（环境科学专业论文）应用固化酶检测蔬菜中农药残留的速测技术研究.pdf

摘要 免疫法测定黄曲霉素等毒素开发设计的，为将酶标仪应用到对农药残留的快速 检测上，本文专门编写了一套应用软件，使酶标仪能实现对农药残留的检测。 该软件具有较好的人机交互界面，能够自动提示检测过程，计算并打印检测结 果，可与计算机连用进行数据的存储及网络传输。 第四，乙酰胆碱酯酶的来源问题一直是困扰农药残留快速检测技术发展的 一个重要因素。如果采用进口酶源不但价格较昂贵，而且到货周期较长，难以 满足检测过程的需求。本文以胎牛血清为例对乙酰胆碱酯酶的分离纯化进行了 一定的探索。在对酶活性进行科学定义的基础上，分别考察了a c h e 最适的p h 范围、温度、底物浓度、反应时间等因素，最终确定出a c h e 的检测方法，为酶 的分离纯化奠定了基础。通过采用硫酸铵逐级沉淀、葡聚糖凝胶柱层析、d e a e 纤维素柱层析三步分离纯化过程，可得到单点纯的乙酰胆碱酯酶，表现在凝胶 电泳上即由硫酸铵沉淀液的4 条谱带减少至一条谱带。 第五，将研制出的捣碎提取设备、固化乙酰胆碱酯酶、和酶标仪组合在一 起构成一套完整的农药残留快速检测设备。应用该设备对二百多个蔬菜样品进 行实际检测，并将检测结果与气相色谱法进行对照，结果表明两种方法的吻合 率在8 0 以e 。 关键词：农药残留快速检测固定化酶乙酰胆碱酯酶 a b d n c t a b s n a c t ni si m p o r t a i l tf o rp e o p l e sh e a l 也t od e v d o p m e n taf h td e t e c t i o nt e c l l n o l o g yo f p e s t i c i d er e s i d u ei nv e g e t a b l e s ，w h i c hc o u l dc a u s ea c u t ef o o dt o x i c i 够i nm i sa m d e ， s o m ed e m e r i tw e r ed i s c u s s e dd b o u tp a s tp e s t i c i d er e s i d l l ef 瓠td c t e c t i o nt e e h n o l o g y 锄dan e wo n ew a sd e v c l o p e da 1 1 du s e df o rv e g e 拓出1 es 黝p l e sd e t e c t i o n f i r s y ，p e s t i c i d er e s i d u ee x t r a c t i o ne m c i e l l c yo fp a s tf 瓠td e t e c t i o nt e c h n 0 1 0 9 i e s w a ss t i l d i e d i np a s tm ep e s t i c i d e sr e s i d u ei 1 1v e g 就a b l e sw a se x t m 曲e dw i m p b s0 r m e t h a n o ls 0 1 u t i o nb ys i m p l er i n s e i i lt l l ea m d e ，a f t 盯d i f f b r e n tc o n c e n 仃a t i o no f p e s t i c i d es t 锄d a r ds a m p l e sw a ss p i k e d0 nv e g e t a b l es u 吨峙et h ee x 仃a c t i o ne 蚯c i e n c y o fs i m p l ef i n s eo fs i xk i l l d so fp e s t i c i d ew a sc n s u r e db yg a sc h m a t o g r 印h yt h e r e s u l t si n m c a t et h a tt 1 1 ee x 廿a c te 伍c i e n c yo f v e g e t a b l es a m p l e sw a sa 跣c t e db yp l a c c d t i m ea tr o o mt e i n p e r a n l r e w h e np l a c c d2h o u r so n l yt h ec x 订a c t i o ne 伍c i c i l c yo f6 k i n d so fp e s t i c i d e sb ys i m p l er i n s ew a sm o r et h a n8 0p e r c e n tb u tw h e nm ep l a c e d t i m ew a sp m l o n g e dt om o r et 1 1 a n4h o l l r st h ee x 饥l c t i o ne f f i c i c i l c yd e c l i n e dr 印i d l yt o b e l o w4 0p c