（食品科学专业论文）鸡蛋清中溶菌酶的提取、性质及在乳制品中的应用研究.pdf

高兴华 摘要 东北农业大学 摘要 本课题以 鸡蛋 综合利用为目 的， 提取其中 有用的 微量成分溶菌酶，并 对其性质及在乳 制品中的 应用进行研究。 鸡蛋清中 溶菌酶的 提取采用离子交换树脂吸附法，不仅对蛋清功自 日 待 性影响小， 而且 工艺简单，成本低，酶提取率高，酶活力也较高 艺 条 件为: p h 7 .0 . 搅拌吸附3 .5 h . 1 m o v l n a c l o (tv 旨 吸 附 耀 克 雷伯氏 杆菌属、 志贺氏 杆菌属、 奈瑟球菌属、 假单抱菌属、巴 斯德菌属、 欧文氏 菌属对溶菌酶相 对敏感; 弧菌 属、 变形 杆菌 属 对溶菌 酶 不敏感。 v e d im in a ( 1 9 7 9 ) 测 定了4 7 6 种g 一 菌 对 溶菌 酶的 敏感 性， 发 现霍乱弧菌属和假单抱菌属对溶菌酶抗性较高， 气单抱菌属、 埃希氏大肠杆菌和 n a g 一弧菌对溶菌酶有不同的敏感性。 v a k il e t a l ( 1 9 6 9 ) 研究发 现牛 乳中 八 种g 杆菌: 溶壁 微 球菌、 乳 链球 菌、 干酪乳 杆菌、 金黄色葡萄球菌、 藤黄八叠球菌、 粪链球菌、 短杆菌、 葡萄杆菌和五种g 一菌: 埃希氏 大肠杆菌、 s e r r a t i a m a r c e s s e n s 、 脆弱变形杆菌、 荧光假单 抱杆菌、 绿脓假单抱菌 对牛乳中 细胞壁质酶敏感， 除乳酸菌类细菌 ( 干酪乳杆菌、 乳链球菌) 外都对人乳中 胞 壁质 酶 敏感。 s h a h a n i ( 1 9 7 0 ) 发 现牛 乳和人乳 溶菌 酶可 溶 解1 3 种 细 菌 的 细 胞壁。 h u g h e y a n d j o h n s o n ( 1 9 8 7 ) 证明 嗜 热解 糖梭菌( 腐败菌) 对 溶菌 酶 非常 敏感， 嗜 热脂 肪芽 抱杆 菌 和 酪丁 酸梭菌 对溶菌 酶也 很敏感. g e o r g e ( 1 9 5 5 ) 发 现 绿脓 假单 抱菌经丙 酮或一定 热 处理后对溶菌酶敏感性增加。 溶菌酶对一些病原菌如g 球菌、 链 球菌、 伤寒杆菌 、 炭 疽杆菌等具有一定的杀菌效果 ( 朱佳珍，1 9 9 2 ) ， 对大肠杆菌、 普通变形菌 ( 腐败菌) 、 副溶血性弧菌等g - 菌也有一定的分解作用， 其最有效的溶菌浓 度为0 .0 5 % 刘宗柱， 1 9 9 7 ) 0 溶菌酶对酪丁酸梭菌有很强的 抑制作用。酪丁酸梭菌是引 起干酪后期胀气的 主要 腐败菌， 尤其是硬质干酪生产时， 酪丁酸梭菌发醉干酪中的 乳酸盐产生二氧化 碳、 氢气、 丁酸 和乙 酸.内部 气体聚集导致干酪 爆裂或产生裂缝， 造成质地劣化。 溶菌 酶可有效抑 制干酪的后期胀气，且不会影响发酵剂中的微生物和干酪成熟过程中的有益微生物 ( c a r in i e t a l , 1 9 8 5 ) . g a r d n e r a n d n ik o o p o u r ( 1 9 6 9 ) 研究 发 现1 % 溶菌 酶可 延 长荧 光假 单 抱菌 迟 滞期， 初始菌 数减少9 6 % . t e o t ia a n d m i l le r ( 1 9 7 5 ) 研究 发 现2 2 c , 0 . 1 % 的 溶 菌酶在3 h 就可完全除掉火鸡腿和胭体上污染的 沙门氏 菌。 b o t t a a i ( 1 9 7 8 ) 研究了 溶菌 酶 对耐 热乳酸菌的 溶解 作 用. 乳 清中 天然 乳酸菌 对溶菌 酶非 常敏感， 溶菌酶浓度高于。 川% 后， 其浓度与溶菌作用成正比 例。一些发酵乳杆菌 在 有0 .0 3 % 的 溶菌酶的m r s培 养基 上仍能 生 长( c u n n in 助a m , 1 9 9 1 ) . 溶菌 酶 对乳中 腐败菌 和致病菌的破坏作用强于产乳酸细菌， 实际上较 低浓 度的 溶菌酶能促进两种千酪 生产菌、 乳脂链球菌的生长 ( a k s h i , 1 9 7 2 x ) 。 千酪乳杆菌、 变形链球菌细胞在稳定期 较对数生长期易 被溶解 ( c u n n i n g h a m , 1 9 9 1 ) 。当 培养基 ( 生长介质)中有化学物质时 产 乳 酸细 菌 对溶 菌酶较敏感( c h a s s y , 1 9 8 0 ) . 单核增生李斯特菌是一种重要的食源性病原菌。单核增生李斯特菌对溶菌酶的敏 感程度与该菌的生理状态及其所在的介质或食品成分有关，低温下生长的菌体细胞比常 温下生长的菌体细胞对溶菌酶更敏感( 徐德斌，1 9 9 2 ) . v i r g i n i a ( 1 9 8 9 ) 发现溶菌酶可杀死 或抑制一些食品中单核增生李斯特菌s c o tt a的生长。 溶菌酶中 加入三聚磷酸盐、 e d t a . 乳铁蛋白、转铁蛋白、 n i s i n时溶菌酶对单核增生李 斯特菌的抑制作用会加强 ( s i m , 1 9 9 4 ) ,溶菌酶对蔬菜中单核增生李斯特菌的抑制作用强于对动物性食品中的单核增生 李斯特菌的抑制作用。 