（环境工程专业论文）甘油发酵生产13丙二醇的菌种筛选及培养基优化研究.pdf

硕i j 学化论文 摘要 l ，3 一丙二醇( 1 ，3 - p r o p a n e d i o l ，简写为1 ，3 一p d o ) 是一种重要的化工原料，可以作 为单体来生产聚酯、聚醚、聚酰胺等聚合物，市场空问巨大。尤其是以1 ，3 一丙二醇为单 体合成的聚酯材料p ，r t ，因具有良好的弹性、耐污染性、良好的着色性和良好的生物降 解性等受到越来越多的关注，也为l ，3 一丙二醇的大规模生产展示了美好的前景，从而使 1 ，3 一丙二醇的研究与开发越来越受到人们的重视。在能源日益紧缺的今天，研究以可再 生资源为原料生产生物柴油，对环境污染小，副产物甘油用于微生物转化法生产l ，3 一丙 二醇具有积极的现实意义。随着发展中国家植物油产量的大幅度提高和在化工中的大量 使用，甘油在世界市场上将逐步过剩并且价格下降，使开发利用生物技术将甘油作为底 物转化为高价格的产品( 如1 ，3 一丙二醇) 成为瞩目的焦点。 本实验采用的粗甘油来自利用光皮树制取生物柴油的副产物。光皮树制取生物柴油 的过程中将大量产生甘油，为了更好的利用甘油，将其转化为高价格的产品( 如l ，3 一丙 二醇) ，本实验从光皮树林土壤中诱集分离筛选得到8 株形态特征不同的菌体。通过摇瓶 培养后进行气相色谱测定得到一株效果较好的发酵甘油生产1 ，3 一丙二醇细菌s x 7 。 对菌体s x 7 进行形态特征观察、生理生化等实验发现该菌为革兰氏阳性菌，无芽孢， 兼性厌氧菌，接触酶阴性。再根据精氨酸产氨，淀粉水解、明胶液化和生长条件等实验 初步判定该菌为肠道细菌。 将该肠道细菌s x 7 进行好养培养9 6 h 、厌氧培养9 6 h 、先好氧后厌氧( 各4 8 h ) 培养， 发现在完全厌氧的条件下，该菌产量为最高，为1 7 1 8 9 l ，转化率为5 2 0 0 9 6 。为了使得 该菌株歧化甘油生产l ，3 一丙二醇的产量得到提升，对其培养条件中微量元素、有机盐、 无机盐、发酵p h 、培养时间、培养温度等进行了系统研究。确定最佳发酵培养基是：甘 油4 0 o o g l ，k h z p 0 40 5 0g l ，k z h p o 。3 h ：0 1 0 0g l ，( n h 。) 。s 0 43 0 0g l ，c a c l z 2 h z o 0 0 2g l ，c a c o 。2 o o g l ，酵母粉3 o o g l ，微最元素溶液4 m l l ，f e 。s o 。5 o o m g l ， m g s 0 4 7 h ：00 0 5 9 l 。该菌株1 ，3 - p d o 产量为2 5 0 3 9 l ，对甘油的转化率达至w 7 5 7 6 。 较之优化前，产量提升了7 8 5 9 l ，转化率提升了2 3 7 6 。 关键词：1 ，3 一丙二醇；甘油；肠道细菌；培养基优化 i i 硕i 学位论爻 t e m p e r a t u r e s u c ha sas y s t e m t od e t e r m i n et h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nm e d i u mi s ：g l y c e r o l 4 0 0 0 9 l ，k h 2 p 0 4o 5 0g l ，k 2 h p 0 4 3 h 2 01 0 0g l ，( n h a ) 2 s 0 43 0 0g l ，c a c l 2 2 h 2 0o 。0 2g l ，c a c 0 32 0 0 9 l ，y e a s te x t r a c t ，3 0 0 9 l ，m o s tm i c r o e l e m e n t ss o l u t i o n4 m l l ，f e 2 s 0 45 0 0 m g l ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 5 9 l t h es t r a i n so f1 ，3 - p d op r o d u c t i o no f 2 5 0 3 9 l ，t h ec o n v e r s i o nr a t eo fg l y c e r o lt or e a c h7 5 7 6 o p t i m i z a t i o nt h a nt h ef o r m e r ，t h e o u t p u ti n c r e a s e d7 8 5 9 l ，e n h a n c e dt h ec o n v e r s i o nr a t eo f2 3 7 6 k e yw o r d ：1 , 3 - p r o p a n e d i o l ；g l y c e r o l ；i n t e s t i n a lm i c r o o g a n i s m ；m e d i ao p t i m i z a t i