毕业论文--抗冷基因RLK的遗传转化研究.doc

本科生毕业论文（设计）中文题目 抗冷基因RLK的遗传转化研究 英文题目 Study on Genetic Transformation of Chilling Resistance Gene RLK 学生姓名 班级 5 学 院 植物科学学院 专 业 生物技术（植物） 指导教师 职称 教授 吉林大学学士学位论文（设计）承诺书 本人郑重承诺：所呈交的学士学位毕业论文（设计），是本人在指导教师的指导下，独立进行实验、设计、调研等工作基础上取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文（设计）不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本人实验或设计中做出重要贡献的个人或集体，均已在文中以明确的方式注明。本人完全意识到本承诺书的法律结果由本人承担。 承诺人 年 月 日中文摘要玉米是重要的粮食作物，种植范围广泛，世界三大著名玉米黄金带分别位于美国、墨西哥和中国。我国幅员辽阔，玉米种植形式多样，受地理因素影响，东北地区低温冷害频率较高，严重影响到玉米的产量和质量。随着玉米在工业和农业方面需求量的不断攀升，东北地区玉米遭受低温胁迫的问题亟待解决。低温冷害会诱导玉米ZmRLK基因的表达，并且表达量与低温处理时间成正比。RLK是富含亮氨酸重复跨膜区域的类受体蛋白激酶，在抗非生物胁迫方面发挥重要作用，ZmRLK过表达可以增强植株对冷害的耐受能力。本研究选用玉米自交系HiII的幼胚作为受体材料，将抗冷基因RLK用农杆菌介导法侵染转化导入幼胚，进一步培养，诱导形成胚性愈伤组织，再分化获得转化植株，进而提高玉米抗冷性，培育出能够抗冷的玉米新材料。主要研究结果如下：从HiII玉米果穗中接种幼胚，以农杆菌介导法进行侵染，经双丙氨膦多次筛选，获得382块抗性愈伤组织，分化后共获得抗性苗177株。经PCR分子检测，其中带有Bar基因的有21棵，阳性率约为11.9%；带有特异片段35S-ZmRLK的12棵，阳性率约为6.8%。本研究利用现代生物技术对玉米进行遗传改良，为进一步提高玉米抗冷性提供实验依据。关键词：玉米；RLK基因；幼胚；农杆菌介导法；遗传转化AbstractMaize is an important food crop, planting a wide range. The worlds three famous maize gold belt were located in the United States, Mexico and China. Chinas vast territory, maize planting in various forms, affected by geographical factors, the northeastern region of high frequency chilling injury frequency is high, seriously affecting the yield and quality of maize. With the increasing demand for maize in industry and agriculture, the problem of low temperature stress in maize in northeastern China needs to be solved urgently.The chilling injury induced ZmRLK expression, and the expression level was proportional to the low temperature treatment time. RLK is a leucine-rich transmembrane region-like receptor kinase, which plays an important role in the fight against abiotic stress. The overexpression of ZmRLK can enhance plant tolerance