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-学院本科生毕业论文 题 目 连翘及桑葚中芦丁含量的测定 专 业 应 用 化 学 院 部 化学与化学工程学院 学 号 、 、 、 姓 名 、 、 、 指 导 教 师 、 、 教授 答 辩 时 间 、 、 、 论文工作时间：2011 年 12 月 至 2012 年 5 月 论文题目来源：论文题目来源：国家自然科学基金项目国家自然科学基金项目编号：编号： 四川省自然科学研究项目四川省自然科学研究项目编号：编号： 校级自然科学研究项目校级自然科学研究项目编号：编号： 师范学院 2012 届本科毕业论文 连翘及桑葚中芦丁含量的测定连翘及桑葚中芦丁含量的测定学 生 -指导教师 -摘 要：利用反相高效液相色谱法测定连翘及桑葚中芦丁成分的含量。采用 SHIMDZU VP-ODS(4.6 mm150 mm、5.0 m)色谱柱，甲醇-0.08%：硫酸溶液(6:4)为流动相，流量为 1.0 mLmol-1，检测波长为 360nm。结果：芦丁标准溶液在 0.464-2.32 g 范围内的线性回归方程为 Y=21200X +13697(r=0.9995)，平均回收率为 99.4%，RSD= 0.8 % ( n=5)。结论：此方法可用于检测连翘及桑葚中芦丁的含量，为连翘及桑葚的质量评价提供依据。实验表明该方法简便、快捷、适用性好。关键词：HPLC；连翘；桑葚；芦丁；含量测定 师范学院 2012 届本科毕业论文 Determination of rutin in forsythia suspense (thunb.) and mulberryUndergraduate -Supervisor - Abstract：The paper is to introduce the experiment of determining the contents of rutin in Forsythia suspense (Thunb.) and mulberry with RP-HPLC. Taking SHIMDZU VP-ODS conlumn (4.6 mm150 mm, 5.0 m), a mixture of methanol -0.08% phosphoric acid in the ratio of 6 to 4 by volume with a flow-rate of 1.0 mLmol-1 and the detection wavelength was set up at 360 nm. Results: the linearity of rutin was obtained over the ranges 0.464-2.32 g. The linear equation was Y =21200X +13697 (r=0.9995), the average recoveryrate was 99.4%, RSD = 0.8% (n=5). The method can be used for the determination of rutin in Forsythia suspense and mulberry, which provides a scientific basis for quality assessment to Forsythia suspense and mulberry. This method is reliable accurate and suitable for the determination of rutin. Keywords：HPLC; Forsythia suspense; Mulberry; Rutin; Determination 师范学院 2012 届本科毕业论文 目目 录录 前言 .11 连翘、桑葚、芦丁及高效液相色谱法的介绍 .11.1 连翘的简介.11.2 桑葚的简介.11.3 芦丁的简介.11.4 高效液相色谱的介绍.22 实验部分 .32.1 仪器与试剂.32.2 仪器工作条件.42.3 样品制备.42.3.1 标准储备液的制备 .42.3.2 供品溶液的制备 .42.4 高效液相色谱法测量.52.4.1 流动相的准备 .52.4.2 岛津 LC20AT 高效液相色谱系统的操作.53 结果与讨论 .63.1 检测波长的选择.63.2 流动相的优化.63.3 提取时间及次数的选择.73.4 工作曲线.83.4.1 对照品的测定 .83.4.2 线性回归方程 .83.5 精密度试验.93.6 稳定性试验.93.7 加标回收率试验.10 师范学院 2012 届本科毕业论文 3.8 样品分析.11结论 .13参考文献 .14致 谢 .16 师范学院 2012 届本科毕业论文 师范学院 2012 届本科毕业论文 1前言1 连翘、桑葚、芦丁及高效液相色谱法的介绍1.1 连翘的简介连翘，又称黄花条、连壳、甘草、青翘等，是中国临床常用 传统中药之一，为木犀科连翘属植物连翘的果实，主要分布于我国的山西、河南、陕西、山东、四川及云南等地。