（分析化学专业论文）n连接蛋白质糖基化分析用微流控芯片平台和方法研究.pdf

摘要 摘要 蛋白质糖基化在许多生物和生理过程中发挥着重要的作用，进行蛋白质 糖基化的分析在蛋白质组学以及药物筛选的研究中具有罩要的意义。本论文 分别以寡跨链、糖肽以及整个糖蛋白( 糖形) 为分析对象，进行以微流控芯 片和质谱或者二者联用为基础的n 连接蛋白质糖基化分析平台和方法的研 究。主要内容包括： 在微流控芯片上实现了简单糖的快速电泳分离和直接、间接激光诱导荧 光检测；发展了以芯片电泳与外切糖萤酶酶解结合，激光诱导荧光检测为基 础，以糖肽为分析对象的糖链结构类型分析方法，对火鸡卵白蛋白的糖链结 构进行推测，结果表明该蛋白含有高甘露糖型和杂合型的糖链；设计并制备 了一种集成化凝集素亲和微流控芯片。在通道内构建以整体材料为载体的微 米级的凝集素亲和柱，以电渗流为驱动力，在微流控芯片上实现了传统凝集 素亲和色谱的全过程，用豌豆凝集素亲和芯片对糖蛋白的糖形进行分析，根 据其糖链与豌豆凝集素结合能力的不同将糖形分为与该凝集素不结合、弱结 合和强结合的组分。该芯片具有耗样量少、分析快速以及操作简单的优点。 构建了联接芯片电泳和质谱的鞘流液辅助的纳米电喷雾接口。用该接口 将芯片电泳与离子阱质谱连接，实现了糖蛋白中糖肽结构的具体分析；建立 了用基质辅助激光解吸时间飞行- 质谱( m a l d i t o f m s ) 对从糖蛋白释放 下来的糖链进行结构分析的方法，用该方法进行了不同来源的同种糖蛋白一 鸡卵白蛋白和火鸡卵白蛋白糖链结构的比较分析。 关键词：蛋白质糖基化，芯片电泳。凝集素亲和芯片，质谱 a b s t r a c t a b s t r a c t x i u l im a o ( a n a l y t i c a lc h e m i s t r y ) d i r e c t e db yp r o f b i n g c h e n gl i n g l y c o s y l a t i o np l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei nb i o l o g i c a la n dp h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e s s u c ha sa n t i g e n i c i t y , s e c r e t i o n ，c j e a r a n c eo fg | y c o p r o t e i n sa n dv i r u si n v a s i o n r e s e a r c hi ng l y e o s y l a t i o nm a yc o n t r i b u t et ot h ed e v e l o p m e n to fp r o t e o m i c sa n d d r u gs c r e e n i n g t h i st h e s i sf o c u s e so nt h ed e v e l o p m e n to f n e wm e t h o d o l o g i e sa n d p l a t f o r m sb a s e do nm i c r o f l u i d i cd e v i c e sa n d o rm a s ss p e c t r o m e t r y ( m s ) f o rt h e a n a l y s i so f p r o t e i ng l y c o s y l a t i o n m o n o - a n do l i g o - s a e c h a r i d e sw e r es e p a r a t e db ym i c r o c h i pe l e c t r o p h o r e s i sw i t h d i r e c ta n di n d i r e c tl a s e ri n d u c e d f l u o r e s c e n c e ( l i f ) d e t e c t i o n t h ew h o l e s e p a r a t i o np r o c e s st a k e s af e wm i n u t e s s y s t e m a t i c a l l y ，an e wm e t h o dw a s d e v e l o p e df o rt h eg l y c o p r o t e i na n a l y s i sw i t hm i c r o c h i pe l e c t r o p h o r e s i sc o m b i n e d w i t hc x o g l y c o s i d a s ed i g e s t i o n g l y c o p e p t i d e so f t u r k e yo v a l b u m i nw e r ef o u n dt o c o n t a i n h i g h m a n n o s ea n dh y b r i dt y p eo l i g o s a c c h a r i d e su s i n gt h i sm e t h o d f u r t h e r m o r e ，al e c t i na f f i n i t ym i c r o f l u i d i cc h i pw a sd e s i g n e da n df a b r i c a t e df o r g l y c o f o r ms e p a r a t i o n am i c r o s c a l em o n o l i t h b a s e dl e e t i nc o l u m nw a sd e v e l o p e d u s i n g i m m o b i l i z e d p i s u m s a t i v u m a g g l u t i n i n ( p s a ) c o l u m n o nac h i p , g l y c o f o r m s o f g l y c o p r o t e i n s ，c h i c k e no v a l b u m i n ，t u r k e y o v a l b u m i na n d o v o m u c o i do f d i f f e r e n tg l y c a ns t r u c t u r ew e r ef r a c t i o n a t e di n t