中药注射剂非临床安全性评价方法概述.doc

中药注射剂非临床安全性评价方法概述中国药物警戒第8卷第3期2011年3月March,2011,Vo1.8,No.3中图分类号:R954文献标识码:A文章编号:1672-8629(2011】030161O4中药注射剂非临床安全性评价方法概述严光焰卜迁岑小波(四川大学华西医院,国家成都中药安全性评价中心,四川成都610041)摘要:通过对当前中药注射剂不良反应的特点及安全性评价方法,尤其是针对过敏反应的评价方法的阐述,为中药注射剂的安全性研究提供思路.关键词:中药注射剂;不良反应;过敏反应;代谢组学;蛋白组学Non.clinicalSafetyEvaluationApproachesAppliedtoTraditionalChineseMedicineInjectionYAHGuang-yanBUQianCENXiaobo(WestChinaHospitalofSichuanUniversity.NationalChengduCenterforSafetyEvuationofDrugs,SichuanChengdu610041,China)Abstract:TheadveereactionfeatureofTraditionalChineseMedicineCM)injectionaswellasthesafetyevaluationapproachesappliedtOTCMinjecdonaredescribedinthispaperandthemethodsusedforallergicresponseevaluationarediscussedintensively.,SOastoprovidsuggestionsforthesafetysinofTCM.Keywords:TraditionalChineseMedicineinjection;adversedrugreacdorgallergicresponse;metabonomics;proteomics中药注射剂是传统中药与现代制剂技术有机结合发展起来的现代中药剂型,是中药现代化的创新成果.中药注射剂克服了传统中药剂型起效迟,作用慢,生物利用度低等不足,满足了中医临床急救的迫切需要,在医疗实践中发挥着其他中药剂型难以替代的作用.然而,随着临床应用的日趋广泛,中药注射剂的安全性问题凸显,尤其是过敏反应甚至过敏性休克的报道逐渐增多,人们对中药注射剂安全性的关注也与日俱增.本文对中药注射剂的不良反应特点,安全性评价方法进行了初步探讨,以期为开展相关研究提供思路及参考.1中药注射剂不良反应的特点1.1发生率相对较高中药注射剂的不良反应发生率明显高于其他中药剂型.国内学者对1978年至2009年间的33种中药注射剂不良反应,不良事件(ADR/ADE)文献进行系统分析后发现,中药注射剂ADR/ADE病例报告占整体中药ADR/ADE病例报告的72.64%,其中严重ADR/ADE报告占中药严重病例报告的76.57%m.1.2临床表现的多样化中药注射剂不良反应的临床表现多样化,以过敏反应为主,其中I型过敏反应尤为常见,严重者可导致过敏性休克.其他较为常见的不良反应有皮肤黏膜损害(如皮肤瘙痒,各种过敏性皮疹,黏膜水肿,疮型表皮松基金项目:重大新药创制(2008ZX09305-008);国家自然科学基金(30870888,30970938)作者简介:严光焰,男,在读博士研究生,药理学.通讯f售肴:岑小波,男,教授,博士生导师,药理毒理学.Emaihxbeenalallsina.tom.