价值用途：(1) 药用植物。茎、叶、果实、根均可入药。中药味苦，性微寒。有清热解毒，散结消肿之效；用于治疗温热、丹毒、斑疹、痈疡肿毒，瘰疬，小便淋闭、清心火。果实含连翘酚、甾醇化合物、皂甙(无溶血性)及黄酮醇甙类、马苔树脂醇甙等。现代药理研究认为，连翘抗菌、抗炎、解热、镇吐、利尿强心、抗肝损、镇痛、抑制cAMP磷酸二酯酶、抗内毒素等作用1。连翘中化学成分主要为木质素类、黄酮类、苯乙醇苷类、C6-C2天然醇类等2,3。(2) 膳食营养。连翘种子可提取食用油脂。(3) 美颜护肤。连翘的花及未熟的果实，采集后用水煮20分钟，每天在早上或睡前用此水洗脸，有良好的杀菌、杀螨、养颜护肤作用。长期坚持使用，可消除面部的黄褐班、蝴蝶斑，减少痤疮和皱纹。1.2 桑葚的简介桑葚，又称桑果、桑枣，为桑科落叶乔木桑树的成熟果实。桑葚果实中含有丰富的葡萄糖、蔗糖、果糖、胡萝卜素、维生素、苹果酸、琥珀酸、酒石酸及钙、磷、铁铜、锌等矿物质元素。价值用途：(1) 药理作用。中医认为桑葚味甘酸、性微寒，入心、肝、肾经，为滋补强壮养心益智佳果，具有补血滋阴生津、止渴、润肠燥等功效4-7。(2) 营养功效。可增强免疫器官的重量；能增强非特异免疫功能；对体液免疫有增加作用；对T细胞介导的免疫功能有显著的促进作用；对细胞突变具有预防作用；具有抗乙型肝炎病毒的作用和抗AIDS的作用。 师范学院 2012 届本科毕业论文 21.3 芦丁的简介芦丁(Rutin)又名芸香苷、紫槲皮苷，为浅黄色针状晶体(水)，熔点176，结构为3,4-四羟基-3-芸香糖黄酮，是一种来源很广的黄酮类化合物。主要存在于豆科植物槐的花蕾、果实，芸香科植物芸香全草，金丝桃科植物红旱莲全草及蓼科植物荞麦的籽苗中。作用与用途：现代药理实验证明芦丁有抗氧化8 、抑制HepG2细胞的生长9 、降低单纯性肥胖大鼠的血糖 10 、抗血小板活化因子与受体结合11等作用。临床用于防治脑溢血、高血压、视网膜出血和急性出血性肾。其具有抗炎作用、维生素P样作用、抗病毒作用、抑制醛糖还原酶作用等。由于芦丁属于维生素类药，有降低毛细血管通透性和脆性的作用，保持及恢复毛细血管的正常弹性。芦丁的化学结构式(如图1-1)。图 1-1 芦丁的结构式图1.4 高效液相色谱的介绍高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)又称“高压液相色谱” 、 “高速液相色谱” 、 “高分离度液相色谱” 、 “近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将 师范学院 2012 届本科毕业论文 3具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相色谱法有“三高一广一快”的特点： (1) 高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。 (2) 高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。 (3) 高灵敏度：紫外检测器可达 0.01 ng，进样量在 L 数量级。 (4) 应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。 (5) 分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在 1530min，有些样品甚至在 5min 内即可完成，一般小于 1 小时。此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。高效液相色谱的缺点是有“柱外效应” 。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。目前国内对连翘及桑葚中芦丁含量测定主要有比色法、紫外分光光度法和HPLC 及 GC 法等，但比色法的干扰因素较多，而紫外分光光度法准确度不高，因此本实验采用高效液相色谱法测定连翘及桑葚中芦丁的含量。