（动物营养与饲料科学专业论文）复合诱变选育β葡聚糖酶高产菌株及其酶学性质的研究.pdf

摘要 b 葡聚糖酶可以将1 3 一葡聚糖降解为小分子 消除麦类饲料中1 3 葡聚糖的抗营养 作用 从而作为一种饲料添加剂在动物营养界倍受关注 然而 目前 b 葡聚糖酶 生产菌大多由于产酶活力低 发酵培养条件复杂而受到限制 本试验以b 葡聚糖酶 生产菌黑曲霉s d l 6 为研究材料 首先利用紫外线照射和n 注入技术对其进行改良 育种 并筛选出一株高产菌株a n l 然后对高产菌株液体发酵培养基 最佳发酵培 养条件进行了优化 最后 对高产菌株a n l 所产p 葡聚糖酶酶学性质进行研究 对黑曲霉菌株s d l 6 进行紫外线照射 结果表明 当照射时间为1 0 m i n 时 黑曲 霉孢子存活率在7 0 8 0 之间 而此时突变率达到最大 因此确定l o m i n 为最佳照 射时程 矿注入黑曲霉孢子参数研究发现 孢子存活率先是随着注入剂量的增加而迅 速下降 当注入剂量增加到7 0 x 2 6 x1 0 n c i a 2 时存活率出现平缓回升 注入剂量 超过9 0 x 2 6 x1 0 n c r n 2 时又再次开始下降 随着注入剂量的增大 孢子总突变率 呈现先降后升再降的趋势 正突变率变化与总突变率保持一致 而负突变率逐渐上升 经紫外线和对反复复合诱变 突变高产菌株a n i 的b 葡聚糖酶酶活由出发菌株 s d l 6 的4 9 3 2 u m l 提高到9 0 2 5 u m l 突变菌株a n l 经传5 代培养 产酶性能稳定 研究首先采用单因素试验和正交试验对黑曲霉a n l 产1 3 葡聚糖酶的液体发酵培 养基进行了初步研究 确定了黑曲霉菌株的最适培养基组成 大麦粉4 豆粕粉2 硫酸铵o 3 1 3 葡聚糖0 1 吐温8 0o 2 醋酸钠o 1 抗坏血酸o 1 碳酸 钙0 4 k 2 i i p 0 4 3 h 2 00 0 5 m g s 0 4 7 h 2 00 0 3 f e s 0 4 7 h 2 00 0 0 1 然 后 在优化后的培养基基础上确定黑曲霉a n l 产b 葡聚糖酶最适发酵条件 即当发 酵温度为3 4 发酵时间为6 0 h 培养基起始p n 为6 5 接种量为1 5 m l 1 0 0 m l 时 有利于突变株a n l 最大产酶 对黑曲霉菌株a n l 产b 葡聚糖酶基本酶学性质的研究表明 b 葡聚糖酶适宜反 应温度在4 0 4 5 之间 在4 5 时 相对酶活最高 当p h 为5 0 时 1 3 葡聚糖酶酶 活最高 b 葡聚糖酶在4 0 以下有着较好的热稳定性 当p n 低于5 0 时 b 葡聚 糖酶相对较稳定 金属离子对b 葡聚糖酶酶活力有一定的影响 在5 0 m m o l l 的离 子浓度下 z n 2 c a 2 f e 3 和c 0 2 对b 葡聚糖酶具有较强的激活作用 而c u 2 m 9 2 m n 2 f e e 和k 对该酶表现出明显的抑制作用 关键词 复合诱变量 葡聚糖酶条件优化酶学性质 a b s t r a c t 1 3 g l u c a n a s ec a l ld e c o m p o s e1 3 g l u c a nt om i c r om o l e c u l ea n dt h ea n t i t r o p h i co f1 3 g l u c a n e a r lb ee l i m i n a t e d s ot h e1 3 一g l u c a n a s ew a si n t e r e s t e db yt h ea n i m a ln u t r i t i o ng r o u p a sak i n do fa n i m a lf e e d sa d d i t i v e s b u ti t sa p p l i c a t i o nw a sr e s t r i c t e df o ri t sl o we n z y m e a c t i v i t ya n dc o m p l e xf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s t h es t r a i na s p e r g i l l u sn i g e rs d l 6w a st h e s t u d y i n gm a t e r i a li n t h i se x p e r i m e n t f i r s t l y t h es t r a i nw a sc o m p o u n dm u t a g e n e s i s e db y t h eu l t r a v i o l e ti r r a d i a t i o na n dt h ei o ni m p l a n t a t i o n a n dw es c r e e n e dah i 曲p r o d u c i n gs t r a i n a n l t h e n t h ec u l t u r em e d i u ma n dt h ef o m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h em u t a