（遗传学专业论文）果蝇aurora+b抑制模型的建立和在体（in+vivo）功能分析.pdf

中文摘要 果蝇a u r o r ab 在体功能的初步探讨 研究生：刘刑导师：谢维 东南大学基础医学院遗传学研究中心 摘要 近几年在对细胞有丝分裂过程的研究中发现，存在着一个动点蛋白的调控网络。 其中有一类蛋白家族一染色体乘客蛋白( a u r o r ab ，i n c e n p ，s u r v i v i n ，t d 一6 0 ) 在细胞有 丝分裂过程中扮演着重要的角色，是与染色体有效而又忠实的分离以及胞质分裂密切相 关的。研究表明，a u r 。r ab 是该乘客蛋白家族中唯一的一个具有丝氨酸苏氨酸激酶活 性的蛋白，目前已证实可与i n c e n p 以及s u r v i v i n 组成复合物来调控自身的活性，并通 过磷酸化下游底物来调控有丝分裂的进程。 为了能够进一步在体研究a u r o r ab 基因的功能，了解其在果蝇发育中的作用，首 先通过基因重组技术，在体外融合表达纯化a u r o r ab ( h i s ) 。蛋白，免疫动物后经 g s ta u r o r ab n 截短蛋白的纯化获得抗a u r o r ab 的多克隆抗体，经免疫印迹法鉴定结 果显示，该抗体在原核表达体系及果蝇组织中均可检测到目的蛋白，并有较好的特异性 和反应性。 运用转基因技术，我们选用了果蝇pe l e m e n t 改建的载体p w i z ，构建了重组质粒 p w i za u r o r ab d s r n a ，通过显微注射的方法，获得用于a u r o r ab 抑制表达的转基因果 蝇。基于g a l 4 一u a s 系统，选择不同的g a l 4 一品系果蝇与我们的转基因果蝇进行杂交。 结果显示，在d ag a l 4 或a c t i n g a i 。4 驱动抑制a u r o r ab 表达时，会导致9 0 以上的 果蝇蛹期致死，当转基因果蝇p w i z a u r o r ab d s r n a 与e y e l e s s g a l 4 杂交后，可以驱 动a u r o r ab 在果蝇眼睛成虫盘m f 前的细胞内沉默，结果显示5 0 的果蝇会致死，还 有5 0 的果蝇大部分表现为复眼的缺陷表型，通过扫描电镜和果蝇复眼切片的i e 染 色进一步表明，在果蝇眼睛成虫盘干涉a u r o r ab 后由于细胞分裂的异常，导致o m m a t i d i a 数目的减少以及排列规律的打破。在v g g a l 4 的驱动下抑制a u r o r ab 在翅膀成虫盘细 胞内的表达，会引起果蝇翅膀发育的异常，并且翅膀发育缺陷同复眼缺陷表型一样常表 现出不对称性。根据上述实验结果提示，果蝇a u r o r ab 激酶对果蝇的正常发育是必须 的，可能是通过调节细胞的分裂进而在果蝇的发育过程中扮演重要的角色。 本研究不仅为a m o r ab 蛋白研究的后续工作制备了有利的工具，还通过转基因果 蝇的建立，为在体分析及进一步研究a u r o mb 在有丝分裂调控网络中的作用蛋白奠定 了基础。 关键词：a u r o m b ；有丝分裂；转基因果蝇；i a i 英文摘要 s t u d yo nt h ef u n c t i o nd 加s 叩厅以白a u r o r abg e n e 觑v z v o p o s t - g r a d u a t e ：l i ul is u p e n 咕s o r ：x i ew e i g e n e t i c sr e s e a r c hc e n t e r ，s o u t h e a s tu n i v e r s i t ym e d i c a ls c h o o l a b s t r a c t m a n yd a t ao fr e c e n tr e s e a r c ho nc e nd i v i s i o ns h o wt h a tt h e r ei s a j li n t e r a c t i o na n d r e g u l a t o r y n e t w o r kb e t w e e nk i n e c h o r ep r o t e i n s a m o n g山o s ek i n e c h o r ep m t e i n s ， c 1 1 r o m o s o m ep a s s e n g e rp r o t e i n s ，i n c l u d i n ga u r o r ab ，i n c e np ，s u r v i v i n ，t d 一6 0e t c ，p l a y i m p o r t a n tr o l e si ns e v e r a la s p e c t so f c e l ld i v i s i o ns u c ha st h ep r e c i s ea n df a i t h f l l ls e p a r a t i o no f c h r o m o s o m e sa i l dc ) r t o k i n e s i s a u r o r