2 实验部分2.1 仪器与试剂岛津LC20AT高效液相色谱系统(LC6AD输液泵，SPD-M20A二极管阵列检测器，CLASSvp5.0色谱工站，CTO6A柱温箱)；101-2A型数显恒温干燥箱；AY120电子天平(SHIMADZU)；SZ-93型自动双重纯水蒸馏器； 师范学院 2012 届本科毕业论文 4AUW220D 十万分之一天平(SHIMADZU，Japan)25 mL 比色管25 mL 容量瓶芦丁标准品(中国药品生物制品检定所提供)连翘(安徽省亳州市科辉药业有限责任公司)桑葚(四川祥龙绿色有限公司)甲醇(色谱醇.，成都科龙化工试剂厂)磷酸(A.R.，成都科龙化工试剂厂)除甲醇外，其余试剂均为分析醇实验用水为二次重蒸水2.2 仪器工作条件SHIMDZU VP-ODS 反相色谱柱(150 mm 4.6 mm，5.0 m)；流动相为V(甲醇-0.08%)：V(硫酸溶液)为(6:4)混合溶液，流量为 1.0 mLmol-1，紫外检测波长为 360 nm，进样量为 5 mL，柱温为 35 。以芦丁峰计理论塔板数大于3500。2.3 样品制备2.3.1 标准储备液的制备精密称量经五氧化二磷干燥的芦丁对照品 58.0 mg，置 25 mL 容量瓶，用甲醇定容至刻度，摇匀，超声，再精密吸取 1 mL 稀释十倍，配制成浓度为232g mL- 1 的芦丁标准储备液。2.3.2 供品溶液的制备将待测样品连翘于 75干燥至恒重，粉碎过 0.33 mm 筛，精密称定约 1.0 g，置于 25 mL 锥形瓶中，加入甲醇 15 mL，避光超声处理 40 min，上清液转入25 mL 容量瓶。分别用 5 mL 甲醇重复提取 2 次，合并提取液，甲醇定容至 25 mL，摇匀，微孔针头过滤器过滤，待测。将待测样品桑葚于 75干燥至恒重，粉碎过 0.33 mm 筛，精密称定约 2.0 g，置于 25 mL 锥形瓶中，加入甲醇 15 mL，避光超声处理 40 min，上清液转入 师范学院 2012 届本科毕业论文 525 mL 容量瓶。分别用 5 mL 甲醇重复提取 2 次，合并提取液，甲醇定容至 25 mL，摇匀，微孔针头过滤器过滤，待测。2.4 高效液相色谱法测量2.4.1 流动相的准备(1) 根据实验选择合适的流动相，配制流动相溶液，并根据需要选择不同的滤膜(0.45 m)进行过滤。(2) 将抽滤后的流动相进行超声脱气处理 20 min。2.4.2 岛津 LC20AT 高效液相色谱系统的操作(1) 打开 HPLC 工作站，连接流动相管道和检测系统。(2) 进入 HPLC 控制界面的主菜单，点击 manual，进入手动菜单。(3) 若系统有一段时间未用，或换了新流动相，需先冲洗泵和进样阀。冲洗泵直 接在泵的出水口用针头抽取。冲洗进样阀，需在 manual 菜单下，点击purge 再点击 start，冲洗速度不要超过 10 mlmin-1。(4) 调节流量，初次使用新流动相，可先试一下压力，流速越大压力越大，通常不要超过 2000。点击 injure，选择合适的流速，点击 on，开始走基线，当基线平稳，开始进样准备。(5) 设计测试方法： (a)点击 file，选择 select users and methods，即可选取各种现有的测试方法。(b)若需建立新的方法，点击 new method，设置新的测试方法，保存文件。(c)根据需要选择配件，包括进样阀，泵，检测器等。确定后，点击protocol。(d)一个完整的测试方法包括：进样前的稳流，一般 2-5 min；基线归零；进样阀的 loading-inject 转换；测试时间，随样品的不同而不同。 师范学院 2012 届本科毕业论文 6(e)测试完毕，导出数据，存盘。(6) 关机操作(a)全部测定完毕后，按规定用适当溶剂(一般用甲醇)冲洗泵，进样器、柱及检测器。(b)关闭电源，使用登记。3 结果与讨论3.1 检测波长的选择芦丁对照品与供试品在本实验溶剂体系下，用二极管阵列检测技术12,13对组分峰进行全波段紫外光谱扫描。(图3-1)。Spectrum at time 4.07 min.nm200400600800mAU0100200mAU01002004.07 min图 3-1 芦丁对照品紫外光谱图芦丁与样品相同保留值处组分峰紫外光谱具有良好一致性。芦丁最大吸收波长分别为 205 nm、258 nm、360 nm。在 205 nm 处供试品中的其它不明物组分有一定吸收，将对测定产生干扰，导致测定误差，在 258 nm、360 nm 处虽无其它组分干扰吸收，但在 360 nm 处的吸收更强。