一些低酸性食品中肉毒梭菌是主要的污染菌， 它可以产生肉毒毒素而危害人体健 康 ( c o n n e r e t a l , 1 9 8 9 ) 。溶菌酶也可杀死或抑制培养基上或一些食品中肉 毒梭菌芽 抱 或营养细胞的生长繁殖，溶菌酶与一些鳌合剂 ( 如 e d t a , d t p a ) 、三聚磷酸盐、山梨 酸钾、 对轻基苯等协同作用， 其杀菌效果更强 ( s i m , 1 9 9 4 ) 0 溶菌酶对一些酵母菌也有抑制作用，因为一些酵母的细胞壁含有几一j 质，可被溶 菌 酶作 用。许 多 酵 母菌 生长 在 低p h条件下并 产生 气体、 乙 醇 和 其它 一 些在食品中 不希 望的物质，导 致食品腐败变质 ( f r a z i e r a n d w e s t h o ff , 1 9 9 8 ) 。某 些酵 母还对人体有致病 性，如白 色假丝酵母。 b a r b a r a a n d p e lle g r in i ( 1 9 7 6 ) 发现溶菌酶对白 色假丝酵母和 c r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s 有抑制作用， 李秀辉 ( 2 0 0 0 ) .y 研究表明 溶菌酶对白 色假丝 酵母和新生隐球菌有抑制作用， s i m ( 1 9 9 4 ) 认为溶菌酶与溶血卵磷脂或多聚 l - 赖氨 酸共同 作用对啤酒搪酵母、 鲁氏 结合糖酵母、克 鲁斯氏 假丝酵 母、白 色假丝酵母、 新型 隐球酵母的抑制效果较好。 由 于溶菌酶对g 菌作用强于g 一菌， 所以 可通过化学改性或加热改性来提高溶菌 酶的 抑菌能力， 扩大抑菌谱。因为g 一菌的细胞壁中 肤聚糖含 量较少且被其他一些膜类 物质覆盖，这些膜物质的主要成分为脂多糖，溶菌酶很难进入g 一菌的细胞壁肤聚糖层 进行作用 ( f r a z i e r e t a l , 1 9 9 8 ) 。近来一些学者发 现对溶菌酶 进行适当的改 性或蛋白 修 饰可增强 溶菌酶对g 一菌的抑制作用。 溶菌 酶的 化学改 性主要采用化学修饰法和加热改 性两种方法。 化学修饰法是在溶菌酶的蛋白 分子上结合某些含疏水性基团的 化学物质， 如多 搪 ( n a k a m u r a , 1 9 9 0 , 1 9 9 1 : n a k a m u r a , 1 9 9 2 , 1 9 9 4 ; h is h a m , 1 9 9 4 ) , 脂酞 基( h i s h a m , 1 9 9 1 ; h is h a m . 1 9 9 3 ; c a r m e n , 1 9 9 4 ; k in g e t a l , 1 9 8 9 ; t a k a h a s h i , 2 0 0 0 ) , 疏 水性 肚 ( h i s h a m , 1 9 9 2 ) 等，增加溶菌酶的 乳化能力， 可增强溶菌酶对 g 一菌的抑制作用。 加热改 性是指溶菌酶在一定的 温度下加热一定时间， 使溶菌 酶部分变性，对 g 菌抑制 作mwimm不士.伯对 c. -菌的抑制作用显著增强 ( h i s h a m. 1 9 9 6 : l b r a h a m e t a l, 1 9 9 6 ) , 4 溶菌酶的性质及应用 溶菌 酶 ( l y s o z y m e , e c 3 .2 . 1 . 1 7 ) 又 称作胞 壁质 酶 ( m u r e m id a s e ) 或n - 胞壁质 聚糖 水 解酶， 它是一 种碱性蛋白 酶， 易 溶于水， 在 普 通有 机 溶 剂中 不 溶， 略 有甜 味 ( m a e h a s h i . 1 9 9 8 ) , 鸡蛋 清溶菌 酶是由1 2 9 个氨基酸 残 基 组 成的 单 条 肚 链蛋白 质， 共1 9 5 0 个原子， 分子内 有四 个二硫键交联， 分子量约为 1 4 7 0 0 d a ，等电 点约为 1 0 .51 1 . 0 ，分子为椭球 形， 大小 约为4 5 x 3 0 x 3 0 a ( s i m , 1 9 9 4 ) ， 最适 温 度为5 0 c ， 最 适p h 值为6 - 7 左右 ( 日船 津胜鹤 大典.1 9 8 2 ) . 高兴华 鸡蛋清中 溶菌醉的提取性质及在乳制品中的应用 研究 东北农业大学 溶菌酶在 酸性条 件下p h 4 .5 - 4 .7 范围内 易 形 成晶 体 ( s a lt o n , 1 9 5 7 ) . 酶的 结 构不很 紧密，大多数极性基分布在表面， 便于与溶剂 ( 小分子) 结合。 酶的整个分子中有一个 狭长的凹陷， 最适小分子底物与 酶结合时， 正好与此长形凹陷 镶嵌， 凹陷中的谷氨酸3 5 与天冬氨酸 5 2 、色氨酸是活性中心的氨基酸残基 ( 刘军，1 9 9 4 ) . 溶菌酶是最早被测定 其三维结构的酶， 现在对溶菌酶的 研究已 达到原 子水 平 ( p h i l ip , 1 9 6 6 ; a ld e rt o n a n d f e v o l d , 1 9 4 6 ) .溶菌酶广泛存在于许多动物组织分泌物、蛋清、微生物及一些植物如 卷心菜、木瓜、萝 卜 、芜将等中. 