（生物化学与分子生物学专业论文）引物设计及其在egfr基因分型中的应用.pdf

引物设计及其在e g f r 基因分型中的应用 捅要 药物基因组学是门研究基因组信息和药物反应之间关系以及基因组信息和疾病 之间关系的科学。人类基因组中某些遗传多态性能够预示药物反应，进而通过检测这些 遗传多态性位点就能够预测某个人对某种药物是良性反应、不良反应还是没有反应。这 样，药物基因组学致力于使用合理的手段根据每个患者所具有的独特基因构造选择最优 的药物治疗方式，确保以最小的负作用取得最大的疗效，从而在临床上实现“个性化用 药”。例如，人表皮生长因子受体( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r ，e g f r ) 可作为非小细 胞肺癌肿瘤( n o n s m a l lc e l ll u n gc a r l c e r ，n s c l c ) 治疗的相关靶点【l 】。研究表明：大多 数对酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物( 如吉非替尼) 敏感的患者中在肺腺癌细胞中都存 在e g f r 酪氨酸激酶域的突变 2 刮，揭示检测e g f r 基因突变能够在临床上指导n s c l c 患者对于吉非替尼的个体化用药【7 】。而中国人的这种能提高药物疗效的突变频率比西方 人要更高0 1 ，因此对中国人群进行e g f r 基因分型具有更加重大的意义。当今的基因 分型检测方法很多，基本上是基于p c r 技术的。众所周知，引物在p c r 之中占居核心 的地位。即使对于某些非基于p c r 技术的基因分型方法( 如侵入法i n v a d e ra s s a y 】) 也离不开跟引物性质相似的探针。所以，引物设计是基因分型方法成功的关键，深入研 究引物设计非常有必要。 本文研究了当今广泛应用的各种基因分型方法，详细系统地研究了引物设计的方法 理论以及各种引物设计的生物信息学工具，指导大家如何便捷、完善地设计引物。本研 究成功地设计出了一套扩增人类e g f r 基因的多重p c r 引物，其产物可以便捷地为下 游e g f r 基因分型提供模板。本研究还详细地介绍了完善的m a s s a r r a y 的引物设计方法。 m a s s a r r a y 是当今世界领先的一种s n p 基因分型技术，在基因组精细定位、连锁关联性 研究、常规基因s n p 检测等领域有着广泛应用。借助于m a s s a r r a y 先进的引物设计方法， 成功地设计并优化了本实验室所开发的基于高温连接酶检测反应技术( 1 i g a s ed e t e c t i o n r e a c t i o n ，l d r ) 的一步法引物设计和基于缺口连接酶链反应( g a p l c r ) 的两步法引物 设计。这两种基因分型新方法的突出特点是不用借助于医院常规仪器之外的特殊昂贵设 备就能够直接应用于临床基因诊断。但是，这两种方法的引物都受s n p 位点附近序列 的限制，导致某些s n p 位点的引物中存在不可避免的严重的发夹等二级结构，进而使 得该s n p 位点无法检测。为了克服这种限制，试图在引物中引入错配从而破坏掉二级 结构。实验结果发现错配使用必须谨慎，因为只有在少数方法的体系中才容许存在错配。 论文最后详细讨论了引物设计中使用错配的条件以及其方法。 关键词：引物设计，多重p c r 引物，错配，基因分型，e g f r ，m a s s a r r a y ， 高温连接酶检测反应，缺口连接酶链反应，药物基因组学，个体化用药 t h ea p p l i c a t i o no fp r i m e rd e s i g ni ne g f rg e n o t y p i n g a b s t r a c t p h a r m a c o g e n o m i c si sas c i e n c et h a te x a m i n e st h ei n h e r i t e dv a r i a t i o n si ng e n e st h a td i c t a t e d r u gr e s p o n s ea n de x p l o r e st h ew a y st h e s ev a r i a t i o n sc a nb eu s e dt op r e d i c tw h e t h e rap a t i e n t w i l lh a v eag o o dr e s p o n s et oad r u g ，ab a dr e s p o n s et oad r u g ，o rn or e s p o n s ea ta 1 1 b yd o i n g s o ，p h a r m a c o g e n o m i c sa l m st od e v e l o pr a t i o n a ld r u gt h e r a p y , w i t hr e s p e c tt ot h ep a t i e n t s g e n o t y p e ，t