r c e n tf o rm o s tp e s t i c i d e s f o rt h i sr e a s o naf h s te x 拄a c t i o nt e c h n 0 1 0 9 yb ya m i c r o - h o m o g e n i z e rw a sd “e l o p e da n dt h ee x 廿a c t i o ne 伍c i e n c yc o u l dg e tm o r ct h a n 7 0p e r c e n tf o rm es i xk i n d so f p e s t i c i d e s s e c o n d l y t 1 1 ea c c t y l c h o l i n e s t e r a s ee n z y m e ( a c h e ) i m m o b i l i z a i i o nt e c h o l o g y w a ss t i l d i e d c r o s s 一1 i n i ( i n gw a sab r o a d l yu s e de 1 1 z y m ei m m o b i l i z a t i o nt e c h n o l o g yi n t h i sa n i d e ，血ea 行c c t i o nf 犯t o r so fi m m o b i l i z e da c h ea c t i v i t yf o re x 锄p l ep h ，m e c o n c e n 仃a t i o no fb s a ，g aa n dg e l a t i nw c r es t i l d i e d t h ei m m o b i l i z e da c h eb y c r o s s 1 i n l ( i n gm a i n 切i n c d m o r ct h a l l6 0p c r c e n ta c t i v i t ya r e rp l a c e di nr o o m t e m p c r a t l l r ef o r6m o n t h s t h ei m m o b i l i z e d e n z y m ea c t i v i t yr e c o v c r yb y c r o s s l i n k i n gw a sl o w e rb e c a u s et h eb i 一血n “o n a lr e a g e n tg a w a sh u r t 血1 l yt oa c h e n o wak i n do fp h o t o c r o s s l i l l k a b l ep 0 1 y i n e rp v a s b qg o tr e c o g i l i t i o no nc n z y m e i m m o b i l i z a t i o n ah i g h e rp r o d u c t i o nt e d m o l o g yr o u t ew a se x p l o r e di nl a b o r a t o r ya n d m ep r o d u c tw a su s c dt oi m m o b i l i z ea c h e 1 1 1 ei m m o b i l i z e da c h eb yp v a s b qh a s h i g h e re n z y m ea c t i v i t yr e c o v e r ya n dm o r em a n 7 0p c r c e n ta c t i v i t yw a sg o t t e na 丘e r6 m o n m sp l a c e di nr o o mt e m p e r a t u r e i i i a 6 s 妇c f 盯血d l y ，i n s t e a do fo b s e n ，i n gb ye y e sam i c r o p l a t er c a d e rw a su s e df o r i i n p r o v i n gt h ee s t i l n a t i o nr e s u l ta c r a c y u s u a l l y ，m i c r o p l a t er e a d e rw a sd e s i g n c d f o ra n a t o x i nd 就e c t i o n as o r w a r cw a sw 血e dt oa d j u s tt h em i c r o - p l a t er e a d e rf b r p e s t i d d er c s i d u ed e t e c t i o n t h es o f w a r ec o u l dh i i l tt h ed c t e c t i o np m c e s s ，c a l c u l a t e a l l dp r i i l td e t e c