g e n i cs t r a i n a n lw e r es t u d i e d f i n a l l y t h ee n z y m o l o g yp r o p e r t i e so fb g l u c a n a s ee x c r e t e db y a s p e r g i l l u sn i g e ra n lw e r es t u d i e d t h eu l t r a v i o l e ti r r a d i a t i o ni n d i c a t e d 1 1 1 eo p t i m u mi r r a d i a t e dt i m ei s1 0m i n u t e s t h e s t u d yo np a r a m e t e ro fn i m p l a n t a t i o ni n t oa s p e r g i l l u sn i g e ri n d i c a t e d t h es u r v i v a lo f s p o r eo fa s p e r g i l l u sn i g e rw a sd e c r e a s e dr a p i d l yw i t ht h ei m p l a n t a t i o nd o s ei n c r e a s i n g f i r s t l y t h e nt h es u r v i v a la p p e a r e dt or i s ew h e nd o s ea d d e dt o7 0 x 2 6 x1 0 i o n s e r a 2 t h e s u r v i v a ld e c r e a s e d a g a i n w h e n9 0 2 6 1 0 i o n s c m zw a s a p p l i e d n l em o r e i m p l a n t a t i o nd o s e t h et o t a lm u t a t i o nw a si n c r e a s e df i r s t l ya n dt h e nd e c r e a s e d t h ep o s i t i v e m u t a t i o nw a st h e8 a n l e 髂t h et o t a lm u t a t i o n b u tt h en e g a t i v em u t a t i o nw a si n c r e a s e dw i t h t h ei n c r e a s i n gi m p l a n t a t i o nd o s e t h ea c t i v i t yo f1 3 一g l u c a n a s eo fm u t a t e ds t r a i n a s p e r g i l l u sn i g e ra n lw a sr a i s e df r o m4 9 3 2 u m l t o9 0 2 5 u m l c h a r a c t e r i s t i c so f e n z y m e sp r o d u c t i o ni na s p e r g i l l u sn i g e rm u t a n ta n lk e p ts t a b l eb y5t i m e ss u b c u l t u r e b ys i n g l ea n do r t h o g o n a lt e s t ac u l t u r em e d i u mf o rt h eb 西u c a n a s ep r o d u c t i o nb y a s p e r g i l l u sn i g e ra n lw a ss t u d i e d t h eo p t i m a lm e d i u mc o n s i s to f 4 b a r l e yp o w d e r 2 b e a nc a k ep o w d e r o 3 n h 4 2 s 0 4 o 1 1 3 一g l u c a n o 2 t w e e n8 0 o 1 n a a c o 1 v i t a m i n e o 4 c a c 0 3 0 0 5 k 2 h p 0 4 3 h 2 0 0 0 3 m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 0 1 f e s 0 4 7 h 2 0 t h es t u d yo no p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f t h em u t a g e n i es t r a i na n l w a si n d i c a t e d t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ew a s3 4 2 f e r m e n t a t i o nt i m ew a s 6 0 h p hw a s6 5a n ds e e dv