（食品科学专业论文）灵芝发酵、富铁条件优化及栽培.pdf

摘要 灵芝是一种价值很高的食药用真菌。大量实验证明，灵芝代谢产物中的很多成分 如灵芝多糖、灵芝酸都具有明显的药理活性，有很好的治疗和保健作用。本文对韩 芝和黑芝发酵条件进行了优化，对黑芝多糖抗氧化活性和富集铁元素能力进行 了研究，并对灵芝栽培进行了探讨。 1 对韩芝液体发酵培养基的碳源、氮源、初始p h 、发酵温度和发酵时间进行了 条件优化，结果表明，韩芝液体最佳发酵条件为：葡萄糖4 ，玉米粉2 ，初始p h 6 0 ，发酵温度为2 8 ，发酵时间为7 d 。 2 正交试验得出，黑芝多糖提取的最佳工艺条件为：乙醇浓度8 0 、提取时间 1 9h 、p h5 5 ，各因素对黑芝多糖提取得率的影响程度由大到小依次为：乙醇浓度 提 取时间 p h 。在此条件下黑芝胞外多糖得率为5 2 3 4 3g m 。黑芝多糖浓度为4 0m g m l 时，对o h 与d p p h 自由基的清除率分别达到3 9 8 5 和2 3 4 ，表明黑芝多糖具有 明显的抗氧化活性。 3 对影响黑芝富铁的四个因子做了单因素实验。结果表明黑芝富集铁元素的最适 条件为；2 8 ，p h6 0 ，培养时间6d ，摇床转速为1 8 0r m i n ；在此条件下黑芝多糖 含量为5 1 0 l ，富铁率为0 3 8m g l 。 4 灵芝生长最适培养基：木屑7 2 ，玉米淀粉5 ，麦麸2 0 ，蔗糖1 ，石膏 粉1 ，磷肥1 。 关键词：胞外多糖发酵富铁栽培灵芝 f e r m e n t a t i o na n di r o n - e n r i c h e dc o n d i t i o n sa n dc u l t i v a t i o no f g a n o d e r m al u c i d u m a b s l r a c t g a n o d e r m al u c i d w ni saf a m o u sm e d i c i n a la n de d i b l ef u n g u sw i t hs p e c i a ln u l r i t i o n a la n d m e d i c i n a lv a l u e m a n ys r l d l e ss h o wt h a ts o m ec o m p o n e n t so fg a n o d e r m al u c i d u ms u c ha s p o l y s a c c h a t i d ea n dg a n o d e n i ca c i dh a v eg r e a tp h a m a a c o a y n a m i c sa c t i v i t i e s t h i sp a p e ri n v e s t i g a t e a f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fg a n o d e r m al u c i d u m , a n t i - o x i d a t i o na c t i v i t yo fg a n o d e r m aa m z m s e x o p o l y s a c d 均r i d e sa n di t sc u l t i v a t i o n 1 t h eg a n o d e r m al u c i d u mh gf l u i df e r m e n tc o n d i t i o n si n c l u d i n gc a r b o ns o u r c e ，n i t r o g e n s o u r c e ，p h , f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ea n dt i m ew e r ee x a n a i n e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a l c u l m r ec o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：c a r b o ns o u l x 冶- w a sg l u c o s ea n dc o n c e n l r a t i o nw a s4 ，n i t r o g e n s o l r o ev d d sc o m - s t e e p l i q u o r2 ，t h ep hw a s6 0 ，f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ew a s2 8 ，c u l t u r et i m ew 摊 7d 2 ag 册棚s w a i no fg a n o d e r m al u c i d w nw a ss e l e c t e df o ra c c u m u l a t i n gp o l y s a c c h a r i d e a n