懈型药疹),血液系统损害(如白,粒细胞减少,紫癜,再生障碍性贫血),心血管系统损害(如心律紊乱,心功能衰竭,心绞痛)等.1-3厂家,批次之间的差异性由于中药注射剂的工艺技术条件和药材质量,制剂质量标准控制水平的差异,不同厂家,不同批次的同一中药注射剂可发生不同的不良反应31.1.4防范措施的不足临床医师对各类中药注射剂的特点,适应证和注意事项缺乏全面了解,对合理用药的意义缺乏正确的理解,导致出现无指征或超适应证用药,用法不正确等问题,且未建立有效的防范,应对措施.2中药注射剂安全性研究的主要方法2.1过敏反应研究评价技术中药注射剂不良反应以过敏反应为主,目前用于中药注射剂过敏反应的研究方法包括:被动皮肤过敏,主动皮肤过敏,胴窝淋巴结试验,直接检测过敏物质和细胞因子法,体外肥大细胞脱颗粒试验等方法.2.1.1被动皮肤过敏试验一般采用大鼠(豚鼠或小鼠)作为试验对象,先以卵白蛋白液或受试中药注射剂作为抗原制备抗血清.另取相应的实验动物,背部脱毛后将上述血清注射于动物皮内致敏,经过一段时间后经静脉注入含1%伊文思兰的卵白蛋白液或受试中药注射剂进行攻击.处死动物后取出致敏点皮肤,测定致敏点皮肤蓝斑直径;或剪碎浸泡后在一定波长处测吸光度值,作为反应强度的指标.被动皮肤过敏试验具有操作简便,结果直观,费用低廉等优点,但该试验仍有个体差异明显161中国药物警戒第8卷第3期2011年3月March,2011,Vo1.8,No.3且灵敏度低等不足.有学者采用该方法研究了双黄连注射剂和磷酸川芎嗪注射剂的致敏性,观察到这两种中药注射剂能引起过敏反应,但是也有学者利用该方法对具有较强临床致敏反应的鱼腥草注射剂进行研究,并未观察到鱼腥草所导致的过敏反应.笔者认为该方法适合于评价中药注射剂引起的过敏反应,但存在一定的假阴性结果,需配合其他过敏反应研究方法共同进行中药注射剂致敏性研究.2.1.2主动过敏反应检查法这是现行版各国药典药物过敏反应的检查方法,一般是取体重250g350g的健康豚鼠6只,每鼠隔日分3次腹腔注射药液0.5mL进行致敏,自第一次起l4天和2l天后,分别取3只豚鼠由静脉注射同种药液1.0mL,观察静脉注射后30分钟内受试豚鼠是否发生过敏反应,如有竖毛,喷嚏,干呕,连续咳嗽3声和呼吸困难等现象中的2种或2种以上,或出现抽搐,休克,死亡现象之一者,判定为过敏反应阳性.已有学者对双黄连注射液,鱼腥草注射剂和穿琥宁注射剂等引起的过敏反应进行了相应的研究,但是发现该方法也容易出现假阴性结果-s,胭窝淋巴结试验啮齿类动物(小鼠或大鼠)足跖部淋巴回流都必须进入胭窝淋巴结,作为足跖部惟一的引流淋巴结,进入足跖部皮下的外源性物质如果扩散,将首先进入胭窝淋巴结,故胭窝淋巴结将是机体对足跖部注射药物发生免疫应答的第一部位.具有致敏效应的药物进入胴窝淋巴结,诱发特异性免疫应答,导致胭窝淋巴结肿大,重量增加,淋巴细胞增殖,数量增加,分泌细胞因子和抗体.因此通过检测这些胭窝淋巴结的变化可以评价药物诱导免疫应答的潜能I81.胴窝淋巴结试验相比被动,主动皮肤过敏试验而言,该方法可配以流式细胞术,细胞因子和抗体浓度检测等技术进行定量检测,是较为客观的观察终点.该方法简单省时且特异性和灵敏性高,同时可以减少动物使用量,但是胭窝淋巴结试验的机制不清,结果重复性差,给药途径不常规,缺乏公认的标准91.研究发现,经足跖部皮下给予C57BL/6J小鼠双黄连注射剂lmg/只时可以升高胭窝淋巴结重量,但是胭窝淋巴结质量指数和细胞指数均为达到阳性标准;当双黄连注射剂的剂量升高到5mg/只时可以使胭窝淋巴结质量指数和细胞指数均达到阳性标准,不仅证明了胭窝淋巴结试验在中药注射剂过敏性研究中的可行性,同时提示在利用胭窝淋巴结试验研究中药注射剂过敏反应时,要注意给药剂量的合理选择直接检测炎症因子由于中药致敏过程中常伴随抗体(IgE,IgM等),细胞因子(如白介素类),炎症因子162(组胺,白三烯,血栓素等)的变化,因而可通过酶联免疫吸附(ELISA)等检查技术对血清或免疫细胞中的上述因子进行检测以判断过敏反应是否发生.国内已有学者通过检测大鼠和豚鼠血清中组胺含量的变化,以此评价双黄连注射液引起的过敏反应1O,ll】.2.1.5体外大鼠嗜碱性粒细胞脱颗粒试验大鼠嗜碱性粒细胞在过敏反应中起着关键作用,在过敏反应的机制研究和检测中应用广泛.嗜碱性粒细胞可结合微量的特异性IgE抗体,过敏原再次接触后即可引发脱颗粒.