溶菌酶的 化学性质非常 稳定 ， p h 值 在1 .2 - 1 1 .3 范围内 剧烈 变 化时 其结构儿乎不 变。 溶菌 酶在酸 性条 件下 遇热较稳定， 在p h 4 .5 , 1 0 0 加 热3 0 m in活力 仍维持 稳定 ， 碱性 条 件下 热稳定 性 差， 高 温处 理时， 酶 活力 降 低( c u n n in g h a m , 1 9 9 1 ; 李冬 梅， 1 9 9 9 ; c o tt e r i l l , 1 9 5 4 ) ,溶菌酶的热变性是可逆的， 其变性临界点是 7 7 c 。丙酮、乙醚和乙醇可将水溶 液中的溶菌酶沉淀而不破坏其活性，s d s等表面活性剂及碘等可阻抑其活性 ( 黄文涛 等，1 9 8 9 ) 鸡蛋清是生产溶菌酶的主要来源，鸡蛋清中溶菌酶的含量约占蛋白总量的 3 .4 - -3 . 5 %，特别是卵清内外层稀液中溶菌酶含量较高 ( 吴定，路桂红，1 9 9 6 ) 。鸡蛋清 溶菌 酶作为 溶菌酶的典型代表，是目 前重点研究对象 ( 朱 奇，1 9 9 8 ) 0 溶菌酶在 3 7 时 其生物学活性可保持 6 h ，当 温度较低时保持时间更长 ( 朱 佳珍，1 9 9 2 ) ， 这是溶菌酶在 体内 起作用的基础. 溶菌酶既是药品， 又是保健品， 还是生 化药物中理想的药用酶，国 外己 经开始应用于药物制剂、 食品和饮料的添加剂、 生化试剂和医学诊断剂等 ( 陈兵， 1 9 9 4 ) 0 溶菌酶在医学上的应用最多，它与静菌剂并用可大大提高抗菌力，如溶菌酶中添 加甘油、癸酸脂、 六偏磷酸钠调 和的 静菌剂对大 肠杆菌 和芽抱菌的 溶菌效果特优。 抓化 溶菌 酶医疗效果更广， 有浓痰分散、出 血抑制、 组织修复、 消炎镇痛、 抗过滤性病毒等 作用， 因而用抓化溶菌酶的 制药有消炎消痔、治感冒、 皮肤病及眼、 鼻、喉等用药 ( 邹 中 华，1 9 9 4 ) .口 腔中主要的 龋齿病原菌是突变链球菌， 溶菌 酶可有效抑制突变链球菌 的生长繁殖，防止龋齿的发生。目 前日 本已有含溶菌酶的牙青生产。 溶菌酶作为一种无毒无害蛋白 质， 还是一种安全性很高的杀菌剂，应用于食品工 业中作为防腐剂。 溶菌醉作为防腐剂有以 下 优点 ( s i m , 1 9 9 4 ) : ( d 溶菌酶是很稳定的蛋白 质， 有较强的 抗热性。 蛋清溶菌 酶是 c型，是己 知的 最耐热的酶; ( 2 ) 溶菌酶不会因为有机溶剂的处理而失活，当 转移到水溶液中时，溶菌酶的活 力可全部恢复: ( 3 ) 溶菌酶可被冷冻或干澡处理， 且活 力稳定; ( 4 ) 溶菌 酶 适宜p h 5 .3 - 6 .4 , ， 可 用于 低酸 性 食品 防 腐; ( 5 ) 溶菌酶生产成本较低; ( 6 ) 溶菌 酶的 抗菌谱较广，不仅 局限于g 菌， 对部分g 一菌也有抑制效果; ( 7 ) 溶菌酶作为防腐剂安全性高。 溶菌 酶是一种天然蛋白 质， 1 9 9 2 年f a o w t o的 食品添加剂协会己经认定溶菌醛在食品中 应用是安全的。 硕士学位论文 前言 东北农业大学 溶菌酶作为防腐剂应用在食品中的研究日 本 较多，且有许多 专利。 新鲜蔬菜、水 果、 鱼肉 等均可用涂溶菌酶溶液来防腐。 溶菌 酶与食盐水溶液处理蚝、 虾和 其它海洋食 品， 在 冷藏条件下贮藏， 可 起到防腐作用 ( c u n n in g h a m , 1 9 9 1 ; 郭本 恒等，1 9 9 6 ; 郭 本恒等，1 9 9 8 ) 。鱼糕、 糕点、 酒类、 新鲜水产品等也可用溶菌酶来防腐。 y a j im a ( 1 9 6 8 ) 发 现溶菌 酶是日 本 清酒中 火 落菌 ( 一 种 乳酸菌) 的 强 抑制剂。 v c h id a ( 1 9 7 2 ) 用溶 菌酶抑制 m ir in l iq u o r ( 一 种日 本 料酒) 中火 落菌， 添加。 0 2 % 溶菌 酶即 可 完全抑制火落菌生长，室温贮藏一年溶菌酶活力仍保持 9 5 %以上。6 5 c 巴氏杀菌 5 h , 对 溶菌 酶活力 影响不大。 室 温下 一年 后酶活力 仍 保 持8 5 % ( c u n n in g h a m , 1 9 9 1 ) . n a k a g a w a a n d m a e s h ig i ( 1 9 8 0 ) 在土 豆 色拉中 添加 1 .5 % 的 商品 溶菌酶 一甘 氨酸 复合 物， 货 架期由 2 3 h延长到 4 3 h ( 3 5 c - 3 7 c ) . 溶菌酶还可降低罐头食品 杀菌温度。 章银良( 1 9 9 9 ) 用 溶菌酶对草墓保鲜， 可降 低草墓烂果率和失重， 与 甘氨酸复 配使用效果更好。 溶菌 酶在 果蔬汁饮料中 也能起到防 腐保鲜作用( 林亲录。王德安，1 9 9 4 ) , 溶菌酶对干 酪防 腐研究 得最多。 v a k i l ( 1 9 6 9 ) 研究得出 结 论: 溶菌 酶是重要 的乳的 天 然抗 菌物。 b a k r i a n d w o l f e ( 1 9 7 1 ) 发 现溶菌 酶 可 使酪蛋白 胶束不 稳定， 其机理 类似于 凝乳酶而引起酪蛋白降 解。 