t i o nr e s u l t sa u t o m a t i c a l l ya i l dw h e nl i l l l ( e d 惭t l lac o m p u t e rd c t e c t i o n r s u l t sc o u l db en a n s m i t t e do nn e t 、v o r k f o u r t h l y ，t h es o u r c eo fa c h ew 勰0 n eo fi m p o r t a n tf a c t o rw h i c ha 虢c t e dt h e d c v e l o p r n e n to f p e s t i c i d er e s i d u e 缸td e t e c t i o nt e c h n 0 1 0g y _ 1 1 1 ea c h ec 1 1 z y i n es o u r c e o ff 巩a lb o v i n es e r u mw a ss 印a r a t e da n dp u r i f i e db ya m m o n i u ms u l f 缸e 丘_ a c t i o n a l p r e c i p i t a t i o n ，s e p h a d e x g 一1 0 0 g e l c o l u m n矗l 打a t i o na n dd e a e c c l l u l o s e c h r o m a t o 聊h y t h es d s - p a g ea 1 1 a l y s i s o ft h e 删6 e dc n z y l n ep r 印a r a t i o n s h o w e do n eb a n db yp r o t e i ns t a i n i n g a r e rm eo p t i m a lp h ，t c l n p e r a t u r e ，s e d i m e n t c o n c e n 仃a t i o n ，r c 删o nt i m ew e r ed 曲锄i n e db yc x p 嘶m e n t 也ec i l z y i n eu n i t ew a s d e f h l c da so n eu n i t 、】l r i l lh y d r o l y z e1 0 肛m o l eo fa c e t y l c h 0 1 i n et oc h o l i n ea n da c e t a t e p e r m i na t p h 8 0a t3 7 。c f i n a l l y ，t 、】l r oh u n d r e ds 锄p l e sw e r cd e t e c t e db yt l l ed e v e l o p e d 加td c t e c t i o n t e d h n 0 1 0 9 y t h er e s u l t sw c r ec o n s i s t e n t 、】l r i 虹lg a sc h r o m a t o 伊a p h yb e t t e l k e y w o r d s ：p e s t i c i d er e s i d u e ； 协td e t e c t i o n ；i m m o b i l i z 。de n z y m e ； a c e t y l c h o l i n s t e r a s e 第一章概述 第一章概述 民以食为天，食品质量是决定人生存质量最重要的因素之一。改革开放以 来，中国人经过自己的努力用占全球7 的耕地养活了占世界2 2 的人口，取得了 世界瞩目的巨大成就。在解决了温饱问题以后，人们已经开始注意食品的质量 问题，不但食品的营养成分受到关注，其可能的污染更被越来越多的人们关注“1 。 新中国成立以后我国开始建立自己的农药生产工业，并且开始大规模的生 产有机氯农药。上世纪8 0 年代初，鉴于有机氯农药在环境中的残留期较长，我 国开始研究全面取代有机氯农药，代之以残留期较短的有机磷和氨基甲酸酯类 农药。直到今天，这两类农药仍然在我国目前使用的农药品种当中占有主导地 位。经过三大类农药几十年的持续施用我的农药污染情况到底怎样呢；为防止 急性食物中毒事件的发生，对这两类农药的检测手段又有何进展呢? 对此我国 的许多学者一直都给予了较高的关注。 第一节我国农药污染现状研究 1 1 1 有机氯农药污染现状研究 有机氯杀虫剂包括两大类，即以苯为原料的和不以苯为原料的，前者如滴 滴涕( d d t ) 、六六六等，后者如环戊二烯类、毒杀酚等。从有机合成农药的发 展史来看他们是最早广泛使用的一类药剂，尤其是滴滴涕的开发被认为是现代 农药的起点，在3 0 多年的历史进程中，对农业丰收和预防虫媒传染病方面起到 了巨大的积极作用。 1 9 5 0 年末，中国研制六六六( b h c ) 成功，此后，大规模生产和使用有机氯 农药，八十年代初达到顶峰。1 9 8 3 年我国才开始禁止生产b h c 、d d t 等有机氯农 药。