to chilling injury.In this study, the immature embryos of maize inbred line HiII were selected as the acceptor material, and the cold-resistant gene RLK was transformed into the immature embryo by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. The embryogenic callus was induced and transformed into the transformed plants. Thereby improving the cold resistance of corn, to cultivate new materials that can resist cold corn. The main findings are as follows:The immature embryos were inoculated from HiII maize and were infected by Agrobacterium tumefaciens, and 382 resistant calli were obtained by double-propylamine. A total of 177 strains of resistant seedlings were screened and identified by PCR. The results showed that there were 21 genes with Bar, 11.9% positive, 12 trees with 35S-ZmRLK, The positive rate was about 6.8%. In this study, the genetic improvement of maize was carried out by using modern biotechnology, and the experimental basis was provided to further improve the cold resistance of maize.Keywords: Maize; RLK ; Immature embryos; Agrobacterium-mediated method; Genetic transformationIII目录第1章 前言1第1节 研究背景1第2节 文献综述12.1 抗冷基因12.2 RLK基因22.3 玉米的遗传转化32.4 玉米遗传转化检测4第3节 技术路线及研究意义53.1 技术路线53.2 研究意义5第2章 实验材料6第1节 实验受体材料6第2节 菌株和表达载体6第3节 实验仪器及药品63.1 实验仪器设备63.2 药品试剂6第4节 培养基配方6第3章 实验方法8第1节 获取幼胚8第2节 农杆菌侵染82.1 配制农杆菌侵染液82.2 农杆菌侵染玉米幼胚9第3节 抗性筛选培养9第4节 分子检测104.1 CTAB法提取玉米叶片DNA104.2 PCR反应11第5节 结果与讨论125.1农杆菌侵染玉米幼胚125.2 PCR分子检测135.3 数据统计145.4 讨论15结论17致谢18参考文献19第1章 前言第1节 研究背景玉米（Zea mays L.）是一年生禾本科植物，是我国重要谷物之一。玉米自身含有很多有益人体的成分，如蛋白质、维生素和微量元素等，在生产、生活中用途十分广泛，不仅可用于食品和饲料加工，而且也是重要的工业原料，如用作生物燃料、发酵工业生产等，同时还在药品、纺织业、化妆品等方面发挥自身作用。随着现代工业的稳定发展和全球人口基数的不断增加，在生产生活中人们对玉米的需求与日俱增。植物生长离不开适宜的环境条件，温度对植物生长发育的影响不容忽视。低于最低温度，植物所受的危害称为冷害1。低温冷害会产生多种不利影响：不仅会抑制植物的呼吸和光合作用，引起细胞能量胁迫，还会干扰植物的代谢反应；同时对水的透性降低，造成生理干旱，严重时可使植株生长迟缓甚至死亡。