k i a z a e t a l ( 1 9 7 4 ) 认为溶菌酶能增加乳蛋白的消化。 干酪生 产中丁酸菌的污染使干酪胀气，不能食用，为解决这个问题生产者必需应用不含丁酸菌 的 牛乳或减少干酪制造乳中丁 酸菌的 抱子数。w a s s e r f a l l ( 1 9 7 6 ) 认为目 前唯一合适的 方 法是提高乳质量和应用溶菌酶.他在制造e d m a 干酪时在加入凝乳酶之前加入溶菌酶悬 浮液 ( 5 0 0 u l m l 即0 .6 % 的蛋清) ，发 现可防止 干酪后期胀气. 干酪感官上无变化， 对干 酪生产也无影响。 溶菌 酶对肉 制品 的防 腐作 用也 有 研究。 a k a s h i ( 1 9 6 9 , 1 9 7 0 . 1 9 7 1 ) 对溶菌 酶 添加 于熟香肠、色拉米香肠和维也 纳香肠后的防 腐作 用进行了 一系列的 研究，发现加热处理 后 溶菌 酶 ( l z ) , n a c l , n a n o 2 三者结 合 ( 3 % n a c 1+ 0 .0 1 2 5 o/ a n a n o , 十 。 0 5 % - 0 .2 o/ l z ) 较单 独 应用0 .2 0/ a 溶菌酶 或 用3 % n a c l + 0 .0 1 2 5 % n a n o 2 效 果 好， 未 经 加热处 理 溶菌酶 防 腐效果优于n a c l 十n a n o z 。 维也纳香 肠最好的防腐效果是肠衣浸在0 .0 5 % 溶菌 酶及磷 酸 盐 缓 冲 液( p h 6 .5 ) ， 碎肉 中 加 入。 0 5 5 % 溶 菌 酶， 煮 熟 后 香 肠 浸 在0 .0 5 % 溶菌 酶 及 磷 酸 盐 级 冲 液( 州6 .5 ) 中 c u n n in 助 a m , 1 9 9 1 ) 。 溶菌酶还是一种存在于人体正常体液及组织中的非 特异性免疫因子， 有许多药理及 保健作用，可加到鲜奶或奶粉中， 作为婴儿食品 添加剂， 增强要儿的免疫力 ( i l l 延军， 1 9 9 7 : 张宗 岩，1 9 9 3 ) . d u b o i s -p r e v o s t ( 1 9 7 0 ) 阐 述 婴儿 喂 养时 添加 溶菌酶 到牛 乳中 可 得到类似人乳的 牛乳， 例如要儿乳粉中添加溶菌酶制成含酶乳粉，作为 母乳的代用品， 这种代用品己 经在法国、奥 地利等许多国 家市场上出 售。 溶菌酶是要儿生长发育必需的 抗菌蛋白， 对杀死肠道腐败球菌有特殊作用， 还可 直接或间接促进婴儿 肠道双岐乳杆菌 的增殖，促进要儿胃肠道内 乳酪蛋白形成微细凝乳，有利于婴儿消化吸收 ( 张宗岩， 1 9 9 3 ) .它可促进人工喂 养的 耍儿肠道菌群的 正常化。 n is h i h a v a a n d i s o d a ( 1 9 6 7 ) 将溶 菌 酶 加到要儿奶 粉中 模拟人 乳， 发现溶菌 酶有 此功 效 ( c u n n in g h a m , 1 9 9 1 ) ， 它能够 加 强 血清灭 菌蛋白( p r o p e r d in ) , y 一 球蛋白( y - g lo b u lin ) 等 体内 防 御因 子，以 增强 对感 染的 抵抗力， 特别是 对早产婴儿 有防止体重 减轻， 预防消 化器官疾病， 增进体重等功效 性质及在乳制品中的应用研究 东北农业大学 ( 张宗岩，1 9 9 3 ) 。所以 溶菌酶是婴儿食品的良 好的添加剂。 溶菌酶是生物工程中必不可少的工具酶。一般应用溶菌酶进行菌体或细胞破壁提取 细胞内容物 ( 如原生质体等)应用于融合育种 ( 刘仲敏，1 9 9 5 ) ， 或生产蛋白质、核酸 类呈味物质。溶菌酶也是生物工程中重要的 研究对象，随着生物技术的发展，对溶菌酶 的研究也更精细，更深入，提取溶菌酶也具有更重要的战略意义。 环境工程中也用溶菌酶处理污水、 污泥， 即处理含有生 物难降 解物质的废水， 它能 加快污泥脱水速率，泥饼含水率下降， 提高污泥消化率 ( 刘军，1 9 9 4 ) 。利用酶工程在 环境工程中是一个很有前途的发展方向， 溶菌酶以其特有的性质在环境工程中的应用更 具潜力。基于溶菌酶的广泛用 途及在蛋制品加工中发挥资 源优势， 综合利用原材料， 增 加产值利润，所以本课题将鸡蛋清中溶菌酶作为主要研究对象，这也是蛋的综合利用课 题的一部分。 5 研究的目 的和意义 自1 9 8 5 年以 来， 我国已 经连续十多次 禽蛋 产量位居世界 第一， 到 1 9 % 年我国的 禽 蛋 产量为1 9 6 9 万t ， 人 均禽蛋占 有量1 5 k g ，己 经超过 世界的 平 均水 平， 其中 鸡蛋占 8 2 %，水禽蛋 ( 主要是鸭蛋)占 1 8 % 0 1 9 9 9年我国禽蛋产量为2 1 9 0万 t ，人均占有禽 蛋 1 7 k g ， 达到发 达国 家水平。 我国 禽蛋 生 产的 主要省份是山 东、 河北、 江苏、 河 南和 黑 龙江等北部省份。 尽管我国养禽业的发展很快，禽蛋产量不断增加，但是我国的禽蛋加工业却未跟 上禽蛋生产的步伐。