虽然在我国有机氯农药被禁用了2 0 多年，但食品中仍然能检测出有机氯农药 残留，且平均值远远高于其它发达国家。13 。1 9 9 2 年卫生部食品卫生监督检验所 对全国食品中有机氯农药进行的大规模调查是国内最近的一次大规模调查。以 黑龙江省、北京市、四川省、浙江省和广东省为检测点，分别代表东北、华北、 西南、华东和华南地区，选择最能代表中国人群基本膳食的8 大类食品：粮食、蔬 第一章概述 菜、水果、肉禽、水产、植物油、蛋、乳，在市场上采集样品3 5 5 件5 “。3 5 5 件样 品中有2 件b h c 含量超出中国残留限量标准，合格率为9 9 4 4 ，d d t 合格率1 0 0 。但 相当数量样品仍检出b h c 和d d t 残留，b h c 检出率6 9 ，d d t 检出率4 2 ，动物性食品 中b h c 、d d t 残留量显著高于植物性食品。监测结果与中国允许残留量标准( m r l ) 比较，b h c 为限量标准的o 6 1 8 o ，d d t 下降趋势缓慢，为限量标准的3 0 9 6 3 5 0 ；与w h o 日允许摄入量( a d i ) 比较，中国居民通过膳食摄入的b h c 、d d t 的量 低于w h o 规定的日允许摄入量。但如与世界其它国家比较，以成年男子每日膳食 摄入b h c 和d d t 量比较，中国远远高于世界发达国家水平。b h c 摄入量中国是美国 的8 4 倍、日本的1 5 倍，d d t 摄入量中国是澳大利亚的1 6 倍、美国、日本的2 4 倍。 大量调查结果表明”“1 ，中国食品中有机氯农药残留水平虽然较7 0 年代有了 明显的下降，但远远高于世界发达国家，由于有机氯农药性质稳定，不易降解和 其高脂溶性，其影响至今没有消失。1 9 8 9 年我国曾对三十个城市的母乳中有机氯 农药的残留水平进行监测，b h c 含量在1 3 9 1 5 5 m g k g ，d d t 含量在o 8 3 1 5 o m g k g 。 中国八十年代末，p ，p d d t 水平低于印度、墨西哥，高于其它工业发达的国 家，p ，p d d t 、b b h c 水平仍名列前茅，处于最高水平。无锡市1 9 9 0 年对该市进行 调查表明，按世界卫生组织提出的计算方法，每公斤体重婴儿每天吃母乳1 3 0 9 ， 计算实验区婴儿从母乳摄入六氯苯、b h c 、d d t 的量，结果表明，调查地区的婴儿 从母乳摄入b h c 、d d t 的量均高于世界卫生组织世界粮农组织规定的最高允许 值。北京市通过八年监测，模拟计算结果表明，北京市母乳中b h c 的水平降到八十 年代初经济发达国家的水平需1 5 2 0 年的时间。3 。 李卫华“”等对上海和宜兴地区环境和人体中有机氯农药的污染状况进行了 调查，分别在上海和宜兴两城市采集2 0 种食物样品及5 份人乳腺组织，采用气相 色谱法对样品中有机氯含量进行测定结果发现d d t 、b h c 、六氯苯及其代谢物 ( h c b ) 、氯丹( c h l s ) 在食品中的检出率分别为8 5 、6 4 、5 9 和5 3 ，食品中 b h c ，h c b ，c h l s 含量较低；而人乳腺组织中d d t 和b h c 的含量很高，可分别达 1 9 0 0 0 n g g 脂肪和1 7 0 0 0 n g g 脂肪。结果表明上海和宜兴地区食物和人乳腺组织 中普遍还能检测到有机氯农药的残留，但较前期监测数据已有明显下降。 2 第一章概述 1 1 2 有机磷和氨基甲酸酯类农药污染现状研究 有机磷和氨基甲酸酯类农药的降解半衰期一般为几周至几个月，一般认为 其在食品中的残留量很少，但是后来的研究表明，这些所谓的非持久性农药在 某些环境条件下也会有较长的残存期，并在动物体内产生蓄积作用。对一些生 长期短的蔬菜类食品，由于害虫多、施药量大，加之违章使用等，有机磷农药 的超标现象严重“。 当前蔬菜上使用的甲胺磷、氧化乐果、马拉硫磷等高毒、高残留甚至剧毒 农药的现象还相当普遍。农业部于2 0 0 0 年5 月组织对京、沪、渝、鲁、浙5 省市 5 0 多个蔬菜品种1 2 9 3 份样品抽检，不合格率达2 2 1 。国家质量技术监督局于 2 0 0 1 年第1 ，2 ，3 季度重点抽查了2 3 个大中城市的大型蔬菜批发市场的菜花、番 茄、甘蓝、黄瓜、茄子、白菜、油菜等十余类蔬菜。抽查结果表明，蔬菜农药残 留超标问题突出表现在两个方面：一是有机磷残留量超标：二是一种蔬菜中含 有多种农药残留的现象比较普遍“。北京市2 0 0 1 年上半年对蔬菜批发市场的抽 检结果是“放心菜”的比例仅为8 3 1 “。2 0 0 0 年6 9 月对合肥市1 0 个主要菜市 场的蔬菜商品抽样调查，检测有机磷及氨基甲酸酯类农药的超标情况，结果合格 率为8 5 。2 0 0 1 年5 1 0 月对合肥、六安、蚌埠、芜湖、巢湖等6 个市的菜市场出 售的蔬菜进行了调查，结果显示有机磷及氨基甲酸脂农药平均超标率为8 。近 年来，农药残留超标情况呈下降趋势，进一步定性分析发现污染农药主要为甲 胺磷，氧乐果等“。蔬菜上主要使用有机磷、氨基甲酸酯和菊酯类农药品种。