玉米是需较高温度和较强光照才能正常生长发育的喜温喜光植物，在遭受低温冷害时抵抗力相对较差。冷害严重时不仅影响发芽，还有可能使种子出现发霉腐烂现象。在中国的东北和华北地区低温冷害发生频率较高，每隔3-5年就有一次一般性的低温冷害，造成玉米减产5%-15%；每5-10年有一次严重冷害，造成玉米减产15%以上2。东北地区玉米一年只有一季，低温冷害会严重威胁到玉米的质量与产量。因此，提高玉米的抗冷能力、培育玉米抗冷材料意义深远。第2节 文献综述2.1 抗冷基因在遭遇低温冷害时，玉米植株会进行自我调节，进行一系列相应的结构和代谢变化来适应低温，提高自身抗冷性。调节期间植株自身ABA含量增加，束缚水比例升高，自由水比例减少，细胞膨压恒定，降低植株体内的蒸腾和结冰，有利于提高玉米的抗冷性；呼吸代谢整体减弱，促进糖分积累；诱导蛋白的形成，如Ca2 +调控基因表达蛋白等，同时与抗冷功能有关的某些酶表达加强，增强玉米抗冷性。玉米植株在遭受低温冷害时，会产生大量的活性氧。为减少活性氧对植株的危害，玉米会启动保护酶系统，SOD、CAT 同 APX在清除过程中发挥了重要的保护作用3。目前已从普通小麦品种中克隆出SOD、CAT、APX、GR、CBF和GI等几个抗冷相关基因的c DNA片段4。COR( Cold-regulated)基因主要作用于合成低温诱导蛋白，小麦的WCS120和WCS200、拟南芥的RCI1和RCI2、大麦的blt63、苜蓿的SM2201和SM2358 等都是低温诱导基因，能够使细胞表现出抗寒力5。在玉米中，低温可诱导玉米 ZmCDPK1、ZmCLC-D、ZmFAD8、Mlip15、ZmRLK 、ZmMAPKKK和ZmMKK1等表达6-7。其中ZmCLC-D、 ZmMAPKKK和 ZmRLK 基因强烈表达，并且表达量与低温处理时间成正比。同时在低温条件下玉米Zm DBF和 ZmDREB2A等转录因子基因也会表达 8-10。2.2 RLK基因受体蛋白激酶(Receptor Protein Kinase ,RPK)参与动物细胞信号转导过程，在植物中发现与RPK结构相似的蛋白,由于大部分没有被证实有受体功能以及未发现相互作用的配体，因此命名为类受体蛋白激酶(receptor-like kinase ,RLK)。目前，在多种植物中发现大量RLK的存在，如玉米、水稻、拟南芥、胡萝卜、大豆等。拟南芥中已经发现超过610个编码类受体蛋白的基因，1000多个类受体蛋白激酶；水稻中发现超过1400个类受体蛋白激酶11-13。植物类受体蛋白激酶位于细胞膜上，在结构上分为三部分：胞外结合域主要是识别和接受外界信号；跨膜结构域将胞内和胞外结构域连接并将蛋白进行绑定，使信号可以从胞外传递到胞内；胞内激酶结构域能够激活胞内的级联反应，通过磷酸化和去磷酸化作用调控下游的靶蛋白，进而调控植物的生长发育。玉米抗冷基因ZmRLK，全长由2028bp核苷酸序列组成，编码675个氨基酸14。这类激酶是富含亮氨酸重复跨膜区域的类受体蛋白激酶（Leucine-rich repeat receptor-like protein kinases, LRR RLKs），胞外结构域富含亮氨酸，LRR基序具有 Lxx Lxx Lxx Lx Lxx Nx LVGx IP 的保守序列14。目前,已经克隆出拟南芥中的CLV1-315、FLOR116、RPK117、TMK118等，水稻中Os RLK119 、Xa2120等RLKs家族基因。RLK不仅参与植物细胞信号转导，而且在调节植物生长发育、抗冷抗病等方面发挥重要作用。2.3 玉米的遗传转化2.3.1 玉米遗传转化方法(1) 农杆菌介导法农杆菌介导法的转化关键在于宿主为根癌农杆菌的Ti质粒。Ti质粒上有一段特殊DNA片段，能转移至植物细胞内并整合其染色体上，称为T-DNA，可用于遗传转化植物载体。Grimsly等首次利用农杆菌介导法将玉米条纹病毒的c DNA导入玉米中，直接证明了农杆菌能侵染玉米21。2001年，Zhao等以HiII 幼胚所诱导的愈伤组织为受体，利用农杆菌介导T-DNA成功转化玉米愈伤组织22。随后，农杆菌介导法被广泛应用于可进行组织培养的玉米基因型和生产中常用的骨干自交系，如H99、HiII、Mo17、A188和齐319等等。