o l u m ew a s1 5 m 1 t h es t u d yo nc h a r a c t e ro f l 3 一g l u c a n a s ee x c r e t e db ya s p e r g i l l u sn i g e ra n li n d i c a t e d t h ef i t t i n gr e a c t i o nt e m p e r a t u r ei sa m o n g4 0 5 0 c 1 0 0 i n4 5 t h er e l a t i v ee n z y m e a c t i v i t yr e a c h e s1 0 0 i np h5 o t h e1 3 一g l u c a n a s ek e e p sb e t t e rs t a b i l i t yi n4 0 c a n di t s k e e p sb e t t e rs t a b i l i t yw h e np hi sb e l o w5 o s o m em e n t a li o nc a ni n f l u e n c e1 3 一g l u c a n a s e a c t i v i t y t h eb g l u c a n a s ec a nb en o t a b l ya c t i v a t e db yz n 2 c a 2 f e s a n dc 0 2 r e s t r a i n e db yc u 2 m 矿 l t n 2 f e 2 a n dk i n5 o m m o l l i i k e yw o r d s c o m p o u n dm u t a g e n e s i sb g l u c a n a s eo p t i m i z i n gf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n 1 1 i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果 也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意 研究生签名 叠堡垒 时间 加 7 年莎月z 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 可以采用影印 缩印或扫描等复 制手段保存 汇编学位论文 同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表 传播学位论文的全部或部分内容 保密的学位论文在解密后应遵守此协议 研究生签名 第一导师签名 杰坌翌时间 纠曰年 月衫日 时间 岬年z 月7 日 文献综述 1 工业微生物的理化诱变选育方法 1 1 物理诱变选育方法 1 1 1 紫外线诱变技术 紫外线是一种最常用的简便而有效的物理诱变剂 它是波长短于紫色可见光而又 紧接紫色光的射线 波长范围是3 6 3 0 0 n m 其诱变机理主要是由于波长2 6 0 n m 左右紫 外线被核酸强烈吸收 引起d n a 变化 紫外线诱变的缺点是易光复活 在微生物选育过程中紫外线诱变多作为有效的诱变剂 并取得了显著效果 肖湘 政等以胶质芽孢杆菌h m 8 8 4 1 作为出发菌株 通过紫外线诱变所得突变株具有发酵周 期缩短 发酵水平提高 芽孢抗逆性能增强等特点 1 1 王芳等 2 0 0 5 2 1 通过紫外光 诱变处理获得一种耐低温 1 0 的深绿木霉 t r i c h o d e r m aa u r e o v i r i d e 突变菌株t u v 1 低温下与亲本菌株相比 t u v 1 菌丝生长速率大 对灰霉病菌的拮抗作用明显 张建 峰等 2 0 0 6 3 利用紫外线对出发菌株红曲霉a s 3 4 7 0 1 进行诱变处理得到一株高产菌 株 其多糖产量提高2 8 6 武晓炜等 2 0 0 5 4 1 通过紫外诱变育种从假单胞菌s 2 中 筛选出一株甲胺磷降解菌 该菌株降解率比出发菌株提高了8 9 1 1 2 离子注入技术 1 1 2 1 离子注入及其特点 离子束是元素的离子经高能加速器加速后获得的放射线 根据注入离子种类的不 同可分为氮离子束 氢离子束 碳离子束 氦离子束等 根据注入离子携带能量的大 小又可分为低能 单核能低于1 0 m e v u 重离子 超低能 总能量低于1 5 0 k e v 重离子和 中能 1 0 1 0 0 m e v u 重离子等 5 注入离子具有高传能线密度 l e t l i n e a re n e r g y t r a n s f e r 尖锐的电离峰 b r a g g 峰 及低氧增比 o e r o x y g e ne n h a n c e m e n tr a t i o 并 可精确控制其入射深度和部位 且注入深度常随能量增加而增加 而能量损失则随注 入深度不同而呈尖峰式 b r a g g 峰 曲线分布 因此离子束与电子束 x 射线 y 射线等 相比具有很多独特的优点 如 可以在电场 磁场的作用下被加速或减速以获得不同 的能量 可对其进行高精度的控制 获得平行束 也可被聚焦成微细束 离子在固体 内的直进性好等等 