目 前我国禽蛋还是主要以 鲜蛋形式上市， 禽蛋加工率低， ， 仅有5 % 的 鸡蛋用于蛋制品 加工。我国蛋 制品加工 业起步较晚， 禽蛋 产品 单一， 技术含量低， 还 未形 成规模化生产. 远远落后于欧、美等发 达国家。由 于蛋 制品 加工业落后， 不能调节 鲜蛋 生产与加工、消费之间的平衡，加上禽蛋不便于运输， 造成大规 模蛋禽饲养地如东 北三省等地区的禽蛋 供过于求， 价格偏低， 特别是华北、东北的蛋 鸡生产大省， 许多禽 蛋生 产厂亏损倒闭 ( 苏 秦，1 9 9 0 ) , 严重影响了蛋禽饲养者的积极性， 限 制了 我国 养禽 业的 持续发展。 为解决这些问 题， 发挥我国 禽蛋优势，开发 禽蛋 深加工技术， 生产溶菌 醉、 卵磷脂、免疫球蛋白等 科技含量高的 功能 性产品， 增加产值利润， 对促进我国养禽 业的 持续发展和蛋制品加工业的 发展、蛋 制品生 产的多样化及保健食品的开发具有重要 意义。这样既综合利用了我国t蛋资源，又创造了更高的经济效益。 目 前虽然对溶菌醉的研究较多， 但是缺乏适于工业化生产溶菌醉提取的可行性工 艺 及溶菌酶在食品中的 研究， 对溶菌醉的 性质等的 报道也说法不一，为了 更好的 将溶菌 醉应用于医药、 食品 等行业中， 有必要对溶菌醉的 提取、 性质及应用进行系统性的 研究。 本试 验即以 综合利用鸡蛋为目 的， 研究了 适宜工业化生 产的溶菌醉提取工艺。 该工艺具 有工艺过程简单、 提取效率高、 醉活力 较高、 成本 低、 生产周期 短、 可连续生产的 特点， 并对溶菌醉的稳定性、 抑菌能力等也进行了 研究，为溶菌酶的 应用提供可行性依据. 本试验的研究范围如下: 1 .研究鸡蛋清中溶菌酶的提取工艺，并确定提取最佳工艺条件; 硕士学位论文 前言东北农业 大学 2 .提取溶菌酶后剩余蛋 清的功能 特性的 研究: 3 .鸡蛋清溶菌酶活力及活力稳定性研究; 4 .溶菌酶的紫外扫描光谱研究，确定溶菌酶的活性中心变化; 5 .溶菌酶抑菌试验: 6 .溶菌酶在乳制品中的应用。 高兴华 鸡蛋清中溶菌醉的提取 性质及在乳制品中的应用研究 东北农业大学 1 材料与方法 1 . 1 试验材料和仪器设备 1 . 1 . 1 试验材料 市售鲜鸡蛋 ( 购于东北农业大学) 脱脂乳抓化钾 ( 分析纯) 鲜牛乳 ( 购于东北农业大学奶站) 蔗糖 ( 食用级)甘氨酸 ( 分析纯) 弱酸性阳离子交换树脂e d t a( 分析纯)乳酸 ( 分析纯) 溶壁微球菌氯化钙 ( 分析纯)乙醇 ( 分析纯) 磷酸氢二钠 ( 分析纯)氯化镁 ( 分析纯)蛋白 陈 ( 分析纯) 冰醋酸 ( 分析纯)硼酸 ( 分 析纯)牛肉 膏 ( 分析纯) 磷酸二氢钠 ( 分析纯)a o t( 气溶胶)琼脂粉 ( 分析纯) 抓化钠 ( 分析纯)异辛 烷 ( 分析纯)柠檬酸 ( 食用级) 浓盐酸 ( 3 6 - 3 8 %)( 分析纯)苯甲酸钠 ( 分析纯) 乳糖 ( 分析纯) 三抓乙酸 ( 分析纯)亚硝酸钠 ( 分析纯) 葡萄糖 ( 分析纯) 狡甲基纤维素钠 ( 分析纯)胆盐 ( 分析纯) 1 . 1 . 2 试验仪器 电 动搅拌器杭州仪表电 机厂 自 动柱层析仪l k b p ro d u c k e r a .b s w e d e n 层析柱 ( 4 0 c m x 3 c m ) 东北农业大学实验室提供 p h s - 2 5型p h计上海精科雷磁仪器厂 l d 4 - 2 型电 动离心机北京医用离心机厂 m i n it a n 侧u l t r a fi l t r a t i o n s y s t e m c o l e - p a r m e r i n s t r u m e n t c o . u s 电 子天平上海天平仪器厂 7 2 3 0 g分光光度计上海分析仪器厂 7 2 1 分光光度计上海分析仪器厂 d s - 1 型高 速组织摘碎机上海标本模型厂 h g 2 0 2 - 5 型电 热恒温干操箱南京实验仪器厂 电热恒温水浴锅南京实验仪器厂 电热恒温培养箱连云 港医疗器械设备厂 冰箱青岛 海尔集团 真空干燥器东北农业大学化学馆提供 手提式蒸 汽消毒器宁波镇海医 疗器械设备厂 游标卡尺食品学院畜产品实验室提供 d d s - i 1 a型电 导率仪上海伟 业仪 器厂 硕士学位论文 材料与方法 东北农业大学 1 .2试验方法 1 . 2 . 1 树脂的活化处理 新购的离子交换树脂先用清水浸泡， 浮选法除去 细小 颗粒， 工 业酒精浸泡 2 h - 4 h , 水洗至中性，用2 m o v 1 盐酸浸泡2 h ，水洗至中性， 2 m o l a 碱液浸泡2 h ，水洗至中性， 再 用0 .2 m o l l . p h 6 .2 磷酸盐缓 冲液 平 衡过夜， 备 用 ( 陈 来同 等，1 9 9 7 ) . 1 .2 .2溶菌酶活力的 测定 1 .2 .2 . 1底 物悬 液的 制备 菌种采用溶壁微球菌 ( a f t r o c o c c u s l y s o d e i k l i c u s ) .菌 种接种于营养肉 汤培养基扩大 培养 ( 2 8 c . 2 4 h ) ，再接种于营养肉汤琼脂培养基培养 ( 2 8 c . 