o n 坝l j 学位论文 插图索引 图1 1微生物厌氧代谢甘油途径1 l 图2 1l ，3 丙二醇的工艺流程1 7 图2 2l ，3 丙二醇合成工艺流程1 8 图3 1 标准曲线一2 8 图3 2标准品l ，3 丙二醇的g c 图谱2 9 图3 3待测液l ，3 丙二醇的g c 图谱2 9 图4 1菌体在种子培养基中的生长曲线3 7 图4 2 接种量对发酵的影响一3 8 图4 3微量元素对发酵的影响3 8 图4 4 镁离子对发酵的影响3 9 图4 5铁离子对发酵的影响4 0 图4 6p h 对发酵的影响4 0 图4 7 酵母粉对发酵的影响4 l v f 油发酵生产1 3 丙二醇的菌种筛选及培养皋优化研究 附表索引 表1 1微生物生产l ，3 一丙二醇的实验结果比较9 表2 。ll ，3 丙二醇的主要物理性质1 3 表3 1 主要试验仪器2 3 表3 2 待测菌株的形态及运动性3 0 表3 3 糖发酵实验3 l 表3 4 生理生化特性3 2 v l 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：易恙壮 日期：护7 年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密囹。 ( 请在以上相应方框内打“寸) 作者签名：弛恙私 导师签名： 日期：99 。日期：乜7 ， 年6 月缈日 年月审日 硕十学位论文 第一章绪论 1 1课题研究的背景和意义 1 1 1 课题研究的背景 自从1 9 8 9 年联合国环境规划署工业与环境中心制定了清洁生产计划，在 全球范围内兴起了推行清洁生产的热潮。美国、荷兰、加拿大、丹麦等国家对其 国内工业企业提出削减能源的一系列法案，法国还设立了无污染工厂的奥斯卡奖， 奖励在采用无废工艺方面做出成绩的企业。我国也从1 9 9 5 年开始，把清洁生产写 进国家环保的法律当中。其中在1 9 9 5 年颁布了中华人民共和国固体废物污染环 境防治法，1 9 9 5 年和1 9 9 6 年修订后发布了中华人民共和国大气污染防治法 和中华人民共和国水污染防治法。均明确规定：国家鼓励支持开展清洁生产， 减少污染物的产生量。按照联合国环境规划署的定义，清洁生产是指将综合预防 的环境战略，持续地应用于生产过程和产品中，以便减少对人类和环境的风险。 生物柴油作为一种生物质能源，是矿物燃料最理想的替代能源，不会对大气碳平 衡产生影响，发展它既有助于缓减能源危机又能改善环境。是当前最经济环保， 极具发展潜力的绿色能源之一。这正与联合国环境规划署提出的清洁生产相顺应。 而在得到生物柴油的同时，常常伴随着副产物粗甘油的生成，假如将之丢弃，必 然会造成资源上的浪费和环境的压力，而甘油正是合成1 ，3 一丙二醇的主要原料， 用生产生物柴油的副产物粗甘油提纯后生产1 ，3 一丙二醇不仅有很高的商用价值， 还能解决粗甘油的处理问题，是个两全其美的好办法。 l ，3 一丙二醇( 1 ，3 一p d o ) 是一种重要的有机化工原料i lj ，广泛应用于增塑剂、洗 涤剂、防腐剂、乳化剂、聚酯和聚氨酯的合成，也可用作防冻剂、溶剂、保护剂 等。其中最重要的应用是制备聚对苯二甲酸丙二醇酯( p t t ) 聚酯纤维。p t t 是一种 性能优异的聚酯材料，兼具聚对苯二甲酸乙醇酯( p e t ) 的高性能和聚对苯二甲酸 丁二醇酯( p b t ) 的易加工性，又具有尼龙良好的回弹性和抗污染性能，且易染、耐 磨，在地毯、工程塑料、服装面料等领域大有作为，具有广阔的应用前景，是目 前国际上合成纤维开发的热点，被专家预测为2l 世纪最主要的新纤维品种之一【2 1 。 但是由于原料l ，3 一丙二醇成本高，对其发展造成了制约，因此从2 0 世纪9 0 年代起， 低成本1 ，3 一丙醇合成工艺的研究丌发工作成为热点课题之一l 3 。 1 1 2 课题研究的目的和意义 l ，3 一丙二醇是一种重要的精细化工和医药中间体的原料，2 0 世纪9 0 年代初期， 甘油发酵生产l ，3 一丙二醇的菌种筛选及培养基优化研究 由于其成本较高，是其它二醇的十几倍以至几十倍，工业用途相对也较少，并未 受到人们的重视。2 0 世纪9 0 年代中期，工业上成功的开发出了以1 ，3 丙二醇为原 料的新型聚酯材料聚对苯二甲酸丙二醇酯( p t t ) ，p t t 具有良好的加工性能、电气 性能、机械性能和尺寸的稳定性，保持了p e t 纤维的优良的抗皱性和耐化学性，其 强度能够满足纺织要求。此外，它还具有优良的柔软性、抗日光性、耐污性、低 静电性、低吸水率等。其优良的性能和潜在的易回用性使其在服饰材料、地毯材 料、工程塑料、薄膜材料等领域具有非常广阔应用前景。国家化纤部门己将发展 p t t 纤维列入合成纤维产品结构调整规划中。 在甘油生物转化为l ，3 一丙二醇的生产成本中，原料占有较高的比重，利用廉 价光皮树副产物甘油作为原料将会较大的降低原料成本，使发酵法生产1 ，3 一丙二 醇在生产条件、生产成本及环境保护等方面与化学法相比均具有较强的优势，从 而具有更强的市场竞争力。