i t io n a l q u a l i t y b y u s i n g g l y c i n i n g e n e s . k e y w o r d s g l y c i n i n ; g e n e f a m i l i e s ; h o m o g e n e i t y ; m a j o ra mi n o a c i d ; r i c e n u t r i t i o n a l q u a l i t y i m p r o v e m e n t 优质大豆球蛋白g y 7 基因克 隆及转化烟草 的研究 d引言 大豆是富含蛋白质的最重要农作物， 是人类和动物非常理想的蛋白质营养来 源。据报道，大豆蛋白 质具有天然的降血脂( s u g a n u , 1 9 9 6 ) 和降低血浆胆固醇 ( k i t o e t a l , 1 9 9 3 ) 保健功能，可避免动物性食品中的胆固醇问题，由大豆制成 的人造肉将是人类未来的重要蛋白质营养来源( 刘后利， 2 0 0 1 ) 。富含优质蛋白质 的大豆既可直接作为人类重要的、 有保健作用的营养来源， 同时还是人们改良其 他重要农作物营养品质的基因库。大豆球蛋白 在大豆种子发育过程中逐渐积累， 是组织特异性表达产物， 因此对大豆球蛋白及相应基因进行研究， 对人们认识高 等植物种子基因表达调控具有重要意义。 对大豆球蛋白结构、 基因组成、 表达调 控以及利用大豆球蛋白基因改良其他作物的研究一直是人们感兴趣的课题。 1大豆盐溶性球蛋白组分及 1 1 s 大豆球蛋白结构 在大豆种子中， 蛋白 质分为水溶性的清蛋白( 1 0 % ) 和盐溶性的球蛋白( 9 0 % ) ( f u k u s h i m a , 1 9 9 1 ) 。 按 照在p h 7 . 6 , 0 . 5 m 离 子强 度的 缓冲 液中的 沉降 速度， 盐 溶 性的球蛋白 又可分为四种组份:2 s , 7 s , i i s , 1 5 s a 1 1 s 和 1 5 s 组分分别是大豆 球蛋白和大豆球蛋白多聚体。而 7 s组分是异源的， 大部分是0 一 伴大豆球蛋白， 还包括y - 伴大豆球蛋白、 脂肪氧化酶、血球凝集素等。 2 s 组分包括胰蛋白酶抑 制剂、 细胞色素c , a 一 伴大豆球蛋白 等( 周兵等， 1 9 9 8 ) 。 在大豆盐溶性球蛋白 的 四种组分中，7 s和 l 1 s球蛋白是两种主要的成分，分别被称为豌豆球蛋白 ( v i c i l i n ) 和豆球蛋白( l e g u m i n )( 刘后利， 2 0 0 1 ) 。 大豆的豆球蛋白 主要为大 豆球蛋白( g l y c i n i n ) ， 约占 成熟种子总蛋白 含量的4 0 % ( u t s u m i , 1 9 9 2 ; u t s u m i e t a l , 1 9 9 7 )，是目 前 大豆盐溶性球蛋白 研究的重点。 大豆球蛋白是大豆种子的主要贮藏蛋白，占种子干重的2 0 % 左右， 积累于子 叶细胞的蛋白体中( 郑易之等， 1 9 9 2 ) 。从种子中提取的大豆球蛋白为六聚体复合 物，分子量介于3 2 0 -3 7 5 k d 之间。每个六聚体复合物包含两个三聚体，每个只 聚体由三个亚基组成， 每个亚基由一个酸性肤( a ) 和一个碱性肤( b ) 通过二硫键 连接而成( s t a s w i c k e t a l , 1 9 8 4 ) . a 月 太 和b 月 太 来源于同一 个基因，即首先由 一 个大的m r n a 翻译成a - b 蛋白 前体， 然后再通过翻译后加工形成酸性肤和碱性肤。 现至少己经分离出六种酸性肤( a , a ,h , a : 一 人 ， 和 a s ) 和五种碱性肤( b ,氏, b z - b , ) 优质大豆球蛋白g y 7 基因克 隆及转化烟草 的研究 d引言 大豆是富含蛋白质的最重要农作物， 是人类和动物非常理想的蛋白质营养来 源。据报道，大豆蛋白 质具有天然的降血脂( s u g a n u , 1 9 9 6 ) 和降低血浆胆固醇 ( k i t o e t a l , 1 9 9 3 ) 保健功能，可避免动物性食品中的胆固醇问题，由大豆制成 的人造肉将是人类未来的重要蛋白质营养来源( 刘后利， 2 0 0 1 ) 。