abi st h eo n l ym e m e m b e ro fp a s s e n g e rp r o t e i nf a m i l y p o s s e s s i n gs e r 仃hk i n a s ea c t i v i t y r n a if o ra u r o r abo ri n c e n pp r o t e i nd r a m a t i c a l l y i n h i b i t e dt 1 1 ea b i l i t yo fc e l l st oa c h i e v ean o r n l a lm e t a p h a s ec h r o m o s o m ea l i g n r n e n t c e l l s o v e r e x p r e s s i n gs u r v i v i nh a v eh i g h e ra u r o r a bk i n a s ea c t i v i t y i 、h u sa u r o r abi n t e r a c t sw i t h n 、了c e n pa n dsu r 、，i v i nt of o m c o m p l e xt or e g u l a t ei t so w na c t i v i t ya n d c o n t m l st h ep r o c e s so f m i t o s i st f 啪u g hp h o s p h o r y l a t i n gi t ss u b s t r a t e s t bg e tm o r ei n s i g h to ft h ef u n c t i o no fd r o s o p h i l aa u r o r abi nv i v oa n di t sm l ei n d r o s o p h i l ad e v e l o p m e m ，t l l ea u r o r ab 一( h i s ) 6p r o t e i nw a se x p r e s s e d a 1 1 d p u r m e d i n l m u n i z e dr a b b i ta n dg e n e r a t e dt h es p e c i f i ca n t i b o d ya g a i n s ta u r o r aba r e rp u r i 矗c a t i o nw i t l l g s t a u m r abn t e m l i n a l 如s i o np r o t e i n w e s t e mb i o tr e s u l t ss h o wt h a tt h ea n t i b o d yw e g e n e r a t e dc o u l dd e t e c tt h ea u r o r abp r o t e i ne x p r e s s e di ne c 0 1 ia n dt i s s u e ，t h e nt h ev e c t o r f o rr n ai n t e 疵r e n c e ：p w i z - a 0 r ab d s r n aw a sc o n s 仰c t e d t h et r a 【l s g e n i cd r o s p h i l a l i n e sf o ra u r o r abk i l o c k d o w nw e r eg e n e r a t e dt h r o u 曲m i c r o 岫e c t i o n t h ec r o s sr e s u l t so f t r a n s g e n i cd r o s o p h i l a 肌dv a r i o u sg a l 4d r o s o p h i l ai n d i c a t c dm a t 山eu b i q u i t o u si n h i b i t i o n o fa u r o r abe x p r e s s i o nc a u s em o r et h a n9 0p e r c e n td r o s o p h i l aw a sl e t l l a ld u r i n go re a r l i e r t h a np u p a ls 切g e w h e nt h ee x p r e s s i o no fa 眦o r abw a ss p e c m c l yi n l l i b i t e di nt h ec e l l e s b e f o r em o r p h g e nf i 埘o w ( m f ) o fe y e a i l l l t e n ad i s c ，a r o u n d5 0 d m s o p h i l aw e r el e t h a l a i l d t h e r ew e r ed e v e l o p m e n ta b n o n i l a l i t yo fe y ei