4 8 h) 。用蒸馏水将培 养好的 菌体 洗下。 离心 ( 4 0 0 0 r p m , 2 0 m in ) , 倾去 上 清 液， 沉 淀为 菌 体， 加入少量无菌 水， 洗涤菌体，再离心，倾去上清液， 如此反复洗涤菌体数次， 最后用。 冷丙酮洗 涤、 离 心( 4 0 0 0 r p m , 2 0 m in ) , 重复2 - 3 次， 然后 放 到真空 干 燥器中 干 燥成菌 粉， 研细 备 用 ( 袁玉 荪等，1 9 7 外 称取干菌 粉5 m g , 置于 匀浆器中， 加入 少 量p h 6 .2磷 酸盐 缓 冲液 研磨 数分 钟， 倾 出 ， 用少 量缓 冲 液洗匀 浆器， 并 稀 释至2 5 m 1- 3 0 m l ， 比 色 测 定。 氏 ， . 调 节 使o d 4 ， 在。 .3 - 0 .7 范围内。 1 . 2 .2 . 2 酶液的 制备 准 确 称 取 干 酶 粉5 m g ， 用0 . 1 m o ia . 州6 .2 磷 酸 盐 缓 冲 溶 液 定 容 至2 5 m 1 ， 再 吸 取1 m l 酶 液， 稀释至6 5 m 1 ， 备用。 1 . 2 . 2 . 3 活力侧定 将酶液和底物悬液分别置于2 5 水浴中 保温 l 0 m i r w 1 5 m in ， 吸取底物悬液2 . 8 m l , 里 l c m比 色 杯中比 色 测定o d 4 5 o ， 此时 为 零时 读 数， 然 后 加入 酶液。 .2 m 1 , 迅速 摇匀， 从 加入酶液起记时， 每隔1 m i n测定一次o d 4 5 0 1 共测三次. 本试验的酶活力单 位定 义 为 每 分 钟。 氏 ， 下降。 .0 0 1 为 一 个 活 力 单 位( 2 5 c , p h 6 2 ) ( b . 施 特 尔 马 赫， 1 9 9 2 ) . 每 毫 克 酶 活 力 单 位 u / m g ) = ( a o d 4 5o l m in ) x 1 0 群品 的 微克 数 1 .2 .3 蛋白 质 含 盆的 侧定 采用福林一酚法 ( 于果平，1 9 9 3 ) . 1 . 2 3 . 1 标准曲 线的 绘制 吸取 i m l 酪蛋白标准液， 加入试剂甲5 m 1 , 里2 5 水浴中保温l o m i n ， 再加入。 . 5 m l 试剂乙， 摇匀， 保温3 0 m i n . 6 5 0 n m测定o d值，以蛋白 质浓 度为横坐标，以 吸光值为 纵坐标做标准曲 线。 1 . 2 .3 .2 样品 侧定 取 l m l 试液， 加入试剂甲5 m l , 置2 5 水 浴中 保沮1 0 m i n ， 再 加入。 .5 m l 试剂乙， 摇匀， 保温3 0 m i n , 6 5 0 n m测定o d值。 待测样品测得的o d值， 查 标准曲 线即 得蛋白 浓度。 高兴华 鸡蛋清中溶菌醉的提取 性质及在乳制品中的应用研究 东北农业大学 表1 - 1 蛋白 浓度标准曲 线的绘制 试液 号 蛋白 质含 量 ( 4 g ) 蛋白 质标 液 ( 3 0 p g / m l )蒸馏 水o d 6 5 0 ( mi ) ( ml ) 1 2 3 4 5 6 _一1 . 0 6 0 0 . 2 0 . 8 1 2 0 0 . 4 0 . 6 1 8 0 0 . 6 0 .4 2 4 0 0 . 8 0 . 2 3 0 0 1 . 0一 1 . 2 . 4 溶菌酶表观浓度的 测定 1 .2 .4 .1标 准曲 线的 绘 制 溶菌酶标 准液: 将 溶菌 酶结晶 用1 / 1 5 m o l/ i , p h 6 .4 的 磷酸 缓冲 液 制成4 0 g g / m l 浓 度的 酶液， 按表1 - 2 绘制标准曲 线: 在容量为3 m 1 的比 色杯中 准确加入充分混匀的 基质菌悬液2 .8 m 1 ， 加入溶菌 酶标准 液0 .2 m l , 迅速混匀， 开 动秒表， 测定第3 0 s 和3 m i n 时o d 。值，以 水 作空白，以 两次 光密度之差作为纵坐标，以溶菌酶浓度为横坐标，绘制标准曲 线。 1 . 2 . 4 . 2 样品 侧定 在容 量为3 m 1 的比 色 杯中 准确加 入充 分混 匀的 基 质菌 悬液2 .8 m 1 ， 加 入试 液0 .2 m l , 迅速混匀，开 动秒表， 测定 第3 0 s 和3 m i n 时o d 6 1 . 待测 样品 得到的 两次光密度之差， 查 标准曲 线即 得每毫升 溶液中 溶菌酶的 量 ( 陀) 。 表1 一标准曲 线的绘制 t a b le l - 2 d r a w i n g o f t h e s t a n d a r d c u r v e 试管号溶菌酶标准水溶菌酶含量o d , 溶液 ( m l ) ( m l ) ( p g / m l ) 51015加2530 0 .0 5 0 . 1 0 。 . 加 0 . 3 0 0 .4 0 0 . 5 0 0 .9 5 0 . 9 0 0. 8 0 0 . 7 0 0 . 6 0 0 . 5 0 1，汽j46 1 .2 .5洛宙醉 提 取工艺 的 研究 1 . 2 . 5 . 