本文对不同的培养基条件下发酵甘油生产1 ，3 一丙二醇 进行了研究，考察了不同培养基条件下发酵甘油对肠道菌厌氧发酵生产l ，3 一丙二 醇的影响。 1 21 ，3 一丙二醇的技术发展史及生产情况 1 2 11 ，3 一丙二醇的技术发展史 1 9 4 8 年，美国s h e l l 公司就申请了以丙烯醛水合路线合成l ，3 一丙二醇的专利， 并在2 0 世纪六七十年代，将此专利进行了产业化实施。 1 8 8 1 年，f r e u n d 发现巴斯德梭菌( c l o s t r i d i u mp a s t e u r i a n u m ) 能发酵甘油 产生l ，3 一丙二醇。 l9 9 1 年，p t t 聚酯产品在欧洲实现工业化生产，当时1 ，3 一丙二醇的价格为 $ 3 0 k g 。 l9 9 5 年，德国d e g u s s a 公司成功的开发出以丙烯醛为原料合成1 ，3 一丙二醇的 工艺。其成本与乙二醇大致相当，并在比利时建成2 0 0 0 吨年中试装置；并于1 9 9 6 年兴建5 万吨年的工业化生产装置，其产品用于生产新型聚酯纤维p t t 和聚酯涂 料。 l9 9 6 年，荷兰的s h e ll 公司以环氧乙烷为原料生产出成本较低的1 ，3 一丙二醇； 我国科研单位从这一年开始关注l ，3 一丙二醇的生产技术发展。 l9 9 7 年我幽丌始同d up o n t 等圈外公r d 进行技术转让谈判，但遭到拒绝。 l9 9 8 年，d e g u s s a 公司计划生产l ，3 一丙二醇9 0 0 0 吨年，s h ell 公司计划在 原有的年产3 6 0 0 吨的基础上扩大到7 2 力吨年，美国d u p o n t 公司也准备建一个 年产5 力吨的l ，3 丙二醇生产厂4 1 ；我国可以向固外企业高价进v 1l ，3 一丙二醇， 硕十学位论文 国内大型石化公司也开始看好p t t 聚酯项目5 1 ，这促使国内一批科研单位开始研 发l ，3 一丙二醇。 1 9 9 9 年，荷兰s h e l l 公司在美国路易斯安那州建立产能为7 2 万t a 的1 ，3 一 丙二醇生产装置6 1 。 2 0 0 0 年美国杜邦公司开发出p t t 并且注册了商品名为s o r o n a 。 2 0 0 1 年，美国d u p o n t 公司在生物法技术研究上取得突破，实现了通过采用 廉价有机物作为转化底物直接生产1 ，3 一丙二醇，并进入中试阶段。 2 0 0 2 年，荷兰s h e l1 公司和s g f 公司合资在加拿大蒙特利尔建立了产能为 9 0 7 万吨年的p t t 生产装置；我国实现1 ，3 一丙二醇工业化生产，首家生产企业 是山东邹平铭兴化工有限公司，采用石化路线( e o 法) ，投产时规模仅1 6 0 吨 年。 2 0 0 3 年，美国d u p o n t 宣称将通过生物转化法将1 ，3 一丙二醇产品大规模生产。 2 0 0 5 年，9 月末黑龙江辰能生物工程有限公司与清华大学签订了“发酵法生 产1 ，3 一丙二醇工业性试验技术开发合同书，从1 0 月份起公司技术人员赴湖南 益阳同清华大学和河南天冠集团共同进行1 ，3 一丙二醇项目的工业性放大试验。 2 0 0 6 年底，我国湖南海纳百川生物工程公司建成了3 0 0 万吨年的工业化生 产装置。 1 2 21 ，3 丙二醇的生产情况 1 2 2 1国外1 ，3 一丙二醇的生产状况 德国d e g u s s a 公司 世界上最主要的专业化学品公司德国d e g u s s a 公司自l9 9 5 年成功开发由丙烯 醛合成1 ，3 一丙二醇的工艺后成为用这种方法申请专利最多的公司。8 1 。目前，德 国o e g u s s a 公司由丙烯醛水合、氢化制备1 ，3 一丙二醇的方法、技术己基本成熟， 他们也在德国w e s - s e li1 公司建设了l 套0 9 万吨年的生产装置。 荷兰s h e l l 公司 荷兰s h e l1 公司首先实现了p t t 的商品化。该公司用环氧乙烷为原料开发成 功低成本的l ，3 一丙二醇生产方法，并建成了l0 力吨年的生产装置。近年来成为 国际上1 ，3 一丙二醇最大的生产厂家。产品主要是用于生产“c o m e m ”品牌p t t 聚 酯。再者，荷兰s h e l1 公司进行了新的l ，3 一丙二醇工艺试验，传统方法是通过环 氧乙烷羰基化反j 邂生成3 一羟基丙醛中问体，然后加氢得到1 ，3 一丙二醇。但是由于 3 一羟基丙醛( h p a ) 会发生自缩聚反应瓶产生副产物，从而降低l ，3 一丙二醇的收 率，s h e l l 公司通过研究发现以甲基一3 一羟基丙酸盐进行加氢即可成l ，3 一丙二醇， 且收率较高。据s h el l 公司预测，到2 0lo 年，包括非纤维应用在内的全球p t t 需求量将达到l0 0 万吨年钔。 甘油发酵生产1 ，3 - 丙二醇的菌种筛选及培养基优化研究 美国d u p o n t 公司 美国d u p o n t 公司与世界第二大工业酶生产商g e n e n c o r 国际有限公司申请了 许多可以发酵碳源为底物，用基因工程菌直接生产1 ，3 一丙二醇的专利并取得了一 些进展。