农杆菌介导法操作简单方便，遗传稳定性好，整合的外源基因多为单拷贝，不易发生重排，可转移大片段的外源DNA，集合多种优点，在植物遗传转化中应用广泛。(2) 电击法将外源DNA和宿主细胞混合，在高压电脉冲作用下，细胞膜会被瞬时击穿出现微孔，从而使外源DNA进入细胞。该方法对基因型的依赖较低。1986年Fromm 等人以玉米原生质体为受体，首次利用电击法转化获得愈伤组织23。1995年，Chowrira GM 等利用电击法成功将抗除草剂转入玉米中24。Shou等和Breusegem等分别将烟草中的MAPKKK( NPKI)、MnSOD 和 FeSOD 基因导入玉米中，Quan 等将大肠杆菌中的胆碱脱氢酶 bet A基因导入玉米中，都成功培育出抗冷性强的玉米品种5。(3) 基因枪法基因枪轰击法是利用高压气体，使目的基因附着在金属粒子上并高速射进受体植物的细胞、组织或器官。1999年，张秀君等以玉米幼胚和愈伤组织为受体，利用基因枪转化技术获得阳性植株25。2008年，徐立华等以玉米自交系鲁原341和齐319的愈伤组织为受体，利用基因枪法成功将AHAS基因导入玉米，并获得T0种子26。基因枪法不受受体材料限制，避开了原生质体再生障碍，植株基因突变率低，在水稻、玉米中应用较多。但基因枪法费用昂贵，遗传稳定性较差，转化频率低，应用技术有待进一步开发。(4) 花粉管通道法花粉管通道法是外源基因借助花粉管通道最后整合到植物基因组中的方法。一九七九年我国科学家周光宇首次提出并创立花粉管通道法。王秀君等以玉米自交系X90为受体，利用花粉管通道法获得含耐草甘膦基因m G2-epsps 的玉米植株，经过抗性筛选、分子检测后确定获得转化植株27。花粉管通道法费用低廉、操作方便，不需经过组织培养，转化频率高；但存在受大田环境影响等缺点。2.3.2 玉米遗传转化受体材料幼胚、愈伤组织、原生质体、成熟胚以及种质均可作为玉米遗传转化的受体材料，此外也可用直接分化再生系统获得转化植株。未成熟胚是目前应用最广泛的受体材料，其经过脱分化形成愈伤组织，再分化获得植株。多选用黄色或乳黄色、结构松散易碎的颗粒状愈伤组织，能够保持胚性，生长速度快，扩增繁殖能力强，遗传稳定性好。实验操作过程简单方便，转化率和成活率均较高。相对于未成熟胚来说，成熟胚、原生质体、花药等实验操作过程繁琐复杂，遗传稳定性差，还可能出现基因丢失状况，目前应用较少。2.4 玉米遗传转化检测玉米遗传转化的分子检测方法有很多，以目的基因为检测目标，有Southern检测、Northern检测、PCR检测、基因芯片等；以蛋白质为检测目标，有Western检测、酶联免疫法、试纸条检测、蛋白芯片等。PCR 技术用于体外快速扩增特定DNA序列，在玉米遗传转化检测中发挥重要作用。检测过程中通过特异引物进行扩增，能够初步确定阳性植株。PCR 技术操作方便快速，但是检测的植株假阳性率高，因此对PCR 检测呈阳性的植株，还需进行进一步的分子验证。Southern 杂交技术以碱基互补配对为基本原则，准确性非常高，用来检测外源DNA是否存在，从而确定外源基因整合到基因组的情况。Northern 杂交能够确定外源基因是否在受体细胞内被转录，可以有效降低PCR的假阳性。Western杂交是从翻译水平检测遗传转化结果，通过 Western杂交能够确定外源基因是否能在受体细胞内最终被翻译成蛋白质，从而发挥基因的功能28。利用Bar基因作为筛选标记基因目前已得到了广泛的应用。Bar基因是从链霉菌中分离获得的。将Bar基因作为筛选标记基因与目的基因构建到同一载体上，再进行遗传转化，培养后期进行筛选鉴定，能存活下来就间接表明外源目的基因已进入受体细胞中。该方法准确性高，作用效果明显。目前，已有多种作物成功导入Bar基因，如马铃薯（1994年）29、水稻（1995年）30、玉米（1996年）31、大麦（1996年）32、小麦（1997年）33、燕麦（1998年）34、烟草（1999年）35以及棉花35、荞麦35、西红柿35等作物。第3节 技术路线及研究意义3.1 技术路线3.2 研究意义本研究选用玉米自交系HiII的幼胚作为受体材料，将抗冷基因RLK用农杆菌介导法侵染转化导入幼胚，进一步培养，诱导形成胚性愈伤组织，再分化获得转化植株，进而提高玉米抗冷性，培育出能够抗冷的玉米新材料。本研究为进一步研究ZmRLK基因在玉米中的抗冷功能奠定了实验基础。