1 不同 树脂提取沼苗醉的 效果比 较 取3 0 0 m ) 蛋清加入 1 0 0 m 1 树脂， 调p h b . 5 左右，室 温慢速搅拌吸附3 . 5 h 以树脂 粒子充分运动无死角为宜， 避免 起泡沫， 过速， 将树脂分离， 用少量水洗涤树脂， 合并 沈液，分别取样测定加树脂前 后蛋 清中 溶菌 酶的 浓度， 测定溶菌 酶的活力。依据下面的 公 式计算出 树脂吸附力、 酶吸附 率及洗脱液酶收率。 硕士学位论文 材料与方法 东北农业大学 树脂吸附力 ( m g / m l) = ( c o v o - c ,v , y v t 其中 : c a 一处 理前 溶液中 酶浓 度 ( m g / m l ) v 。 一 处理 前溶液 体 积 ( m i ) c 。一处 理后 溶液中 酶浓 度( m g / m l ) v :一处 理 后溶 液体 积( m l ) v r -树脂体积 ( m l ) 溶 菌 酶 吸 附 率( % ) 一( 1 一 处理后溶液体积) x 处理后溶液中酶浓度 更 硬 丽落 液 体 积、 处 理 前 溶 液 中 酶 浓 度 x 1 0 0 % 1 . 2 . 5 . 2 不同方 法提取溶菌醉的 效 果比 较 1 . 2 . 5 . 2 . 1 离子交换树脂吸附 法 ( 赵景联，1 9 9 1 ; 李桂英，1 9 9 4 ; l i - t h a n , 1 9 8 6 ) 提取工艺流程: 鲜鸡蛋一一打蛋取蛋清、过滤一一搅拌吸附一一上柱洗脱一超滤浓缩一一结 晶或冷冻干燥成品 1 .2 .5 .2 .2直接 结晶 法( a ld e rt o n , 1 9 6 4 ; 施德 恒，1 9 9 2 ; 谢 新 华， 1 9 9 8 ; 陈 兵等， 1 9 9 4 ) 鲜 蛋 清 过 滤 后 稀 释5 倍， 加 入5 % n a c l 粉 末， 用i m o l/ i n a o h 调 节p h l 0 .5 , 4 c 静 止 结晶7 2 h - 9 6 h . 将混合物 在3 0 0 0 r p m离 心1 5 m in , 沉 淀主 要为 溶菌 酶， 将 沉淀用乙 酸 调节p h 5 .0 ， 再离 心去 不溶物， 上 清再以 相同 方 法结晶 两次。 得 到溶菌 酶， 测 定 溶菌 酶 活力并计算出溶菌酶收率。 1 .2 .5 .2 .3 阴 离 子多 箱 法( c h in g - c h u a n y a n g , 1 9 9 8 ; s im , 1 9 9 4 ) 将过泌后的鲜蛋清稀释5 倍， 向 蛋清中 加入c m c 0 . 5 % w / v ， 搅拌形成均一溶液， 室 温 下 静里2 4 h , 溶液变浑浊， 4 0 0 0 r p m离心2 0 m in ， 收 集 上 清， 测定 蛋白 浓度 及溶菌 酶活 力. 沉淀 溶在。 .0 2 m o v i 碳酸盐 缓冲 液中( p h 1 1 .0 ) 使总 体 积达5 0 m l , 测定 溶菌酶 含t及溶菌酶活力， 计算出 溶菌酶收率。 1 .2 .5 . 2 .4反 胶 束法( k a z u m it s u , 1 9 9 5 ; l y e , 1 9 9 5 ; d e k k e r , 1 9 8 9 ; t a d a a k i , 1 9 9 3 ; 赵 国 华等.1 9 9 8 ) 反 胶束 ( r e v e rs e m ic e l l e ) 是 指分散于 连续 有机溶剂介 质中 的 包含 有水分 子内 核e 水 他” ) 的 表 面活性 剂的 聚 集 体， 与正 常胶束 有明 显区别。反 胶 束中 表 面活 性 剂的 极 性部分 伸入胶束内 形成极性内 核.而非极性链处于有机溶剂中， 胶束中 央为 “ 水池” ， 反胶束 溶液包括两相， 一相是含有极少t 表面活性剂和有机溶剂的 水相:另一种为以 有机溶剂 为连续相的反 胶束体。萃取时 待萃取的蛋白 液以 水相形式与 反胶束体 接触， 使蛋白 先最 大限度地转入反胶束体 ( 萃取) ，而后含有蛋白的反胶束与另一个 水相接触， 通过调节 p h 、 离 子强 度等回收 蛋白 质 ( 反 萃取) ( 赵国 华等，1 9 9 8 ) . 反 胶束 法 萃取溶苗酶即是 利用这一原理来萃取溶菌醉的。 将鲜蛋清稀释1 0 倍，取5 0 m l 稀释后蛋清加入5 0 m 1 异辛 烷 ( 含a o t 5 0 m m o l/ 1 ) , 室 温 振 荡5 0 m i n , 3 0 0 0 r p m离 心5 m in ， 上 层 有 机 相 加 入 等 量的p h 1 1 .8 磷 酸 盐 缓 冲 液( 含 o . l m o 14 k c i ) ， 室 温振荡4 5 m in , 3 0 0 0 r p m离 心5 m in ， 下 层水 相含 溶 菌 酶， 测 定 溶菌酶 含t及溶菌酶活力， 计算出溶菌酶收率。 1 .2 .5 .3蛋 清 稀释 度 对 溶菌醉 提 取的 影响 高兴华 鸡蛋清中溶菌醉的提取 性质及在乳制品中的应用研究东北农业大学 将蛋清分别稀释0 . 1 .2 .3 . 