根据美国咨询公司c o n d u x 的一项规划化，近几年内p t t 年产将达到百万 吨，1 ，3 一丙二醇需求量也会因此大大增加。d u p o n t 公司主要采用单糖( 葡萄糖或 果糖) 或多糖( 纤维素、淀粉) 等碳水化合物作碳底物，在合适条件下使一种碳 底物与含有编码的一种活性甘油脱水酶、或二酶脱水酶的基因的微生物接触转化 为1 ，3 一丙二醇。2 0 0 1 年，d u p o n t 公司在生物法技术研究上取得突破，实现了采 用廉价有机物作为转化底物，直接生产1 ，3 一丙二醇，并进入中试阶段。2 0 0 3 年， d u p o n t 宣称将通过生物转化法大规模生产1 ，3 一丙二醇产品。 另外，据悉d u p o n t 公司生产p t t 原料来自德国纬塞林，基于石化路线生产的 1 ，3 一丙二醇。新的基于淀粉( 糖) 发酵法生产l ，3 一丙二醇的生物发酵催化路线工 艺已开发成功，d u p o n t 公司与t a t e & l y l e 公司( 英国) 、g e n e n c e r 国际公司( 美 国) 合作投产了谷物而不是石油生产l ，3 一丙二醇的中型装置。以谷物用生物发酵 法制造p t t 的总费用比以石油化工厂产品制造的要便宜2 5 。1 套中型装置位于美 国伊诺斯州德卡杜尔的t a t e & l y l e 公司谷物的加工厂内。在新的发酵工艺中，由 磨碎的潮湿谷物发酵得到的葡萄糖经2 步转化成l ，3 一丙二醇。 ，英国戴维( d a v y ) 工艺技术公司( d p t ) 戴维( d a v y ) 工艺技术公司( d p t ) 和韩国三星先进技术研究院联合生产1 ，3 一 丙二醇，是采用改进后的先进工艺，三星的专利技术用环氧乙烷均相加氢、酯化 生成羟基酯中间体，中间体再用d p t 公司加氢和精制技术使之转化为l ，3 一丙二醇， 所得产品纯度超过聚酯树脂要求值。 f 1 本化学技术d p t 公司 同本化学技术d p t 公司受韩国三菱公司委托，开发了l ，3 一丙二醇的生产工艺。 d p t 以自己的加氢及精制技术，以现有的聚酯树脂作原料生产l ，3 一丙二醇。 1 2 2 2国内1 。3 一丙二醇的生产状况 山东铭兴化工有限公司 2 0 0 2 年投资兴建，是浙江大学联合化学反应1 ：程研究所的中试基地。采用环 氧乙烷法生产1 ，3 一丙二醇，于2 0 0 2 年实现工业化，由此首次实现了3 5 0 0 吨年 的1 ，3 一丙二醇的国产化产品。但当时的年产最仅大约16 0 吨左右。 黑龙江石油化学研究院 黑龙江石油化学研究院，采用改性的阳离了树脂催化剂进行丙烯醛水合反应 生产1 ，3 一丙二二醇。丙烯醛的选择率和3 - h p a 的选择性均可达到8 5 以上；在固定 的床反应器中，以n i a 12 0 3 为催化剂，3 一h p a 的转化率和l ，3 一丙二醇的选择性均 大于9 9 ，目前正在进行中试。 4 硕十学位论文 上海石化公司研究院 上海石化公司研究院也采用改性阳离子树脂作催化剂进行丙烯醛水合反应； 而加氢反应催化剂则采用改性r a n e yn i 在釜式反应器中进行3 - h p a 加氢反应， 3 - h p a 的转化率和1 ，3 一丙二醇的选择性均大于9 9 。 1 3 微生物发酵法岐化甘油生产1 ，3 一丙二醇的研究进展 在1 0 0 多年前，人们就知道1 ，3 丙二醇能从甘油发酵的来。微生物发酵甘油生 产l ，3 丙二醇的研究始于2 0 世纪7 0 年代中期，那时r u c hfe 等【l o 】( 1 9 7 4 ) 就对 甘油在肺炎克雷伯氏菌( k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ) 中的代谢规律进行了研究，并于 1 9 7 5 年报道了在该菌种中存在两条独立的甘油代谢途径。在此后的大约2 0 年中， 人们主要集中在甘油代谢关键酶的研究上，而对甘油厌氧发酵的研究却仅仅始于 2 0 世纪8 0 年代末9 0 年代初期。那时，由于生物油脂的价格降低，导致人们大量 的使用脂肪分解的方法来生产工业上使用的脂肪酸，从而也导致脂肪分解的副产 物甘油的大量积累过剩，甘油在国际市场上的价格也随之走低。在这种情况下， 欧共体国家为了缓解甘油过剩的压力，不得不积极地进行甘油转化的研究，当时， 甘油转化1 ，3 丙二醇的研究被赋予极大地热情。1 9 8 2 年和1 9 8 7 年的f o r a g e 与 f o r s b e r g 【ii 】分别对k l e b s i e l l ap e n u m o n i a e 和c l o s t r i d i aa c e t o b u t y r i c u m 发酵l ，3 丙 二醇的厌氧特性和影响因素进行了研究2 。