已有研究论证了其作为一种体外过敏反应预测模型的可行性02,31.但该方法存在一定的不足,如不同实验室间结果存在差异,与临床试验的相关性差等.随着实验条件的不断优化,该方法的检测灵敏度和准确性会不断提高,而成为一种快速灵敏的药物过敏反应的预测模型,尤其对于中药注射剂这类成分复杂的药物,采用大鼠嗜碱性粒细胞能对多个成分同时检测,并能减少过敏反应检测的实验动物.2.1.6免疫芯片技术以上检测方法都只能判断中药注射剂是否有致敏性,对中药注射剂致敏成分的鉴定基本一无所知,免疫芯片技术为我们鉴定中药注射剂致敏成分提供了一种新思路,它是一种将抗原一抗体结合反应的特异性与电子芯片高密度集成原理相结合而产生的芯片检测技术.将若干个抗原(或抗体)高密度排列在一起制成芯片同时与标本反应可一次获得芯片中所有已知抗原(或抗体)的信息.有学者提议以绿原酸为指标建立中药注射剂多组分免疫芯片,并认为这将对中药注射剂的过敏反应研究具有很强的现实意义【151.2.2中药注射剂过敏反应研究中应关注的问题在进行中药注射剂过敏反应研究时应注意以下几方面的问题:(1)中药注射剂引起的过敏反应不仅仅是I型过敏反应,上述由中药注射剂引起的再生障碍性贫血,粒细胞减少就可能是由型或者型过敏反应引起的,所以应根据受试物的特点和具体情况,除进行常规的I型变态反应试验外,还应进行II一型过敏反应试验,而不能仅仅局限于I型过敏反应试验.(2)应重视给药剂量和给药速度对动物过敏反应发生的影响.如上所述,双黄连注射剂给药剂量对行胭窝淋巴结试验的结果有明显的影响.(3)动物种属的选择.一般认为豚鼠是进行过敏性试验的最敏感动物,但其过敏反应的高阴性率与临床存在的高阳性率存在差异,相关性较差.有学者比较了小鼠,豚鼠和比格(Beagle)犬用于评价过敏反应时的敏感中国药物警戒第8卷第3期2011年3月March,2011,Vo1.8,No.3度和准确度,观察给药后的行为学和血浆中组胺,IgE,IgG,IgM的含量,表明比格犬可能是研究过敏反应的最佳实验动物06.这些研究提示,豚鼠可能不总是最敏感动物.(4)注意区分真正的过敏反应和中药类过敏反应.2.3类过敏反应研究现有研究报道发现,I型过敏反应不能够全面阐述中药注射剂致急性过敏反应的机制,提示中药注射剂引起的急性过敏反应除I型变态反应外还应考虑包括类过敏反应.类过敏反应发生的机制,目前认为主要是药物直接刺激肥大细胞(嗜碱性粒细胞)脱颗粒释放组胺,激活补体系统,异常合成类花生酸类,抑制缓激肽降解等,并没有特异性的IgE参与17,181.中药注射剂成分复杂,助溶剂等辅料使用较多,有可能通过激活补体系统诱发类过敏反应I2J.有学者研究发现,双黄连注射液可提高大鼠腹腔肥大细胞的组胺释放率和体内血浆的组胺水平,这种现象一般是首次给药就可出现,表明双黄连注射液可能引起类过敏反应f】91.采用Beagle犬对7种中药注射剂进行类过敏反应研究,发现在一次静脉给药后动物出现症状,轻者出现烦躁不安,红疹,腹皮红,严重者有流涎,恶心,呕吐,过敏性休克等症状,同时检测到血清组胺含量明显升高,认为7种中药注射剂均导致Beagle犬出现类过敏反应2o1.因此,类过敏反应的研究将可能是中药注射剂安全性评价的一个重要内容.另外,有学者比较了猪,犬和大鼠3种实验动物用于评价类过敏反应的敏感性,结果显示犬除了能和猪一样表现出全身性低血压,心输出量降低,心率失常,皮肤潮红的类过敏反应症状外,还有显着的血细胞和植物神经变化,因此认为犬更适于用来评价中药注射剂的类过敏反应21,22】.2.4溶血试验研究药物引起人体内溶血分为免疫性溶血和非免疫性溶血两类.免疫性溶血是药物通过免疫反应产生抗体而引起的溶血,为型(由IgG介导)和I型(由IgG,IgM介导)过敏反应;非免疫性溶血是药物直接导致的溶血.药物非免疫性引起红细胞破裂的原因有很多:主要有:药液的渗透压.如果输入药物为低渗盐溶液,就有可能引起红细胞膨胀,甚至破裂,逸出血红蛋白,即产生溶血.有研究发现,不同厂家生产的参麦注射液原液均为低渗溶液并且可导致明显的体外溶血现象【嚣】.