据 某7 个省市部分地区蔬菜农药残留调查统计表明，甲胺磷( 高毒农药品种) 残留量 为o 0 0 5 m g k g 0 5 7 2 m g k g ，检出率和超标率均为5 9 ；久效磷( 高毒农药品种) 残留量为o 0 2 0 7 m g k g o 6 7 2 3 m g k g ，检出率和超标率在1 0 左右；对硫磷( 高毒 农药品种) 残留量为o 0 9 0 皿g 妇1 9 9 6 m k g ，检出率和超标率分别为3 4 8 和 7 5 ；敌敌畏残留量为0 0 1 0 m g k g 0 5 4 9 m g 风，检出率、超标率分别为 7 9 ，2 0 ；乐果残留量为0 0 1 7 m g k g o 1 3 8 m g k g ，检出率和超标率分别为 7 3 5 ，1 5 。马拉硫磷残留量为o 1 9 l m g k g 0 3 2 m g k g ，检出率为7 0 。从上述6 种有机磷农药残留状况看，高毒农药品种是不允许在蔬菜上使用的，但在部分地 区有检出并有较高的超标率，敌敌畏、乐果和马拉硫磷中等毒性农药品种检出率 高，也有1 5 2 0 的超标率“5 。2 0 0 0 年底至2 0 0 4 年，己在全国进行了3 次针对蔬 菜农药残留的国家监督抽查，共抽查了6 3 个大型蔬菜批发市场的4 3 6 种产品，合 第一章概述 格2 6 7 种，平均抽样合格率为6 1 2 ，比国家监督抽查总体抽样合格率低近2 0 个百 分点。如果把2 0 0 1 年所抽蔬菜产品归类，其制样合格率顺序为，果菜类 甘蓝类 豆类 叶菜类 葱蒜类。以2 0 0 4 年2 季度抽查结果为例，其合格率分别为5 6 9 、 5 1 5 、4 7 1 、4 5 8 、2 0 0 。抽样数据表明，秋冬蔬菜农残合格率相对高，春 季使用农药的频次和数量较秋冬大”。如1 9 9 9 年1 1 月1 2 月湖北省药检所2 次对 武昌水果湖、大东门、广埠屯、马房山、汉口红桥等5 个集贸市场的蔬菜进行有 机磷残留速测，共抽查2 2 个蔬菜品种4 8 个样品，其有机磷农药检出率高达3 0 ，残 留量最高者为l o m g k g 其超标达到惊人的程度，检出率达7 1 9 “；河北省防疫站 1 9 9 7 1 9 9 9 年历时3 年的调查表明，蔬菜中残留农药的种类和数量逐年增多，检 出率也逐年上升。1 9 9 4 年3 5 月间对我国部分瓜果蔬菜的抽样调查发现，在1 1 种8 4 件蔬菜样品中，农药残留超过国家标准的4 1 件，其中韭菜和小白菜农药残留 超标率达1 0 0 。2 0 0 0 年8 月4 日安徽商报报道，安徽省与国家农业标准化与检 测中心合作对合肥市主要蔬菜市场叶菜类蔬菜进行检测发现，被检测样品严重 超标的占2 8 1 ，韭菜、木耳菜的农药残留最为严重，超标的达3 7 5 。2 0 0 0 年农 业部药检局在北京某大型农副产品批发市场抽检1 0 5 个样8 个样品存在农药严重 超标问题，其中1 个大白菜样品中含高毒甲胺磷量达6 9 m g k g ，是国家规定标准 的7 0 0 倍。有关部门在杭州抽取的7 2 个样品中，超标的就有2 2 个，占3 0 5 。2 0 0 1 年6 月2 2 2 7 日对丹江口市城区4 个蔬菜市场分别进行了抽样检测，共取样5 9 个， 农药残留超标或严重超标4 9 个，占8 3 1 。其中叶菜类取样3 3 个，农药超标或严重 超标样2 9 个，占8 7 8 ；瓜菜类取样1 7 个，农药残留超标或严重超标样1 4 个，占 8 2 3 ；水果类取样9 个，不合格或严重超标样6 个，占6 6 7 “。 据国家统计局提供的资料表明，仅1 9 9 5 年，全国2 7 个省( 市) 的农药中毒事件 就多达43 7 7 起，其中3 2 0 4 起为致死中毒事件。1 9 9 9 年卫生部收到食物中毒报告 9 7 起，中毒4 9 9 9 人，死亡1 0 3 人。其中农药中毒1 1 6 6 人，死亡6 9 人，未正式报告的数 字难以统计。卫生部和农业部估计2 0 0 0 年我国农药中毒超过2 0 万人。1 9 9 4 年3 5 月间对我国部分瓜果蔬菜的抽样调查发现，在1 1 种8 4 件蔬菜样品中，农药残留 超过国家标准的4 l 件，其中韭菜和小白菜农药残留超标率达1 0 0 “” 第二节农药残留检测技术研究进展 农药在保证和促进农牧业发展，满足人们对农副产品的需要等方面所发挥 4 第一章概述 的显著作用是众所周知的。然而近年来，食用受到农药严重污染的食品而造成的 中毒事件屡有发生。因此，农药污染的严重现状越来越受到人们的关注。，食品 安全问题也越来越引起世界各国的重视，因为它与人们的健康有最直接的联系。 为了保障消费者健康，必须加强农药残留的检测。随着超高效农药的开发应用 和待检样品的增加，对农药和药物残留分析技术的灵敏度、特异性和快速性提 出了更苛刻的要求”。因此，农药残留分析技术的进步也受到高度重视。我国 的农药和药物残留分析技术始于2 0 世纪5 0 年代，那时的农药和药物残留检测技 术仅限于化学法、比色法和生物测定法。检测方法缺乏专性，灵敏度也不高。 气相色谱自2 0 世纪6 0 年代初应用于农药残留分析，推动了农药残留分析技术的 飞速发展，大大提高了农药和药物残留量的检测水平。2 0 世纪8 0 年代以来，高 效液相色谱法开始广泛应用于对热不稳定和离子型农药及其代谢物的分析。