h e y n d r i c k x ( 1 9 9 1 ) 和d a b r o c k ( 1 9 9 2 ) 等分别对巴氏梭菌( c l o s t r i d i ap a s t e u i a n u ) 的厌氧发酵进行了报道。b i e b lh ( 1 9 9 1 ) 和g u n z e lb ( 1 9 9 1 ) 率先发表了丁酸梭菌( c l o s t r i d i ab u t y r i c u m ) 厌氧发酵甘油 生产l ，3 丙二醇的学术论文【l3 。1 4 j 。迄今为止的十多年里，微生物学专家们主要围 绕发酵菌种的分离、选育、及发酵条件等方面进行研究，并对l ，3 一丙二醇厌氧发 酵的机理、抑制因素、营养需求等多方面进行了报道。 1 3 1 甘油生产现状 甘油，英文名g ly c e r in 或g l y c e r o l ，是一种重要的化工原料。其生产方法主 要有三种，一为天然油脂皂化酶催化水解：二为化学合成：三为发酵法生产1 1 5 1 。 在多数发达国家甘油的来源主要是前两种方法，特别是在欧洲，由于天然脂肪价 格与石油裂解物的价格相比较低，导致工业上大量使用的脂肪酸，较多地采用脂 肪分解的方法来生产这些脂肪酸，也致使脂肪分解的副产品一甘油在市场上大量过 剩。随着欧洲利用过剩的菜子油和豆油为原料生产生物柴油( 其主要副产物甘油) 获得推广应用，已逐步成为廿油主要的来源。因此，在欧洲甘油来源主要靠第一 种方法，即油脂皂化酶催化水解。 舀：我国则三种方法并存，尤其是发酵法更为领先。以江南大学( 原无锡轻工 学院) 为代表的利用耐高渗酵母用淀粉质原料发酵法生产甘油，并建立了我国发酵 甘油发酵生产1 ，3 - 丙二醇的菌种筛选及培养幕优化研究 甘油研究基地，其生产水平处于国际领先地位【l6 1 。目前，该学院选育的w l - 2 0 0 2 5 菌种是国内能产甘油的耐高渗酵母的优良菌株，在含糖2 5 左右的发酵液中产甘油 高达1 2 以上，总糖转化率可达5 0 ，生产强度3 0 9 ( l d ) ，达到国际领先水平。其 研制的蒸馏设备与载体蒸馏技术，在甘油和残糖比为1 ：l 的情况下，提取率可达8 0 以上，且残渣的清洗也较容易。发酵法生产甘油，操作简单，对设备无特殊要求， 发酵工艺路线成熟。现在，生产强度更高达3 5 0 9 ( l d ) ，发酵后期不消耗甘油或 少消耗甘油的优良菌株又在江南大学诞生，并已申请国家专利。但目前由于我国 甘油市场不景气，大部分甘油生产厂处于停产、半停产状态，因而各种方法生产 的甘油价格都基本持平，但由于发酵甘油有特殊的应用领域，如食品、药品行业， 从工艺和应用角度考虑，仍以发酵法为首选。 1 3 2 甘油代谢菌种 现已发现，自然界中能够以甘油为底物转化为1 ，3 丙二醇的菌种主要有肠道 细菌的克雷伯氏肺炎杆菌( k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e ) 、产气克雷氏菌( k l e b s i e l l a a e r o g e n e s ) 、弗氏柠檬酸菌( c i t r o b a c t e rf r e u n d i i ) ，乳酸菌属的短乳杆菌( l a c t o b a c i l l i b r e v i s ) 和布氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l ib u c h n e r i ) ，梭菌属的丁酸梭状芽孢杆菌 ( c l o s t r i d i ab u t y r i c u m ) 和巴氏梭状芽孢杆菌( c l o s t r i d i ap a s t e u i a n u ) ，其中 k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e ，c i t r o b a c t e rf r e u n d i i ，c l o s t r i d i ab u t y r i c u m 是研究最深入的 1 7 - 1 8 】。甘油作为上述微生物的唯一碳源和能源物质，经过微生物代谢后除目的产 物l ，3 丙二醇外，还有乙酸、乙醇、丁酸、2 ，3 一丁二醇、乳酸、琥珀酸等副产物， 但浓度相对较低。发酵的底物、产物及副产物都能抑制微牛物的生长。克雪伯杆 菌和丁酸梭状芽抱杆菌具有较高的甘油耐受力，发酵速度较快，克雷伯杆菌与弗 氏柠檬酸杆菌属于兼性菌，而丁酸梭状芽抱杆菌则要求严格的厌氧条件。虽然克 雷伯杆菌与弗氏柠檬酸杆菌是转化1 ，3 一丙二醇的良好菌种，但由于它们属于条件 致病菌，故在实际应用上应有严格的操作规范，防患于末然。 l ，3 一丙二醇的转化率、生产强度及最终发酵浓度足考察l ，3 一丙二醇生产菌的 主要指标。表卜2 是几种微生物菌种发酵生产l ，3 一丙二醇的结果比较。 由表卜2 可以看到，克雷伯杆菌与柠檬酸菌相比，l ，3 一丙- 二醇的转化率要低， 它的转化率只有0 6 2 m o l m o l ( 丙二醇甘油) ，而柠檬酸菌则有o 6 4m o l m o l ( 丙二 醇甘油) 。