第2章 实验材料第1节 实验受体材料采用本实验室选育的玉米自交系HiII作为受体材料，选取授粉后12-14天的幼胚作为侵染材料进行遗传转化。第2节 菌株和表达载体菌株：根癌农杆菌菌株 EHA105 （本实验室保存）表达载体：植物过表达载体p CAMBIA3301-35S-ZmRLK （本实验室保存） 第3节 实验仪器及药品3.1 实验仪器设备超净工作台、低温高速离心机、水浴锅、PCR仪、紫外分光光度计、恒温振荡摇床、分析天平、冰箱等。3.2 药品试剂肌醇、水解酪蛋白、天门冬氨酸、L-脯氨酸、2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、叶酸、甘氨酸、生物素、6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）、IBA（3-吲哚丁酸）、NAA（萘乙酸）、卡那霉素、利福平、DL2000 Marker、r Taq 酶、Ex Taq 酶，购于上海生工生物工程公司；琼脂糖，购自博跃公司；蔗糖、琼脂粉、无水乙醇、75 %乙醇、NaOH、甘露醇、EDTA（乙二酸四乙酸钠）、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、酵母提取物、Tris（三羟甲基氨基甲烷）等。第4节 培养基配方（1）YEP 液体培养基（pH=7.0）：5 g/L 氯化钠+5 g/L 酵母提取物+10 g/L 胰蛋白胨。（2）YEP 固体培养基(pH=7.0)：5 g/L 氯化钠+5 g/L 酵母提取物+10 g/L 胰蛋白胨+15 g/L 琼脂。（3）继代培养基(pH=5.8-6.0)：改良 MS有机+ N6微量+ N6大量+铁盐+0.6 g/L L-脯氨酸+0.2 g/L 天门冬氨酸+ 0.5 g/L 酸水解酪蛋白+2 mg/L 2,4-D +肌醇+叶酸+6 g/L 琼脂+30 g/L 蔗糖。（4）诱导培养基（pH=5.8-6.0）：改良MS有机+ N6微量+N6大量+铁盐+0.6 g/L L-脯氨酸+0.2 g/L 天门冬氨酸+0.5 g/L 酸水解酪蛋白+2 mg/L 2,4-D+肌醇+6 g/L 琼脂+30 g/L 蔗糖（5）共培养培养基（pH=5.8-6.0）：改良MS有机+N6微量+N6大量+铁盐+0.5 g/L 酸水解酪蛋白+肌醇+叶酸+6 g/L琼脂+30 g/L蔗糖+0.4-0.6 g/L头孢霉素。（6）分化培养基（pH=5.8-6.0）：改良MS有机+ N6微量+N6大量 +铁盐+0.6 g/L L-脯氨酸+0.2 g/L 天门冬氨酸+ 0.5 g/L 酸水解酪蛋白+肌醇+叶酸+6 g/L 琼脂+30 g/L 蔗糖。第3章 实验方法第1节 获取幼胚（1）HiII玉米材料采用套袋方式进行人工授粉，12-14天后选取果穗完整的的玉米。（2）将超净工作台和相应工具进行消毒灭菌15-20分钟，灭菌完成后剥开玉米果穗上的苞叶，用75%的乙醇消毒。从尖部开始用镊子纵穿玉米果穗穗轴，再用解剖刀进行削切，逐行从上到下削去种皮和三分之一的胚乳。（3）挑取幼胚，长度大约在1-1.5毫米。将幼胚接种到预培养基上，盾片向上，在25下进行暗培养3天以备用。第2节 农杆菌侵染2.1 配制农杆菌侵染液（1）根癌农杆菌放置在-80超低温冰柜中保存。将带有目的基因RLK的根癌农杆菌从冰柜中取出，于室温下解冻，利用平板划线的方式接种到YEP 固体培养基上，将培养基放置在恒温培养箱中，温度设为28，培养约28小时，以便挑取单菌落。（2）菌液小摇：事先配制的 YEP 液体培养基中加入适量卡那霉素和利福平，称量5 mL的YEP 液体培养基置于空三角瓶中。挑取固体培养基上的单菌落接种到YEP 液体培养基中，在28下200rpm振荡培养10小时。（3）从三角瓶中量取约2 L的菌液，进行 PCR分子检测，根据电泳结果鉴定正确的农杆菌菌液。（4）菌液扩摇：事先配制的含有适量卡那霉素和利福平的YEP 液体培养基，称量50 mL置于空三角瓶中。将步骤（3）中正确的菌液接种到该YEP 液体培养基中, 在28恒温培养振荡器中，200rpm 振荡培养10-12小时。（5）在扩摇振荡期间，多次用紫外分光光度计测定OD600。特别是扩摇后期，要缩小测量时间间隔，避免OD600过大，影响实验进度。