富含优质蛋白质 的大豆既可直接作为人类重要的、 有保健作用的营养来源， 同时还是人们改良其 他重要农作物营养品质的基因库。大豆球蛋白 在大豆种子发育过程中逐渐积累， 是组织特异性表达产物， 因此对大豆球蛋白及相应基因进行研究， 对人们认识高 等植物种子基因表达调控具有重要意义。 对大豆球蛋白结构、 基因组成、 表达调 控以及利用大豆球蛋白基因改良其他作物的研究一直是人们感兴趣的课题。 1大豆盐溶性球蛋白组分及 1 1 s 大豆球蛋白结构 在大豆种子中， 蛋白 质分为水溶性的清蛋白( 1 0 % ) 和盐溶性的球蛋白( 9 0 % ) ( f u k u s h i m a , 1 9 9 1 ) 。 按 照在p h 7 . 6 , 0 . 5 m 离 子强 度的 缓冲 液中的 沉降 速度， 盐 溶 性的球蛋白 又可分为四种组份:2 s , 7 s , i i s , 1 5 s a 1 1 s 和 1 5 s 组分分别是大豆 球蛋白和大豆球蛋白多聚体。而 7 s组分是异源的， 大部分是0 一 伴大豆球蛋白， 还包括y - 伴大豆球蛋白、 脂肪氧化酶、血球凝集素等。 2 s 组分包括胰蛋白酶抑 制剂、 细胞色素c , a 一 伴大豆球蛋白 等( 周兵等， 1 9 9 8 ) 。 在大豆盐溶性球蛋白 的 四种组分中，7 s和 l 1 s球蛋白是两种主要的成分，分别被称为豌豆球蛋白 ( v i c i l i n ) 和豆球蛋白( l e g u m i n )( 刘后利， 2 0 0 1 ) 。 大豆的豆球蛋白 主要为大 豆球蛋白( g l y c i n i n ) ， 约占 成熟种子总蛋白 含量的4 0 % ( u t s u m i , 1 9 9 2 ; u t s u m i e t a l , 1 9 9 7 )，是目 前 大豆盐溶性球蛋白 研究的重点。 大豆球蛋白是大豆种子的主要贮藏蛋白，占种子干重的2 0 % 左右， 积累于子 叶细胞的蛋白体中( 郑易之等， 1 9 9 2 ) 。从种子中提取的大豆球蛋白为六聚体复合 物，分子量介于3 2 0 -3 7 5 k d 之间。每个六聚体复合物包含两个三聚体，每个只 聚体由三个亚基组成， 每个亚基由一个酸性肤( a ) 和一个碱性肤( b ) 通过二硫键 连接而成( s t a s w i c k e t a l , 1 9 8 4 ) . a 月 太 和b 月 太 来源于同一 个基因，即首先由 一 个大的m r n a 翻译成a - b 蛋白 前体， 然后再通过翻译后加工形成酸性肤和碱性肤。 现至少己经分离出六种酸性肤( a , a ,h , a : 一 人 ， 和 a s ) 和五种碱性肤( b ,氏, b z - b , ) 优质大豆球蛋白g y 7 基因克隆及转化烟草的研究 ( n i e l s e n , 1 9 8 4 ) 。大豆球蛋白的高级结构易受环境中p h 值和溶液离子强度的影 响。 在p h 7 . 6 ,离子强度为0 . 5 m 的条件下， 大豆球蛋白分子量为3 6 0 k d ，以六对 相同的亚基组成六聚体复合物形式存在。 在 p i ll8 时， 大豆球蛋白又卞要以分子 量为 1 8 0 k d的三聚体复合物形式存在。在 p h 7 . 6的条件下，离子强度从 0 . 5 m 降到小于0 . 1 m 时，六聚体大豆球蛋白也可解离成三聚体形式。 2大豆球蛋白基因家族 现己证实， 大豆球蛋白由多基因家族编码， 迄今为止已有七个大豆球蛋白基因被 克隆、测序。f i s c h e r 和g o l d b e r g ( 1 9 8 2 ) 首次报道了三个高度同源的非等位大豆 球蛋白 基因，并命名为g y l , g y 2 和g y 3 。 这三个基因已 被定位于两个相应的染色 体区域， 其中g y l 和g y 2 位于n 连锁群，g y 3 位于l 连锁群 ( g a r n e r e t a l , 2 0 0 1 )。 s c a l i o n 等( 1 9 8 5 ) 首次报道了编码大豆球蛋白的g y 4 , g y 5 基因。此后d i e r s 等人 ( 1 9 9 3 ) 和c h e n 等人( 1 9 9 8 ) 分别将g y 4 和g y 5 定位于连锁群0 和f , 2 0 0 2 年， b e i i i n s o n 等( 2 0 0 2 ) 又 报道了 g y 6 及g y 7 基因， 其中 g y 6 基因为3 端缺陷型， 不能编码有功能 的大豆球蛋白，位于g 归下游，与g y l , g y 2 同属于n 连锁群。