高 效能的色谱柱可将各组分与杂质分离，高灵敏度和专一性强的检测器解决了早 期不能检出的微量农药、代谢物和降解产物的分析。2 0 世纪9 0 年代，农药残留 分析技术日新月异，一些新技术已进入应用阶段“”。仪器分析法在农药残留检 测技术中占有举足轻重的地位。一向比较烦琐的样品前处理工作正在向省时、 省力、廉价、减少溶剂、减少对环境的污染、微型化及自动化方向的发展，一 些新技术己进入实用阶段，这些新技术包括现代光谱技术、现代色谱分析技术、 波谱和色谱联用技术，生物传感和免疫分析技术、化学计量和信息技术及实验室 自动化等。”州 1 2 1 样品的前处理技术 样品的前处理包括对待测物的提取、净化和浓缩。提取是指使用适当溶剂 ( 常用丙酮或乙腈) 将待测物连同样品基质从固态样品中转移到易于净化和分 析的液态；净化是指将待测物与提取液中的干扰物质分离。在现代残留农药检 测中，提取、净化可以一步完成，提取、净化的界限已十分模糊“。 1 2 1 1 液液萃取技术 液一液萃取“”( l l e ) 是最早使用的一种提取净化方法，该方法不需要昂贵的 设备和试剂，方法简单，易于操作。早期的a o a c ( 国际官方分析家协会) 方法和我 国现有的国家标准方法中，大多使用l l e 作为提取净化的手段。其一般步骤是将 样品和萃取剂置于匀浆机或组织捣碎机中高速捣碎匀浆，使农药被完全萃取，然 5 第一章概述 后过柱净化。常用的柱填料吸附剂为硅酸镁( f l o r i s i l ) 、氧化铝、硅胶等”。 早期的液一液萃取法先是用乙腈提取，然后用石油醚二氯甲烷进行液一液分 配，最后用硅酸镁柱净化。1 9 8 5 年以后，逐步用丙酮代替了乙腈，主要是因为乙腈 有剧毒，而且价格昂贵，而丙酮具有低毒、便宜的优点，并且它既能萃取极性物 质，也能萃取非极性物质。同时剧毒的二氯甲烷也逐步被环己烷、轻油等取代”。 l l e 的缺点在于使用了大量有毒溶剂，对环境和操作人员的身体健康是一种威 胁。另外，使用l l e 进行提取净化费时费力，不能进行即时检测，已经逐步被其 他一些提取方法所取代。 1 2 1 2 固相萃取技术 固相萃取技术于1 9 7 8 年开发”，是目前常用的净化手段。它根据液相分离、 解析、浓缩等原理，使样品溶液混合物通过柱子后，样品中某一组份保留在柱 中，通过再选择合适的溶剂把保留在柱中的组分洗脱下来，从而达到分离、净 化的目的。固相萃取法与液一液萃取及般柱层析相比，可节省时间和溶剂大 约9 0 ，减少杂质的引入，对操作者更安全，重现性好，可避免l l e 中乳化现象 的产生。s p e 是另一种色谱技术应用的形式，依据填料可分为吸附型、分配型和 离子交换这些型，其填料有硅胶、大孔吸附树脂、c 。、c 。腈基、苯基、氨基和 其他特殊填料，其原理基本上与一般色谱相同。对水样和其他液体样品，在选 择合适的萃取柱和洗脱液及其他优化条件后，可使萃取、富集、净化一步完成， 然后直接进行气相色谱法( 简称g c ) 或高效液相色谱法( 简称h p l c ) 分析。 s h e p h e r d 等用c ，。柱萃取水中莠去津，用1 5 h 萃取1 2 个样品，1 0 m l 水样，检出灵 敏度可达5 l o 1 1 9 。w a n 简化了植物油中o c s 残留分析时硅胶柱的净化方法，减少 了有机溶剂的使用”；h 0 1 l a n d 等”“用c ，。柱筛选葡萄酒中7 4 种农药，方法快速，重 现性也好；b e n t a b l ”用半制备c 。分离食用油中的o c s 和o p s 的固体样品，s p e 主要 用于净化，提取仍须先用溶剂萃取，净化时可用单柱，也可用多柱串联使用； s c h e n c k 等”“1 用c 。和f l o r i s i l 硅土s p e 柱串联，净化鸡蛋中有机氯及有机磷的乙腈 提取液，以g c 电子捕获检测器( 简称e c d ) 一火焰光度检测器( 简称f p d ) 测定，大 约减少9 0 溶剂消耗和8 5 废液处理。另一种增强净化效力的方式是用混合型柱， 它可利用多种界面效应来分离和纯化分析组分。m i l l s 等比较了2 种不同的混合 柱在环境及i 临床化学中的应用。一种是将各种不同填料经机械混合装入同一s p e 柱；另一种是将这些带不同极性官能团的物质，化学键合到同一骨架树脂上，将 6 第一章概述 其制成s p e 柱。实验表明，极性的均三氮苯类化合物在机械混合的s p e 柱上，回收 率低于多聚键合型s p e 柱，原因可能是由于硅胶粒子的空间隔离，降低了某些活 性基团的作用。g i l l e s p i e 用多柱s p e 净化植物油和牛脂中的o c s 及o p s ，油或脂 质样品用乙烷溶解后，首先经d i a t o m a c e o u se a m l ( c x 缸- e l u tq e ) 柱和c 。e 键合硅胶 ( 0 d s ) 微柱处理，洗脱液分为两部分，一份浓缩后，丙酮溶解，用g c f p d 测定o p s ， 另一份经氧化铝微柱处理，进一步除去脂质，用g c e c d 测定o c s 。