dt h eo p t i m a lm e d i u mf o rc , - a n a e n n aa r u mw d so p t i m i z e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t a ld e s i g r rt h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r e8 0 e t h a n o lc o n t e n t , e x t r a c t i o nt i m e1 9l l ，f e r m e n t f l u i dp h6 0 i no p f i m i z a t e dc o n d i t i o nt h ey i e l do fe x t m c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d ew a s5 2 3 4 3g l w h e n p o l y s a c c h a r i d e sc o n c e n t r a t i o nw a s4 0m g r 1 1 l ，t h es c a v e l l g i n ge f f e c to n t h eh y d r o x y lr a d i c a la n dd p p h r a d i c a lw e r e3 9 8 5o 6a n d2 3 4 r e s p e c t i v e l y i ts h o w e dt h a tt h ep o l y s a c c h a r i d eo fg 掀m aa m o n h a so b v i o u sa n t i - o x i d a t i o na c t i v i t y 3 s i n 百e f a c t o r t e s t w a s a p p f i e d t o a n n a l y z e t h e f e 2 十o f g a n o d e r m a a m e n t h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e o p t 硫u mc o n d i t i o n sw e r e2 8 ，p h6 0 ，6d c u l t u r et i m e ，s t i 硝n gs p e e da t18 0r p m 1 no p t m f i z a t e d c o n d i t i o nt h ey i e l do fe x w a c e l l u l a rp o l y s a c e h a r i d ev c d s5 1 0g ma n dr 广o f a m o nw a s0 3 8 m 班 4 t h eo p t i m a lg r o wc o n d i t i o n so f g a n o d e r m al u c d u mw e r ef l sf o l l o w s ：s a w d u s t7 2 ，c o r n s t a r c h5 ，w h e a tb r a n2 0 ，s u c r o s e1 ，g y p s u mp o w d e r1 ，p h o s p h a t e1 k e y w o r d ：e x o p o l y s a c c h a f i d e s f e r m e n t a t i o ni r o n - e n r i c h e dc u l t i v a t i o ng a n o d e r m al u c i d u m 插图清单 图2 1葡萄糖浓度对生物量和胞外多糖的影响1 5 图2 2玉米粉浓度对生物量和胞外多糖的影响1 6 图2 3初始p h 对生物量和胞外多糖的影响1 6 图2 4发酵温度对生物量和胞外多糖的影响1 7 图2 5发酵时间对生物量和胞外多糖的影响1 7 图2 - 6不同乙醇浓度对多糖得率的影响1 9 图2 7不同提取时间对多糖得率的影响1 9 图2 8不同发酵液p h 对多糖得率的影响2 0 图2 - 9黑芝多糖清除羟基自由基效果2 1 图2 1o 黑芝多糖对d p p h 自由基清除效果2 2 图3 1铁标准曲线2 5 图3 2不同温度对黑芝多糖含量和富铁率的影响2 6 图3 3不同p h 值对黑芝多糖含量和富铁率的影响2 6 图3 4不同培养时间对黑芝多糖含量和富铁率的影响2 7 图3 5不同摇床转速对黑芝多糖含量和富铁率的影响2 8 图4 。1韩芝在配方2 下生长3 0 图4 2韩芝和黑芝的生长3 1 图4 3韩芝和黑芝的生长3 1 图4 4黑芝在配方1 下的生长3 2 图4 5黑芝在配方2 下的生长3 2 v i i 表格清单 表2 1碳源对对韩芝生长速度的影响1 4 表2 2碳源对对韩芝生长速度的影响1 4 表2 3碳源对生物量和胞外多糖的影响1 5 表2 4氮源对生物量和胞外多糖的影响1 5 表2 5碳源对黑芝生长的影响18 表2 6氮源对黑芝生长的影响1 8 表2 7l 9 ( 3 4 ) 正交实验结果2 0 表2 8验证实验结果2 1 表3 1黑芝在含有不同铁离子浓度p d a 上的生长速度2 5 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导一f i l l 行的研究： 作及取得的研究成果。