g y 7 基因串联于g y 3 基因3 端，与g y 3 同属于l 连锁群。现连锁群n . l 和f 都己被分别定位于第3 号 ( g a r n e r e t a l , 2 0 0 1 ) 、 第1 9 号( l e e e t a l , 2 0 0 0 ) 和第1 3 号染色体上( c r e g a n e t a l , 2 0 0 1 ) ， 仅连锁群0 还未定位到染色体上。 六种有功能的大豆球蛋白 基因各亚 基的特征见表工 。 表1大豆球蛋白 各亚基的特征 t a b l e 1 c h a r a c t e r i s t i c s o f g l y c i n i n s u b u n i t c7*g e n e黑 亚基 s u b a n i t 数据库注册号 d a t a b a s e a c c e s s i o n n u m b e r 分 m r 4 ell aie p 酸性多肤链碱性多肚链 a c i d i c p o l y p e p t i d e 分子皇 m r等电点i e p b a s i c p o l y p e p t i d e 奋 卜 了量m r等电点工 e p 799珊569姗951941 370309729790 叹凡f14.印， 3 3 , 1 6 1 3 2 , 1 3 6 3 1 , 7 1 8 4 0 , 6 8 7 3 6 , 3 9 2 3 7 , 3 3 5 2 0 , 4 8 1 2 0 . 3 2 7 2 0 , 6 1 l 2 0 , 6 2 6 1 9 , 0 5 0 2 0 . 3 5 9 578537522533姗63? c aa3 3 2 1 5 c aa3 3 2 1 6 人八d2 3 2 1 1 八 ab2 3 2 1 2 f ws yg3 af 31 9 7 7 7 94n刀 ，一.斗衬b : gigzg3g4份g7 111土n石勺nj vl刃州州vs 内ggg产u n i e l s e n 等( 1 9 8 9 ) 按照大豆球蛋白 基因c d n a 序列的同源性， 曾对g y 1 - g y 5 基因 的不同区域的序列进行了比较分析， 并将g y l , g y 2 和g y 3 分为第一类群， g y ,l 和g y 5 优质大豆球蛋白g y 7 基因克隆及转化烟草的研究 ( n i e l s e n , 1 9 8 4 ) 。大豆球蛋白的高级结构易受环境中p h 值和溶液离子强度的影 响。 在p h 7 . 6 ,离子强度为0 . 5 m 的条件下， 大豆球蛋白分子量为3 6 0 k d ，以六对 相同的亚基组成六聚体复合物形式存在。 在 p i ll8 时， 大豆球蛋白又卞要以分子 量为 1 8 0 k d的三聚体复合物形式存在。在 p h 7 . 6的条件下，离子强度从 0 . 5 m 降到小于0 . 1 m 时，六聚体大豆球蛋白也可解离成三聚体形式。 2大豆球蛋白基因家族 现己证实， 大豆球蛋白由多基因家族编码， 迄今为止已有七个大豆球蛋白基因被 克隆、测序。f i s c h e r 和g o l d b e r g ( 1 9 8 2 ) 首次报道了三个高度同源的非等位大豆 球蛋白 基因，并命名为g y l , g y 2 和g y 3 。 这三个基因已 被定位于两个相应的染色 体区域， 其中g y l 和g y 2 位于n 连锁群，g y 3 位于l 连锁群 ( g a r n e r e t a l , 2 0 0 1 )。 s c a l i o n 等( 1 9 8 5 ) 首次报道了编码大豆球蛋白的g y 4 , g y 5 基因。此后d i e r s 等人 ( 1 9 9 3 ) 和c h e n 等人( 1 9 9 8 ) 分别将g y 4 和g y 5 定位于连锁群0 和f , 2 0 0 2 年， b e i i i n s o n 等( 2 0 0 2 ) 又 报道了 g y 6 及g y 7 基因， 其中 g y 6 基因为3 端缺陷型， 不能编码有功能 的大豆球蛋白，位于g 归下游，与g y l , g y 2 同属于n 连锁群。