（6）收集菌体：当OD600=0.8-1.0时，将菌液集中到离心管中，5000rpm 离心20分钟。（7）在超净工作台中倒掉离心管中的上清液，在农杆菌沉淀中加入重悬液（含AS浓度100M）进行重悬，使重悬液达到 OD600=0.5-0.6以备用。2.2 农杆菌侵染玉米幼胚（1）在超净工作台中，将配制好的菌液倒入空三角瓶中，加入预培养3天的幼胚。幼胚数量多的，可分装在多个含有菌液的三角瓶中。（2）将含有幼胚的三角瓶放置在恒温振荡培养箱中，温度设为28，150 rpm振荡培养 20-30分钟。（3）用镊子小心取出菌液中的幼胚，轻轻地平铺在已灭菌的滤纸上，等待一段时间，以便滤纸吸干幼胚表面上残留的菌液。（4）将共培养培养基表面铺上一层圆形滤纸（已灭菌），然后将幼胚接种到培养基的滤纸上，在25下进行暗培养3天。（5）暗培养3天后转移到恢复培养基上，于25下进行散光培养15天。期间有的幼胚会长出不定芽，应及时拔掉不定芽再放回恢复培养基中。第3节 抗性筛选培养（1）幼胚在恢复培养阶段会逐渐诱导形成初级愈伤组织。在该阶段内即可进行抗性筛选，通常在培养基中加入3 mg/L的双丙氨膦进行筛选。（2）恢复培养15天后，经抗性筛选很多幼胚褐化甚至死亡，没有褐化的幼胚会形成初级愈伤组织。（3）初级愈伤组织形成后进行继代培养。将愈伤组织转移到继代培养基中，在25下进行散光培养，每15-18天继代一次。该阶段利用双丙氨膦多次进行抗性筛选。（4）继代2-3次后，可得到稳定胚性愈伤组织。将其接种到生芽分化培养基中，温度保持在24，每天光培养16小时，暗培养8小时，光照强度7500lux。（5）一至两周后会出现绿芽点，约20-25天后会长出幼芽。同一块愈伤会长出多棵绿芽，期间可根据出芽情况对愈伤进行切割、分苗。（6）待成苗后转入生根分化培养基中使其生根，当转化植株大约有3-4 条根并且长出侧根时，可开始炼苗。（7）将每一棵转化植株用号码标记，剪取绿色叶片3cm左右，准备进行分子检测及分析。第4节 分子检测4.1 CTAB 法提取玉米叶片DNA（1）将CTAB（2%）事先预热至65备用。将无水乙醇放至冰箱事先预冷。（2）将研钵和研磨棒用液氮预冷，将玉米叶片放入研钵中，加液氮后立即研磨玉米叶片至粉末状。（3）将1.5 mL离心管事先编号，将已有编号的玉米叶片粉末转移至对应号码的离心管中，加入事先预热的CTAB（2%）提取液600 L，用力拍打摇晃离心管，使管内物质充分混匀。（4）将所有离心管放入65水浴锅中恒温水浴1小时，期间每隔10分钟拍打摇晃一次离心管，使管内的物质充分裂解。水浴完成后冷却2分钟。（5）加600 L异戊醇：氯仿（1:24）混合液于离心管中，盖紧离心管管盖，轻轻颠倒混匀2-3次，室温静置5分钟。（6）将离心管进行高速离心，12000 rpm 离心10分钟。为避免吸取到沉淀，事先将完好的黄色枪头剪掉尖端上部，然后吸取上清液，将上清液转移至新的标有相同编号的1.5 mL离心管中。（7）重复步骤（5）、（6）一次。（8）向离心管中加入步骤（1）中预冷的的无水乙醇1 mL，盖紧离心管管盖，轻轻翻动混匀，然后放入-20冰箱内1小时。（9）将离心管从冰箱取出，12000 rpm 离心10分钟。然后慢慢倒掉上清液，将离心管管底的DNA保留。（10）加入1 mL75%的乙醇，盖紧离心管管盖，上下颠倒两次，室温静置5分钟。再进行高速离心，慢慢地倒掉上清液。再加一次1 mL75%的乙醇，静置，离心，弃上清。（11）经乙醇洗涤沉淀两次后，会发现离心管内有絮状沉淀。将所有离心管倒置在干净滤纸上晾干（约30分钟）。（12）加入50L的dd H2O（含1L RNAase A），在37下恒温培养1小时。（13）DNA 充分溶解后放入-20冰箱贮藏备用。4.2 PCR反应利用PCR对每一棵抗性玉米植株进行分子检测。本实验中PCR的引物有两种，一是Bar 基因引物，二是RLK的特异序列检测引物（35S-RLK片段）。模板是提取的所有玉米叶片DNA。分子检测所需引物序列见表3.1；PCR反应体系见表3.2； PCR反应程序见表3.3。