据我所 知，除了文中特别加以标志和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得金胆堇些塞堂 或其他教育机构的学位或证二 弓而使用过的材料。与我一同i ：作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签字：声乐删签字日期：哆年年月矽日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金壁工些厶堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被奄阅或借阅。本人授权金日墨上些厶 堂一可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权。 弓) 学位论文者签名：协办4 ， 签字日期：6 乡年年月尸日 学位论文作者毕业后去向： ：1 ：作单位： 通讯地址： 导师签名缈挪 期：寸泓猸 电话： 邮编： 致谢 本研究的完成首先要感谢我的指导老师叶明教授的精心指导和鼓励。硕士 期间，我深深地被叶老师渊博的学识，严谨的治学态度以及常年如一日的工作 热情所感染，让我为之钦佩，受益终生。在此谨表达我诚挚的敬意和衷心的感 谢。 其次，我要感谢我的家人，他们一直用微薄的收入支持着我的学业。千言 万语诉不完他们给予我的爱，在此，我只想对他们说，诩十谢你们。 同时，整个论文的完成还得到了本院曹树青教授、魏赵军教授、刘国庆副 教授、李延红老师的支持；同时微生物资源与应用实验室的谭炜、朱立、沈君 子、李世艳、叶崇军、钱晓勇、彭伟、许庆平等同学在生活和学习过程中给予 了不同程度的关心和帮助。另外，庞伟、刘陈冰、黄南山、潘丙南、陈正义等 同学也提供了热情的帮助。 最后，我要特别感谢我的两位同窗好友邢迎节和喻明贤，感谢他们给予的 帮助和鼓励。 三年来，要感谢的人太多太多，在此一并对他们致以最诚挚的感谢，没有 他们的帮助，本论文就不可能顺利的完成。 作者：陈九山 于2 0 0 9 年3 月 i x 第一章绪论 1 1 引言 韩芝、黑芝，属于担子菌纲( b a s i d i o m y c e t e s ) ，多孔菌目( p o l y p a r a l e s ) ，多 孔菌科( p o l y p a r a c e a e ) ，灵芝属( g a n o d e r m a ) 。近代医学发现多种灵芝具有增强 免疫，促进新陈代谢，抗肿瘤，延缓衰老等作用。灵芝菌丝体含有多糖、多种 氨基酸、活性肤、三萜类、碱基、核苷、硬脂酸、多种微量元素、苯甲酸、多 种酶、酶抑制剂以及多种生物碱等多种生物活性物质；而且菌丝体有富集作用， 能将环境中稀有元素如硒、锗、碘的无机形式转化为有机形式，有利于人体吸 收，这更增强了灵芝菌丝体功效 1 - 9 。 1 2 灵芝的有效成分和生物活性 1 2 1 灵芝多糖 多糖作为来自高等植物、动物细胞膜和微生物细胞壁中的天然高分子化合 物，是构成生命的四大基本物质之一。目前已分离到的灵芝多糖有2 0 0 多种， 其中大部分为b 一葡聚糖，少数为a 葡聚糖，多糖链由三股单糖链构成。是一种 螺旋状立体构形物，其构形与d n a ，r n a 相似，螺旋层之间主要以氢键固定， 分子量从数百到数十万。除一小部分小分子多糖外，大多不溶于高浓度酒精， 而溶于热水。灵芝多糖是灵芝中最有效的成分之一，倍受医药工作者的重视。 据报道，灵芝多糖具有刺激宿主非持异性抗性【1 0 , 1 1j 、免疫特异反应以及抑制肿 瘤生理活性的特性 1 2 , 1 3 】。多糖分子量大于10 0 0 0 时显示强抑制肿瘤活性，活性 强弱还与多糖链分支的程度及支链上羟基的数量有关。另有报道，灵芝多糖还 能提高机体免疫力，提高机体耐缺氧能力，消除自由基，抗放射，提高肝脏、 骨髓、血液合成d n a ，r n a 和蛋白质的能力，从而延长寿命。 多糖有胞内多糖和胞外多糖之分，胞内多糖大多存在于灵芝细胞壁的内 壁。液体培养的发酵液和固体培养的培养基中有菌丝体分泌的胞外多糖，它主 要是真菌在生长的过程中排到体外的次生代谢产物。灵芝多糖大多为异多糖， 多数有分枝，部分多糖含有肽链，其药理活性一般也较高。据梁忠岩报道，树 舌( g a n o d e r m aa p p l a n a t u m ) 的多糖链在0 1m o l ln a o h 溶液中会解离为单糖 链。多糖的药理活性与单糖间糖苷键的结合形成有关。一般单糖间以p ( 1 3 ) ( 1 6 ) 或以p ( 1 4 ) ( 1 6 ) 连接的糖苷键是有活性的。多糖的药理活性还与其立体结构有 关，若螺旋型的立体结构被破坏，多糖的活性则大大降低【l4 1 。