药物直接与红细胞膜作用,改变脂质体膜的透过性,从而引起红细胞的破裂.金银花作为双黄连注射剂的一种重要原料药,其所含的皂苷类物质可以与红细胞膜上的胆固醇等物质作用而使细胞膜通透性增加引起红细胞的破裂或者变形,导致溶血.目前,对中药注射剂部颁标准(ws3一B328998)采用目试法测定溶血,结果只是阴性(不溶血),阳性(溶血),而无法了解溶血程度.另外,有些中药注射剂本身就有一定的颜色,如双黄连注射剂是棕红色液体,严重干扰了目试法对溶血的观察.所以笔者建议考虑采用溶血率法测定中药注射剂的溶血性.研究表明,溶血率法测定在双黄连注射液体外溶血试验,明显优于原标准中肉眼目试法测定溶血,把溶血结果以溶血率量化并可以排除注射剂颜色对目视法的干扰,此方法可推广至所有中药注射液的溶血测定zT1.2.5组学在中药注射荆安全性评价中的应用2.5.1代谢组学代谢组学通过研究机体的内源性小分子物质的变化来探讨药物对机体的系统性作用.其通常采用现代分析测定方法,计算机及信息技术,以高通量实验和计算为特征,完成细胞或者生物体所有代谢物的“指纹图谱”,进而探讨药物对机体的作用.代谢组学在药物安全性评价方面有其独特的应用优势,因为生物样品(如尿液,血液,脑脊液,气管洗脱液等)可以连续多次获取,并可在同一动物或人体观察毒性作用发生,发展和恢复过程.与传统研究手段相比,药物代谢组学从整体上展示生物体内在的变化状态,能够获得生物体整体性,动态性的信息,这与中医药整体思维方法具有趋近特征,提示代谢组学研究方法与中医药思路具有互相渗透性,符合中医药的思维方式嚣29/.采用代谢组学研究方法研究中药注射剂不良反应,探索反映中药注射剂不良反应的生物标记物可作为中药注射剂安全性评价研究的重要内容.笔者所在实验室采用代谢组学方法研究经静脉给予双黄连注射液的Beagle犬的血清,得到了反映细胞膜损伤的生物指标的改变,并且这些结果和常规生化病理结果较为一致,证实该方法比较适合于评价中药注射剂引起的毒性反应.2.5.2蛋白质组学蛋白质组学是对蛋白质进行系统性研究的科学,可对不同时间和空间上发挥特定功能的蛋白质组群进行研究.双向凝胶电泳一质谱是目前蛋白质组学研究最常用的技术平台,首先通过双向聚丙烯酰胺凝胶电泳按等电点和相对分子质量不同对蛋白质进行分离;建立双向凝胶电泳图谱,利用软件进行图像分析;将有差异的蛋白点进行质谱鉴定;最后进行生物信息学分析.在药学研究应用中,蛋白质组学在药物作用靶点的识别与验证,药物耐药机制的探索,药物毒理学研究等163中国药物警戒第8卷第3期2011年3月March,2011,Vo1.8,No.3方面已显示出巨大的潜力.利用蛋白质组学技术将能够发现大量与药物毒理研究有关的标志物,并且能够利用所鉴定的标志物预测药物毒性,从而加快药物研究开发的进程【3】1.蛋白质组学在中药注射剂研究中的应用仍处于初步探索阶段,但是蛋白质组学为中药注射剂安全性评价提供了契机,因为蛋白质组学正好与中药注射剂的多组分,多靶点,多代谢途径的特点相吻合132.利用蛋白质组学技术研究中药注射剂对机体蛋白表达谱的影响,这种结合不仅对中医药基础理论现代化研究具有重要的理论意义,而且对中药注射剂走向世界具有重要的意义.3结语中药注射剂安全性评价工作当前应着重解决中药注射剂的过敏反应,为努力寻找能预测过敏反应的实验方法,考虑将代谢组学和蛋白组学这些系统生物学方法及其他较新的技术手段应用于中药注射剂的安全性评价工作中.中药注射剂的安全性问题虽然突出,但是通过充分的多学科的研究和不断地改进提高,其安全性是可控的,并且其临床作用是目前化学药物无法替代的,因此不能简单地淘汰或废除中药注射剂,而是要通过安全性再评价工作,提高中药注射剂的质量标准,将安全风险控制在合理范围内,促进我国中药注射剂的健康发展.参考文献:【l】袁强,王莉,成岚.国家基本药物目录(2004年版)33种中药注射剂不良反应/不良事件文献分析【J1.中国循证医学杂志,2010,10(2):132139.