表3.1 PCR所需引物序列Table 3.1 PCR required primer sequence引物名称引物核苷酸序列Bar-F5-GTCTGCACCATCGTCAACC-3Bar-R5-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-335S-ZmRLK-F5-GACGCACAATCCCACTATCCTT-335S-ZmRLK-R5-GTGGCATAGCCCATAGTTCTTC-3表3.2 PCR反应体系Table 3.2 PCR Reaction System体系成分用量Ex Taq 酶12.5 Ldd H2O9.5 L模板 DNA2 LForward Primer（10M）0.5 LReverse primer（10M）0.5 LTotal25 L表3.3 PCR反应程序Table 3.3 PCR Reaction Procedures反应温度及时间955min9530s5830s35 cycles721min7210min4forever第5节 结果与讨论5.1 农杆菌侵染玉米幼胚从HiII玉米果穗中接种800个幼胚，利用农杆菌介导法侵染，幼胚在恢复培养时期通过双丙氨膦进行抗性筛选，共形成抗性愈伤组织382块。愈伤组织在继代过程中，进行了多次双丙氨膦筛选，切除了褐化的愈伤组织，保留颜色乳黄、结构松散的愈伤组织。继代间隔时间为15-18天，通过切割愈伤组织进行扩繁。经2-3代后接种到分化培养基，经分化培养获得抗性苗177株。主要过程如图3.1。图3.1 玉米遗传转化主要过程Figure 3.1 The main process of maize genetic transformation 5.2 PCR分子检测用过表达载体上的 Bar 基因引物与特异片段引物 35S-ZmRLK-R 和35S-ZmRLK-F对提取的DNA进行PCR检测。对玉米转化植株进行 PCR，扩增 Bar 基因，再进行琼脂糖凝胶电泳，部分结果如图3.2。通过图片可见在样品泳道444 bp处出现了多条亮色的条带，与阳性对照进行对比，结果一致，证明Bar基因的扩增成功。 图3.2 部分玉米转化植株Bar基因检测电泳图Figure 3.2 Partial maize transformation plant Bar gene detection Electrophoresis chart注：M：DL2000 Marker；1：空白对照（水）；2：阳性对照（质粒）；3-15为样品DNANote: M: DL2000 Marker; 1: blank control (water); 2: positive control (plasmid); 3-15 for sample DNA用35S-ZmRLK-R 和35S-ZmRLK-F特异片段引物对提取的DNA进行PCR，再进行琼脂糖凝胶电泳，部分结果如图3.3。通过图片可见在样品泳道中出现了多条亮色的条带，与阳性对照928 bp 处的亮色条带进行对比，结果一致。图3.3 部分玉米转化植株 35S-ZmRLK 检测电泳图Figure 3.3 Partial maize transformation plant 35S-ZmRLK detection electrophoresis chart注：M：DL2000 Marker；1：空白对照（水）；10：阳性对照（质粒）；2-4,5-9,11为样品DNANote: M: DL2000 Marker; 1: blank control (water); 10: positive control (plasmid); 2-4,5-9,11 for sample DNA5.3 数据统计从HiII玉米果穗中接种800个幼胚，以农杆菌介导法进行侵染，经双丙氨膦筛选，获得382块抗性愈伤组织，分化后共获得抗性苗177株。经PCR分子检测，其中明显带有Bar 基因的有21棵，阳性率约为11.9%，带有特异片段35S-ZmRLK的12棵，阳性率约为6.8%。结果如表3.4。表3.4 玉米转化各过程数据统计Table 3.4 The data for each process of maize conversion幼胚抗性愈伤组织抗性率抗性苗带Bar的阳性苗阳性率带35S-ZmRLK的阳性苗阳性率80038247.8%1772111.9%126.8%5.4 讨论5.4.1 受体材料玉米幼胚具有较强的生活状态，组织培养效果好，愈伤诱导率高且再生植株能力最强，是进行遗传转化的良好受体材料。