目的基因的制备(一).ppt

基因工程的操作流程 基因工程的操作包含以下步骤 获得目的基因 构造重组dna分子 转化或转染 表达 蛋白质产物的分离纯化 第二讲目的基因的制备 需要克隆的dna片段 编码某种蛋白质 研究某基因结构和功能的关系 研究某基因与疾病的关系 一 从基因文库中获得目的基因 二 用pcr方法获得目的基因 三 基因的化学合成 一 从基因文库中获得目的基因 agenelibrary alsocalledgenomiclibrary isapopulationofhostbacteria eachofwhichcarriesadnamoleculethatwasinsertedintoacloningvector suchthatthecollectionofcloneddnamoleculesrepresentstheentiregenomeofthesourceorganism agenelibraryisalsocalledgenebank 1 基因文库 genelibrary 基因文库 又叫基因组文库 系指在一种载体分子中随机地克隆着某种生物 组织 器官或细胞类型的所有的dna片段而构成的克隆集合体 在理想的情况下 它应包含有该生物种全部的遗传信息 dna文库 dnalibrary 基因文库是在基因工程诞生的早期就已被使用 已经习惯且通俗易懂 但近年来一般称基因文库为dna文库 这是一种更加符合实际更加科学的名称 因为基因文库从本质上讲是由来自染色体基因组的全部dna片段组成的 基因组文库 genomiclibrary 系指生物体基因组dna经过核酸限制内切酶作部分切割之后 克隆在适当的载体分子上 然后将这重组的混合物转化给宿主菌株 例如大肠杆菌 便构成了包含该生物体整个基因组全部遗传信息的基因组文库 thednamoleculesofanorganismininterestareisolated thednamoleculesarethenpartiallydigestedbyanendonucleaserestrictionenzyme sometimes thednamoleculesaredigestedtodifferentlengthsoftimeinordertoensurethatallthegeneshavebeendigestedtomanageablesizes thedigesteddnamoleculesarerunonagaroseelectrophoresisforwhichasuitablerangeoflengthsofdnapiecesareisolatedandligatedtovectorplasmids statistically 99 ofthegeneswillbeincorporatedintotheplasmids theplasmidsthencanbetakenupbysuitablehosts 基因文库的构建 creatingalibrary thehostsarekeptinliquidmediaandcanbefrozenat 80 cforalongperiodoftime usuallythehostsarebacteriathatdonotcontainanyplasmidssoastobesensitivetoantibiotics theprocessofsubdividinggenomicdnaintoclonableelementandinsertingthemintohostiscalledcreatingalibrary aclonebankoragenebank acompletelibraryofhostcellwillcontainallofthegenomicdnaofthesourceorganism 制备全部基因组的dna片断 机械断裂法用超声波或高速搅拌dna溶液 断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端 因此插入载体之前还需要进行修饰加工 少用 限制性内切酶降解 鸟枪法 过去用ecor 现在用sau3a 断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端 可以直接与处理过的载体连接 构建基因组文库全过程 分离纯化基因组dna提取哺乳动物细胞染色体dna 酚抽提法 dna片段与载体的连接包装常用载体 粘性质粒 噬菌体 酵母人工染色体 基因组dna 粘性质粒 重组dna 转化细菌 基因组dna 噬菌体 重组dna 包装成噬菌体 感染细菌1个克隆含有基因组的某个片段 整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和 实际克隆数1975年l clarke等提出了一种计算完整的基因组文库最低重组体所需实际克隆数 n 的公式 n ln 1 p ln 1 f n 文库必需的克隆数p 文库中目的dna片段的出现概率f 插入片段大小 全基因组大小的比值 基因组文库的大小 理论克隆数文库克隆数 基因组dna总长 dna插入片段平均长 从人基因组dna 总长度为3 109bp 的文库中筛选到长约1 5kb目的基因的可能性为99 那么这个基因组文库要多大 理论克隆数 3 109 1 5 103 2 106in 1 0 99 实际克隆数 n 9 2 106in 1 1 5 103 3 109 用质粒 pbr322 克隆目的基因 1 5kb 需要有9 106克隆才能汇集人基因组全部dna序列 若用 噬菌体载体可构建含15kb目的基因的人基因组dna文库 按上式计算所需要的重组体克隆数可以减少到9 105 而要用柯斯质粒将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3 5 105左右 均可满足建库要求 三种常用基因组文库克隆载体的比较 对细菌 酵母和真菌来讲 一个完整的基因组文库所需的克隆数还是在可操作的范围内的 但植物和动物的一个完整的基因组文库包含了太多的不同克隆 如果从中鉴定出目的克隆 工作量是相当大的 这时可以构建针对某一种细胞被表达的基因的基因文库 cdna文库 cdna complementarydna ingenetics complementarydna cdna isdnasynthesizedfromamaturemrnatemplateinareactioncatalyzedbytheenzymereversetranscriptase cdnaisoftenusedtocloneeukaryoticgenesinprokaryotes thecentraldogmaofmolecularbiologyoutlinesthatinsynthesizingproteins dnaistranscribedintomrna whichistranslatedintoprotein