om a x i m i z et h et h e r a p e u t i ce f f i c a c ya n dt om i n i m i z et h er i s ko fd r u gt o x i c i t yf o r a ni n d i v i d u a lp a t i e n t s u c ha p p r o a c h e sp r o m i s et h ea d v e n to f ”p e r s o n a l i z e dm e d i c i n e ”；i n w h i c hd r u g sa n dd r u gc o m b i n a t i o n sa r eo p t i m i z e df o re a c hi n d i v i d u a l s u n i q u eg e n e t i c m a k e u p f o re x a m p l e ，h u m a ne p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r ( e g f r ) c a nb eu s e da st h e t a r g e tf o rt r e a t m e n tr e l a t e dt on o n s m a l lc e l ll u n gc a n c e r al a r g en u m b e ro fr e s e a r c hs h o w s t h a tm u t a t i o n si nt h ee g f rt y r o s i n ek i n a s ed o m a i ni nl u n ga d e n o c a r c i n o m a sf r o mc h i n e s e p a t i e n t sw e r em o r ef r e q u e n tt h a nt l a a tf r o mw e s t e r np a t i e n t s s u c hm u t a t i o n sw e r ew e l l c o r r e l a t e dw i t ht u m o rr e s p o n s et og e f i t i n i b i t sm o r ei m p o r t a n tt od e t e c tt h em u t a t i o n so f e g f rg e n ei nc h i n e s e r e c n t l y , t h e r ea r em a n ym e t h o d so fg e n o t y i n g ，m o s to fw h i c ha r e b a s e do np c r t e c h n o l o g i e s a sk n o w nt oa l l ，p r i m e r sp l a yap i v o t a lr o l ei np c ra si m p o r t a n t a sp r o b e sd oi nn o n p c r - b a s e dg e n o t y p i n gt e c h n o l o g i e s t h e r e f o r e ，t h ed e s i g no fp r i m e r si s t h ek e yt os u c c e s so fa l lg e n o t y p i n gm e t h o d s i t se s s e n t i a lf o ru st os t u d yt h ep r i m e rd e s i g n t h o r o u g h l y f i r s t l y , t h i sp a p e rr e s e a r c h e sv a r i o u sm e t h o d so fg e n o t y p i n gw h i c ha r ew i d e l yu s e dt o d a y , s t u d i e st h eg u i dt od e s i g np r i m e r sa n dm a n yu s e f u lb i o i n f o r m a t i c st o o l sw h i c hc o u l dh e l pa s w o r km o r ee a s i l ya n dp e r f e c t l y i nm y r e s e a r c h ，ih a v ed e s i g n e das e to fs u c c e s s f u lm u l t i p l e x p r i m e r sf o re g f rw h o s ep r o d u c t sc a nb eu s e da st h et e m p l a t eo ft h ee g f rg e n o t y p i n g c o n v i e n t l y t h e n ，t h a n