【2】刘屏.中药注射剂的过敏反应亟待进行科学系统研究【J1.中国药物应用与监测,2010,7(2):67-69.【3】曹学东.9种中药注射剂不溶性微粒观察【J】.中医药研究,2004,11(5):55.【4】文洁,朱建梅,俞励平.磷酸川芎嗪注射液血管刺激性,溶血性及过敏性试验研究【J】.国际医药卫生导报,2009,l5(21):2831.【5】李瑾翡,黎吻,陈琪.注射用双黄连的免疫毒性研究J】.中药新药与临床药理,2008,5(19):172174.【6】吴友苹,徐潘生,卢觅佳,等.鱼腥草注射液I型过敏反应试验【J】.时珍国医国药,2009,20(6):15221523.71LvikM,AIbergT,NygaardU,eta1.Popliteallymphnode(PLN)assaytostudyadjuvanteffectsonrespiratoryallergyJ.Methods,2007.41:72-79.81RavelGandOescote*J.Popliteallymphnodeassay:factsandspectives【J】.JApplToxicol,2005,25(6):451-458.【9】刘兆华,程芳,周庚寅.C57/6J小鼠胭窝淋巴结试验评价注射用双黄连致敏性的研究J】冲国中西医结合杂志,2010,30(1):64._67.101郭姗姗,王意忠,张毅.BN大鼠和豚鼠评价双黄连注射液的过敏反应【J】.中国药理学与毒理学杂志,2009,23(2):128133.164111LiZ,GaoY,WangH,eta1.AratmodelofShuangHuangLianinjection-inducedanaphylaxis【J】.AsianPacJAllergyImmtmol,2010,28(23):l85一l91.121FDA:GuidanceforIndustryImmunotoxicologyEvaluationofIn-ve*tigationalNewDragsEB/OL.2002.http:/www.胁.gov/downlo-ads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidan-ces/ucm079239.pdf.13】ChoiYH,YanGH.Silibininattenuatesmastcell-mediatedaIla?phylaxislikereactionsJ.BiolPharmBull,2009,32(5):868-875.141刘宝峰,李中港,刘兆平.大鼠嗜碱性粒细胞在过敏反应研究中的应用【J1.齐鲁药事,2010,29(14):230-232.15】屈会化,赵琰,王庆国.利用免疫芯片技术筛查中药注射剂致敏成分【J】.北京中医药大学,2008,31(1):23-25.【l6】闫位娟-中药注射剂致敏性研究DI.广西医科大学,2009.171SzebeniJ.Complementactivation-mimedpseudoallergy:anewclassofdrug-inducedacuteimmunetoxicityJ1.Toxicology,2005,216(2-3):106-121.18】DescotesJ,PayenC,VialT.Pseudo-allergicdrugreactions,imspecialreferencetodirecthistaminereleaseJ.PerspectExpClinImmunotoxicol,2007,141150.【l9】程芳,刘兆平冲药注射剂安全性评价与关键技术的研究【J】冲国中药杂志,2009,34(8):10521054.【20】SzebeniJ,AlvingCR,RosivallL,eta1.Animalmodelsofcom-plement-mediatedhypersensitivityreactionstoliposome*andotherl