m i y a z k i 1 5j 从灵 芝子实体得到水溶性多糖，经鉴定为阿拉伯一木一葡聚糖，同样的灵芝子实体 用o 1 mn a o h 提取的杂多糖，由d 一岩藻糖、d 一木糖、d 一甘露糖组成。o g a w a 【l 叫 等从紫芝子实体中提取的碱溶性多糖，以p 一( 1 - - - 3 ) 一d 一吡喃葡聚糖，不溶于 中性或酸性水溶液。s a i t o 等【l7 j 从灵芝子实体碱提物中分离得到酸性多糖g l 2 a ， 由d 一葡萄糖和d 一葡萄糖醛酸以p 一( 1 3 ) 糖苷链相连结。从赤芝子实体热水 提取物中分离得到的多糖b n 3 n l ，是由l 一阿拉伯糖和d 一半乳糖组成的杂多糖 【l 引。何云庆【1 9 】从灵芝子实体热水提取物中分离出8 个多糖均一体，均为白色粉 末，大都以1 3 - ( 1 3 ) ( 1 6 ) 及( 1 4 ) 相连结。罗立新【2 0 】从赤芝子实体中分离的水 溶性多糖，由d 一葡萄糖、d 一甘露糖、d 一木糖、d 一阿拉伯糖、d 一半乳糖、 l 一鼠李糖组成。 总之，灵芝子实体多糖种类很多，有水溶性多糖、酸性多糖和碱性多糖。 大部分多糖以a 一( 1 6 ) 或p 一( 1 - - - 3 ) ( 1 6 ) 及( 1 4 ) 为主链，其侧链数目大小不 一，组成侧链的糖基成分复杂。灵芝多糖以杂多糖为主，主要含有以下单糖： d 一岩藻糖、d 一木糖、d 一甘露糖、d 一葡萄糖、d 一半乳糖、d 一甘露糖、d 一木糖、l 一阿拉伯糖、l 一鼠李糖。 关于灵芝菌丝体多糖，国内对灵芝菌丝体多糖的研究也有一些相关报道。 李刚【2 l j 研究表明，发酵灵芝菌丝体在灵芝多糖含量上，均明显高于相应的野生 和栽培灵芝子实体，说明通过发酵方法生产灵芝菌丝体可显著提高多糖含量。 陈书明【2 2 】等从灵芝菌丝体中提取出一种含氮多糖，由木糖、半乳糖、半乳糖醛 酸及葡萄糖组成，其免疫活性很高。黄为群等【2 3 】从赤芝菌( g l 2 i i ) 发酵液中提取 的水溶性多糖g p ，由葡萄糖、木糖、甘露糖以p d 一糖苷键相连结。孔乐生【2 4 】 以赤芝g l 2 2 发酵液为材料，对g l 2 2 产生的胞外多糖进行了乙醇分级沉淀。 1 2 2 三萜类化合物 三萜类化合物是从灵芝中分离得到的另一类具有生物活性的主要有效成 分，目前已从灵芝中分离得到一百余种，多数为高度氧化的羊毛甾烷衍生物， 具有护肝排毒、抗氧化、抗菌、抗炎、抗h i v 病毒和疱疹病毒、抑制肝脏肿瘤 细胞等活性，是灵芝药用功效的主要物质基础之一。三萜类萜烯酸是灵芝的主 要苦味成分。现已从野生或人工种植的子实体分离得到多种，并从人工培养的 菌丝体分离到部分萜烯酸。如灵芝酸( g a n d e n i ca c i d ) a 、b 、c 、d 、e 、g 、i 、 d m 、m a 、m b 、m e 、m d 、m g ；赤芝酸( 1 u c i d u n i ca c i d ) a 、b 、c 、d 、e 、f 、 o ；t s u g a r i c a c i da 、b 。 三萜类化合物性质不稳定，因此在选择分离提取方法时必须考虑到可能发 生的化学转化问题。常用分离方法有两种：一是用乙醇等有机溶剂在常温下提 取；二是用有机溶剂在低温下提取。提取物的分离多采用吸附剂( 硅胶、氧化铝、 葡聚糖凝胶等) 、吸附色谱法和高效液相色谱法。分离得到的化合物可经h p l c 、 t l c 分析法分析，证明是纯化合物后，可进行元素分析、测定其熔点、旋光等 物理常数。再利用红外、紫外、核磁和质谱等手段进行结构测定。王芳生等( 2 0 0 7 ) 将赤芝子实体经乙醇提取，二氯甲烷萃取浓缩，通过硅胶柱层析，用石油醚： 乙酸乙酯( 9 ：1 1 ：9 ) 梯度冼脱，石油醚乙酸乙酯丙酮混合溶剂重结晶得到灵 芝酸a 、c 和灵芝内酯及灵芝酸d m ( 3 ，7 二氧化8 2 4 ( e ) 一二烯羊毛甾2 6 一酸) 和 灵芝酸e ( 结构为：3 ，7 ，1 1 ，1 5 ，2 3 五氧化5 a 羊毛甾8 烯2 6 酸) 。李平作等 2 ( 19 9 9 ) 将灵芝发酵菌丝体经甲醇提取得粗灵芝酸，以甲苯：乙酸乙酯：乙酸( 12 ： 4 ：0 5 ) 为展开剂，通过硅胶簿层层析法分离得到3 种灵芝酸m l 、m 2 、m 3 。 c h u n n a n l i n 等( 1 9 9 7 ) 将台湾松杉灵芝用氯仿、甲醇分别提取，氯仿提取 物通过硅胶柱色谱首次分离得至u t s u a g r i c a c i da ( 结构为：3 a 乙酸氧基5 a 羊毛 甾8 ，2 4 一二烯- 2 1 一酸) 、t u s a g r i c a c i db ( 结构为：3 a 乙酰氧基1 6 a 羟基2 4 甲基 5 a 毛甾8 ，2 5 二烯2 1 酸) ，以及己知的两种羊毛甾族化合物和一种甾酸。 1 2 3 灵芝酸 灵芝酸( g a n o d e n i ca c i d ) 是灵芝的另一主要活性成分。灵芝酸是一种三萜类 物质，基本构造为数个异戊烯首尾相连构成，大部分为3 0 个碳原子、部分为2 7 个碳原子。灵芝酸有四环三萜和五环三萜二类。各种灵芝中己分离到的灵芝酸 已达1 0 0 多种。