k st ot h ep e r f e c tp r i m e rd e s i g n i n gm e t h o do fm a s s a r r a y , w h i c hi st h e l e a d i n gt e c h n o l o g yf o rs n pg e n o t y p i n ga n dw i d e l yu s e di nt h ef i e l do ff i n em a p p i n g ，l i n k a g e s t u d i e sa n dr o u t i n eg e n e t i ct e s t i n go fs n p , ih a v ed e s i g n e da n do p t i m i z e dt h ep r i m e r s u c c e s s f u l l yb yt h eo n e s t e pm e t h o db a s e do nl i g a s ed e t e c t i o nr e a c t i o n ( l d r ) a n dt h e t w o s t e pm e t h o db a s e do ng a p l i g a s ec h a i nr e a c t i o n ( g a p l c r ) d e v e l o p e df r o mo u rl a b b o t h o ft h em e h o d sc a nb ee a s i l yu s e df o rc l i n i c a lg e n ed i a g n o s i si nt h eh o s p i t a l ，j u s tw i t ht h eh e l p o fc o n v e n t i o n a le q u i p m e n t si n s t e a do fa n yo t h e rs p e c i a la n de x p e n s i v ei n s t r u m e n t s h o w e v e r , t h ep r i m e r sw i t h i na l lt h e s eg e n o t y p i n gm e t h o d sa r el i m i t e db yt h es e q u e n c e sn e a rt h es n p s i ft h e r ea r ei n e v i t a b l ea n ds e v e r es e c o n d a r y - s t r u c t u r e s ，s u c ha sh a i r p i n ，i nt h e s es e q u e n c e s ， 1 1 l t h e s es n p sw i l lh a r d l yb ed e t e c t e d t oo v e r c o m et h i sl i m i t a t i o n ，ia t t e m p tt oi n t r o d u c e m i s m a t c h e st ot h ep r i m e r ss oa st od e s t r o yt h es e c o n d a r y - s t r u c t u r e i th a sb e e nf o u n dt h a tt h e m i s m a t c hm u s tb eu s e dc a u t i o s l y , s i n c et h e r ea l eo n l yaf e wm e t h o d si nw h o s es y s t e m s m i s m a t c hw a st o l e r a t e d i nt h ee n do ft h ep a p e r , i ti si n v e s t i g a t e di nd e t a i lt h a tw h e na n dh o wt o u s em i s m a t c hi nt h ed e s i g no f p r i m e r k e y w o r d s ：p r i m e rd e s i g n ，m u l t i p l e xp c rp r i m e r , m i s m a t c h ，g e n o t y p i n g ，e g f r ，m a s s a r r a y , l d r ，g a p - l c r ，p h a r m a c o g e n o m i c s ，p e r s o n a l i z e dm e d i c i n e 1 v 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。 