（1）幼胚易于产生胚性愈伤组织，获得的胚性愈伤组织具有较强的长期继代能力，利于开展遗传操作。（2）长度在一至二毫米的玉米幼胚最容易被农杆菌侵染，大大提髙了玉米遗传转化效率。（3）未成熟胚的盾片再生植株的能力很强，玉米幼胚可通过短时间的愈伤化而不经过愈伤组织阶段即可直接再生植株。大量的实践经验表明，玉米幼胚取材会受到生长季节的严格限制，需要在授粉后10-15天、幼胚大小为1-2毫米时利用,超过这个时期幼胚过大,转化效率会大大降低。幼胚诱导胚性愈伤组织受到基因型的限制，很多玉米骨干自交系胚性愈伤组织诱导率很低，甚至根本无法诱导出胚性愈伤组织。HiII是玉米遗传转化良好的受体基因型。HiII可诱导形成胚性愈伤组织，经继代以及再分化后有较强的再生能力，能分化出较多幼苗。幼胚作为受体材料受到一定限制，可通过幼胚诱导出的胚性愈伤组织作为理想的受体材料。（1）胚性愈伤组织受外界环境因素影响较小。（2）一个幼胚通过继代就能产生大量的胚性愈伤,而且愈伤可以长期继代保存。这样不仅满足了受体材料的供给,而且还不受季节性限制。5.4.2 转化率在抗冷基因RLK转入玉米幼胚的实验中，转化率受多种因素影响：（1）温度。植物在适宜温度下能够快速生长，在转化过程中尤其是共培养阶段，温度要保持在25，该温度利于农杆菌转入幼胚内，过高过低都会影响转化率。（2）菌液浓度。在侵染之前，要进行小摇和扩摇来获得适宜的菌液浓度。菌液浓度太低，菌体与幼胚的接触会受到限制；菌液浓度太高，不仅会伤害幼胚，还会难以抑制杂菌等。（3）无菌操作。每一步实验都要严格遵守操作规范，减少染菌的可能性。实验所用的工具、仪器等要进行消毒灭菌，共培养时所需的圆形滤纸等也要灭菌。农杆菌侵染后的培养基可加入适量浓度的头孢霉素，抑制杂菌或内生菌。5.4.3 菌类感染本实验后期发生了菌类感染。对于感染真菌的植物组织，大多难以挽救，及时将整个培养皿处理掉。对于培养皿中感染细菌的植物组织，进行分类处理：已经接触到菌落的，将植物组织在已加入适量头孢霉素的无菌水中漂洗；未接触到细菌菌落的，在超净工作台（无风条件下）中将其转移到新培养基中。本次研究分化后获得的抗性苗数量不多，与菌类感染有很大关系。结论通过农杆菌介导法将抗冷基因RLK成功转入玉米自交系HiII。侵染幼胚获得Bar基因阳性苗 21 棵；阳性率约为 11.9%，带有特异片段35S-ZmRLK的12棵，阳性率约为6.8%。致谢光阴荏苒，大学时光即将结束。四年的学习生活使我收获颇丰，无论是拓展知识还是体验实践，这段青春自由的时光总是让人难以忘怀。以毕业论文的完稿作为圆满句点，期间获得许多的关心和帮助，在此要向他们表达我最诚挚的谢意。首先要感谢基础生物系的吴颖老师，同时也是我毕业论文的指导老师。在整个论文的准备和写作过程中，吴颖老师给予了极大的关心和鼓舞。无论是选题、搜集资料还是文章结构，吴老师提出了许多宝贵的意见。在我完成初稿后，老师又在百忙之中抽出时间对我的论文进行了仔细修改。在此谨向吴老师表示我最诚挚的敬意和衷心的感谢！同时还要感谢植物科学学院的各位老师，是你们向我们传道、受业、解惑，教会了我们勤劳学习，老实做人，踏实做事，以宽容之心面对生活。各位老师渊博的专业知识、严谨的治学态度、无限的工作热忱给予我深深地启迪与影响，在点滴会聚中使我逐步构成成熟的人生观和价值观。特别感谢李倩师姐、张燕飞师兄、马宁师姐等在实验上的精心指导和帮助；感谢隋颂扬、周璐、鲁伟华等同窗好友的支持和帮助，在生活以及学习上无微不至的照顾和关心。最后，感谢我的父母及家人对我学业的支持与鼓励，是你们无私的爱与关怀让我不断前进。感谢一直以来关心我的大学好友、高中好友及儿时玩伴。感谢吉林大学植物科学学院的培养！感谢吉林大学对我的培养！参考文献1王忠植物生理学北京: 中国农业出版社，2008: 5355382中华人民共和国农业部，中国农业年鉴编辑委员会中国农业年鉴北京: 中国农业出版社，2011: 2182213Massacci A，Pietrini F，Loreto F，et al The effect of growth at low temperature on photosynthetic 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