灵芝酸是灵芝的苦味成的主要来源，其含氧功能团对苦味的产生 起重要作用。各种赤灵芝中的三萜类具有品种特异性，可以作为鉴定灵芝品种 的依据之一。灵芝酸在不同种的灵芝中或同一品种不同培养基培养的及不同生 长阶段的子实体中，其含量是不同的，所以其苦味程度也有所不同，一般味苦 的灵芝其灵芝酸含量往往较高。日本对灵芝商品及灵芝制成品的灵芝酸含量十 分重视，认为灵芝酸含量高，灵芝产品质量就好。 灵芝酸有强烈的药理活性，有止痛、镇静、抑制组织胺释放、解毒、保肝、 毒杀肿瘤细胞等功能，是灵芝的主要有效成分之一。灵芝酸能抑制大鼠巨细胞 释放组织胺，抑制血管紧张肽转化酶的活性，降低血压，灵芝酸还能抑制大鼠 肝细胞从2 4 ，2 5 二氢羊毛甾醇合成胆固醇，可以用来防治动脉粥样硬化和心脏 病。 1 2 4 各种元素 灵芝中含有多种元素。不同品种灵芝中元素的种类和含量略有差异，人工 培养的灵芝与野生灵活子中的元素种类和含量也不一致。等离子体发射光谱分 析( i p c ) 结果表明：灵芝浸膏粉中含有2 5 种元素，其中c a ，m g ，p ，f e ，z n ，c u ， n i ，c o ，c r ，m o ，l i ，b ，v ，s n ，g e ，s r ，t i ，s e 等1 9 种为人体必需或有益 的常量或微量元素。原子吸收光谱分析( a a s ) 结果表明：灵芝浸膏粉中含有丰 富的钙( 2 3 3 0p p m ) ，镁( 2 4 4 0p p m ) 、磷( 4 5 0 0 0p p m ) 及铁( 3 9 0p p m ) ，锰( 15 6p p m ) ， 锌( 5 5 3p p m ) 、锗( 2 5 0p p m ) 等，这些元素为人体正常生长发育所必需或在人体 内起重要的保健作用。已9 1 f e ，c a ，z n ，m n 等有养血益肝、补肾之功效；z n ， c u ，m n ，l i 等微量元素与活血化淤、益气安神等功效有关；微量元素t i 对预防 心血管系统疾病起重要作用；此外，g e ，s e ，m n ，c u ，m o ，c r ，n i 等微量 元素与人体抗衰老、抗癌等密切相关【25 1 。 文献报道，担子菌纲多孔菌中有机锗的含量高达8 0 0 2 0 0 0m g k g ，它有抑 制多种肿瘤的生长，调节免疫功能等作用，因此有人认为灵芝中的有机锗有某 种生理活性【2 6 1 。但文献报道灵芝中的有机锗含量差异很大，不同产地的野生灵 芝，人工培养与野生灵芝的有机锗含量均不相同。野生灵芝中有机锗的含量一 般都很低，有的甚至不能检出。有一日本作者报道，不同地区和不同生长阶段 的灵芝，有机锗含量为1 3 7 8u g k g ，而水提物中未检出【2 7 1 。这证明，灵芝水提 物的生物学作用与锗无关。中国医学科学院药物研究所有人将有机锗加入深层 发酵培养菌丝体的培养液中，可使菌丝体中有机锗的含量显著增高。由此可见， 对于人工培养的灵芝，无论是子实体还是菌丝体，都可以根据人们的需要人为 的在培养基中加入某种成分，而使灵芝中该成分的含量显著提高。 1 2 5 生物碱 灵芝腺苷是一种活性很强的物质，是灵芝的主要有效成分之一。灵芝含有 腺嘌呤和腺嘌呤核苷，尿嘧啶和尿嘧啶核苷 2 8 1 。灵芝有多种腺苷衍生物，都有 较强的药理活性，能降低血液黏度，抑制体内血小板聚集，能提高血红蛋白2 、 3 - 二磷酸甘油的含量，能提高血液供氧能力和加速血液微循环，提高血液供氧 能力和加速血液微循环，提高血液对心、脑的供氧能力。动物实验表明，尿嘧 啶和尿嘧啶核苷对实验性肌强直症小鼠血清醛缩酶有降低作用【2 9 1 。紫芝中含有 五种生物碱【30 1 ，一种为r 。三甲胺基丁酸，在窒息性缺氧模型中，有提高存活时 间的作用，并能使离体豚鼠心脏冠状动脉流量增加。 1 2 6 其它 灵芝中含有少量蛋白质、多肽、氨基酸。赤芝孢子内脂a 有降胆固醇的作 用。赤芝孢子酸a 有降转氨酶作用。灵芝、紫兰、薄树芝中的薄醇醚，灵芝孢 子中的孢醚，可使部分切除肝脏的小鼠的肝脏再生能力增强。灵芝纤维素能降 胆固醇，预防动脉粥样硬化、便秘、糖尿病、高血压、脑血栓等 3 1 1 。余竟光等 从薄盖灵芝深层发酵菌丝体中分离到4 种呋喃衍生物。药理实验表明其中5 经甲 基呋喃甲醛有抑制血小板聚集的作用【3 2 。 1 3 灵芝多糖的生物活性 1 3 1 调节免疫 迄今为止，关于灵芝多糖的免疫调节功能的机制还不十分清楚，普遍认为其 免疫功能可能是灵芝多糖能直接或间接激活t 细胞、b 细胞、巨噬细胞( m 西) 、 自然杀伤细胞( n k ) 等免疫细胞、促进未经纯化的脾细胞在体外的增殖，增强 d n a 多聚酶伐的活性以及促进自细胞介素的分泌等来实现其免疫功能的。据报 道【33 1 ，许多适量的灵芝多糖可明显增a n t 细胞的增殖、t 细胞的表面表型表达及 t 细胞诱生i l 2 的能力，增强t 细胞d n a 多聚酶活性、增加t 细胞亚类的数量和 功能具有明显的免疫增强和恢复作用。李明春【3 4 】等采用激光扫描共聚焦显微镜 ( l s c m ) 技术，动态监测g l p ( 灵芝多糖) 均一体组分g l b 7 对小鼠t 细胞胞浆游离 c a 2 + 浓度和胞内p h 的影响。