学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时，本人保 证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文章一律注明作者单位为西北 大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：塑茎堕指导教师签名： 砷归年6 月侈曰z o 幻年易月侈日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本 论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大 学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：饶交波 护p 年6 月哆日 两北大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 药物基因组学概述 药物基因组学( p h a r m a c o g e n o m i c s ) 1 2 - 1 5 】是一门研究个人的基因遗传如何影响机体 对药物的反应的一门科学，是基因组学( f u n c t i o n a lg e n o m i c s ) 和生物信息学 ( b i o i n f o r m a t i c s ) 相结合的一门新兴科学。它最早兴起于2 0 世纪9 0 年代末，从基因水 平研究基因序列的多态性与药物效应多样性之间的关系，即：研究基因本身及其突变体 对不同个体药物作用效应差异的影响，以此为平台开发药物，指导合理用药，提高用药 的安全性和有效性，避免不良反应，减少药物治疗的费用和风险1 7 1 。将这个基因、药 物成份与服用后反应的一连串关联，运用在用药之上，就可以知道带有某特定基因之人， 不适合服用含有某特定成份的药物，进而降低药物副作用产生的风险；反之，也可以知 道带有某特定基因之人，特别适合服用含有某特定成份的药物，进而提升治愈疾病的机 率，这就是药物基因组学。简言之，药物基因组学致力于人类基因组信息和药物反应之 间关系以及人类基因组信息和疾病之间关系的研究，有望在临床上实现“个性化用 药，- 根据每个人独特的基因构造选择最优的药物剂量及其搭配方式。 药物基因组学是基于药物反应的遗传多态性提出来的，所以遗传多态性是药物基因 组学的基础。药物遗传多态性主要包括药物代谢酶、药物转运蛋白、药物作用靶点等基 因多态性。这些多态性的存在可能导致许多药物在治疗中药效和不良反应的个体差异 【18 1 。药物基因组学在药物开发以及药物个体化应用方面有着广泛前景，尤其基因分型确 定个人的多态性中有重要的应用价值。近年来，单核苷酸多态。| 生( s i n g l en u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m s ，s n p ) 的研究成为一个热点。s n p 与许多药物效应的个体差异有关，随 着d n a 序列测定研究工作的纵深发展，人们愈来愈相信基因组中这类多态性有助于解 释个体的表型差异、不同群体对疾病特别是复杂疾病的易感性以及对各种药物的耐受性 和对环境因子的反应，因此寻找s n p 已经成为人类基因组计划( t h eh u m a ng e n o m e p r o j e c t ，h g p ) 的重要内容【1 9 , 2 0 。人类基因组d n a 序列中大约9 0 的变异形式是s n p 【2 l 】。位于基因编码区的s n p 会引起蛋白质氮基酸的置换，导致其功能改变；而位于基 因调控区的s n p 则可影响基因的表达量，也能影响药物代谢和反应。通过检测对特定 药物具有敏感性或抵抗性的患者群的s n p 差异，可以寻找与药物代谢和反应有关的遗 传标记，从遗传背景预测个体和药物反应，指导合理用药，提高治疗效果。 2 0 0 2 年1 0 月底一项新的科学规划国际人类基因组单倍型图谱( h a p l o t y p e sm a p ， h a p m a p ) 计划【2 2 】正式开始实施，从药物基因组学水平开展s n p 分析的个体化药物治疗 第一章前言 研究有了更新的进展【2 3 1 。h a p m a p 计划是由美、加、中、日、英、尼日利亚等国共同发 起、参与及完成。中国由中科院北京基因组所的科学家牵头，承担了3 号、8 号和2 1 号染色体短臂单体型图的构建，约占总计划的1 0 。项目共取样2 7 0 个正常个体，其中 非洲3 0 个三联家系，欧洲3 0 个三联家系，亚洲4 5 个中国人、4 5 个日本人。一期计划 在2 0 0 5 年完成，共成功分型1 0 0 多万个s n p 位点，全基因组平均3 k b 就有一个s n p 位点；二期数据共成功分型3 0 0 多万个s n p 位点，密度约为一期数据的3 倍，构建起 一张精度更高信息更完整的多人种遗传多态图谱。随着h g p 和h a p m a p 计划完成，特 别是h a p m a p 计划取得的成果为研究者提供了充足的遗传多态位点( 高密度的遗传变异 图谱) ，再将上特定疾病( 性状) 风险联系的相关信息，才使得全基因组关联分析研究 ( g e n o m e - w i d ea s s o c i a t i o ns t u d y ，g w a s ) 成为可能。