而 360 nm 波长处待测组分与其他杂质峰能够基线分离，检测灵敏度高，故本实验确定最佳检测波长为 360 师范学院 2012 届本科毕业论文 7nm。3.2 流动相的优化由于黄酮类化合物常带有酚羟基，在水中会部分解离，而未解离的羟基与固定相作用较强，从而导致拖尾，所以黄酮类的反相 HPLC 中需要加入酸调节pH 以抑制解离，克服拖尾现象，这与离子抑制色谱技术的原理是一致的14，基于文献15采用的流动相体系，本试验通过对流动相进行多次对比、优化实验，同时考虑降低实验成本，结果表明 V(甲醇-0.08% )V(磷酸溶液)为(6:4)混合溶液相对于其他流动相有良好的分离效果，目标与其他组分均之间到达基线分离(R1.5)，且保留值适宜，满足分析方法要求。3.3 提取时间及次数的选择根据对样品及滤渣中目标成分的检测，得出提取次数与目标成分提取百分率关系如图 3-2 所示。0.880.90.920.940.960.980123456提取次数提取百分率图 3-2 样品提取次数与目标提取百分率关系在尽量完全的提取目标成分的前提下，综合考虑降低实验成本及缩短实验时间、提高效率，供品溶液由样品通过3次提取配制而成。经查阅文献16-18，在提取中应用超声波振荡技术是一种快速、高效而且不破坏组分的好方法19-21 。具体操作为：将样品分别用纯甲醇超声提取20,30,40,50,60 min，各重复提取3 师范学院 2012 届本科毕业论文 8次，超声提取按本实验条件测定芦丁含量。结果表明：纯甲醇超声处理40 min以后随超声提取时间的增加，芦丁含量无明显变化，因此选择超声提取40 min，重复提取3次为试验条件。HPLC测定样品提取目标组分后的残渣，无待测组分的特征峰出现，说明已完全提取样品中的芦丁。3.4 工作曲线3.4.1 对照品的测定精密吸取 232.0 gmL- 1芦丁标准溶液 1.0 mL 作为待测对照品。取对照品溶液检测。得出对照品色谱图(如图 3-3)。 图 3-3 芦丁对照品色谱图3.4.2 线性回归方程分别精密吸取 2.0 L、4.0 L、6.0 L、8.0 L、10.0 L 的芦丁标准溶液，测定峰面积，以峰面积均值 Y(v.s)对照品进样体积 X(L)进行线性回归，得到芦丁线性回归方程为：Y=21200X +13697，其 r=0.9995，芦丁在 0.464-2.32 g范围内与峰面积成良好线性关系。线性回归图如(图 3-4)。 师范学院 2012 届本科毕业论文 9050000100000150000200000250000024681012uL峰面积 图 3-4 芦丁线性回归曲线3.5 精密度试验在 2.2 节色谱条件下，精密吸取芦丁标准溶液 5 L，连续进样 5 次，测得标准样品峰面积为：118576，119387，119670，120183，117573，RSD=0.8%(n=5)。3.6 稳定性试验(1) 选取样品连翘溶液作稳定性实验。分别在 0，2，4，6，8，12 h 进样10 L，测定峰面积。(如表 3-1)。表 3-1 连翘中芦丁稳定性试验结果连翘中芦丁 峰面积0h786712h785894h767646h786268h7872012h78683计算其峰面积的 RSD 值为 0.1%，说明样品在 12 h 内很稳定。 师范学院 2012 届本科毕业论文 10(2) 选取样品桑葚溶液作稳定性实验。分别在 0，2，4，6，8，12 h 进样10 L，测定峰面积。(如表 3-2)。表 3-2 桑葚中芦丁稳定性试验结果桑葚中芦丁 峰面积0h705322h706974h707186h704878h7065912h70324计算其峰面积 RSD 值为 0.2%，说明样品在 12 h 内很稳定。3.7 加标回收率试验(1) 以连翘作为加标回收率试验，准确称取已知芦丁含量为 0.31%连翘样品6 份，各约 0.5 g，1 份作为测定本底值样品用，另 5 份分别添加 2.0 mL 浓度为232 gmL- 1的芦丁标准品溶液，用纯甲醇按 2.3.2 节制备供试品溶液。测定加标样品中各组分含量。(见表 3-3) 师范学院 2012 届本科毕业论文 11表 3-3 连翘中芦丁回收率试验结果本底值(g)加标量(g)测定值(g)回收率(%)X(%)RSD(%)155.09157311.199.4154.94157309.998.7154.66157310.299.1155.96157313,3100.2155.59157312.199.799.4 0.5(2) 以桑葚作为加标回收率试验，准确称取已知芦丁含量为 0.13%桑葚样品6 份，各约 0.5 g，1 份作为测定本底值样品用，另 5 份分别添加 2.0 mL 浓度为232 gmL- 1的芦丁标准品溶液，用纯甲醇按 2.3.2 节制备供试品溶液。