4 倍，按原蛋清体积与树脂体积比为5 : 加入树脂， 调 节p h 6 .5 - - 7 左右， 慢速搅 拌室 温下吸附3 .5 h , 然后过 滤 将蛋 清与 树脂分开， 用少 量 水洗涤树脂，并将洗涤液与处理后蛋清和并，测定溶菌酶含量， 计算树脂吸附力、酶吸 附率和酶收率， 并测定酶活力。 1 . 2 . 5 . 4 提取溶茵酶 搅拌吸附 阶段最佳工艺条 件确定 溶菌酶提取的关键一步是搅拌吸附阶段， 故采用三因素三水平 l 9 ( 3 )正 交试验 设 计 确定最佳的 提取条件. 三因素为蛋 清树脂比 ( 3 : 1 . 5 : 1 . 7 : 1 ) , p h ( 6 0 . 7 .0 . 8 .0 ) 和搅拌吸附时间 ( 2 . 5 h . 3 h . 3 .5 h ) ,测定指标有酶收率 、酶活力。 表 卜 3正交试验因素水平表 ，泵 a b c ( 蛋清树脂比)( p h )( 搅拌吸附时间) 1 2 3 3 : 1 6 刀2 . 5 5 : 1 7 刀3 乃 7 : 1 8 . 0 3 . 5 1 . 2 .5 . 5 不同 浓度洗脱液 对溶菌醉提取的影响 按蛋 清树脂比 为5 : 1 在蛋 清中 加入 树脂，调 节p h 6 .5 - 7 左右， 室 温慢速 搅拌吸附 3 . 5 h , 然后过涟将蛋清与树脂分开，用少量水洗涤树脂， 合并蛋清及洗涤液，分别用 o . i m o la . i m o l / l . 2 m o la n a c l 溶液洗脱溶菌酶， 测定溶菌酶含量及活力，并计算出溶 菌酶收率。 1 . 2 . 5 . 不同 洗脱方式对溶菌 醉提 取的影响 按 蛋 清 树 脂比 为5 : 1 在 蛋 清中 加 入 树 脂， 调 节p h 6 .5 - 7 左 右， 室 温 慢 速 搅 拌 吸附 3 . 5 h , 然后过滩将蛋清与树脂分开，用少量水洗涤树 脂， 合并蛋 清及洗涤液， 分别以间 歇搅拌 洗脱和上柱洗脱方式洗脱溶菌酶， 测定溶菌醉的含里 及酶活力. 1 . 2 .6提 取 溶 菌醉 后 蛋 清 功能 特 性 侧 定 1 1 .6 . 1起泡性 及 泡 沫 租定性的 侧定 起泡性表示样品 起泡的难易， 泡沫稳定性表示 气泡破裂难易。 根据宁正祥 ( 1 9 9 8 ) 和赖晓 岭 ( 1 9 9 7 ) 将样品 稀释至蛋白 浓度为 1 % 的 溶液， 取 l o o m 在高 速组织捣碎机中 以1 0 ,0 o o r p m速 度 均 质3 0 s ， 连 续 四 次， 共2 m in ， 记 录 均 质 停 止 时 泡 沫 体 积v . 和均 质 停止后3 0 m i n 的泡沫体积v z ， 起泡性和泡沫稳定性按下 式计算: 起泡性 ( %)=鱼 型 丝 丝 塑 型 喳塑 生x 1 0 0 vo 1 0 0 泡沫稳定性 ( %)二 均质停止后 3 0 m in 的泡沫体积粼v 2 ) 1 0 0 x l o o v 1 . 2 . 6 .2 乳化性的 侧定 乳化力 表示蛋白 质亲水亲油 性的 能 力. 根 据宁正 祥( 1 9 9 8 ) 和 耿 欣( 1 9 9 9 ) 将蛋 清 稀释至蛋白 浓度为 1 %， 取 5 0 m 1 稀释后蛋清， 用磁力搅拌器慢速搅拌，以 每分 钟 5 m l 的谏序加入色拉油，边加边搅拌，同时每 2 m i n测定一次电导率并记录所用色拉油的体 硕士学位论文 材料与方法 东北农业大学 积及质量， 乳化力达最大时电 导率值为零， 加入n a c l 时电 导 率值又会回升， 证明 此时 为零点， 乳化力最大。 1兮5 被 乳 化 油 的 毫 升 数 / 1 0 0 m g 蛋 白 质 = m x 生 p m -滴加油质量 ( m g ) p 一油的 密度 ( m g / m l ) 1 . 2 . 7 样品中抓离子含且的测定 采用莫尔法 ( m o h r ) ( 刘福岭，1 9 8 7 ) . 1 .2 .8 溶菌醉活力稚定 性的研究 1 .2 .8 . 1不 同p h , 沮 度 及 加 热 时 间 对 沼 菌 酶 活 力 及 活 力 稳定 性 的 影 响 溶 菌酶晶 体5 m g 用0 . 1 m o la p h 6 .2 磷酸 盐 缓 冲液 定 容至2 5 m l ， 再 取l m l 酶液稀 释 至6 5 m l 备 用。 分别 将溶菌酶 溶液调p h 4 .0 , 5 .0 , 6 .0 , 7 .0 , 8 .0 , 9 .0 ， 分 别 在 不同 温 度 ( 5 0 , 6 0 , 7 0 , 8 0 , 9 0 , 1 0 0 c)加热3 0 , 6 0 , 9 0 , 1 2 0 m i n , 测定溶菌酶残余活力。 1 . 2 . 8 . 2 常见金属离子对溶菌醉活力及活力毯定 性的 影响 溶 菌 酶晶 体5 m g 用o . 1 m o la p h 6 .2 磷 酸盐 缓冲 液定 容至2 5 m l ， 再 取i m l 酶液稀 释 至6 5 m l 备 用。 在溶菌 酶溶液中 分别 加入。 .5 % n a c l , 0 .5 % k c i , 0 .5 % c a c lz ( 溶菌 酶 溶 液 用蒸 馏水定 容、 稀释) 、