g y 7 基因串联于g y 3 基因3 端，与g y 3 同属于l 连锁群。现连锁群n . l 和f 都己被分别定位于第3 号 ( g a r n e r e t a l , 2 0 0 1 ) 、 第1 9 号( l e e e t a l , 2 0 0 0 ) 和第1 3 号染色体上( c r e g a n e t a l , 2 0 0 1 ) ， 仅连锁群0 还未定位到染色体上。 六种有功能的大豆球蛋白 基因各亚 基的特征见表工 。 表1大豆球蛋白 各亚基的特征 t a b l e 1 c h a r a c t e r i s t i c s o f g l y c i n i n s u b u n i t c7*g e n e黑 亚基 s u b a n i t 数据库注册号 d a t a b a s e a c c e s s i o n n u m b e r 分 m r 4 ell aie p 酸性多肤链碱性多肚链 a c i d i c p o l y p e p t i d e 分子皇 m r等电点i e p b a s i c p o l y p e p t i d e 奋 卜 了量m r等电点工 e p 799珊569姗951941 370309729790 叹凡f14.印， 3 3 , 1 6 1 3 2 , 1 3 6 3 1 , 7 1 8 4 0 , 6 8 7 3 6 , 3 9 2 3 7 , 3 3 5 2 0 , 4 8 1 2 0 . 3 2 7 2 0 , 6 1 l 2 0 , 6 2 6 1 9 , 0 5 0 2 0 . 3 5 9 578537522533姗63? c aa3 3 2 1 5 c aa3 3 2 1 6 人八d2 3 2 1 1 八 ab2 3 2 1 2 f ws yg3 af 31 9 7 7 7 94n刀 ，一.斗衬b : gigzg3g4份g7 111土n石勺nj vl刃州州vs 内ggg产u n i e l s e n 等( 1 9 8 9 ) 按照大豆球蛋白 基因c d n a 序列的同源性， 曾对g y 1 - g y 5 基因 的不同区域的序列进行了比较分析， 并将g y l , g y 2 和g y 3 分为第一类群， g y ,l 和g y 5 优质人豆 球蛋白g y 7 基因克隆及转化烟草的研究 分为第二类群， b e i l i n s o n 等( 2 0 0 2 ) 按照大显球蛋白亚基的同源性，将g y 6 和g y 了 基因分为第三类群。 3大豆球蛋白的基因结构及碱基同源性分析 分析t 匕 较 g y l ( g e n b a n k x 1 5 1 2 1 ) 、g y 2 ( g e n b a n k x 1 5 1 2 2 ) , g y 3 ( g e n b a n k x 1 5 1 2 3 ) , g y 4 ( g e n b a n k a b 0 0 4 0 6 2 ) , g y 5 ( g e n b a n k a b 0 0 3 6 8 0 ) 和g y 7 ( g e n b a n k a f 3 1 9 7 7 6 ) 六种功能性大豆球蛋白基因的结构， 发现它们的结构组成相同， 均具 有四个外显子和三个内含子。陈三凤等( 2 0 0 0 ) 曾比较了来自 d a r e , r a i d e n , f o r r e s t 和w i l l i a m s 四个大豆品种的g y 4 基因。 其中w i l l i a m s 的g y 4 基因与d a r e 的g y 4 基因序列完全相同， 与r a i d e 。 的g y 4 基因有三个碱基的差异， 与f o r r e s t 差异最大， 但也只涉及到三个氨基酸的区别和一个氨基酸的缺失。 此现象表明同 一种大豆球蛋白基因在不同的大豆品种之间，碱基序列的差异性并不明显。 为了了解三类大豆球蛋白 基因的结构，我们利用v e c t o r n t i 软件比较分析 了这六种功能性大豆球蛋白基因的相应外显子和内含子的同源性 ( 见表2 ) 0 第一类群三种大豆球蛋白 总的外显子同源性比 较接近， 分别为9 0 . 5 % , 9 1 . 5 % 和8 9 . 8 % ， 其中g y l 与g y 3 之间外显子同源性略高于g y l 与g y 2 及g y 2 与g y 3 之 间的同源性。