测定加标样品中各组分含量。(见表 3-4)表 3-4 桑葚中芦丁回收率试验结果本底值(g)加标量(g)测定值(g)回收率(%)X(%)RSD(%)64.9566.0131.0100.065.1866.0130.999.665.1266.0130.398.864.8566.0130.299.064.6666.0130.199.199.30.4通过两个表中加标回收率的数据显示，可认为该方法可以用于测得连翘及桑葚中芦丁的含量。3.8 样品分析 精密吸取 2.3.2 制备的连翘及桑葚样品溶液 5 L 注入高效液相色谱仪，其色谱图如图 3-5，图 3-6。 师范学院 2012 届本科毕业论文 12Minutes012345678910mAU050100150200250300mAU050100150200250300Detector A-360 nm2012.02.2820120302-桑 桑 -2001Retention TimeArea图 3-5 样品连翘Minutes024681012mAU010203040mAU010203040Detector A-360 nm2012.02.2820120302-桑 桑 -2001Retention TimeArea图 3-6 样品桑葚平行测定 5 次，按标准曲线法计算样品中芦丁的含量。实验测定结果如表3-5， 师范学院 2012 届本科毕业论文 13表 3-5 烘干含水样品中目标成分含量（mgg-1）名称 生产单位芦丁测定含量连翘安徽省亳州市科辉药业有限责任公司3.1桑葚四川祥龙绿色有限公司1.3结论高效液相色谱法是目前普遍应用的、较准确的测定连翘及桑葚中芦丁的方法，通过定性定量分析了连翘及桑葚中芦丁的含量分别为 0.31%、0.13%，连翘中芦丁含量略高于桑葚中芦丁的含量。该实验对芦丁的提取方案选择、条件优化等流程提供了一定的理论基础。为人们提取芦丁选择原料提供实验依据，为连翘及桑葚的质量评价以及研究连翘、桑葚的药用价值提供参考。 师范学院 2012 届本科毕业论文 14参考文献1 刘明对连翘药理作用的研究现状J.现代医药卫生，2007，23 (16)：2438-2439.2 李庆，冯文尚连翘的化学成分研究进展J.河南中医学院学报，2005，20 (2)：78-80.3 冯文尚，李开凯，郑新康连翘的化学成分研究J.中国药学杂志，2009，44 (7)：490-492.4 南亚桑葚保健果醋工艺研究J.食品科技，2008，9 (3)：82-84.5 刘玲，叶博桑葚枸杞营养酒发酵工艺研究J.食品工业，2008，9 (1)：51-53.6 汪建国，王琦桑椹保健食醋的开发与研制J.中国酿造，2005，4 (12)：58-59.7 金杰，李志西，张峰等桑葚醋提取物抗氧化性的研究J.中国酿造，2005，3 (10)：20-22.8 Jiang P, Burczynsk i F, CampbellC, et al. Rutin and flavonoid contents in three buckwheat species Fagopyrum esculentum, F.tataricum, and F. homotropicum and their protective effects against lipid peroxidation J. Food Research International, 2007, 40 (3):356- 364.9 沈钦海，马臻，陈国民等芦丁对 HepG2 细胞生长的影响J.第三军医大学学报，2006，28 (18)：1885- 1887.10 郑旭煦，邵承斌，江澜等芦丁对单纯性肥胖大鼠血糖和脂代谢紊乱的调节作用J.西药学杂志，2005，20 (2)：109 -111.11 金鸣，臧宝霞，吴伟等芦丁拮抗血小板活化因子与受体结合的作用J.中草药，2005，36 (3)：390-392.12 Razghi M,Rogalski A.Semiconductor ultraviolet detectorsJ.Appl Phys Lett.1996,79 (10): 7433.13 Stevens K S, Kinniburgh M. 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