但克雷伯杆菌发酵更迅速，因而克雷伯杆菌的1 ，3 一丙二醇的生产强度 要比柠檬酸菌的高。州时克雷伯杆菌对甘油的耐受力为柠檬酸菌的二倍。利用批 式和批式流加发酵，克雷伯杆菌和丁酸梭状芽抱卡t 菌可以使l ，3 一丙二醇的最终浓 度达到5 0 6 0 9 l ，其转化率可达0 5 5 0 6 5 m o l 丙二醇m o l 甘油，生产强度在 卜2 5 9 ( l h ) 。1 ，3 一丙醇的最终浓度的大小主要取决】j 菌种对底物、产物及副 产物的耐受程度及一些关键酶的活性，丁酸梭状芽抱杆菌突变株可以使l ，3 一丙： 6 硕士学位论文 醇的最终浓度达到7 0 9 l 。连续发酵可以提高生产强度到5 - 6 9 ( l h ) ，但发酵液中 1 ，3 一丙二醇的浓度不到批式发酵的一半【1 9 2 0 】，对于同一株菌采用连续发酵和批式 发酵，选择适宜的发酵条件可能相差不大。p f l u g m a c h e r 等用弗式柠檬酸菌采用固 定化细胞技术将生产强度提高到8 2 9 ( l h ) ，但获得的1 ，3 一丙二醇的浓度较低1 2 ， r e i m a n n 用丁酸梭状芽抱杆菌采用连续发酵中空纤维膜错流过滤返回细胞的方法， 将生产强度提高到2 1 9 ( l h ) ，1 ，3 一丙二醇的含量达至i 2 6 5 9 l ，但它存在一个致 命的弱点是膜容易出现污染和堵塞【2 2 l m e n z e l 等用克雷伯杆菌采用连续发酵取得 了较好的效果，1 ，3 一丙二醇的浓度达到4 8 5 9 l ，生产强度为8 8 9 ( l h ) 2 3 】。 表卜1 微生物生产1 ，3 一丙二醇的实验结果比较 t a b l e1 - 1t h er e s u l t so ff e r m e n t a t i o nb yd i f f e r e n ts t r a i n s 转化率 生产强 l 。3 一丙二副产品 菌种培养方式( m 0 1 m 0 1度作者 醇( g l ) 5 ) g ( l h ) 连续 1 8 90 6 11 8 8 e o r s b e r g ( 1 9 8 7 ) 连续 1 9 8 0 7 05 9 5乙酸、 s a i n t a m a n se t 批式流加4 6 00 7 l丁酸 a 1 ( 1 9 9 4 ) c b u t y r i c u m批式流加5 2 60 ，6 62 4 0 批式 3 4 90 5 40 7 2p flu g m a c h e r 丁酸g o tt s c h a l k 批式流加6 5 00 5 71 2 1 ( 1 9 9 4 ) 乙酸、s t r e e k s t r a k a e r o g e n e s 连续 6 2 00 5 03 8 2 乙醇 ( 1 9 8 7 ) h o m a n ne t a 1 批式 2 8 20 6 41 3 3 ( i9 9 0 ) 批式 2 5 90 4 80 7 8 乳酸g o t t s c h a l k 细胞循环 7 10 4 30 16a n d v e r h o f f c f r e u n d i l 辅助发酵8 3 60 6 10 1 4 ( 19 9 1 ) 乙酸、 a b b a d a n d aio u s 同定床 1 6 40 5 78 2 乙醇、 s ie ta 1 ( 1 9 9 5 ) 乳酸 x p n e u m o n a i e 连续 1 8 60 5 75 0 2 乙酸、 1a g( 1 9 9 0 ) 乙醇、 批式 5 6 30 5 62 2 7g u k er l z e l ( 1 9 9 1 ) 乳酸 乙酸、t r a n d in he t 批式流加 5 1 0o 6 21 4 0 乙醇a 1 ( 1 9 8 7 ) 7 什油发酵生产1 ，3 - 丙二醇的菌种筛选及培养基优化研究 c h e ne ta 1 批式流加 5 9 50 5 41 5 7 ( 2 0 0 3 ) m e n z e le ta 1 连续 3 5 2 4 8 50 5 7 0 6 94 9 - 8 8 ( 1 9 9 7 ) 乙酸、 p e ti d e m a n g ee t c b u t y r i c u m e 5批式流加 6 5 o 0 5 4 丁酸 a l b u t y r i e u m 4 7 6 0 6 2 2 0 乙酸、 r ei m a n n ， 批式流加 c b u t m u t a n t e7 0 4 0 9 81 5丁酸b i e b l ( 1 9 9 6 ) 1 3 3 甘油转化生产1 , 3 一丙二醇的途径 1 ，3 一丙二醇是一种典型的甘油发酵产物，并未发现其可由其他有机底物厌氧转 化而来【1 , 1 2j 。甘油作为惟一碳源和能源沿着氧化和还原途径发生歧化反应，氧化 途径中产物与糖类发酵产物一致，并产生供细胞生长所必需的a t p ，在某些产物 形成的同时释放还原力n a d h 。