离子束物质能量的传递特征是 离子通过物质时 在物质中的局部引起高密度的 电离和激发 而且经加速后的离子具有一定的静止质量 注入生物体后可以使质量 能量和电荷共同作用于生物体 6 因此 在育种和改良的应用中植株表现出生理损伤 小 突变谱广 突变频率高 并有一定的重复性和方向性的新特点 王石磊等分别利 用紫外线 u v 亚硝基胍 n n g 离子注入3 种方法对灰褐链霉菌s 1 0 0 l 进行诱变 对 突变株的产酶能力进行比较 结果表明 离子注入诱变具有正变率高 2 0 正变幅 度大 4 0 9 等优点 对该菌是 种较好的诱变方法 1 1 2 2 离子注入在微生物育种中的应用 我国1 9 9 4 年报道了离子注入链霉菌的诱变效应 获得2 6 7 3 的正突变率 1 9 9 5 年又有报道指出 采用矿 c 4 注入核糖霉素产生菌 卡那霉素产生菌时 其中以n 诱变效果最显著 g 近几年来我国学者在离子注入微生物诱变育种方面陆续做了一些 探索 9 2 0 有关工作简介如表1 1 表1 1 离子注入法微生物诱变育种研究进展 t a b l e1 r e v i e wo f s t u d i e so nm i c r o o r g a n i s mb r e e d i n gi n d u c e db yi o ni m p l a n t a t i o n 1 1 3 激光 激光作用于生物体产生压力 热效应 电磁效应及其综合作用 引起生物大分子 的变化 导致遗传变异 激光作为一种育种方法 具有操作简单 使用安全等优点e 2 近年来应用于微生物育种中取得不少进展 胡卫红等 2 0 0 0 2 2 采用c 0 2 激光辐照酿 酒酵母 s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e a s 2 1 1 8 9 筛选到乙醇产量有较大提高的变异株 通过对变异株乙醇脱氢酶同工酶的比较分析发现 其酶谱与出发菌株有所不同 证实 c 0 2 激光确实有诱变作用 韩建荣等 2 0 0 2 2 3 采用h e n e 激光对青霉p t 9 5 p e n i c i l l i u m 印 的原生质体进行诱变处理 选育到一株生物量和类胡萝h 素含量均有显著提高的 变异菌株l 0 5 传代试验表明l 0 5 具有良好的遗传稳定性 周蓬蓬等 2 0 0 2 2 4 应用 y a g 激光照射高山被孢霉 m o r t i e r e l l aa l p i n a 获得了花生四稀酸和油脂含量分别提高 2 4 5 倍和1 7 1 倍的高产菌株 彭益强等 2 0 0 2 2 5 采用1 0 6 i x m 1 5 k i i z 高重复率声光 q nd y a g 激光分别对产植酸酶黑曲霉的孢子悬液和原生质体进行处理 发现原生 质体比孢子耐受激光诱变的能力强 并且效果好 选育到一株酶活提高3 7 5 倍的变异 株 2 1 1 4 微波 微波辐射属于一种低能电磁辐射 具有较强生物效应的频率范围在3 0 0m h z 3 0 0g i i z 对生物体具有热效应和非热效应 其热效应是指它能引起生物体局部温度 上升 从而引起生理生化反应 非热效应指在微波作用下 生物体会产生非温度关联 的各种生理生化反应 在这两种效应的综合作用下 生物体会产生一系列突变效应 1 2 6 2 7 1 据李永泉等 1 9 9 9 2 8 1 报道 微波诱变正变频率高 效果好 操作简便 所选 育菌株遗传性状稳定 因而 微波诱变被用于多个领域的诱变育种 如农作物育种 禽兽育种和工业微生物育种 并取得了一定成果 李永泉 2 0 0 1 2 州采用微波辐照对 黑曲霉木聚糖酶生产菌进行诱变处理 结果选育到一株产量较高的生产菌 其发酵单 位提高了4 3 3 1 1 5 其它物理诱变方法 除了以上几种诱变方法外 x 射线 y 射线 n 射线 b 射线也是很好的诱变剂 王静等 2 0 0 2 圳对黑曲霉产菊粉酶菌株进行c 0 6 0 诱变 筛选到一株突变株 其菊粉 酶酶活提高3 0 费笛波等 2 0 0 2 3 h 利用c 0 6 0y 射线辐照处理获得的诱变菌株芽孢 杆菌 其产酶活力比出发菌株提高3 0 以上 与以上报道相一致 陈亮等 2 0 0 6 f 明 选择能量在氧的k 吸收边附近的同步辐射软x 射线对米曲霉孢子的辐照致死效应进行 了研究 结果表明 突变株的累积产酸量较原发菌株的提高约5 6 李梦等 1 9 9 2 d 3 应用3 2 p t 3 射线内照射大豆风干种子的结果表明 3 2 p 1 3 射线可以引起m l 代的苗高 成株率和孕性等生物学损伤 并且照射强度越高 引起的生物学损伤越严重 同时 也可以诱发m 2 代的叶绿素缺失 孕性和熟期等性状的突变 1 2 化学诱变选育方法 1 2 1 甲基磺酸乙酯 e m s e m s 属于烷化剂的一种 烷化剂通常带有一个或多个活性烷基 此基团能够转移 到其它电子密度高的分子上去 使碱基许多位置上增加了烷基 从而在多方面改变氢 键的能力 e m s 是一种良好的化学诱变剂 目前已成为在作物诱变育种中应用最广泛 的一种化学诱变剃3 4 3 7 e m s 多用于玉米化学诱变育种 并取得了较好的诱变效果 张景萍等实验表明 经e m s 诱变得到的突变体玉米对环境的适应能力提高 抗性增强 1 3 8 1 e