no t h e r5 0 d r o s o p h i l a t h es c 锄e re l e c t r i c m i c r o s c o p ea n a l y s i sa i l dh es t a i n i n go fd m s o p h i l ac o m p o u n de y es l i d er e s u l t ss h o w e dt h a t w h e na u r o r abw a si n t e r f e r e di ne y ed i s c s ，t h ea b n o m a i i t yo fc e ud i v i s i o nr e s u i t e di nt 王” d e c r e a s eo fo m m a t i d i an u i i l b e ra 1 1 dm ed e s t r o yo fo m m a t i d i aa r r a i l g e m e n t i n h i b i t i o no f a u r o r ab e x p r e s s i o ni nw i n gd i s cw i t ht h ed r i v eo fv g g a l 4c a u s ea s y m m e t “cd e v e l o p m e n t d e f e c to fw i n g s 1 址et o g e m e r ，t h e s ed a t ad e m o n s t r a t et h a ta u r o r abk i n a s ei sr e q u i r c df o r d r o s o p h i l ad e v e l o p m e n ta 口di tm a yb ea ne s s e n t i a lf k t o r l f o u 曲l ec o n t m lo fc e l ld i v i s i o n t h e s ew o r kg e n e r a t ep o w e r f u lt o o l sf o r 血r t h e rr e s e a r c ho na u m r abf u l l c t i o n ，山e i n t e m c t i o nn e t 、o r ko fc e l lc y c l er e l a t e dp m t e i n sa n dt h eg e n e t i cp a t h w a y ( s ) t l l a ta u r o r abi s i n v o l v e d k e yw o r d s ：a u r o r ab ，m i t o s i s ，t r a l l s g e n i cd r o s o p l l i l a ，r n a i l i 、1 t 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用 过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示了谢意。 研究生签名：塞：! 叠日期： 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内 容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可 以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研 究生院办理。 研究生签名： 主：i 碰：l 导师签名： 日期： 绪言 绪言 a u r o r a 是一类独特的丝苏氨酸激酶，主要参与细胞的有丝分裂和减数分裂的调节。 酵母基因组只编码个a u r o r a 激酶，i p l l p ，果蝇等后生动物编码a u r o r a a 和a u r o r a b 两种激酶，而在哺乳动物中则有a u r o r aa ，b ，c 三种亚族。目前实验已证实a u r o r ab 是和i n c e n p ，s u r v i v i n 构成一个复合物参与细胞分裂调控。当通过r n a 干涉技术破坏 该复合物后，会引起染色体凝集、染色体分离、纺锤体装配以及胞质分裂的异常。在果 蝇中，a u r o r ab 和a u r o r aa 在激酶催化活性区域的同源性较高，d m a u r o r aa 主要定 位在中心体处，d m a u r o r ab 在细胞分裂中期定位在着丝粒内部区域，后期定位于纺锤 体m i d z o n e ，到了末期则定位到m i d b o d y 。目前围绕d m a u r o r ab 的研究并不是很深入， 已有的实验结果表明它是和果蝇中另一个乘客蛋白i n c e n p 构成复合物，上游受到c d c 3 7 和h s p 9 0 的调控，当在体外s 2 细胞中抑制c d c 3 7 的表达，会影响a u r o r ab 的定位及激 酶活性。d m a u r o r ab 下游可以磷酸化组蛋白i 3 ，也因此一旦在s 2 细胞中沉默a u r o r a b ，会直接导致染色体浓缩及分离的异常并出现多倍体细胞现象。 