如今，h a p m a p 计划已经掀起了人类 研究复杂疾病易感基因的浪潮【2 4 】。g w a s 能精确揭示影响人民健康的重大疾病的易感 性，从而阐明这些重大疾病的遗传学发病机制，是目前科学界公认的最为有效的重大疾 病研究方法，被科学杂志评选为2 0 0 7 年世界十大科学进展之首。任何一种表型( 包 括遗传疾病和性状) 都可以肯定在基因组中存在相应的基因，而g w a s 可以在全基因组 水平上同时研究几万到几十万个甚或几百万个遗传变异，因此在大规模全基因组测序开 始前，g w a s 是目前研究复杂疾病( 性状) 易感基因的一种强力高效的研究方法，将为复 杂疾病( 性状) 研究指引方向，使人类更好地认识自身疾病；最终将会使遗传信息与临床 表型成功对接，进而为药物开发、疾病预防、诊断和治疗提供新的契机，为将来实现优 化的个体化诊断、治疗奠定坚实的基础，从而推动人类社会整体健康水平的提高。 1 2e g f r 基因检测及个体化用药 非小细胞肺癌( n o n - s m a l lc e l ll u n gc a n c e r s ，n s c l c ) 是当今世界上最常见的恶性 肿瘤之一。近年来随着分子技术的提高，产生了针对分子靶点的抗肿瘤药物。这些药物 针对性强，能特异的杀伤肿瘤细胞，效果显著。其中以表皮生长因子受体( e p i d e r m a l g r o w t hf a c t o r r e c e p t o r ，e g f r ) 为靶点的分子靶向治疗酪氨酸激酶抑制剂在非小细胞肺癌 治疗中日渐突出oe g f r 是表皮生长因子受体家族中的4 个成员之一。e g f r 在非活性 状态下是单体，当受体与配体结合后可形成同源或异源二聚体，受体胞内区发生自我磷 酸化并启始一系列胞内信号级联，促进细胞从g 1 期过渡到s 期，细胞复制扩增。e g f r 对细胞衍生起重要作用，相关研究证明，e g f r 在癌症发展过程中如血管生成【2 5 j 及肿瘤 细胞转移、粘附和凋亡抑制【2 6 】等过程中起重要作用。 大量研究表明e g f r 可作为癌症治疗的相关靶点【l 】。靶向e g f r 药物主要有两类： 2 两北大学硕士学位论文 一类是作用于受体胞内区的小分子酪氨酸激酶抑$ 1 齐t j ( ( t y r o s i n ek i n a s ei n h i b i t o r ，t r d ) ， 主要包括吉非替尼、埃罗替尼、e k b 5 6 9 、p k i 1 6 6 、g w - 2 0 1 6 及c i 1 0 3 3 ；另一类是作 用于受体胞外区的单克隆抗体( m a b ) ，包括西妥昔单抗( c e t u x i m a b ) 、a b x e g f 及e m d 7 2 0 0 0 等。临床研列2 7 发现，e g f r 靶向药物单药治疗有效率约为2 0 ，但与单纯化疗相 比，将t k _ i 类药物与细胞毒类药物联合应用并不能显著改善有效率和生存期；而m a b 类药物西妥昔单抗与伊立替康的联合疗效明显优于单药治疗，有效率分别为2 2 9 和 1 0 8 ( p = o 0 0 7 ) ，疾病进展时间( t t p ) 分别为4 1 个月和1 5 个月( p 9 0 位于外显子1 9 2 1 。绝大多数( 8 5 9 ) e g f r 基因突 变发生在外显子1 9 和2 1 ，其中超过一半( 5 5 8 ) 基因突变发生在外显子1 9 ，4 4 2 为外 显子2 1 基因突变。外显子1 9 碱基缺失，主要是第7 4 6 7 5 2 位密码子的碱基缺失突变， 外显子2 l 的点突变主要是第8 5 1 位密码子出现t g 转换。因此只要将1 8 - 2 1 e x o n 全部 扩增出来，就可以为下游检测e g f r 基因上任何一个与治疗非小细胞肺癌相关的突变提 供模板。 综上可得，非小细胞肺癌病人如果含有e g f r 基因酪氨酸激酶域的某些突变将导致 4 西北人学硕上学位论文 对吉非替尼等药物的更加敏感，而没有含有这些突变的病人即使服用吉非替尼也无效。 如果病人不携带有e g f r 突变而服用此类药物，不仅耽误病情而且造成巨额药费的浪 费。在用药前筛查检测病人是否携带有e g f r 基因突变显得尤为重要，是临床非小细胞 肺癌诊断治疗的一个重要辅助工具。所以，如何快速准确地检测这些与药物反应性有关 的e g f r 基因突变成为人们垦待解决的问题。 1 3 基因分型技术综述 s n p 基因分型分子诊断技术在药物基因组学研究中发挥着重要的作用。基因诊断已 经被整合到选择性治疗和检测结果中。应该开发出经济有效的基因分型方法，以方便于 医生根据它来指导临床的个体化用药。准确检测等位基因在不同易感人群中的分布频率 在临床群体遗传学中是最基本的，基因分型错误将严重影响生物学研究结论的可靠性。 因此，选择合适的s n p 基因分型方法是极其重要的。 自1 9 8 5 年p c r 技术问世以来，p c r 被不断广泛应用于基因分型中【3 1 1 。由于p c r 具有强大的d n a 体外扩增能力，与核酸分子杂交技术相结合，使基因分型的敏感性和 特异性都大大增强。基于p c r 技术的基因分型检测技术得到了迅速的发展，并不断衍 生出许多新的检测手段和技术 3 2 】。 