m s 的烷化作用主要发生在d n a 的鸟嘌呤n 7 位置上 烷基取代h 离子后 使之 成为一个带正电荷的季铵基团 3 从而发生两种遗传效应 一是烷化的鸟嘌呤与胸腺 嘧啶配对 代替胞嘧啶 发生转换型的突变 二是由于鸟嘌呤的n 7 烷基活化 糖苷 键断裂造成脱嘌呤 脱去鸟嘌呤的d n a 4 子 在进一步复制时 原来的鸟嘌呤的位 置就成了一个空位 其互补位置上的碱基就不受严格的配对限制 四种碱基都有机会 进入 从而造成置换现象 此外 还可以发生糖 磷酸骨架断裂 产生染色体的缺失 e m s 的诱变效应可用 两高一广 来评价 即 效率高 频率高 范围广 3 9 1 e m s 3 化学诱变产生点突变的频率较高 而染色体畸变相对较少 可以对作物的某一种特殊 性状进行改良 用e m s 处理玉米花粉 突变频率可高达7 8 4 0 1 安学丽等 2 0 0 3 f 4 l 用甲基磺酸乙酯处理玉米自交系0 8 2 的种子 结果表明 甲基磺酸乙酯对玉米自交系 种子是一种有效的化学诱变剂 在m l 代引起了较大的生理损伤和生物学效应 m 2 代 质量性状未发生明显变异 但株高 穗位高 茎周长和穗上叶片长等数量性状出现了 较高的突变频率 其中株高的负突变增加明显 李改平等 2 0 0 2 4 2 用三种化学诱变 剂分别对汤姆青霉菌株进行化学诱变 实验证明 e m s 诱变效果最好 1 2 2 叠氮化钠 n a n n a n 3 是一种点突变剂 它与d n a 的作用方式是碱基替换 因此 处理种子最适 宜的时间是在d n a 合成开始时 n a n 3 的等电点是p h 4 8 在p h 3 0 时n a n 3 溶液中主 要产生h n 3 分子 它呈中性 易透过膜进入细胞内 以碱基替换方式影响d n a 的正常 合成 从而导致点突变的产生 n a n 3 只作用于复制中的d n a 所以应当把种子预浸 到种胚中d n a 第一次合成开始时 立即用n a n 3 溶液处理 n a n 3 具有高效 无毒 价 格便宜 使用安全等优点 在酸性溶液中对大麦叶绿素缺失和形态突变非常有效 姜 振峰等 2 0 0 6 4 3 用0 0 4 的化学诱变剂叠氮化钠处理大豆品种 m l 代田间调查发现 处理后的植株成活率降低 有矮化和晚熟现象 并证明利用化学诱变剂叠氮化钠处理 大豆种子是研究大豆化学诱变效应的有效途径之一 张超美 1 9 9 4 用不同浓度的 叠氮化钠处理小麦种子 结果表明 在0 2 2 0m m o l i 撒度范围内 叠氮化钠抑制种 子萌发和生长 抑制去氢酶和过氧化物酶活性随萌发过程的增高 面低浓度叠氮化物 处理刺激幼苗生长 提高酶的活性 1 2 3 平阳霉素 p y m 平阳霉素是一种抗生素 抗生素的作用具有高度选择性 能抑制细胞的生长 它 们的大多数对维持生命有重要意义的结构的特殊部位起作用 p y m 是平阳霉素 p i n g y a n g m y c i n 的英文缩写形式 它属于博莱霉素的一类 是博莱霉素的a s 组分 目 前主要作为抗肿瘤药用于临床 对多种癌症具有较好的疗效 4 5 4 7 p y m 是一种新的 诱变剂 在许多实验中均被证明为具有安全 高效 诱变频率高 范围大等特点 与 e m s 相比 表现为诱变特点相近 在某些方面优于e m s 很具有开发和应用前景 4 p 许耀奎等 1 9 9 4 m 实验结果表明 平阳霉素是一种有效的诱变剂 它不仅能够 引起较高频率的染色体畸变 对m 植株有较强的抑制作用 而且能够使m 2 产生较高 频率的性状变异 为其应用于作物新品种选育提供了依据 夏英武等 1 9 9 7 4 9 用0 5 1 0 1 5 2 0 和2 5i ig m l 的平阳霉素处理水稻种子 结果表明 平阳霉素在m l 能 引起较高频率的染色体畸变 并对种子发芽 幼苗生长 植株结实等产生不同程度的 损伤效应 在m 2 能诱发频率较高的叶绿素 株高与抽穗期突交 三者的总突变频率 以浓度为1 5 ig m l 的最高 4 1 2 4 亚硝基胍 n n g n 甲基 n 硝基 n 亚硝基胍 n n g 是一种烷化剂 由于其突出的诱变效果 被称为 超诱变剂 其作用机制为 通过烷化基团使d n a 子上的碱基或磷酸部 分发生烷化作用 d n a 复制时导致碱基配对错误而引起突变 引起d n a 分子中磷酸 和糖之间的共价键发生断裂 使两个鸟嘌呤n 7 位点形成共价键 一般双功能烷化剂 易引起d n a 双链间的交联 形成变异或死亡 可能造成染色体畸变 5 甜 n n g 的化学性质活泼 不太稳定 水溶液中易水解 半衰期短 应用棕色瓶盛 药 并放在干燥器中 冰箱保存 配制时要用一定范围的缓冲液 现配现用 n n g 杀菌率低 诱变效应高 实际使用时可以低浓度较长时间处理 而获得较高的突变率 叶勇等 2 0 0 3 瞄副研究不同浓度的亚硝基胍 n n g 对雨生红球藻7 9 7 株的影响 结 果证明 加入不同浓度的n n g 后 静细胞数占总细胞数的比例均有所下降 叶绿素a 叶绿素b 总胡萝h 素 虾青素的积累都有增多 并且当n n g 浓度为1 0 l im o f l 时 虾 青素含量无论是以体积计还是以单位细胞计均达到最高 分别提高7 2 和1 0 5 6 孟 庆繁等 2 0 0 4 硎以兽疫链球菌c 5 5 1 5 1 为原始菌种 