转基因动物就是用实验方法将目的基因导入其基因组，使外源基因与动物本身的基 因整合在一起，并随细胞的分裂而增殖，在动物体内得到表达，并能稳定地遗传给后代 的一类动物。1 9 8 1 年，g o r d o n 和r u d d l e 第一次成功地将外源基因导入动物胚胎，创 立了转基因动物技术。1 9 8 2 年d r r p a l m i t e r 获得转基因小鼠。转入大鼠的生长激 素基因，使小鼠体重为正常个体的二倍，因而被称为“超级小鼠”。此后相继培育成功 了其他一些转基因动物。由于转基因动物是对多种生命现象本质深入了解的有效 工具，它将对整个生命科学产生全局性影响。因此，转基因动物技术在1 9 9 1 年第一次 国际基因定位会议上被公认是遗传学中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后的第四 代技术，被列为生物学发展史上1 2 6 年中第1 4 个转折点。 果蝇作为一个有效的模式生物具有生长周期短、子代繁多、染色体数少、养殖容易 等优点，并且其全基因组测序已完成。因此通过转基因果蝇的建立，运用基因组全序列 信息库、生物信息学分析以及分子生物学技术等在整体动物表型水平进行分析，为研究 基因功能及其表达调控、胚胎发育和人类疾病的分子机制提供了条件基础和技术手段。 果蝇a u r o r ab 体外实验己初步证实是与细胞有丝分裂密切相关的，但体外环境并不能 完全模拟体内的真实情况。因此，为了对该蛋白的功能进行深入研究，我们首先经r t p c r 获得果蝇a u r o r ab 的c d n a ，通过该蛋白的体外表达、纯化、动物免疫及抗血清的纯化， 得到了抗该蛋白的抗体，随后通过a u r o r a b 蛋白r n a i 转基因果蝇的建立，从整体或特 定组织水平对该蛋白激酶的功能进行体内实验分析及更深层次的探讨。这项工作不仅为 下一步实验制作了必备的工具，而且为在体研究有关该蛋白的后续研究建立了模式动物 平台并积累了必要的数据和经验，为在果蝇模型中研究细胞周期异常导致疾病奠定了基 础。 东南大学硕士学位论文 a u r o r a 激酶家族研究进展 细胞增殖是细胞生命活动的重要特征之，是通过细胞周期来实现的。一个细胞周 期即是一个细胞生命活动的全过程，即由一个亲代细胞变成两个子代细胞。细胞周期又 分为分裂间期( i n t e r p h a s e ) 和有丝分裂期( m i t o s is ) 两个相互延续的时期。分裂间期是 细胞增殖的物质准备和积累阶段，又可人为地分成g 1 期，s 期和g 2 期三个阶段，其中 g 1 期是d n a 合成预备期，主要是细胞生长及r n a 、蛋白质合成旺盛期；s 期是d n a 合成 期，与d n a 合成有关的酶及组蛋白含量达到最高点：g 2 期是有丝分裂准备期。因此， 细胞周期是高度有序的沿着g l s g 2 一m 运转，并周而复始。 高等真核生物的细胞周期是一个十分复杂的过程，处于细胞周期不同时期的细胞， 所表达的蛋白种类、数量都存在明显的差异，因此真核生物的细胞周期又是一个高度精 确并受到严格调控的过程，其中有丝分裂期就是处于这种状态下的一个重要的时相。一 旦细胞分裂过程发生紊乱，如染色体装配异常、染色体运动失调、遗传物质不能平均分 配到两个子细胞中等等，都会引起细胞的死亡，从而影响正常的生命活动。 细胞周期中参与调控细胞增值信号通路的蛋白很多，包括细胞周期依赖激酶 ( c d k s ) 、它的下游底物、c d k 抑制剂( c k i s ) 以及肿瘤抑制蛋白p 5 3 和r b 等等，这些蛋 白大部分参与g 1 和s 期的调控。细胞有丝分裂进程是受一系列蛋白磷酸化事件影响的， 其中蛋白磷酸酶和磷酸激酶可以通过可逆性磷酸化蛋白质来调节这一过程。目前研究的 较为清楚的参与有丝分裂事件的蛋白激酶是c d k l 和p l k l ( p o l ol i k e k in a s e ) 。 c d k l c y c l i n b 复合物可以触发细胞进入有丝分裂，p “l 在有丝分裂中调节马达蛋白。 最近又有一蛋白激酶家族一a u r o r a 激酶成为新的研究热点。a u r o r a 是一个丝氨酸苏氨 酸蛋白激酶家族，它参与调控细胞分裂进程中的许多环节，被认为与间期中心体、分裂 期微管、纺锤体的中间体等密切相关，还是控制多倍体细胞发生的关键调控者。此外， 在很多人恶性肿瘤中a u r o r a 蛋白的高表达也越来越引起人们的高度重视。最初， a u r o r a 的等位基因是在进行果蝇纺锤体极性( s p i n d l e p o l e ) 行为突变表型的遗传筛查 中发现的，也因此得名”1 。酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 基因组仅编码一个这样的 激酶，i p l l p ，同样是在缺陷表型的筛查中发现的，温度敏感突变如，括细胞，导致 多倍体细胞的发生，提示i p l l p 参与调节有丝分裂过程中的染色体分离”。