比如当今广泛应用的s n p 基因分型的方法有：p c r r f l p 、a l l e l e s e p e c i f i cp c r 、 s e q u e n o m ( c a 、u s a ) 、t a q m a np r o b e ( a p p l i e db i o s y s t e m s ，c a ，u s a ) a n di n v a d e r ( t h i r dw a v et e c h n o l o g i e s ，w i ，u s a ) 、d n a 芯片。这些方法的原理如图1 【3 3 】。其中 大部分是基于p c r 技术的，也有非基于p c r 技术的。但是，这些s n p 检测方法的中央 核心部件主要依靠的就是d n a 杂交、退火的严谨性以及反应酶的忠实度。下面将分别 介绍各种方法。 基于酶的s n p 分型技术的反应精确度普遍比基于杂交的s n p 分型技术的反应精确 度高。p c r i 讧l p 就是一个传统的基于酶的s n p 分型技术【3 4 1 ，它依赖于巧妙地选择限 制性内切酶切出用于识别突变位点的短片段长度多态( 如图1 中的a ) 。但是这种方法 还存在一个主要缺点是它需要使用电泳分离酶消化之后的产物，这将严重限制反应的通 量和操作的自动化。 另外一个使用得比较少的是a l l e l e s e p e c i f i cp c r ，它将选择性p c r 引物杂交和亚序 列p c r 反应相结刽3 5 , 3 6 。反应条件必须优化好以确保杂交和亚序列扩增只在p c r 引物 和模板完全配对时才能进行延伸反应( 通常多态性位点都是引物的3 末端) ( 如图l 中 的b ) 。该方法使用非常方便，但是不适用于设计所有的s n p 位点，因为这种方法受s n p 5 第一章前言 邻近序列的限制并且非常难以在多重体系中实现反应。 由s e q u e n o m 开发的m a s s a r r a y ( m s a r r a y ) 法【3 刀反应包括：提取基因组d n a 、多 重p c r 扩增反应、单碱基延伸反应、最后使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 ( m a l d i t o fm s ) 通过单碱基延伸反应产物的分子量差异测定s n p 类型( 如图1 中的 c ) 。该技术有通量高、灵敏等优点。 t a q m a n 探针是一种寡核苷酸探针，在探针的3 末端连接有荧光报告基团，而5 末 端连接有荧光淬灭基团。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收：而 当p c r 扩增时，t a q 酶的5 外切酶活性能将结合到靶d n a 链上的探针的淬灭基团切除 掉，使探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号 ( 如图l 中的d ) 。通过使用不同的荧光报告基团，在同一个p c r 中可以同时检测不同 的酶切消化等位基因特异性探针。这种5 外切酶实验已经成功用来区分只有一个碱基差 异的等位基因 3 8 , 3 9 。 侵入法【l l j ( i n v a d e ra s s a y ) 并不需要p c r 扩增步骤。t h i r dw a v et e c h n o l g i e s 出品的 裂解酶( c l e a v a s e ) 是一种翼状内切酶( f l a pe n d o n u c l e a s e ) ，它能够识别并剪切开有重 叠的两条寡核苷酸链与靶d n a 链杂交所形成的翼状结构复合物( 如图1 中的e ) 。经过 酶切反应之后，信号探针( s i g n a lp r o b e ) 的5 端片段被释放出来，从而被检查系统所识 别。设计合适的探针使得其或者能够完全配对、或者只在剪切位点含有一个碱基的错配， 就能够在人类基因组d n a 中区分出s n p s e 4 0 。但是，由于侵入法需要直接使用大量基因 组d n a ，而且使用一种比t a qd n a 聚合酶更为昂贵的裂解酶，它的经济实用型将是一 个非常实际的话题。 生物微阵列( 或称生物芯片) 技术是近年来出现的快速、高通量的检测工具，它利 用微点阵技术，将成千上万的生物组分( 细胞、蛋白质和d n a 等) 排列在固相基质上， 生物样品中被检测组分与基质上特定物质反应，然后引入相应的信号( 如荧光) 达到对 生物样品分析的目的。生物微阵列技术使一些传统的生物学分析手段能够在尽量小的空 间范围内，以尽量快的速度完成。目前，生物芯片技术飞速发展，包括基因芯片、蛋白 质芯片、组织芯片：，细胞芯片、芯片实验室等多种芯片技术已经被研究者用于大规模突 变检测和多态性筛选。目前，有多种基于d n a 芯片的方法及专利技术用于基因突变检 测( 如s n p s 检测) 及核酸测序分析。根据原理可以分为基于核酸杂交反应，单碱基延 伸反应【4 l 4 2 1 ，等位基因特异性引物延伸和连接反应【4 3 州，引物连接反应 4 5 1 ，限制性内 切酶反应，锁式探针反应【4 6 等等。