onedifferencebetweeneukaryoticandprokaryoticgenesisthateukaryoticgenescancontainintrons interveningsequences whicharenotcodingsequences andmustbesplicedoutofthernaprimarytranscriptbeforeitbecomesmrnaandcanbetranslatedintoprotein prokaryoticgeneshavenointrons sotheirrnaisnotsubjecttosplicing oftenitisdesirabletoexpresseukaryoticgenesinprokaryoticcells asimplifiedmethodofdoingsowouldincludetheadditionofeukaryoticdnatoaprokaryotichost whichwouldtranscribethednatomrnaandthentranslateittoprotein however aseukaryoticdnahasintrons andsinceprokaryoteslackthemachinerytosplicethem thesplicingofeukaryoticdnamustbedonepriortoaddingtheeukaryoticdnaintothehost thisdnawhichwasmadeasacomplementarytothernaiscalledcomplementarydna cdna toobtainexpressionoftheproteinencodedbytheeukaryoticcdna prokaryoticregulatorysequenceswouldalsoberequired e g apromoter cdna无内含子 长度较基因组基因小 使操作更为方便 mrna比基因组中基因少 因此筛选某一特定功能基因工作量较小 mrna中拷贝数大于基因组中的拷贝数 利于获得较多的模板 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白不同种类不同状态的细胞的cdna文库不同不能研究基因组的结构功能 cdna文库特点 基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组dna克隆群体 cdna文库是指含有所有重组cdna的克隆群体 基因组文库 来源于基因组dna 反映基因组的全部信息 用于基因组物理图谱的构建 基因组序列分析 基因在染色体上的定位 基因组中基因的结构和组织形式等 cdna文库 来源于细胞表达出的rna 反映基因组表达的基因序列信息 用于研究特定细胞中基因的表达状态和表达基因的功能等 比较 cdna文库 cdnalibrary 将纯化的某种生物的特定发育阶段或组织的mrna 经反转录酶作用合成双链的dna群体 同适当的载体分子重组之后转化给寄主菌株 如此便构成了特定的cdna文库 这种文库与基因组文库不同 它只包括特定的发育阶段特定组织或器官中表达的基因 而不是全部的基因 cdna文库 cdnalibrary 的构建 生物体是由很多不同类型的细胞组成的 如神经细胞 血细胞 肝细胞等 每种细胞都含有相同数目基因 但不同类型的细胞所表达的基因是有差别的 因为在任何一种细胞中都只有部分基因得到表达 我们可以利用这一事实来制备cdna文库 制作文库的起始材料不再是dna而是信使rna mrna 由于只有那些被表达的基因会被转录成mrna 因此以mrna为材料所得到的克隆将只包含细胞所有基因的一部分 当目的基因在某一细胞类型中高水平表达时 建立该细胞的cdna文库就特别有利于目的基因的分离 麦醇溶蛋白是小麦中的一种重要的营养蛋白 在发育的小麦种子中 编码醇溶蛋白的基因高水平表达 这些细胞总mrna的30 是麦醇溶蛋白的mrna 显然 如果我们从小麦种子中克隆mrna 将会得到大量特异表达的麦醇溶蛋白基因的克隆 cdna文库的构建方法 cdna克隆的基本过程是在一系列酶的作用下 使总poly a rna制剂转变成双链cdna群体 并插入到适当的载体中 然后再转化大肠杆菌细胞 如此便构建了包含所有编码序列的cdna文库 此种技术 已成为当今研究分子生物学的基本手段 在真核细胞中 大部分mrna的3 末端都具有poly a 尾 oligo dt canbeboundtothepoly a tailandusedtorecoverthemrna aaaaaaaaaa n 5 cap 原理 1 分离细胞总rna 然后从中纯化出poly a rna 通过寡聚 dt 纤维素柱将结合着 dt 的磁珠加入到总rna中 再用磁铁收集磁珠 最后洗出mrna 2 合成第一链cdna oligo dt 与mrna的poly a 结合可以作为合成第一链cdna的引物 在逆转录酶的作用下 以mrna为模板 以oligo dt 为引物模板合成cdna 形成rna dna杂交分子 这种合成第一链cdna的方法又称为利用oligo dt 引导的cdna合成法 置换合成法该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cdna mrna杂交链不用碱变性 而是在dntp存在下 利用rna酶h在杂交链的mrna链上造成切口和缺口 从而产生一系列rna引物 使之成为合成第二链的引物 在大肠杆菌dna聚合酶 的作用下合成第二链 3 合成双链cdna分子 该反应有3个主要优点 1 非常有效 2 直接利用第一链反应产物 无须进一步处理和纯化 3 不必使用s1核酸酶来切割双链cdna中的单链发夹环 目前合成cdna常采用该方法 自身引导法合成的单链cdna3 端能够形成一短的发夹结构 这就为第二链的合成提供了现成的引物 当第一链合成反应产物的dna rna杂交链变性后利用大肠杆菌dna聚合酶 klenow片段cdna第二链 最后用对单链特异性的s1核酸酶消化该环 即可进一步克隆 但自身引导合成法较难控制反应 而且用s1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mrna5 端序列出现缺失和重排 因而该方法目前很少使用 聚合酶 4 将合成的双链cdna分子重组到质粒载体或噬菌体载体上 导入到大肠杆菌细胞增殖 如何从文库中获得基因 nucleicacidhybridizationistheprocess discoveredbyalexanderrich ofcombiningcomplementarysingle strandednucleicacidsintoasinglemolecule nucleotideswillbindtotheircomplementundernormalconditions sotwoperfectlycomplementarystrandswillbindtoeachotherreadily