多细胞动 物，如线虫( e p 卵仃曲、非洲爪蟾( 胎月印“曲以及果蝇( 口皿p 鲫p 驷s 旭r ) 中则分化为两 种具有明显功能差异的同源蛋白，a u r o r aa 和a u r o r ab ，而在哺乳动物中则有该家族 三个亚族，a u r o r aa ，a u r o r ab 以及a u r o r ac “1 。这三个哺乳动物的a u r o r a 激酶在序 列上非常相似，尤其在人a u r o r aa 和b 羧基端的催化区域同源性达到7 l ，在氨基端 的长度和序列上三者差异则较大，但仍可在n 一端差异中发现三个公认的保守区域一 a _ b o x i ，a 岫o x i i 以及a r b o x i i i ( 图1 ) 。目前对于这些b o x e s 的功能并不很清楚，有 可能是亚细胞定位和识别底物蛋白所必须的。由于这三个a u r o r a 亚家族结构的差异， 导致它们的定位与功能的不同。a u r o r aa 从中心体的复制到有丝分裂的结束，一直位 文献综述 于中心体及领近中心体的微管处。，a u r o r ab 是“染色体乘客蛋白”家族的一个成员， 在细胞分裂过程中呈动态变化，与i n c e n p ，s u r v i v i n 共同组成复合物来发挥调控作用 的，a u r o r ac ，目前研究还不是很多，但最近的文献报道它也是乘客蛋白家族的一员， 并在一些肿瘤组织中高表达”1 。 这里主要讨论a u r o r aa ，a u r o r ab 及a u r o r ac 三个成员在细胞分裂周期中的功能， 并对前两个激酶必要的下游因子以及如何作用于底物蛋白来调控细胞有丝分裂做一个 系统的阐述。 a u r o r aa a u r o r aa 和纺锤体的组装 a u r o r aa 定位于中心体和近中心体的微管上，在g 1 和s 期的表达量较低，峰值出 现在细胞周期的g 2 m 期，其激酶活性是细胞周期依赖的，并且已经证实磷酸化作用是 a u r o r aa 激酶活性所必须的。当通过r n a i 技术沉默线虫、果蝇中a u r o r aa 的表达 后，相应的会在线虫中破坏y t u b u l i n 募集到中心体处“”，在果蝇中同样也阻断了 dt a c c ( 微管动力蛋白) 及y t u b u l in 在中心体上的募集“，纺锤丝的微管因此将会减 少6 0 ，最终导致有丝分裂过程中微管及中心体形态的缺陷。然而，a u r o r aa 对这些 c e n t r o s o m i n 的招募并不依赖它自身的激酶活性，提示在这个过程，它参与了纺锤体微 管的装配。a u r o r aa 的调节是一个复杂的过程，包括磷酸化去磷酸化和降解。在用 x e n o p u s 卵提取物研究时发现，当体外激活重组x e n o p u sa u r o r aa 时，在丝氨酸5 3 、 苏氨酸2 9 5 以及s e r t i n e 3 4 9 都发生了磷酸化，这和人a u r o r aa 的磷酸化位点 s e r i n e 5 1 ，t h r e o n i n e 2 8 8 ，s e r t i n e 3 4 2 分别一一对映“，表明特定位点氨基酸的磷酸化 对于激活a u r o r aa 激酶活性是十分重要的。最早在人细胞中发现t p x 2 是a u r o r aa 互 作蛋白，随后对x e n o p u s 的研究也进一步证实纺锤体装配因子t p x 2 是a u r o r aa 激酶的 一个上游调控子，可通过竞争性抑制磷脂酶p p l 以及促进a u r o r aa 的自磷酸化调节 a u r o r aa 的激酶活性“3 “3 。降低t p x 2 的表达，或者增加非磷酸化的a u r o r aa 都会抑 制两级纺锤体的组装，由此断定a u r o r aa 的自磷酸化是有丝分裂纺锤体装配的关键事 件。 细胞有丝分裂晚期g 1 早期，许多蛋白在蛋白水解酶的作用下周期性降解。a u r o r a a 是通过a p c c d h l 降解的，它有两个区域可被a p c c d h l 识别，一个c 一端 d _ b o x ( d e s t r u c t i o nb o x ) 和一个n 一端很短的新的识别区域a - b o x ab o x 在所有的脊椎 动物中是很保守的，并且在爪蟾该区域包含了s e r 5 3 ，和人该区域s e r 5 1 等同。只有当 a - b o x 存在，d _ b o x 才有功能，磷酸化a u r o r aa 的a - b o x 可以抵挡a p c 介导的降解“。 最近a u r o r aa 的一个新的负调控蛋白a i p 被证实是保守的核蛋白，可能直接或以蛋白 酶依赖的方式下调a u r o r aa ，但具体功能还不很明确。 a u r o r aa 与肿瘤的发生 a u r o r aa 是原癌基因的一个候选者。它在许多肿瘤中都有过量表达”“，用转染 a u r o r aa 的细胞注射裸鼠可导致肿瘤，这依赖激酶的催化活性。最近研究显示当在人 查堕2 三堂堡主兰竺丝兰 以及啮齿动物细胞中过表达a u r o r aa ，导致非整倍体、中心体扩增以及转化细胞的异 常。