b e i l i n s o n 等( 2 0 0 2 ) 认为，在第一类群三种大豆球蛋白基因之间， g y l 与g y 3 之间遗传距离较近， 而g y 2 与g y l 和g y 3 之间遗传距离相对较远。 分 析第一类群三种大豆球蛋白内 含子平均同 源性分别为7 4 . 3 % , 5 4 . 0 % 和4 5 . 3 % ， 其 中g y l 与g y 2 之间的同源性明显高于g y l 与g y 3 和g y 2 与g y 3 。 尽管在内含子中 核昔酸的改变不会影响到多肤链氨基酸的组成， 然而在功能相近的两个基因中内 含子碱基之间的差异也是长期变异积累的一种表现。 如果同时考虑外显子和内含 子两方面，也许g y l 与g y 2 之间的遗传距离更近一些。 第二类群的外显子同源性介于7 7 % - 9 4 % ，平均为8 5 . 8 % ,比 第一类群三种大 豆球蛋白总的外显子同源性都低， 而且两者总的内含子同源性也较低。 这表明第 二类群两种大豆球蛋白 彼此之间分离的时间可能比第一类群三种大豆球蛋白 之 间的分离更早些口 分析第一和第二同类群中不同大豆球蛋白荃因的内含子之间的同源性， 变化 范围都非常大， 第一类群介于1 7 % - 9 9 % 之间， 第二类群介于9 % - 7 1 % 之间。 在第一 优质人豆 球蛋白g y 7 基因克隆及转化烟草的研究 分为第二类群， b e i l i n s o n 等( 2 0 0 2 ) 按照大显球蛋白亚基的同源性，将g y 6 和g y 了 基因分为第三类群。 3大豆球蛋白的基因结构及碱基同源性分析 分析t 匕 较 g y l ( g e n b a n k x 1 5 1 2 1 ) 、g y 2 ( g e n b a n k x 1 5 1 2 2 ) , g y 3 ( g e n b a n k x 1 5 1 2 3 ) , g y 4 ( g e n b a n k a b 0 0 4 0 6 2 ) , g y 5 ( g e n b a n k a b 0 0 3 6 8 0 ) 和g y 7 ( g e n b a n k a f 3 1 9 7 7 6 ) 六种功能性大豆球蛋白基因的结构， 发现它们的结构组成相同， 均具 有四个外显子和三个内含子。陈三凤等( 2 0 0 0 ) 曾比较了来自 d a r e , r a i d e n , f o r r e s t 和w i l l i a m s 四个大豆品种的g y 4 基因。 其中w i l l i a m s 的g y 4 基因与d a r e 的g y 4 基因序列完全相同， 与r a i d e 。 的g y 4 基因有三个碱基的差异， 与f o r r e s t 差异最大， 但也只涉及到三个氨基酸的区别和一个氨基酸的缺失。 此现象表明同 一种大豆球蛋白基因在不同的大豆品种之间，碱基序列的差异性并不明显。 为了了解三类大豆球蛋白 基因的结构，我们利用v e c t o r n t i 软件比较分析 了这六种功能性大豆球蛋白基因的相应外显子和内含子的同源性 ( 见表2 ) 0 第一类群三种大豆球蛋白 总的外显子同源性比 较接近， 分别为9 0 . 5 % , 9 1 . 5 % 和8 9 . 8 % ， 其中g y l 与g y 3 之间外显子同源性略高于g y l 与g y 2 及g y 2 与g y 3 之 间的同源性。b e i l i n s o n 等( 2 0 0 2 ) 认为，在第一类群三种大豆球蛋白基因之间， g y l 与g y 3 之间遗传距离较近， 而g y 2 与g y l 和g y 3 之间遗传距离相对较远。 分 析第一类群三种大豆球蛋白内 含子平均同 源性分别为7 4 . 3 % , 5 4 . 0 % 和4 5 . 3 % ， 其 中g y l 与g y 2 之间的同源性明显高于g y l 与g y 3 和g y 2 与g y 3 。 尽管在内含子中 核昔酸的改变不会影响到多肤链氨基酸的组成， 然而在功能相近的两个基因中内 含子碱基之间的差异也是长期变异积累的一种表现。 如果同时考虑外显子和内含 子两方面，也许g y l 与g y 2 之间的遗传距离更近一些。 第二类群的外显子同源性介于7 7 % - 9 4 % ，平均为8 5 . 