s p e 的另一优 点是容易实现前处理的自动化，将其与h p l c 液相色谱( 简称l c ) 在线结合可实现 许多农药残留的全自动分析。 1 2 1 3 固相微萃取技术 固相微萃取( s p m e ) 是8 0 年代末由加拿大学者提出的一种简便、快捷、无溶 剂的样品制备与前处理技术。s p m e 的原理是利用待测物在基体和萃取相间的非 均相平衡，使待测组分扩散吸附到石英纤维表面的固定相涂层，待吸附平衡后， 再与气相色谱( g c ) 或高效液相色谱( h p l c ) 联用以分离和测定待测组分。s p m e 与 g c 联用适于分析挥发性有机物，通过热解析使待测组分与萃取纤维分离。而对于 难挥发的有机物可利用s p m e 与h p l c 的联用技术，通过溶剂解析的作用达到分离 效果。s p m e 的萃取模式可分为三种：直接法，即将石英纤维暴露在样品中，主要 用于半挥发性的气体、液体样品萃取；顶空法，将石英纤维放置在样品顶空中， 主要用于挥发性固体或废水水样萃取。；膜方法，将石英纤维放在经过微波萃取 及膜处理过的样品中，主要用于难挥发性复杂样品萃取。s p m e 的原理是利用待测 物在基体和萃取相间的非均相平衡，使待测组分扩散吸附到石英纤维表面的固 定相涂层，待吸附平衡后，再与气相色谱( g c ) 或高效液相色谱( h p l c ) 联用 以分离和测定待测组分。 在s p m e 方法中，被测物质的萃取量取决于它在样品基质和固定涂层中的分 配平衡。分配系数越大，萃取率越高，检出的浓度也就越佳。c o r r e i a 。7 1 讨论了纤 维涂层、萃取时间、萃取温度以及纤维暴露在样品中的时间等因素对萃取效果 的影响。提高萃取率的方法有：依据样品情况，即被测物的挥发性与基体亲和 程度选择萃取方式以及固定相组成，根据“相似相溶”原理，对于不同极性的样 品选取相应固定相”8 ”3 。增加固定涂层厚度不仅可提高被测物质吸附量，而且 不同厚度萃取的对象也有所不同，小分子或挥发性物质常采用厚的涂层，大分子 或半挥发性化合物采用薄的涂层。加入无机盐，调节溶液的离子强度，降低极 第一章概述 性有机物的溶解度。可通过调节溶液的p h 值，防止某些待测物质离子化。对 于强极性物质，可通过衍生化反应来降低待测物的极性，提高其挥发性，增加其 吸附到固定相的能力，。 利用s p m e 技术作前处理，能得到很好的实验效果。s i m p l i c i o 等3 采用s p m e g c f p d 联用方法测定水果和果汁中有机磷农药，实验表明对于水果及果汁基 体中所有农药，该方法检测限在2 ug k g 以下。在2 5 ug k g 到2 5 0 | lg k 的浓度范 围内，果汁中每种农药残留的平均回收率在7 5 9 和1 0 2 6 之间，而水果中除了 吡唑，其它农药平均回收率在7 0 和9 9 之间。用s p m e g c f i d 连用方法可以在u g m l 和n g m l 水平上分离并定性和定量地检测食品中的薄荷醇和薄荷酮“。s p m e 技术在样品前处理方面有很大的发展空间。 1 2 1 4 凝胶渗透色谱法 凝胶渗透色谱法( g p c ) 又称空间排阻色谱法，基于体积排出的分离机理， 不仅可用来分离和测定小分子物质，而且还可以分析具有相同化学性质但分子 体积不同的高分子同系物，其主要依据在于相对分子质量的差别。根据这种差 别，通过g p c 可以将农药与农药、农药与共提取物分开，从而使之得到分离和 净化。该技术的色谱柱的内径和长度都必须达到一定标准。色谱柱子的内径一 般在1 5 2 5 c m ，柱内凝胶高度不低于2 0 c m ，只有这样它才能容纳一定量的杂 质并使之与农药分开。色谱柱通常采用玻璃柱。常用的色谱柱填料主要有交联 聚苯乙烯凝胶、多孔交联聚苯乙烯凝胶、f l o r i s i l 、氧化铝及硅胶等。常用的 洗脱剂有：乙酸乙酯、环己烷、二氯甲烷”23 等。g p c 的最佳参数“”不仅包括溶剂、 载体的选择，还包括合适的温度以及溶质的化学性质等。 g p c 是农药残留分析中一种常用有效的提纯方法，由于具有自动化程度高、 较好的净化效率、以及较好的回收率，广泛适用于有机磷、有机氯农药的提取， 尤其是脂类食物样品中残留农药的提取。该技术对各种农药的过柱回收率能达 到9 3 1 0 7 ，方法灵敏度高，准确度好，能很好的分离共萃取物质“。 1 2 1 5 超临界流体萃取 所谓超临界是物质的一种特殊流体状态：当气液平衡的物质升温升压时，热 膨胀引起液体密度减少，而压力升高又使气相密度变大，当温度和压力达到某一 点时，气液两相界面消失成为一均相体系，这一点就是临界点。当物质的温度和 8 第章概述 压力高于此l 晦界点时，它就处于超临界状态，即为超i 临界流体。s f e 能同时完成萃 取和分离两步操作，具有分离效率高，操作周期短，传质速度快，溶解能力强，选 择性高，无环境污染等优点。目前最常用的超临界流体是c 0 。，其分子的极性比较 小，可用于提取非极性或弱极性农药残留。s n y d e r “”在有机氯农药( o c s ) 和有机 磷农药( o p s ) 测定中，比较了用3 甲醇为改性剂的c 0 。