该现象是由于打破了正常的胞质分离以及促进p 5 3 缺乏的细胞增多引起的“。事实 上我们知道，a u r o r aa 并不直接参与调控胞质分裂，可能性是由于过早的通过纺锤体 a _ b o x la - b 假l la - b o x i l l * a ur ac q w p l p v n g g q a q r v ls 雉s s q r 一一v p l 拜q k q k q l q 荟滑s a u r bq t a p s g l 8 t l p q r v le p v 零p s a b v l 一一q k v m e n s s a u r c s s p r a v v q lq t a q q p 8 s 图1 人a u r o r aa ，b ，c 的结构比较 m e t a s c a s i sr e v i e 、屿2 2 ：4 5 l 4 6 4 2 0 0 3 组装检验点而导致细胞分裂的异常“。过表达a u r o r aa 与表达无活性的a u r o r ab 会 产生很相似的表型，这可能是因为这两个激酶在激酶区有很高的同源性，二者均可以磷 酸化组蛋白h 3 的s e r l o 。a u r o r aa 还可以与g t p a s e 激活蛋白r a s g a p 形成三聚体复合 物。或许在有丝分裂的调控过程中，a u r o r aa 的过表达可以与a u r o r ab 竞争底物，从 而影响细胞正常的有丝分裂。 a u r o r ab a u r o r ab 是一种染色体p a s s e n g e r 蛋白，通过免疫荧光染色在哺乳动物细胞、线 虫以及果蝇细胞中对该激酶蛋白进行了定位，分裂前期到中期定位在内部着丝粒，分裂 后期到末期则由纺锤体的m i d z o n e 转移到m i d b o d y 。a u r o r ab 的表达峰值同a u r o r aa 一样也在g 2 m 期，并且激酶活性是细胞周期依赖的“。该乘客蛋白家族的另一个成员 i n c e n p 在很多真核生物中都有同源基因，与染色体的分离及胞质分裂是密切相关的。 a u r o r ab 与i n c e n p 构成一个稳定的复合体，并可调控i n c e n p 的定位及活性。s u r v i v i n 抑制凋亡蛋白( i a p ) 家族的一员，参与凋亡的抑制、有丝分裂和胞质分裂的调控，并和 a u r o r ab ，i n c e n p 一起构成复合物。当抑制或打破a u r o r ab 的复合物，染色体在纺 锤体上的列队、染色质蛋白( 特别是组蛋白h 3 ) 的磷酸化以及胞质的分裂都会出现异 常现象。 a u r o r ab 在染色体列队和分离过程中的作用 b u d d i n gy e a s t 仅有一个a u r o r a 激酶，i p l1 p ，与i n c e n p ，s u r v i v i n 的酵母同源物 s l i l 5 p 和b i r l p 共同组成一个复合物0 2 删。当突变i p l l 和s l i l 5 会导致姊妹染色单体 分离的异常，是由于染色单体不能正确定向到纺锤体上而形成单极染色体“”3 。因此在 酵母中，着丝粒相关的i p l l 复合体可能通过正确将微管装配到动粒来促进双极染色体 的形成。在果蝇细胞中干涉a u r o r ab ，i n c e n p 后，会影响染色体的列队、分离、后期进 程及胞质分裂“6 。在线虫中抑制a u r o r ab 复合物表达后可以观测到同样的细胞分裂 异常现象。因此a u r o r ab 复合物是染色体浓缩、列队、分离以及胞质分裂所必须的1 。 近来，有研究认为a u r o r ab 对染色体运动的调节是通过改变微管动态不稳定性来完成 的。当微注射a n t ia u r o r ab 抗体，极大的提高了星体微管的稳定性，相反降低了纺锤 体微管的浓度”。大鼠n r k 细胞过表达无催化活性的a u r o r ab 干扰微管的接触并引起 动粒中的d y n e i n 和c e n p e 的丢失，并影响m a d 2 正常定位到动粒“，而这些马达蛋白参 与动粒与微管的结合和动粒与纺锤丝接触点的信号通路。l l e s p e r a d i n ，一种小分子抑制 剂可以在体外抑制a u r o r ab 的活性，但对a u r o r aa 和a u r o r ac 则没有影响。用 n o c o d a z o l e 处理后的细胞中加入h e s p e r a d i n ，m a d 2 ，c e n pe 的表达水平并不受到影响， 而b u b r l 和b u b l 的水平下降。非常相似的结果也出现在s u r v i v n 抑制后的细胞。”。这 些数据表明，a u r o r ab 在修复微管装配错误中扮演重要角色。 最近，又有一个a u r o r ab 新的作用底物被证实。a u r o r ab 在体外可以磷酸化m c a k 氨基端5 个高度保守的丝氨酸位点，当体外模拟突变m c a k 的磷酸化位点，会降低微管 的解聚活性并显著增加了单极染色体的生成，此外r n a i 或表达无活性的a u r o r ab 也将 影响m c a k 在着丝粒处的装载。