thisiscalledannealing annealingmaybereversedbyheatingthedoublestrandedmoleculeofdna orrnaordna rna tobreakthehydrogenbondsbetweenbasesandseparatethetwostrands thisiscalledmeltingordenaturation 核酸杂交技术 核酸杂交 nucleicacidhybridization 它是指两个互补或部分互补的核酸分子形成稳定的碱基配对杂交体的过程 核酸分子单链之间有互补的碱基顺序 通过碱基对之间非共价键 主要是氢键 的形成即出现稳定的双链区 这是核酸分子杂交的基础 杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补 所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序 即某种程度的同源性 就可以形成杂交双链 分子杂交可在dna与dna rna与rna或rna与dna的二条单链之间进行 如果用与目的基因互补的dna或rna作探针 就可以利用核酸杂交技术 nucleicacidhybridization 鉴定出特定的重组体 由于dna一般都以双链形式存在 因此在进行分子杂交时 应先将双链dna分子解聚成为单链 这一过程称为变性 一般通过加热或提高ph值来实现 使单链聚合双链的过程称为退火或复性 用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针 再与另一种核酸单链进行分子杂交 thereexisttwokindsofnucleicacidhybridization botharemethodsinwhichradioactivelylabeledsinglednastrandsofknownbasesequencesareusedasaprobetodetectthenucleotidesequenceofanothersinglestrandeddnaorrnamolecule thefirstoneiswidelyusedfordetectionofspecificgenesincellulardna itwasdevelopedbye m southernandiscalledsouthernblotting inthisprocedure thetargetdnaisdigestedwithoneormorerestrictionendonucleases size fractionatedbyagarosegelelectrophoresis denaturedandtransferredtoanitrocelluloseornylonmembraneforhybridization duringtheelectrophoresis dnafragments whicharenegativelychargedbecauseofthephosphategroups arerepelledfromthenegativeelectrodetowardsthepositiveelectrode andsievedthroughtheporousgel smallerdnafragmentsmovefaster forfragmentsbetween0 1and20kblong themigrationspeeddependsonfragmentlength butscarcelyatallonthebasecomposition thus fragmentsinthissizerangearefractionatedbysizeinaconventionalagarosegelelectrophoresissystem toachieveefficientsize fractionationoflargefragments 40kbtoseveralmegabases amorespecializedsystemisrequired suchasapulsed fieldgelelectrophoresisapparatus followingelectrophoresis thetestdnafragmentsaredenaturedinstrongalkali asagarosegelsarefragile andthednainthemcandiffusewithinthegel itisusualtotransferthedenatureddnafragmentsbyblottingontoadurablenitrocelluloseornylonmembrane towhichsingle strandeddnabindsreadily theindividualdnafragmentsbecomeimmobilizedonthemembraneatpositionswhichareafaithfulrecordofthesizeseparationachievedbyagarosegelelectrophoresis subsequently theimmobilizedsingle strandedtargetdnasequencesareallowedtoassociatewithlabeledsingle strandedprobedna theprobewillbindonlytorelateddnasequencesinthetargetdna andtheirpositiononthemembranecanberelatedbacktotheoriginalgelinordertoestimatetheirsize 印迹法 blot 的主要步骤 1 dna用限制性内切酶处理 2 dna片段混合物通过电泳分离 3 电泳后 通过印迹技术转到酯酰纤维薄膜上 以便操作 4 用已知小片段dna作为探针 互补结合需要找的基因片段 5 探针dna片段已用放射性元素标记 使胶片感光后可看出 thesecondmethodiscallednorthernblotting itisusedtoidentifythebasepairsequenceofrna rnaisextractedandfractionatedaccordingtosizebyelectrophoresis thentheprocedureisthesameasinsouthernblotting northernblottingisfrequentlyusedinstudiesofgeneexpression e g whetherspecificmrnaispresentindifferenttypesofcells a e procedurefornorthernblotting a rnaisisolatedfromvari