基于这些原理各大知名生物技术公司开发了各种s n p 6 目北大学硕学位论立 检测平台。诸如贝克曼公司( o r c h i dc e l l m a r k b e c k m a nc o u l t c r ) 的s n p 通量分析系统4 7 】 ( s n p s u v , a ma s s a y ) ，伊路明纳公司( n l u m i n a ) 的g o l d e n g a t e 多重位点特异性延伸扩增分 型系统( g o l d e n g a t eg e n o t y p i n ga s s a y ) ，昂飞公司( a 蛳n j x ) 的人全基因组图谱分析系 统( g e n e c h i p h u m a n m a p p i n ga s s a y s ) ，伊路明纳公司( n l l 蛐i n a ) 的i n f i n i u m 基因分型 系统( i n f m i u mg e l l o t y p i n ga s s a y ) ，昂飞公司( a f f y m e t r i x ) 的药物代谢酶和转运体目标 基因分型系统( t a r g e t e dg e l o t y p i n gs y s t e mf o rd r u gm e t a b o l i z i n ge n z y m e sa n dt r a n s p o r t s ( d m e t s ) a n a l y s i s ) 等等。另外，在相关的专利技术如u s 5 4 2 7 9 3 0 4 9 ，u s 6 4 7 9 2 4 2 5 “， w 0 9 3 0 0 4 4 7 5 1 1 u s 5 8 7 1 9 2 1 5 2 1 ，u s 6 8 5 8 4 1 2 矧，u s 5 8 6 6 3 3 7 5 4 等也提出了很多s n p s 检测的新方法。 w r t w t帆n p 8 n s1 1 1 1 t 1 1 - r 拳型2 1 。 l u u u u f m 田： 二 t r r r t t l l n 一3 i u u l u u ，一 吣叫卜夕 图1当夸流行的s n p 基因分型方法原理示意图( 引用 f k jd i t e r 4 n t “p e m n m t h o d t 匿 第一章前言 当然，还有很多其他基因分型技术，由于篇幅有限，这里不详细介绍。大家可以参 考文思远【5 5 1 综合整理出来的表l 。 表1 基因分型方法简表( 引用5 s 1 ) t a b 1s u m m a r yo fg e n o t y p i n gm e t h o d s 8 西北大学硕士学位论文 这些方法虽然都有自身的一些优势，但是也都存在各自的缺陷。比如基于直接核酸 杂交反应的芯片技术，其非特异性杂交导致分辨率不高，易产生假阳性结果；基于单碱 基延伸反应和等位基因特异性引物延伸反应的芯片技术均需要多色荧光系统及需要对 靶标进行扩增、制备和纯化等步骤，从而使大规模的突变检测工作费时耗力等。开发出 一种经济实用型的新型的s n p s 检测方法有非常重要的意义。 m i t a n i 3 3 1 开发出了一中新型的快速的经济实用型s n p 检测新技术s m a i t a m p 2 ( 如图2 ) 。s m a r t a m p 2 全称叫s m a r ta m p l i c a t i o np r o c e s s ，它可以在等温条件下不需要 d n a 纯化和p c r 扩增，只用3 0 分钟就能够检测基因多态或者突变【8 5 1 。建立s m a r t a m p 2 方法体系的关键策略是抑制试验扩增之中的错配。这是通过引入两个互补的路径达到 的。在第一路径中，一个错配结合蛋白t h e r m u sa q u a t i c u s ( t a q ) m u t s 被加入到反应体系 中。t a qm u t s 能够通过特异性地结合到错配扩增的产物上，抑制背景d n a 在进入扩增 循环中错误引发( m i s p r i m e ) ( 如图2 中的a ) 。在第二路径中，折回引物( t u r n b a c kp r i m e r s ， t p ) 和折叠引物( f o l d i n gp r i m e r s ，f p ) 两种非对称引物被引用进来，以最大限度减少两者 9 第一章前言 选一的错误扩增途径( 如图2 中的b 和图3 t 删) 、气= j 3 ，、一5 5 下忑：i 、。 。” l g ，- l - - - - 一5 5 、一3 s 。耳= _ 一，。哦：、 l e t p 。