经亚硝基胍 n n g 诱变处理 获得一株高产透明质酸 h y a l u r o n i ca c i d h a 的变异株j 1 8 其h a 产量较原始株提高 一倍 1 2 5 其它化学诱变方法 除了上述四种化学诱变剂外 还有许多化学诱变方法被研究者们所应用 徐晓军 等 2 0 0 4 5 5 用盐酸羟胺将氧化铁硫杆菌优势菌 t f 菌 化学诱变后对低品位黄铜矿进 行细菌浸出 实验表明 盐酸羟胺化学诱变能够使t f 菌产生较明显的变异 能较好 地提高菌种的活性和对低品位黄铜矿的生物浸出性能 陈新征等 2 0 0 5 5 6 用硫酸二 乙酯诱变生产d 核糖的转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌 得一突变菌株 其d 核糖产量 较出发菌株提高8 1 6 9 21 3 一葡聚糖酶及其在畜禽生产中的应用研究 2 1 b 一葡聚糖酶的分子生物学 b 一葡聚糖酶 p g u c a n a s e 是酶系家族 有1 3 1 4 p 葡聚糖酶 1 3 b 葡聚糖 酶 1 2 1 4 b 葡聚糖酶 1 4 b 葡聚糖酶和1 3 1 6 b 葡聚糖彰5 7 5 9 1 谷物种籽在 其发芽过程中能产生b 1 3 和1 3 1 4 葡聚糖酶 b 葡聚糖酶也可由细菌 如枯草芽孢 杆菌 b a c i l l u ss u b t i l i s 地衣芽孢杆菌 b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 真菌 如黑曲霉 a s p e r g i l l u sn i g e r 米曲霉 a s p e r g i l l u so r y z a e 臭曲霉 a s p e r g i l l u sf o e t i d u s 冻土毛 霉 m u e o rl i i 锄a l i s 和瘤胃微生物产生 6 0 6 1 2 1 1b 一葡聚糖酶的酶学性质 p 一葡聚糖酶的分子量因来源不同而有差异 那冰等对小黑麦检测得出的b 葡聚 糖酶分子量分别为5 1 k d 和2 3 k d 6 2 1 孙斌等 2 0 0 4 6 3 1 从小麦叶片中提取出的b 葡聚 5 糖酶的分子量为5 2 o 5 3 6 k d a 黎柳君等 2 0 0 6 1 6 4 从青稞中提取出的1 3 葡聚糖酶 与小麦的1 3 葡聚糖酶有所不同 青稞1 3 葡聚糖酶的分子量为2 7 k d a 据报道 植物 1 3 葡聚糖酶和微生物b 葡聚糖酶在氨基酸序列和三维结构上没有同源性和相关性 但却有相同的底物专一性 是对同一底物专一性的同向进化 6 而微生物性b 葡聚 糖酶之间基因结构相似 核甘酸和氨基酸序列有一定的同源性 唐治玉等 2 0 0 6 叫 测得木霉且 葡聚糖酶的分子量为8 0 1 3 7 k d 路梅等 2 0 0 2 6 实验得出嗜热毛壳菌 内切b 葡聚糖酶的分子量为6 7 8 k d 6 9 8 k d 吕文平等 2 0 0 4 6 哪计算出1 3 葡聚糖 酶的分子量为2 6 9 8 k d 万平平等 2 0 0 6 渺钡4 得拮抗链霉菌该酶p 葡聚糖酶的分子 量为4 1 3 k d 不同来源的b 葡聚糖酶的最适p h 范围不同 大多数纯化了的1 3 一葡聚糖酶的最适 p h 在3 7 之间 据报道 小麦b 葡聚糖酶p h i 6 o 6 3 桑粒肩天牛幼虫1 3 葡聚糖酶 p h y 9 5 2 7 0 1 黑曲霉b 葡聚糖酶p h 为3 6 7 1 1 木霉 土曲霉 葡聚糖酶p h 为5 0 6 6 6 9 短小芽孢杆菌b 葡聚糖酶p h 为5 左右 6 8 淀粉液化芽孢杆菌b 葡聚糖酶p h 为6 5 7 2 1 而这些不同来源1 3 葡聚糖酶的适宜温度范围则差异不大 大都在4 0 5 5 c 多数实 验表明 c a 2 n a z n 2 对b 葡聚糖酶酶活力具有激活作用 而c u 2 f e 3 m n 2 对b 葡聚糖酶酶活力具有抑制作用 6 6 6 7 6 9 7 2 2 1 2p 一葡聚糖酶的结构与功能 细菌所产的b 1 3 1 4 葡聚糖酶 e c3 2 1 7 3 能有效降解谷物中的1 3 葡聚糖 但 它在结构上不周于植物所产酶 它属于糖苷水解酶1 6 家族p 引 蛋白质中心由两个b 折叠堆砌在其顶端构成两个三明治样式 中心处由7 条经弯曲的反向平行链通过蛋白 质一端构成一个裂隙 在分子裂隙的凹段 被视为是低聚糖底物的结合位点 在其壁 上线性排列了大量的芳香族残基 顶端则分布着一些酸式催化残基 这些催化残基都 分布于同一条定时发生极性与非极性转换的9 链上 该链的第一个催化残基指向蛋白 质分子表面 此处可以使其与底物相互结合 其后部的则指向疏水的分子内耐7 4 2 21 3 一葡聚糖酶的作用机理 大部分谷物都含有鼻 葡聚糖 大麦和燕麦中含量较高 常见结构是由许多葡萄 糖单位通过1 3 1 3 和b 1 确电形成的直链结构 7 5 1 1 3 葡聚糖的性质常受提取条件的影 响 高温提取的b 葡聚糖比在4 0 时提取的粘度更高 混合链b 葡聚糖的典型结构 如下 1 3 g l u p 1 4 1 3 一t 3 一g l u p 一 p 1 3 b g l u p 一 1 4 一p g l u p p 葡聚糖的理化特征与其结构密切相关 由于b 