8 % ,比 第一类群三种大 豆球蛋白总的外显子同源性都低， 而且两者总的内含子同源性也较低。 这表明第 二类群两种大豆球蛋白 彼此之间分离的时间可能比第一类群三种大豆球蛋白 之 间的分离更早些口 分析第一和第二同类群中不同大豆球蛋白荃因的内含子之间的同源性， 变化 范围都非常大， 第一类群介于1 7 % - 9 9 % 之间， 第二类群介于9 % - 7 1 % 之间。 在第一 优质大豆球蛋白g y 7 基因克隆及转化烟草的1 0 1 究 类群中， 内含子2 同源性都比较高，内含子1 和3 变化明显;而在第二类群中内 含子2 变化明显， 内含子 i 和3 同源性相对较高。 这一现象是否存在着某种规律 性，有待进一步研究。 表2大豆球蛋白 基因外显子 和内含子同 源性百分数 t a b e 2 c o mp a r i s o n o f h o mo g e n e i t y o f t h e g l y c i n i n g e n e s e q u e n c e s 基因对 g y f 龙y 2 g y i / g y 3 g y 2 / g y 3 g y i / g y 4 g y 2 / g y 4 g y 3 / g y 4 g y l / g y 5 g y 2 / g y 5 g y 3 / g y 5 g y 4 / g y 5 g y i / g y 7 g y 2 / g y 7 g y 3 / g y 7 g y 4 / g y 7 g y 5 / g y 7 外显 子i 内含子i 外显子2 内含子2 外显子3 内含了3 外显子4总外显子总内含 子 9 5 9 1 . 5 8 9 . 8 5 3 . 8 5 2 . 5 5 3 . 3 5 3 . 0 5 2 0 5 4 . 3 8 5 . 8 5 4 . 0 5 4 . 3 5 4 5 5 6 . 5 5 5 3 7 4 3 5 4 . 0 4 5 . 3 5 2 . 2 4 6 . 0 3 6 . 0 4 7 . 3 41. 0 3 4 . 0 5 0 . 0 5 7 . 0 4 6 . 7 3 5 . 3 5 7 . 7 3 5 . 7 男92944947钓49495080邪5756阶54 ，八乙尸no“n乙n曰q乙才任门飞1八mcn0n 通暇qj三，八j户口5乃judrjj共ij咔六j内 86898840424q36鸽犯77仍42414844 99邵834040肠2828309动4944巧13 扎91盯能62能66能幻能动的6361朋 8217比盯66部能悦况神72邓1359阴 引95906159能61朋翻叭驯59阳6061 4大豆球蛋白 基因的表达调控 n i e l s e n 等( 1 9 8 9 ) 认为，第一、 第二类群大豆球蛋白 基因在开花后2 5 天开始 转录， 5 5 天达到最大，9 1 天降到很低的水平， b e i l i n s o n 等( 2 0 0 2 ) 认为第三类群 的 g y 7 基因在种子中熟期表达。 n i e l s e n 等还证实m r n a 最丰富的时期也是蛋白 合成 最活跃的时期， 说明基因表达的调控主要发生在转录水平上， 他们还用幼嫩子叶 的细胞核进行体外转录实验， 证明大豆球蛋白基因的表达除了受转录水平的调控 之外还受转录后水平的影响， 因为 特定时期 m r n a 的 含量并不总是与转录速率绝对 一致。 大豆球蛋白各亚基基因与其他种子蛋白 基因相似， 它们的5 -u t r 区均具有 保守的顺式作用元件， 包括2 8 b p l e g u m i n b o x 5 -c a t g c a t g -3 r y 重复元件 以 及c a c a 成分等，对这些元件功能的研究已 较为深入。l i e v r e 等人( 1 9 9 2 ) 将5 -u t r 区的一些可能顺式作用元件与g u s 报告基因连接转化烟草，证明5 一 c a t g c a t g -3 元件对于控制基因表达的量具关键作用，属于增强子成分。工 t o h 等( 1 9 9 3 ) 在研究a , b ,n ( g 2 )亚基时发现包含l e g u m i n b o x 在内的一3 2 6 一 一 1 0 2 区 优质大豆球蛋白g y 7 基因克隆及转化烟草的1 0 1 究 类群中， 内含子2 同源性都比较高，内含子1 和3 变化明显;而在第二类群中内 含子2 变化明显， 内含子 i 和3 同源性相对较高。 