结果表明，g l b 7 通过外钙内流及i r 3 非敏感钙池释 放c a 2 + 引起t 细胞中 c a 2 + 的升高，通过n a + h + 交换系统及其他调节途径引起t 细胞p h 升高，从而激活t 细胞。曹容华【3 5 】等研究表明，灵芝多糖具有活化小鼠 4 腹腔m o 的功能，使m o 表面结合自身胸腺细胞花环增多，吞噬杀菌功能增强， m o 体积增大，伪足增多。韩纪举【3 6 】等人用灵芝多糖做细胞培养对照实验，结 果表明，灵芝多糖可以诱导和促进n k 细胞的活性。季修庆【3 7 】等人也通过细胞 培养实验证实，灵芝多糖对细胞增殖有抑制作用，从而使受损细胞不能增殖， 实现抗辐射作用。灵芝多糖不但从动物的整体水平起作用，对于细胞水平也有 保护作用。为了探索灵芝多糖免疫调节的机制，李明春 3 8 】等人采用细胞培养和 竞争性蛋白结合分析法测定小鼠腹腔m o 中c a m p 含量结果表明，灵芝多糖能引 起小鼠腹腔m 西中c a m p 浓度的升高，所以认为，灵芝多糖通过引起小鼠腹腔m o 中c a m p 浓度的升高，从而引起p k a 活化，激活m o 。这很可能是g l b 7 增强小 鼠免疫功能的重要途径。 1 3 2 抑制肿瘤 灵芝多糖能防止肿瘤的发生和抑制肿瘤的生长，大量实验研究表明，灵芝 多糖无直接细胞毒性，在管内均不能抑制肿瘤细胞生长。那么它是如何实现抗 肿瘤作用的呢? 其抗癌机理目前尚无定论，较有代表性的理论是免疫功能论、 端粒酶论、促分化论等三种机理【”】。所谓免疫功能论就是通过增强机体免疫功 能而实现的，这是己被许多专家学者所证实的【4 0 1 。林志彬通过血清药理学实验、 灵芝与巨噬细胞脾细胞共同培养上清液，结果均表明，灵芝多糖确能直接作用 于巨噬细胞和t 淋巴细胞促其产生肿瘤坏死因子a ( t n f a ) 和干扰素丫( i f n y ) 等细 胞因子进一步抑制肿瘤细胞或促使其凋亡【4 。林教授还和张群豪采用体内体外 实验相结合方法，m t t 法测肿瘤细胞增殖程度，流式细胞仪测细胞凋亡，同时 采用生物法测定t n f a ，e l i s a 狈0 定i f n y ，并用逆转录聚合酶链反应( r t - p c r ) 方法检测m r n a 表达。得出结论：灵芝多糖无直接的抗肿瘤作用，其抗肿瘤作 用是通过促进t n f o t 、i f n t m r n a 表达增加t n f a 、i f n l , 的分泌而实现的【4 引。端 粒酶论是最近几年由上海药物研究所实验研究后提出的一种新的灵芝抗癌机 理。灵芝提取物能造成癌细胞端粒酶失去活性，促使癌细胞在分裂后自然凋亡 【4 3 1 。促分化论是大连医科大学张耀铮教授研究的课题，研究揭示癌细胞在促分 化剂作用下可以重新向正常细胞分化、逆转，开辟了一条非杀伤性治疗肿瘤的 新思路、新途径1 4 4 | 。 国内外的学者也对灵芝的抗癌特性进行了一定的研究，胡洪波、n a m s h i k a h n 等人用酒精提取灵芝的有效成分对胸腺癌患者进行临床实验发现，提取物 能抑制癌细胞的生长【45 1 。许多学者进行大量的动物实验表明，灵芝的提取物对 癌症的疗效能达n 5 0 的转化率。在台湾专门用于与化疗和放疗的配合治疗中， 能增强疗效和加快病情的恢复1 4 6 。 1 3 3 抗衰老作用 近年来研究认为，衰老主要是由于体内自由基引起生物膜的脂类过氧化导 致膜结构损伤和功能失活引起的。李明春【4 7 】等人采用激光扫描共聚焦显微镜技 术，动态监测灵芝多糖均一体g l b 7 对小鼠腹腔巨噬细胞( m ) 活性氧自由基含量 的影响，实验表明，灵芝多糖能降低小鼠腹腔m 活性氧自由基的产生，并能拮 抗p m a 引起的小鼠腹腔m 活性氧自由基的产量，从细胞水平证明了灵芝多糖的 抗衰老作用。灵芝多糖的抗衰老作用还表现其他方面，如：能提高d n a 多聚酶的 活性，从而促进免疫细胞d n a 合成和细胞繁殖，起到抗衰老的作用。邵华强等 人对灵芝进行了老龄小鼠的血清超氧化物歧化酶试验、过氧化脂质试验和果蝇 的生存试验。结果表明，灵芝能明显增强老龄小鼠的血清超氧化物歧化酶的活 性，降低老龄小鼠血清中过氧化脂质的含量，延长果蝇的寿命【4 引。证明了灵芝 多糖有抗衰老的作用。 1 3 4 抗辐射作用 辐射对机体造成损害的机制之一是产生大量自由基，引发一系列脂质过氧 化反应，引起细胞中核酸、蛋白质分子结构的破坏，最终对各组织和器官造成 严重的损害，同时，辐射引发免疫功能降低，造成死亡。吴京燕等【4 9 】观察了灵 芝多糖合剂对辐照小鼠外周血白细胞及超氧化物歧化酶( s o d ) 活性的影响。发 现受试组白细胞数量及s o d 活性较模型组显著提高。季修庆等【5o 】用不同剂量的 g l p 作用n i h 3 t 3 细胞，再用1 5 g y 6 0 c 0 7 射线照射细胞1 2h ，利用流式细胞仪检 测细胞各周期百分率及凋亡率。结果表明，1 5 g y 6 0 c 0 7 射线照射可促进n i h 3 t 3 细胞增殖，而o 1 5g y 6 0 c 0 7 射线照射n i h 3 t 3 细胞1 2h 不能促进细胞凋亡；不 同剂量g l p 均对细胞增殖有抑制作用，从而使受损细胞不能增殖，实现抗辐射 作用。 