i c i s ，一种新的着丝粒内部蛋白可与a u r o r ab ，i n c e n p 以 及s k p l ( f - b o xb i n d i n gp r o t e i n ) 免疫共沉淀，并在体外证实也可以刺激m c a k 微管的 解聚活性。“。在b u d d i n gy e a s t 中，动粒靶向a u r o r a 激酶已研究的较为清楚，n d c l o 作 为一个主要的动粒蛋白，已证实是i p 】l 的底物。d a m l ，外部动粒复合物的一个成员， 还有c s e 4 动粒特异性组蛋白h 3 的变异体也受到i p l l 的调控。哺乳动物动粒特异性组 蛋白h 3 的变异体c e n p a 在体外证实在细胞分裂前期可以被a l l r o r a a 磷酸化，随后到 了前中期则受a u r o r a b 激酶的催化，并且c d 岬a 的磷酸化是a u r o r a b 在内部着丝粒 聚集及动粒功能所必须的【3 ”。在进化过程中，a u r o r ab 调节微管动态的功能可能是较 为保守的，但a u r o r ab 复合物、动粒一微管装配以及通过微管翻转所产生的拉紧状态， 是如何被纺锤体监督机制所感应的还需更深的探讨。 a u r o r ab 和胞质分裂 胞质分裂起始在分裂的后期，它必须和染色体的分离保持协同以确保维持一个完整 的基因组。a u r o r ab ，i n c e n p 复合物在胞质分裂过程中是必不可少的协同者，这在脊椎 动物、线虫、果蝇以及f i s s i o ny e a s t 中都已证实。过表达的大鼠催化失活活性a u r o r a b 可以阻止很多细胞系的胞质分裂，若突变的缺乏与a u r o r ab 结合区域的i n c e n p 也可 以发生类似的现象。线虫中，a u r o r ab 复合物是稳定募集c e m k l p l z e n 一4 的必要前提， c e m k l p l z e n 一4 是一种k i n e s i n 一相似蛋白，其功能是在m i d z o n e 处捆绑搭叠非线性的微 管o 。最近，m g c r a c g a p 也被确定为a u r o r ab 的底物。a u r o r ab 可以磷酸化该蛋白的 s e r 8 7 ，这种磷酸化使得m g c r a c g a p 将小g t p a s er a c 激活蛋白变为r h o a 激活蛋白，磷 酸化的m g c r a c g a p 与r h o 共定位到收缩环，r h o a 调节a c t i n 多聚化并对胞质分裂有重 要作用。细胞中过表达不能磷酸化的m g c r a c g a p ，分裂沟在晚期形成但是不能分成子细 5 东南大学硕士学位论文 胞，提示a u r o r ab 如果磷酸化m g c r a c g a p 发生异常，也会引起类似的结果1 。a u r o r ab 在分裂沟的特异性靶蛋白还包括三种i n t e r m e d i a t ef i l a m e n t s ，例如v i l l l e n t i n ，g f a p 以及d e s m i n 。突变a u r o r ab 与三种蛋白结合的位点，可以引起f i l a m e n t 组装及分离 的异常并最终阻断胞质分裂。7 3 “。总之，a u r o r ab 在细胞有丝分裂过程中可以协同 图2 酵母，脊椎动物动粒和着丝粒区域构造的比较 c u 丌e n to p 删o nl nc e l ib i o l o 剁2 0 0 3 ，1 56 7 2 _ 6 8 3 调控许多影响胞质分裂的因子，来确保胞质分裂的正常行进，包括通过调控微管动态有 选择的分割及通过激活小g t p a s e 和i n t e r m e 出a t ef 订a m e n t s 。 a u r o r ab 活性的调节 a u r o r ab 作为蛋白激酶，其活性一定受到严格的调控。在细胞有丝分裂的g 2 m 期，a u r o r ab 的表达到达最高，是细胞周期依赖的。尽管a u r o r ab 蛋白降解的精确时 问并不很清楚，但在分裂末期该蛋白水平明显急剧下降，并且这种降解可能是由a u r o r a bn 一端序列来介导的。a u r o r ab 激酶的活性也受到复合物的调节。i n c e n p 是微管结合 蛋白，含有一个不保守的氨基端，该区域对靶向到染色体和着丝粒是非常重要的。其 c 端是高度保守的i n _ b o x ，是i n c e n p 与a u r o r ab 结合的区域”1 。i n c e n p 既是a u r o r ab 的底物也可以正向调节a u r o r ab ，a u r o r ab 磷酸化i n c e n p 的i n - b o x ，并提高后者的活 性，可能是由于i n - b o x 区域磷酸化后改变了蛋白的结构，提高了激酶的活性。s u r v i v n ， 可以和a u r o r ab 的催化区域结合，在人细胞中缺乏s u r v i v n 后，a u r o r ab 对组蛋白 h 3 的磷酸化活性下降，因此s u r v i v n 不仅调控a u r o r ab 活性并影响a u r o r ab 在细胞 中的定位。