这一现象是否存在着某种规律 性，有待进一步研究。 表2大豆球蛋白 基因外显子 和内含子同 源性百分数 t a b e 2 c o mp a r i s o n o f h o mo g e n e i t y o f t h e g l y c i n i n g e n e s e q u e n c e s 基因对 g y f 龙y 2 g y i / g y 3 g y 2 / g y 3 g y i / g y 4 g y 2 / g y 4 g y 3 / g y 4 g y l / g y 5 g y 2 / g y 5 g y 3 / g y 5 g y 4 / g y 5 g y i / g y 7 g y 2 / g y 7 g y 3 / g y 7 g y 4 / g y 7 g y 5 / g y 7 外显 子i 内含子i 外显子2 内含子2 外显子3 内含了3 外显子4总外显子总内含 子 9 5 9 1 . 5 8 9 . 8 5 3 . 8 5 2 . 5 5 3 . 3 5 3 . 0 5 2 0 5 4 . 3 8 5 . 8 5 4 . 0 5 4 . 3 5 4 5 5 6 . 5 5 5 3 7 4 3 5 4 . 0 4 5 . 3 5 2 . 2 4 6 . 0 3 6 . 0 4 7 . 3 41. 0 3 4 . 0 5 0 . 0 5 7 . 0 4 6 . 7 3 5 . 3 5 7 . 7 3 5 . 7 男92944947钓49495080邪5756阶54 ，八乙尸no“n乙n曰q乙才任门飞1八mcn0n 通暇qj三，八j户口5乃judrjj共ij咔六j内 86898840424q36鸽犯77仍42414844 99邵834040肠2828309动4944巧13 扎91盯能62能66能幻能动的6361朋 8217比盯66部能悦况神72邓1359阴 引95906159能61朋翻叭驯59阳6061 4大豆球蛋白 基因的表达调控 n i e l s e n 等( 1 9 8 9 ) 认为，第一、 第二类群大豆球蛋白 基因在开花后2 5 天开始 转录， 5 5 天达到最大，9 1 天降到很低的水平， b e i l i n s o n 等( 2 0 0 2 ) 认为第三类群 的 g y 7 基因在种子中熟期表达。 n i e l s e n 等还证实m r n a 最丰富的时期也是蛋白 合成 最活跃的时期， 说明基因表达的调控主要发生在转录水平上， 他们还用幼嫩子叶 的细胞核进行体外转录实验， 证明大豆球蛋白基因的表达除了受转录水平的调控 之外还受转录后水平的影响， 因为 特定时期 m r n a 的 含量并不总是与转录速率绝对 一致。 大豆球蛋白各亚基基因与其他种子蛋白 基因相似， 它们的5 -u t r 区均具有 保守的顺式作用元件， 包括2 8 b p l e g u m i n b o x 5 -c a t g c a t g -3 r y 重复元件 以 及c a c a 成分等，对这些元件功能的研究已 较为深入。l i e v r e 等人( 1 9 9 2 ) 将5 -u t r 区的一些可能顺式作用元件与g u s 报告基因连接转化烟草，证明5 一 c a t g c a t g -3 元件对于控制基因表达的量具关键作用，属于增强子成分。工 t o h 等( 1 9 9 3 ) 在研究a , b ,n ( g 2 )亚基时发现包含l e g u m i n b o x 在内的一3 2 6 一 一 1 0 2 区 忧质大豆 球蛋白g y 7 基因克隆及转化烟草的研究 域和- - 6 5 7 一一3 2 7 区域参与基因表达的数量调控， 还鉴定出与反式作用因子相互 作用的区域，同时鉴定了一些与a , b 。 的顺式作用元件作用的反式作用因子，也称 5 巨 f ，这些因子只在发育中期的早些时候出现。 大豆球蛋白各亚基的m r n a 是在与内质网结合的核糖体上转译合成蛋白质。 与 其它贮藏蛋白一样， 首先合成一段带信号肤的多肤链， 信号肤在内质网腔内被切 除， 然后继续翻译加工成为原大豆球蛋白。 