1 3 5 其他作用 罗少红等人对高血糖小鼠进行灌胃实验时发现，在灌胃剂量达1 0 0m g k g 以上时，可明显降低高血糖小鼠血糖水平，无剂量效应关系；在2 0 0 m g k g 剂量 时，可降低正常小鼠的血糖，有明显的刺激胰岛素分泌的作用，并可明显增强 高血糖小鼠对葡萄糖的耐受力【5 。可见灵芝多糖具有显著的降血糖功效。国内 也开始采用灵芝多糖综合疗法治疗慢性乙型肝炎，达到了慢性迁延性肝炎治愈 率为7 1 4 3 ，慢性活动性肝炎治愈率为5 3 3 3 的良好效果【5 2 】。金春花【5 3j 等人 通过对大小鼠进行实验发现，灵芝多糖可明显地延长小鼠凝血时间，降低高脂 血症小鼠血清中t g 含量，明显延长大鼠体内血栓形成时间，抑制血淤大鼠体外 血栓的形成并降低血淤比粘度。可见，灵芝多糖还有助于提高心脑血液循环， 对预防和治疗心脑血管系统疾病起到良好作用。 1 4 灵芝多糖的提取工艺 灵芝多糖大多数是异多糖，即除含有葡萄糖外，还含有半乳糖、甘露糖、 阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、鼠李糖等其它单糖，由于来源不同，分子量可从数 万到数十万不等，单糖间糖苷键构型有( 1 ，3 ) ，( 1 ，4 ) ，( 1 ，6 ) 差别，多数伴有分枝， 部分多糖还含有肽链【5 4 1 。根据来源不同，灵芝多糖可分为三种，即子实体多糖、 6 液体发酵产生的菌丝体多糖( 胞内多糖) 和发酵液多糖( 胞外多糖) 。传统灵芝多糖 的提取方法有水提醇沉法、稀碱浸提法、稀酸浸提法和酶法等，随着对灵芝研 究的不断深入，又出现超声波法和膜分离法等。 1 4 1 水提醇沉法 水提醇沉法利用多糖溶于热水而不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂的特点， 从灵芝中进行提取，是最为经典的提取灵芝多糖的方法，具有工艺简单、一次 性投入较小，易于推广等优点。 田光辉等l 55 】用水提醇沉法提取灵芝多糖，考察了水温度、酸碱盐介质对 灵芝多糖提取的影响以及用活性碳脱色对灵芝多糖吸附的影响，发现利用 s o x h e h 提取器，分别用乙醚、甲醇回流子实体粉末至无色后，用9 0 的热水浸 提二次，再用9 0 质量分数1 的碳酸钠水溶液浸提二次，能有效地将灵芝 多糖及其它有效成分提取出来。张志军等人【56 】通过对灵芝多糖浸提过程中的温 度、时间以及固液比3 个因素进行了单因素试验和正交试验。结果表明，灵芝多 糖的最佳提取条件为浸提温度9 0 ，浸提时间2 0h ，料液比1 ：1 5 ，浸提温度 对多糖提取率的影响最大，其次为浸提固液比和浸提时间。董昌金【57 】采用正交 设计，用灵芝菌丝体和子实体作材料，采用热水浸提法，研究表明，灵芝多糖 较理想提取工艺为：加水3 0 4 0 倍，热水浸提3 次，每次浸提1 h ，醇析乙醇浓度 为8 5 ，采用蒽酮比色法测定多糖含量，快速、简便、准确，便于工厂推广和 应用。黄纯等 5 8 培0 选择提取次数、温度、提取时间，以及加水量作为进行正交 实验的考虑因素，通过设计4 因素、3 水平正交表，选定灵芝多糖最优化的提取 工艺为15 倍水，10 0 提取1 4 d , 时，共提取3 次。林树钱等 5 9 1 对草栽灵芝多糖肽 提取条件进行研究发现，提取子实体多糖肽的最佳条件为样水比1 ：15 ，温度10 0 ，时间3h ，增加提取次数，可提高多糖肽的产率。 1 4 2 超声波法 由于灵芝子实体木栓质化、结构紧密，具有较好的维持力，存在于细胞壁 内的灵芝多糖较难渗出，传统的水、碱、酸浸提法较难达到理想的效果。近几 年来，出现了超声波法提取灵芝多糖。超声波法是利用超声波产生的强烈振动、 高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，从而把药物的有效成分能较快进 入溶剂的一种提取方法。此技术具有高提出率，提取时间缩短，节约溶剂，低 温提取有利于有效成分的保护等优点 6 0 1 。 李钟玉等【6 1 】通过单因素考察及正交实验优化了用超声波法提取灵芝多糖 的实验条件，并与酸提取方法进行了比较。结果显示在灵芝干粉中加入6 2 5 倍 体积的水，在p h2 0 的条件下用超声波提取4 5m i n 得到的灵芝多糖的量最多。 与酸提取法相比，超声波法的粗提物提取率稍高，但提出物中的糖含量明显增 加，大分子杂质明显减少，进一步证实超声波法提取灵芝多糖优于水、酸、碱 等溶液浸提法。李绮等【6 2 】于2 0 0 3 年应用超声波处理，在破坏孢壁结构的同时提 7 取灵芝孢子多糖，取得理想效果。朱俊沽等【6 3 】将超声波和高压处理相结合提取 灵芝孢子多糖，发现联合处理的多糖得率高于任何单一方法处理的多糖得率。 超声波处理能破坏细胞壁，提高多糖得率，而将超声波处理与其它破壁方法联 合使用可使灵芝多糖得率明显提高。由此表明，将破壁与多糖提取工艺合二为 一是较理想的灵芝多糖提取方法。 1 4 3 膜分离法 由于多糖体对温度很敏感，是热敏性物质。