另一个影响a u r o r ab 活性的因素是它自身在有丝分裂过程中的动态变化。 a u r o r ab 和肿瘤的发生 a u r o r ab ，i n c e n p ，s u r v i v i n 在有丝分裂中期到末期共同构成一个复合物，并且 a u r o r ab 激酶活性是受这个复合物调控的。在许多肿瘤中a u r o r ab 都有过表达。c h o 细 胞中过表达a u r o r ab 可以使组氨酸h 3 磷酸化水平提高，导致染色体分离和胞质分裂的异 常，产生异倍体子代细胞，从而在小鼠发生浸润性肿瘤。同样，在转化细胞系和许多肿 文献练述 瘤包括乳腺癌中s u r v i v i n 也有过表达。因此是否存在一种可能，肿瘤中a u r o r ab 激酶活 性的提高不仅仅是由于a u r o r ab 的过量表达，也可能是受到包括i n c e n p ，s u r v i v i n 或其 它还不清楚的复合物的调控。近来，研究表明组蛋白h 3 在s e r l 0 的磷酸化不仅和染色体 浓缩、分离有关，并且在哺乳动物细胞中还与p e r i c e n t r o m e r i ch e t e r o c h r o m a t i n 起始 有关“”。 果蝇a u r o r ab 的研究现状 果蝇a u r o r ab 又称为i a l 基因，在体外培养的果蝇s 2 细胞中通过r n a i 技术减少a u r o r a b 蛋白表达会引起胞质分裂的异常，并出现染色体浓缩及分离缺陷表型，这与突变果蝇 c o n d e n s i n 基因b a r r e n 后的表型一致“。这利，分离的异常是由于组蛋白h 3 磷酸化程度的 降低及不能招募b a r r e n 蛋白聚集到染色体上造成的。事实上，b a r r e n 突变后会出现明显 的染色质延迟现象，但同样突变果蝇另一个c o n d e n s i n 基因s m c 4 时，却没有该异常现象 发生。d mi n c e n p ，着丝粒内部蛋白已被证实是a u r o r ab 的主要底物，并与果蝇a u r o r ab 一同构成复合物。a d a m s 研究认为，d ma u r o r ab 是部分i n c e n p ，而不是全部i n c e n p 存有 丝分裂中定位所必须的，一旦沉默a u r o r ab 的表达，i n c e n p 在分裂早期还能正确定位到 染色体上，随后就不能在着丝粒处聚集和转移到m i d z o n e 及m i d b o d y 。同样，抑制i n c e n p 的表达后，a u r o r ab 也不能定位到染色体、m i d z o n e 及m i d b o d y 微管处。因此，染色体乘 客蛋白在有丝分裂过程中是相互依赖的。 c d c 3 7 是调控细胞周期不同阶段的许多蛋白激酶活性及稳定性所必须的。在果蝇中 突变c d c 3 7 会导致有丝分裂及精子减数分裂的异常，这和失活a u r o r ab 激酶活性后的表 型非常相似。实验显示a u r o r ab 与c d c 3 7 h s p 9 0 相互作用并是c d c 3 7 h s p 9 0 稳定所必须的， 此外c d c 3 7 h s p 9 0 复合物可以调节a u r o r ab 的功能，一旦在果蝇s 2 细胞中抑制c d c 3 7 ，会 引起a u r o r ab 的异常定位“。目前己证实c d c 3 7 是a u r o r ab 激酶的上游调控子。成功的 有丝分裂要求后期染色体能移动到纺锤体两级，这需要纺锤体能稳定的装配到动粒。在 分裂后期早期，纺锤体的装配依赖于姐妹动粒问的拉紧状态。当在果蝇胚胎表达不能降 解的c y c l i nb 蛋白，姐妹染色体能正常的分离，但分裂后期行为己异常。这是由于细胞 分裂后期a u r o r ab ，i n c e n p 两个相互作用乘客蛋白的共定位被c y c l i nb 的表达所阻滞， 而消除这种异常有丝分裂后期直接追随或与c y c l i nb 蛋白的降解相交迭”3 1 。因此，目前 的研究表明c y c l i nb 的降解是影响分裂后期染色体运动的一个重要因素。在未经处理的 细胞中，有丝分裂染色体总是表现高水平组蛋白h 3s e r l o 的磷酸化，一旦抑制a u r o r ab 或i n c e n p ，会降低组蛋白h 3 的磷酸化程度并导致畸型染色体，因此在果蝇细胞中a u r o r a b 至少是引起h 3 磷酸化的部分原因。”。此外，r n a ia u r o r ab 或i n c e n p 也会导致中心纺锤 体的组成异常，通过免疫染色发现该现象是由于p a v k l p 蛋白在中心纺锤体处显著下降 的缘故，但其蛋白总量并不受a u r o r abr n a i 的影响。p a v k l p 是一种k i n e s i n l i k e p r o t e i n ，是胞质分裂前纺锤体构建所必须的。因此a u r o r ab 在中