原大豆球蛋白在内 质网腔内折叠并形 成三聚体， 在内 质网小泡内被运送至高尔基复合体中进一步加工， 在高尔基复合 体的反面形成前 液泡并在特定的 a s p - - g 场处被切开， 产生酸性和碱性多肤链， 两 条多肚链由二硫键相连原大豆球蛋白 被切开这一过程对于它形成六聚体贮藏蛋 白是必需的( j u n g e t a l , 1 9 9 8 ; d i c k i n s o n e t a l , 1 9 8 9 ) 。前液泡与蛋白质贮存 液泡融合， 贮藏蛋白在其内 沉积( e l i o t e t a l , 1 9 9 9 ) 。这种途径是典型的 “ 内 质 网一高 尔基复合体一液泡”内 膜加工途径。 分析各亚基的序列可以 发现其a s p - g 巧及形成二硫键的半肤氨酸也具保守性。最近，k i n n e y 等发现了正常内膜加工 途径以外的蛋白质加工途径， 即该转基因大豆子叶中的蛋白质可以由内质网小泡 直接形成蛋白体，然后蛋白 体与蛋白 质贮藏液泡融合( k i n n e y e t a l , 2 0 0 1 ) 。原 大豆球蛋白 在蛋白质贮藏液泡中被切开， 产生酸性和碱性多肤链， 两条多肤链再 由二硫键相连。 5大豆球蛋白的氨基酸序列组成 5 . 1氨基酸序列比 较分析 目 前已发现的六种有功能大豆球蛋白之间分子量是有差异的。 用v e c t o r n t i 软件比较分析g y l ( g e n b a n k x 1 5 1 2 1 ) . g y 2 ( g e n b a n k x 1 5 1 2 2 ) . g y 3 ( g e n b a n k x 1 5 1 2 3 ) , g y 4 ( g e n b a n k a b 0 0 4 0 6 2 ) , g y 5 ( g e n b a n k a b 0 0 3 6 8 0 ) 和g y 7 ( g e n b a n k a f 3 1 9 7 7 6 ) 六 种大 豆球蛋白 的 氨基酸 序 列( 图 1 ) ， 显 示不同 大豆球蛋白 之间有 较 多位点氨基酸是相同的。 这些保守的氨基酸序列对于大豆球蛋白高级结构的形成 可能是十分重要的。尤其是四 个保守的半肤氨酸 ( 图1 红色字并阴影显示) 对于 大豆球蛋白高级结构的形成和维持可能更是起着关键的作用。 在接近第四个半肤 氨酸处有两个高度保守的n g 氨基酸序列 ( 图1 下划线显示)，是大豆球蛋白亚基 前体剪切成酸性肤和碱性肤的位点( s c o t t e t a l , 1 9 9 2 )( 图1 )。 忧质大豆 球蛋白g y 7 基因克隆及转化烟草的研究 域和- - 6 5 7 一一3 2 7 区域参与基因表达的数量调控， 还鉴定出与反式作用因子相互 作用的区域，同时鉴定了一些与a , b 。 的顺式作用元件作用的反式作用因子，也称 5 巨 f ，这些因子只在发育中期的早些时候出现。 大豆球蛋白各亚基的m r n a 是在与内质网结合的核糖体上转译合成蛋白质。 与 其它贮藏蛋白一样， 首先合成一段带信号肤的多肤链， 信号肤在内质网腔内被切 除， 然后继续翻译加工成为原大豆球蛋白。 原大豆球蛋白在内 质网腔内折叠并形 成三聚体， 在内 质网小泡内被运送至高尔基复合体中进一步加工， 在高尔基复合 体的反面形成前 液泡并在特定的 a s p - - g 场处被切开， 产生酸性和碱性多肤链， 两 条多肚链由二硫键相连原大豆球蛋白 被切开这一过程对于它形成六聚体贮藏蛋 白是必需的( j u n g e t a l , 1 9 9 8 ; d i c k i n s o n e t a l , 1 9 8 9 ) 。前液泡与蛋白质贮存 液泡融合， 贮藏蛋白在其内 沉积( e l i o t e t a l , 1 9 9 9 ) 。这种途径是典型的 “ 内 质 网一高 尔基复合体一液泡”内 膜加工途径。 分析各亚基的序列可以 发现其a s p - g 巧及形成二硫键的半肤氨酸也具保守性。最近，k i n n e y 等发现了正常内膜加工 途径以外的蛋白质加工途径， 即该转基因大豆子叶中的蛋白质可以由内质网小泡 直接形成蛋白体，然后蛋白 体与蛋白 质贮藏液泡融合( k i n n e y e t a l , 2 0 0 1 ) 。原 大豆球蛋白 在蛋白质贮藏液泡中被切开， 产生酸性和碱性多肤链， 两条多肤链再 由二硫键相连。 5大豆球蛋白的氨基酸序列组成 5 . 1氨基酸序列比 较分析 目