p 1 b 址 c f 5 = = = ：= = = = - - ；- i j i 三i i i 3 3 - ；三i i i = = = 乞! ! ! ，- - - = ，s 8 pc c 、 f c d c ， 0 9 2 f p 图2s m a r t a m p 2 琢理示意图 f i g 2p r i n c i p l e o f s m a r t a m p 2 i 注：a c ：c o m p l e m e n t a r yr e g i o n a ( 互补区域a ) ：b p ：b o o s lp r i m e r ( 故人引物) ；c c ：c o “1 p i c l r i a r y 7 睁o n c ( 互扑区域c ) d c ：c o m p l e m e n t a r y n = g i o n d ( 互补区域d ) f c ：c o m p l e m e n t a r yr e g i o nf ( 互补 r 域f ) ，f p ：f o l d i n g p 丌m e n ( 折叠引物) ：o p ：o u t e r p r i r a e r ( 外侧引物) ：口：t u r n - b a c k p r i m e r s ( 折 同引物) 夕、 伊铲i p 1 1 _ 】、p b 例3 s m a r t a m p 2 非对称引物t p 和f p 所所形成的两种扩增 f i g3 t h ea m p l i c a t i o nd a r t h h a y o f s m a r t a m p 2b y f o l d i n g p r i m e r sa n d 血n 1 一b a c kp r i m e r s j 0 西北火学硕七学位论文 1 4 引物设计概述 上面讲所讲到的各种s n p s 检测的方法，有些方法直接需要使用p c r ，有些方法需 要间接用到p c r ，有些使用的方法原理也是和p c r 相同( 如单间接延伸反应) ，总之基 本上都是基于p c r 技术的s n p 基因分型技术。众所周知，引物在p c r 之中占居核心的 地位。即使对于非基于p c r 的基因分型技术的侵入法( i n v a d e r 】) 也离不开跟引物性 质相似的探针。所以，引物设计是基因分型方法成功的关键，深入研究引物设计非常有 必要。 1 4 1 一般引物设计指导原则 有大量文献【8 7 母0 1 报道引物设计中的指导原则。总结归纳如下： ( 1 )引物长度 引物的长度一般为1 5 3 0 个核苷酸，在做长片段p c r 或做某些特殊的p c r 时应使 用较长的引物，但最多不超过5 0 个核苷酸。通常认为最优的引物长度是1 8 2 2 个核苷 酸。引物的长度一方面要足够长以提供足够的特异性，另一方面也要足够短以便于引物 和模板的退火结合。每增加一个核苷酸引物特异性提高4 倍，这样，大多数应用中最佳 的引物长度为1 8 个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应速率有关。由于 熵的原因，引物越长，它退火结合到靶d n a 上形成供d n a 聚合酶结合的稳定双链模 板的速率越小。 ( 2 ) 引物的熔解温度t m 引物的熔解温度( m e l t i n gt e m p e r a t u r e ，t m ) 是指加热d n a 使得d n a 的双螺旋结 构失去一半形成单链时的温度。t m 值反映出了d n a 双螺旋结构的稳定性。引物的t m 值一般要求在5 2 5 8o c 之间，如果高于6 5 0 c 就非常容易形成稳定的二级结构。 t m 值可以通过公式计算出来。 对于低于2 0 个碱基的引物，t m 值可以用以下公式( 1 1 ) 来粗略估算： t m = 4 ( g + c ) + 2 ( a + t ) 公式( 1 1 ) 对于较长引物，t m 值则需要根据最近邻热动力学理论( n e a r e s tn e i g h b o r t h e r m o d y n a m i ct h e o r y ，n nm o d a l ) 的计算方式 9 1 9 2 】得到。n n m o d e l 假设碱基对的稳定 性取决于碱基对的类型以及其邻近碱基对的取向。这也是目前最准确的方法，公式如下： t m = a h o ( a s o j 。ri nc t ) 公式( 1 2 ) 第一章前言 公式( 1 2 ) 中的r 为普适气体常数( 1 9 8 7c a l y k z m 0 1 ) 。c r 为寡核苷酸链的总浓度。 公式( 1 2 ) 中的a h ( k c a l m o l e ) ：h 为焓( e n t h a l p y ) 。焓是指物质所拥有的热能 总量。a h 是指焓的改变量，表示分子或链段离开晶格所需吸收的热量，与分子间作用力强 弱有关，分子间作用力越大，熔融焓越大。上式中的a h o 的计算是为：在标准条件下， 将所有的相邻近的二碱基对的a h 值累加起来。这个讲起来比较费解，但是通过下面的 一个例子大家就能非常清楚地理解n nm o d e l 的计算方式。 比如在计算c g t t g a 的a h o 值方法如下： 上上山 5 ，c g t t g - a3 囊 3 ，g - c a a c t5 t个 a h o = a h ( c g g c ) + a h ( g t c a ) + a h ( t t h m + a h ( t g a c ) + ( g a c t ) ( 注：比如c g g c 等就是一个二碱基对，每种二碱基对的焓理论值都是可以查