：还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生成 l ，3 一丙二醇拉制。微生物厌氧代谢甘油途径如图1 - 3 。还原途径包括两步反应：第一 步，由依赖于辅酶b ，：的甘油脱水酶催化甘油脱水生成3 一羟基i 大j 醛；第二步，由 1 ，3 一丙二醇氧化还原酶催化3 一羟基丙醛还原生成1 ，3 一丙二醇1 2 5 。2 6 1 。氧化途径中 生成丙酮酸的反应在各菌中是相同的，丙酮酸的去向则因微生物种类而异。在肠 道细菌中，丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解为乙酰c o a 和l j 酸，甲酸往往又 会分解为c o ：和h ：。乙酰c o a 在经乙酞磷酸形成乙酸的过程中尘成过量的a t p ，而 在经乙醛形成乙醇的两步反应中要消耗2 摩尔还原力。在不控制p h 值的条件下， 丙酮酸也可能经a 一乙酰乳酸产生3 一羟基丁醇并最终转化为2 ，3 一丁二醇。此外， 肠道细菌发酵甘油的产物中还有乳酸和琥珀酸1 2 7 - 2 9 】。在丁酸梭菌中，有两个典型 的氧化途径产物：乙酸和丁酸。丁酸由两分子乙酞c o a 氧化2 个y a d t ! ! 后的一连串 反应生成，伴随着a t p 的产生【3 引，在巴斯德梭菌中丁醇成为氧化途径的主要产物， 也有少量的乙醇产生1 3 。另外，如果假设平均细胞生物量组成为c h ：0 ：n ，甘油比 生物量更为还原，故细胞生长也可为l ，3 丙二醉生成提供还原力。 匦】堕固 蚓11 微生物厌氧代谢甘油途径( b i e b le ta l1 9 9 9 k 篇 f i gi _ lb i o c h e m i e a lp a t h w a y so f g l y c e r o lf e r m e n t a t i o n 酸nj 酵只在棱墒中。生2 ，3 丙 醇只在肠道细省中产申，己酸i l 己醇在这眄个茁群 中均产生 匝 p 曼扣卞壬 么p 一 曼寥圃卜鼍圆军诞 篡黟r 1 r 油发酵生产l ，3 一丙二醇的菌种筛选及培养幕优化研究 1 4生产l ，3 丙二醇的发展前景 我国是世界上最大的聚酯生产国，也是最大的聚酯消费国。新型优质聚酯材 料已经在地毯、织物、无纺布、薄膜和热塑性工程材料方面展示了良好的应用前 景，而且其更多的新功能还正在开发中。因此，开发生产高性能的聚酯材料在我 国有着广阔的发展前景。就其生产来看，微生物法以其原料易得，可利用再生资 源，对环境友好而展示其美好的发展前景。可以预料，随着人们对环境意识的增 强以及一次性资源面临枯竭的危险，世界人口和环境压力的增加，生物法生产1 ，3 一 丙二醉将越来越显示出其强大的发展后劲和广阔的发展空间。 据预测，至l j 2 0 1 0 年，全球包括非纤维应用在内的p t t 需求量将超过1 0 万t 年， 相应的，1 ，3 一丙二醇的需求量也会迅速增加。目前，我国只有北京、上海等少数 化学厂生产1 ，3 丙二醇，但产量很小。除此之外，清华大学、大连理工大学等大 学和研究所也对l ，3 一丙二醇的微生物生产进行了研究，希望得到一种有效可行的 方法对1 ，3 一丙二醇进行大量生产。就目前的技术水平而言，我国与国外的发展有 一定的差距，但我国也有了些自已的研究进展，我们应当抓住机遇，为大规模 产业化提供有力的技术支撑。 1 5课题研究的内容 本论文的重点是通过甘油诱集、平板筛选从土壤中分离筛选出一株歧化甘油 产1 ，3 一丙二醇细菌，并对筛选出的目的菌株进行培养基优化。 本论文主要从以下两个方面进行了研究： 1 歧化甘油生产1 ，3 一丙二醇菌种的筛选 运用诱集、平板筛选从土壤中分离筛选出一株歧化甘油产1 ，3 一丙二醇细菌， 通过测定生物量、菌种鉴定、气柏色谱仪检测和高碘酸氧化法等指标考察其歧化 甘油生产l ，3 一丙二醇效果，找到理想高效的歧化甘油生产l ，3 丙二醇菌种。从而 为人们更好利用甘油提供参考。 2 对筛选出的目的菌种进行培养基的优化 对分离筛选出的歧化甘油高产l ，3 一丙二醇菌种进行培养基优化实验，通过对 微生物发酵产甘油的各种影响因素的控制和定量分析，寻求一种最佳的培养目的 菌株的方法，并达到高产l ，3 一丙醇的目的。 l o 硕上学位论文 第二章目的产物1 ，3 一丙二醇的理化性质及生产方法 2 1 1 , 3 丙二醇的理化性质及用途 2 1 1 1 ，3 丙二醇的物理性质 1 ，3 一丙二醇又被称为丙二醇或者1 ，3 一二羟基丙烷。英文名称为 1 ，3 - p r o p a n e d i o l 或者1 ，3 一d i h y d r o x y p r o p a n e ，是一种无色无味，具咸味和吸湿 性的粘稠液体，易溶于水，乙醇，醚类和甲酰胺，微溶于氯仿和苯，是一种可燃、 低毒性物质。其主要物理性质见表卜l 表2 - 11 ，3 一丙二醇的主要物理性质 t a b l e 2 - 1t h ep h y s i c sp r o p e r t i e so f1 3 - p r o p a n e d i 0 1 分子式c 。