1 3 和 1 4 混合键的存在 其溶液呈现许多独特的物理化学特性 如粘度增大 表面活性增强 吸水性和持水性 6 增高 吸附阳离子和有机物等 从而影响动物的消化过程 7 6 1 8 葡聚糖酶水解对绝对要求其底物具有邻接的1 3 和1 4 昼一葡萄糖残基 只 水解在c o 3 位被取代 o 表示羟基氧 的葡萄吡喃糖单元中的b 1 4 一糖苷键 1 3 葡聚 糖主要结构型式为g 4 g 3 g 4 g 4 g 4 g 3 g 4 g 4 g 3 g 4 g r e d g 代表b 葡糖残基 数字代表 1 3 或1 4 且 糖苷键 r e d 代表还原未端 独特的3 o 1 3 纤维二糖 d 葡萄糖 g 4 g 3 g r e d 与3 0 b 纤维三糖 d 葡萄糖 g 4 g 4 g 3 g r e d 是水解的主要低聚产物 1 7 2 31 3 一葡聚糖酶的应用意义 2 3 1 口一葡聚糖及其抗营养作用 e 葡聚糖是谷物 特别是大麦 的主要非淀粉多糖 n s p 它的粘稠性是谷物中的 主要抗营养特性 影响且 葡聚糖的抗营养作用的主要物理化学特性有 粘度 在 低浓度时 b 葡聚糖与水分子相互作用增加了溶液的粘度 随着其浓度的增加 则 b 葡聚糖分子本身缠成网状结构 引起溶液粘度大大增加 当达到一定程度时可能 形成凝胶 亲水性 b 葡聚糖具有高亲水性 通过其网状结构的形成吸收大量的 水分 而改变肠内容物的特性 增加对肠蠕动的抵抗力 表面活性 b 葡聚糖表 面带有负电荷 在溶液中易与食糜表面结合 从而影响养分的吸收 吸附性 1 3 葡聚糖对有机质和矿物离子 如ca z n 2 n 矿 具有较强的吸附能力 从而影响这 些物质的代谢 2 3 2b 一葡聚糖酶在动物生产中的应用研究 2 3 2 1b 葡聚糖酶在猪生产中的应用研究 大麦及其糠麸类饲料中含有的大量可溶性非淀粉多糖等抗营养因子 使用口 葡聚 糖酶酶制剂 能有效降低消化道内容物的粘度 使饲料营养物质的消化转移至肠道进 行 提高内源性消化酶的活性 由此促进猪对养分的消化吸收 提高饲料利用率 促 进动物的生长 俞颂东等 2 0 0 0 r 碍 报道 大麦日粮中添加p 葡聚糖酶对仔猪的影 响为 仔猪十二指肠内容物中葡萄糖和胆汁酸含量试验组分别提高了4 8 9 1 p 0 0 1 和7 3 5 0 俨 o 0 1 空肠内容物粘度降低了6 3 1 p o 0 5 空肠粘膜绒毛和微绒 毛高度分别提高了5 0 0 0 p o 0 1 和5 5 9 1 0 o i 粘膜层变薄 为对照组的 7 2 0 0 p o o i 此外 大肠杆菌数和仔猪腹泻率也分别降低了6 9 8 0 p o 0 5 和 6 2 5 9 p 0 0 5 余东游 2 0 0 1 7 9 对1 8 0 头仔猪和中猪的饲养试验结果表明 与 对照组相比 饲粮中添加b 一葡聚糖酶制剂使仔猪和中猪的日增重分别提高了2 0 6 6 和1 1 5 6 料重比分别降低了8 8 7 并f l1 3 6 1 经济效益分析结果显示 加酶组仔 猪和中猪的单位体增重饲料成本比不加酶组分别下降了8 4 4 和1 3 2 6 冯定远等 揶 1 9 9 8 研究结果为 添加d 一葡聚糖酶为主的复合酶制剂 试验组比对照组平均日增 重高6 p o 0 5 试验组料肉比对照组降低了3 a 1 李卫芬等 1 9 9 9 8 1 1 实验表 明 从猪的日增重 采食量和料重比看 大麦加酶组与玉米组之间无明显差异 但大 7 麦加酶组猪每千克增重饲料成本较玉米组降低了1 1 1 l 由此说明 添加b 葡聚糖 酶的大麦型饲粮不仅完全能达到玉米型饲粮的饲养效果 而且还能提高养猪业的经济 效益 2 3 2 2 且一葡聚糖酶在家禽生产中的应用研究 非淀粉多糖酶不存在于家禽等单胃动物体内 外源添加n s p 酶制剂 可以改善 麦类日粮在家禽上的营养价值 提高营养物质的消化率 提高表观代谢能 降低食糜 粘度 降低排泄量 增进健康等 8 2 韩正康 2 0 0 0 嗍研究表明 在大麦基础日粮 中适当添加p 葡聚糖酶制剂可使 雄雏鸡 7 2 1 日龄 肉用仔鸡 1 4 2 日龄 生长鹅 7 6 0 日龄 及肉鸭 1 4 2 日龄 均不同程度地提高增重和饲料利用率 食糜的粘度降低 通过消化道的速度加快 改善了消化机能 生长激素 g h 胰 岛素样生长因子i i g h i t 3 t s h 胰岛素等与生长关系密切的代谢激素含量均 显著高于大麦日粮对照组 测定他1 日龄雏鸡t 淋巴细胞转化率提高3 0 0 1 p 0 0 5 2 8 日龄提高7 4 1 5 p 0 0 1 机体的细胞免疫力显著提高 吕玉丽等脚 1 9 9 9 在5 0 大麦的产蛋鸡饲粮中 加入b 葡聚糖酶 实验证明其可替代常规玉 米型饲粮饲喂蛋鸡 并且产蛋性能有所提高 饲料价格可下降0 11 元 l g 2 3 2 31 3 一葡聚糖酶在水产动物生产中的应用研究 目前 对1 3 一葡聚糖酶的应用研究主要集中于畜禽 有关t 3 一葡聚糖酶在水产上的 应用研究很少 在家鱼饲料中 次粉 小麦等麦类原料既作为饲料粘合剂 又作为能 量物质 在水产日粮中的应用相当普遍 徐国武等 2 0 0 0 t 8 5 j 痔1 3 葡聚糖酶加入含大 麦3 5 的鲤鱼日粮中 结果表明 试验组鲤鱼的增重率较对照组鲤鱼提高了1 8 6 2 饵料系数降低了5 6 