温度升高，多糖体中糖苷键易 断裂而形成多个糖单体，而糖单体是没有活性的，利用水提醇沉法方法分离量 甚少，甚至有时还会引起灵芝多糖的降解，随着人们对灵芝多糖提取方法的探 讨，近年来出现了膜分离方法。膜分离方法是利用多糖分子量大小不一，在通 过半透膜时，可实现机械分离，然后再低温浓缩、干燥，得粗多糖的一种提取 方法【6 引。刘建华等人【65 】在最近研究认为采用的膜分离技术和冷冻干燥技术采用 的均为低温工艺，所以，对多糖体活性保存较好，整个生产过程在密闭系统中 进行，无需加热，同时避免和减轻了热和氧对物料营养成分的影响，还具有冷 除菌作用，且能耗低、速度快、费用省，在生产过程中不产生污染。采用膜技 术进行灵芝多糖的分离纯化，收率高且极少破坏灵芝多糖结构。膜分离法是近 年来出现的新的提取方法，膜分离技术是近几年来发展起来的高新技术，此技 术在灵芝多糖提取中的应用还是一个新领域。 1 4 4 其他提取方法 几年以前，也有研究者致力于酶法提取多糖的研究，以保持生物活性。随 后又产生了冷冻预处理法与协同酶法、超声波催化纤维索酶法、超临界萃取法 等提取方法。如高大维等【6 6 】采用冷冻预处理，协同酶法提取灵芝多糖，结果表 明该法提取灵芝营养成分高效、易于操作，且提取的生物多糖未受高温高压和 强酸强碱处理，其生物活性保持不变。于淑娟等人【6 7 】在国内外率先采用超声波 的高频振荡及其产生的“空化效应”来破坏紧密的灵芝子实体结构并除去一部 分影响酶接触纤维的妨碍物，从而达到提高纤维素酶水解纤维素的水解效率尽 快释放细胞壁多糖。与其他方法比较发现超声波催化纤维素酶法提取得到的固 形物含量和灵芝多糖含量均是最高的。 1 5 灵芝多糖结构与生物活性的关系 多糖的生物活性和多糖的结构特别是高级结构有很大关系。一般说来，灵 芝多糖的主链越长，侧链频率越高，分子量越大，生物学活性越高。有生物学 活性的灵芝多糖，其分子量一般大于1 0 4 道耳顿【6 引，小于此值则活性很低或完 全没有。灵芝多糖分为a 型和b 型两种，a 多糖没有活性，有活性的多糖均为p 型 结构，具有以1 3 - ( 1 3 ) 糖苷键相连的主链。糖苷键连接吡喃葡萄糖残基，并在主 链的第0 6 ( 少数0 2 ) 碳原子处具有侧链。该结构为灵芝多糖抗肿瘤活性的最小共 同单位。从赤灵芝提取的几种多糖，其侧链频率不同，抑瘤率差异很大。水不 8 溶性葡聚糖，其侧链频率为1 3 1 时，抑瘤率为9 7 9 ，侧链频率为1 1 6 8 和1 2 3 0 ， 同等剂量的抑瘤率分别为5 9 6 和1 0 9 。一般多糖越纯，抑瘤率越高，从平 盖灵芝提取的多糖含有一种糖蛋白，具有细胞毒性，抑瘤率为7 8 1 ，去除该 蛋白质后，同等剂量的抑瘤率为9 5 3 ，细胞毒性消失1 6 引。 多糖的药理活性与单糖间糖苷键的结合形式有关。现认为单糖间以p 一( 1 3 ) ( 1 6 ) 连接或以1 3 - ( 1 4 ) ( 1 6 ) 连接的糖苷键是有活性的，以纯( 1 4 ) 糖苷键连接的则 没有活性。此外，多糖的药理活性还与其立体结构( 三级结构) 有关。若螺旋形 的立体构形被破坏，多糖活性则大大下降。这里不妨比较一下灵芝多糖与淀粉、 纤维素的区别。淀粉和纤维素其单糖间的糖苷键都是( 1 4 ) 连接。淀粉分子的立 体结构为a 型的线状结构，纤维素的立体结构为p 一型的带状结构，二者都没有 立体形的构造，而纤维素和淀粉( 包括糊精) 是没有药理活性的。 多数活性多糖有分枝，部分多糖含有肽链，多糖分枝密度高或含有肽链的 其药理活性般也比较高。灵芝多糖结构中含有较多的糖苷键可能是使其具有 强烈药理活性的原因。 9 第二章灵芝胞外多糖发酵条件优化及其抗氧化活性研究 2 1 引言 灵芝的药理成分非常丰富，包括灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、甘露醇等， 其中灵芝多糖是灵芝的主要有效成分。研究表明，灵芝多糖具有抗肿瘤，可显著 清除机体产生的自由基，防止脂质的过氧化，促进细胞核内d a n 合成，延缓机 体衰老，增强免疫力，是扶正固本的有效成分【7 1 , 7 2 。 目前，国内外多数研究集中在韩芝多糖及其生物活性【7 孓7 5 】，而对于选择 最佳发酵培养基成分和发酵条件鲜见报道；对黑芝的研究主要集中在菌丝体的 培养条件优化7 6 1 、孢子多糖以及生物活性 7 7 铷】方面，但罕见黑芝菌丝胞外多糖 的研究报道。本章以韩芝生物量和多糖含量为评价指标，对韩芝的发酵条件进 行研究；对黑芝胞外多糖的提取的工艺条件及其体外抗氧化性进行了研究；以 期为更好的利用韩芝和黑芝提供理论依据。 2 2 材料 2 2 1 实验菌种 韩芝、黑芝，购于华中农业大学菌种实验中心。 2 2 2 培养基 1 基础发酵培养基：马铃薯2 0 、葡萄糖2 、k h 2 p 0 40 1 5 、m g s 0 4o 0 7 5 、p h 自然。2 p d a 培养基：马铃薯2 0 、葡萄糖2 、琼脂1 8 、p h7 0 、 1 2 1 灭菌2 0m i n ；3 p d y 培养基：马铃薯2 0 、葡萄糖2 、p h7 0 、1 2 1 灭菌2 0m i n 。 2 2 3 试剂及药品 试剂名称 生产厂商 葡萄糖天津市博迪化工有限公司 蔗糖 广东汕头市西陇化工厂 琼脂上海源聚生