h 。0 。结构c h ：o h c h ：c h ：o h 分子量 7 6 1 0 相对密度( 水= 1 )1 0 5 ( 2 5 。c ) 熔点( ) 相对蒸气密度( 空 气= 1 ) 闪点( ) 折射率( 2 0 ) 蒸发热( b p ) 一2 7 2 6 7 9 1 4 3 9 2 1 8 4 6 8 k j m o l 体积膨胀系数( 2 0 - 4 0 ) 沸点( ) 210 - 2 11 饱和蒸气压( k p a ) 0 1 3 ( 6 0 。c ) 自燃温度( ) 表面张力( oo c ) 介电子常数 ( 2 0 ) 0 6 1 1 0 q 4 0 0 4 7 4 3 1 0 q n m 3 5 1 0 4 2 1 2 1 ，3 一丙二醇的化学性质 既具有单醇的性质，又具有二醇的性质。其主要化学性质与1 ，2 一丙二醇 ( 1 ，2 - p d ) 相类似，高温下与羧酸缩合成酯。与异氰酸盐及酸性氯化物生成聚氨 酯。与1 ，2 一丙二醇不同的是1 ，3 一丙二醇只有两个端羟基有反应活性，且反应活性 相同。1 ，3 一丙二醇在酸性催化剂作用下，与醛或酮反应生成二氧杂环乙烷，这是 一种广泛应用的有机无机溶剂。在氧化铝催化下，1 ，3 一丙二醇可生成乙醇、丙二 酸等。其中l ，3 一丙二醇最重要的性质就是与二酸反应生成聚酯和聚氨酯。 甘油发酵生产1 ，3 一丙二醇的菌种筛选及培养幕优化研究 2 1 31 ，3 丙二醇的用途 l ，3 一丙二醇( 1 ，3 - p d o ) 是一种重要的化工原料，可直接用于防冻剂，是多种 增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂的合成原料。也广泛应用与食品、油墨、涂料、 印染、化妆品和制药等行业，并且可以替代1 ，4 一丁二醇和新戊二醇等中间体用于 生产多醇聚酯以及作为碳链延伸剂t 3 2 1 。l ，3 一丙二醇最主要的用途是合成新型聚酯 p t t 的原料 3 3 1 。i ，3 一丙二醇和对苯二甲酸( p t a ) 可以合成聚酯p t t ( 对苯二甲酸 丙二醇酯) ，是一种高性能、易加工的新型热塑性聚酯材料。l ，3 一丙二醇的三个亚 甲基所具有的“奇碳效应使得p t t 分子形成了天然螺旋状的纤维结构，从而具 有良好的回弹性。p t t 还具有良好的染色性能和膨松性能，能够满足高弹力且手 感柔软的纺织品市场需求；p t t 纤维可常压印染并具有良好的抗污垢性能、抗磨 损性能和抗静电性能，可以代替尼龙作为制造地毯的新型材料；p t t 具有很好的 抗冲击强度和尺寸稳定性，比对苯二甲酸丁二醇酯( p b t ) 具有更好的使用性能， 比对苯二甲酸乙二醇酯( p e t ) 具有更好的成型加工性能1 3 4 1 ，在工程塑料领域也 具有巨大的应用潜力。p t t 的优良性能决定了其广阔的市场前景，它的诸多优良 性能使它被评为美国1 9 9 8 年六大石化新产品之一。尽管p t t 在1 9 4 1 年就在实验 室制备出来，但是直到l9 9 5 年才由荷兰s h e ll 公司首先公开宣称p t t 的商品化， 商品名为“c o r t e r r a ”e 3 5 | 。为此，美国化学学会于2 0 0 0 年3 月2 8 日对开发p t t 的s h e l l 公司c o r t e r r a 小组的i 位化学家和化学工程师给予发明奖。由于以l ，3 丙二醇为原料生产的聚酯既提高了产品性能，又减轻了环境污染，因此，1 ，3 一丙 二醇的生产和应用成为当前圈际上合成纤维上维材料开发的热点，其大规模生产 将引发化纤产品结构的根本性调整。l ，3 一丙二醇可与己二酸、癸二酸缩聚，制成 相应的聚酯薄膜，这种薄膜具有生物降解性，埋在土壤中可在自然界微生物作用 下逐步分解。1 ，3 一丙二醇还可以与作为合成油漆的原料，由此合成的油漆具有很 好的弹性和硬度，可用丁：蛇管外层涂料、罐头油漆和粉未喷涂等。其品质优良， 目前只有价格昂贵的二醇类( 主要是1 ，6 一己二醇) 才能与之媲比。在药物合成领 域，l ，3 一丙二醇已用于维生素h 的合成。近年l ，3 一丙二醇作为有机合成原料越来 越受到重视。 2 21 ，3 一丙二醇的合成方法 目前，l ，3 丙二醇的l 产方法主要有化学合成法和微生物发酵法【3 6 3 8 】。在化 学合成生产中已具备商q 扛化的方法有环氧乙烷法和丙烯醛法【39 1 。 2 2 1丙烯醛水合法1 4 0 舶j 德幽d e g u s s a 公司丌发了以丙烯醛为原料生产l ，3 一丙二醇的一 业化路线，并 硕j ：学位论文 申请了专利。其反应方程式为： 丙烯醛水合得到3 - h p a ，然后加氢制得1 ，3 一丙二醇。 c h ：= c h c h o + h ：o h o c h ：c h ：c h o + h 2 一h o c h 。c h ：c h 。o h 丙烯醛路线反应条件比