的s f e 净化与经典的超声波 和索氏提取法的效率，认为s f e 精密度最好，比其他两种方法省时省力，s f e 还可 以通过调节温度、压力和添加适当极性调节剂来选择提取某种目标分析物。 s f e 的流程由萃取与分离两过程组成，影响s f e 效率的因素“7 1 除了萃取剂的 选择外，主要还有：萃取条件，包括压力、温度、萃取剂流量及萃取时间等； 物料性质的影响，包括物料的粒度、样品中的水分及萃取剂的极性等；分离 条件，包括分离时的压力与温度的选择。 s f e 的一个特点是易与其它分析方法联用。n e r i n “”采用离线的s f e g c e c d 的方法测定含水量高的样品中的1 1 种农药，并讨论了水量的影响，指出可通过冷 冻干燥或使样品与无水硫酸钠混合的两种途径来解决该问题。l e h o t a y “”采用不 同固相捕集萃取物，而后用有机物淋洗，最后利用g c i t m s 分析测定了5 6 种不同 农药。实验表明所有捕集溶剂对中都存在少量干扰测定的基体组分，检测限依 赖于捕集溶剂对的选择，其中o d s ( o c t y l d e c y l s i l a n e ) 捕集和丙酮淋洗得出的 农药回收率最高。a n a s t a s s i a d e s “采用s f e 方法萃取水果和蔬菜中多菌灵、2 ，4 一 二氯苯氧乙酸等农药，无需提纯步骤，直接用h p l d a d 检测。 s f c 尤为突出的特点是可与大部分g c 、h p l c 的检测器相连，如可与e c d 、f p d 、 n p d 、u v 、m s 等或与f t i r 、n m r 联用。许亚非”评述了流通池s f c f t i r 联用技 术的灵敏度、分辨率及其影响因素，主要讨论了流通池体积、长度、内径、流动 相吸收及检测条件对联用效果的影响，得出池体积为主要因素的结论。 与经典的萃取技术( 如索氏提取法) 比较，s f e 有如下的优点：快速方便， 超临界流体在常压下可可自然挥发，省去浓缩步骤：样品用量小、分析速度快、 回收率高；s f e 可以与其它技术联用。缺点是：仅适用于低浓度样品的萃取， 浓度过高会干扰检测；不能用于含水量高的样品；技术要求严格；液态二氧化 碳价格昂贵。 1 2 1 6 微波辅助萃取 微波辅助萃取( m a e ) 是种新的少溶剂样品前处理方法。m a e 中溶解选择 9 第一章概述 会直接影响到萃取结果，因此溶解的选择非常重要。由于非极性溶剂介电常数 小，对微波透明或部分透明无法进行萃取分离，因此在微波萃取时，要求溶剂 必须具有一定的极性，对待测组分有较强的溶解能力，对后续测定的干扰较少。 此外也应该考虑溶解沸点因素。常用的萃取剂有：甲醇、乙醇、丙酮、乙酸、 甲苯、二氯乙烷、乙腈等有机溶剂。m a e 的最佳参数除了萃取溶剂外，还包括了 萃取设备、萃取温度及时间。4 的选择。与传统的萃取方法相比，该方法具有萃 取产率高，速度快等优点“”“3 。 1 2 2 农药残留的仪器检测方法 1 2 2 1 纸色谱法 纸色谱法作为一种快速分离和鉴定物质的手段，所见报道较多。为了解决 在野外条件下和基层实验室快速、简便、定量地测定食品中有机氯农药问题， 梁洪军等利用邻联甲苯胺纸色谱法测定了粮食、蔬菜、植物油中有机氯农药， 方法检出限达5 m g 垤。样品斑点显色清晰、色阶明显。可以进行有机氯农残的 半定量测定，与国家标准方法薄层色谱法相比无显著差异。具有方法简单、操 作方便、快速，灵敏度高、干扰少等特点”。 1 2 2 2 薄层色谱法 薄层色谱是以固体吸附剂( 如硅胶、氧化铝等) 为担体，水为固定相溶剂， 流动相一般为有机溶剂所组合的分配型层析分离分析法。 薄层上的分配层析作用，就是以水为固定相，保持在吸附剂上，样品各组 分在固定相与流动相之间不断分配的过程。当分配达到平衡后，溶质a 在两相 中浓度的比值在一定温度下为一常数，这个常数称为分配系数( k ) 。固定相水中彳的浓度 一 流动相展开剂中4 的浓度 样品的组分不同或者溶剂种类改变，k 的数值就不同，在薄层上的移动距离 也不同。各组分在薄层上的移动距离通常用比移值r f 来表示。 。溶质斑点中心移动的距离， 一7 溶剂前缘移动的距离 一1 在一定的层析条件下，对于不同的组分，分配系数k 值不同，r f 也彼此互 1 0 第一章概述 异，因此根据r f 值可以进行分离、定性鉴定。此法常用硅胶和氧化铝作吸附剂， 常用的展开剂为环己烷：己烷( 1 ：1 ) 、四氯化碳：乙酸乙酯( 8 ：2 ) 等。用作薄层 层析的薄层板一般是长方形或方形的，有2 0 2 0 锄、1 5 1 5 c i n 、l o 5 锄、5 2 5 c m 等各种尺寸5 6 1 。t l c 已被应用于蔬菜及植物中某些有机磷农药残留的检 出与定量测定，其最小检出量、灵敏度和精密度都较理想，通常灵敏度可达到 几个时5 7 1 。这种方法简单、快速，可同时分析多个样品，多用于复杂混合物的 分离和筛选。 1 2 2 3 气相色谱( g c ) 法 g c 首先是一种分离技术，实际工作中要分析的样品往往是复杂基体中的多 组分混合物。对含有未知组分的样品，首先必须将其分离，然后才能对有关组 分进行进一步的分析。混合物中各组分的分离性质在一定