鲤鱼粗蛋白的利用率提高了5 0 8 p 0 0 5 粗脂肪的利用 率提高了5 4 5 p o 0 5 另外 从中也能推出试验组鲤鱼较对照组的采食量高 干 物质和粗纤维的利用率均有提高 高春生等 2 0 0 6 8 6 试验研究了饲料中添加b 葡聚 糖酶 5 0 0i u k g 对草鱼 初始体质量约4 1 曲生长性能 饲料消化率和体成分的影响 结果表明 饲料中添加1 3 一葡聚糖酶 草鱼平均增重率提高1 6 5 1 p 0 0 5 干物质消化率提高7 2 7 p 0 0 5 粗蛋白消化率提高7 3 2 p o 0 5 粗纤维消化率提高1 3 6 0 p 2 6 1 0 n e m 2 之间时 氮离子注入到孢子内 由于能量沉积和动量传递 导致d n a 直接或间接损伤或断裂 在黑曲霉本身的修复酶系作用下 使断裂的d n a 重新组合 在这两个剂量之间 由于剂量并不是很大 对d n a 的损伤 也并不是很严重 所以 很可能就筛选到正突变较高的菌株 随着注入剂量的增加 对生物体不可避免地造成 新的物理 化学损伤 在大剂量注入下的能量沉积效应和动量传递的结果将使得d n a 及生物膜等生物大分子的损伤大大超过质量 电荷的保护和刺激效应及细胞本身的修 复能力 结果导致正突变率下降 负突变增加 较好的突变菌株很少出现在这个区域 的剂量下 从上面的研究结果可以看出 当能量为1 5 k e v 注入剂量在3 0 2 6 x 1 0 n e m 2 和9 0 2 6 1 0 1 3 n c r n 2 之间时 对于b 葡聚糖酶产生菌黑曲霉的诱变效 果较好 与吕树娟等 2 0 0 3 1 1 3 报道的有些出入 其利用离子注入氧化葡萄糖酸杆 菌 实验得出获得较高正负突变率的注入剂量范围恰好对应在存活率为3 0 左右的 马鞍 上 4 4 不同发酵培养基对黑曲霉a n l 产酶性能的影响 碳源和氮源的添加量及碳氮比对菌株的生长和产酶有直接关系 碳氮比 c n 偏 低 菌体生长旺盛 易造成菌体提前衰老自溶 不利于产物积累 碳氮比偏高 菌体 数量少 也不利于产物积累 因此选择并控制适宜的碳氮比也是提高酶产量的 个重 要因素 1 1 4 试验分析了培养基中各单因素对产酶的影响 但往往各个因素之间的差 别较大 通过正交试验即可以确定合适的碳氮比 也可以从多个因素中分析主次 分 析各因素对产酶的影响规律 从而得出较优的产酶培养基 1 3 葡聚糖对b 葡聚糖酶 具有一定的诱导作用 在环境中无b 葡聚糖存在时 1 3 葡聚糖酶仅有少量合成并向 细胞外释放 当外界加入一定量的1 3 葡聚糖时 由于该糖分子量较大 一般在 1 5 0 0 0 0 2 9 0 0 0 0 不能进入细胞 只能被释放到胞外的 少量的b 葡聚糖酶分解 产生小分子产物如寡糖或二糖 单糖等 随着小分子产物的积聚 经渗透作用进入细 胞 从而对1 3 葡聚糖酶产生诱导作用 于是b 葡聚糖酶便大量合成 由于诱导作用 的影响 在发酵培养基中添加适量的p 葡聚糖会对产酶有利 然而 从大麦中提取 b 葡聚糖的工艺复杂 添加纯化的大麦b 葡聚糖会增加产品的成本 本研究直接使 用廉价的大麦粉为原料 既提供了可利用碳源 又补充了培养基中诱导 葡聚糖酶 产生的1 3 葡聚糖成分 方法简便易行 并且能降低产品的成本 本试验研究表明 大麦粉是最佳的碳源 豆粕为最佳有机氮源 硫酸铵为最佳无机氮源 与阚劲松等 2 0 0 5 l l 5 1 报道的相一致 另有研究表明 玉米浆为最佳有机氮源 3 1 1 0 s 贺小贤等 2 0 0 3 1 1 6 对黑曲霉产b 葡聚糖酶培养基进行研究 确定了培养基中最佳碳源为3 大麦粉 最佳氮源为2 酵母粉和0 2 的硫酸铵 本试验结果还表明 整体上无机氮 源对b 葡聚糖酶活性的调节明显弱于有机氮源 这不仅因为有机氮源作为一种诱导 物 而且还直接提供霉菌生长所必需的氨基酸 生长因子 此外 试验所选用的豆粕 粉是一种粗制品 本身也含有一定的量的无机盐类 从而一定程度上限制了所添加无 机氮盐的效果 工业生产中应用的是轻质碳酸钙 几乎呈中性 可调节发酵液的p h 值 而且钙 离子能调节细胞透性 对p 葡聚糖酶也有一定的激活作用 7 1 任海霞等 2 0 0 5 1 0 s 报道的c a c 0 3 最佳添加量为0 5 9 m o m l 从本试验结果可以看出 随着c a c 0 3 添加量 的增加 菌株产酶性能急剧上升 当添加量高于0 4 9 1 0 0 m l 时 菌株产酶性能下降缓 慢 对细胞来说 u g 是金属离子当中较为重要的一种 它是许多酶活性中心不可缺 少的一部分 铁则是生命活动必需元素之一 也是一些酶的辅基 f e 2 过量或不足都 会影响b 葡聚糖酶的活性 李平等 1 9 9 9 嵋 对黑曲霉生产b 葡萄糖苷酶发酵条件 进行研究 结果表明 m g s 0 4 7 h 2 0 和f e s 0 4 7 h 2 0 的最适添加量分别为0 0 4 和 5 m g l 1 由本试验结果可知 m g s 0 4 7 h 2 0 和f e s 0 4 7 h 2 0 最佳添加量分别为0 0 3 和0 0 0 1 其中f e s 0 4 7 h 2 0 的添加量与上述报道差异较大 但与任海霞等 2 0 0 5 u 删报道的相一致 细胞内b 葡聚糖酶的合成是受严格代谢控制的 当细胞内合成的 1 3 一葡聚糖酶浓度达到一定水平时 由于