on o n b o u n d ，w e a k l y b o u n da n ds 舡d n g l yb o u n df r a c t i o n sa c c o r d i n gt ot h et y p eo fg l y c a n st h e yc a r r y r e s p e c t i v e l y ，t h ei n t e g r a t e dl e c t i na f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yo nam i c r o f l u i d i cc h i p r e s u l t e di nas i g n i f i c a n tr e d u c t i o ni nt h ea n a l y s i st i m ea n ds a m p l ec o n s u m p t i o n i na d d i t i o n ，as t a b l ea n ds e n s i t i v es h e a t hf l o wn a n oe l e c t r o s p r a yi n t e r f a c ew a s h b s t r a c t d e v e l o p e dt oc o u p l eg l a s sm i c r o c h i pw i t hm a s ss p e c t r o m e t r y t h em i c r o c h i p m s s y s t e mw a su s e d 船ap l a t f o r mf o rg l y c o s y l a t i o na n a l y s i s g l y c o f o r m sa n d g l y c o p e p t i d e sf r o mg l y e o p r o t e i nw e r ea n a l y z e du s i n gm i c r o c h i pe l e c t r o p h o m s i s - q u a d r u p o l ei o nt r a pm s i na d d i t i o n ，t h ec o m p o s i t i o n so fg l y c a n so fi n t a c t g l y c o p m t c i n sw e r ed e t e r m i n e du s i n gm a l d i - t o f m sw i t h6 x o g l y c o s i d a s e d i g e s t i o n t h e s r u c t u r eo f g l y c a n s w a sf u r t h e r a n a l y z e d w i t hm s m s m e a s u r e m e n to nm a l d i q t o f m s k e yw o r d s ：p r o t e i ng l y c o s y l a t i o n ，m i c r o c h i pe l e c t r o p h o r e s i s ，l e c t i na f f i n i t y m i c r o f l u i d i cd e v i c e ，m a s ss p e c t r o m e t r y 第一章n - 连接蛋白质糖基化分析进展 1 1 引言 第一章n - 连接蛋白质糖基化分析进展 ( 文献综述) 蛋白质的糖基化在许多生物过程，如免疫、细胞识别、信号传导以及病 毒侵入等发挥着重要的作用。糖蛋白上的糖链在很大程度上影响着蛋白质的 结构和功能【l 】。因此蛋白质糖基化的分析不论是在蛋白质组学的研究还是在 药物筛选中都具有重要的意义。寡糖可以连接在肽链的丝氨酸( s e r ) 或者苏 氨酸( t 1 l r ) 上，这种结构称为o 连接的糖基化，相应的糖链被称为o - 连接 的糖链或者寡糖，具有相应结构的糖肽或者糖蛋白被称为0 连接的糖肽或者 糖蛋白；寡糖也可以连接在肽链的天冬酰胺( a s n ) 上，这种结构称为n 连 接的糖基化，而相应的糖链被称为n 连接的糖链或者寡糖，具有相应结构的 糖肽或者糖蛋白称为n 连接的糖肽或者糖蛋白。迄今为止，由于没有一种非 常好的特异性酶可以将o 连接的糖链从蛋白上释放下来，其研究相对比较 少，对o 连接糖基化规律和机理的研究也不多。n - 连接的蛋白质糖基化分析 相对比较透彻，从糖基化形成的机理到糖链的结构分析以及对糖链功能的认 识都相对成熟。由于本文仅涉及n 连接的蛋白质糖基化，本章就n - 连接蛋 白质糖基化的特点、分类、分析策略、现代化分析技术、发展趋势以及本论 文开展的工作傲一简单的介绍。 1 2n 连接糖基化介绍 1 - 2 1n 连接糖基化特点 n 连接糖基化是在细胞的内质网和高尔基体内经过一系列复杂的反应完 成，是蛋白质糖基化类型中存在最多的一种【2 】。首先寡糖链g i e n a c 2 m a n g g i c 3 在内质网内连接在新形成肽链上具有a 蛐x s e r t h r 结构的( x - 脯氨酸外的 任意一种氨基酸) a s n 上，该糖链上的末端的葡萄糖基和甘露糖基可以被葡 2 n - 连接蛋白质糖基化分析用微流控芯片平台和方法研究 萄糖苷酶和甘露糖苷酶剪切。因此在内质网内该蛋白上连接的糖链比较小， 而且不均一化程度比较低。但当这些糖形进入高尔基体内，糖链在甘露糖营 芦 h 佩 ；- h 2 、n h 妇c o 棚c h 2 c o n h 魂c 0 、v nxs 仃 图i - in 连接的糖基化结构 f i g u r ei - ls t m c t u r co f n - g l y c o s y l a t i o n 酶和糖基转移酶的共同作用 下加工成熟，形成了高甘露糖 型、杂合型和复杂型三种类型 的糖链【3 】。图1 1 为n 连接糖 基化的结构示意图。从蛋白质 的n 连接糖基化的过程中可 以看出其具有两个特点：第一 具有a s n - x s c r f f h r 结构是进 行n 连接糖基化的必要而非 充要条件。也就是说所有n 连接的糖链都连接在具有 a s n - x se r j 叮1 l r 结构的a s n 上， 但是并不是所有具有该结构的a s n 就一定会连接有寡糖链，因此在n - 连接糖 蛋白糖基化位点的分析中仅仅根据氨基酸序列结构只能得到潜在的糖基化位 点，具体哪一个a s n 为糖基化位点还需要进一步的分析；第二所有的n 连接 的糖链均具有g l c n a c 2 m a n 3 的五糖核心结构。这一点为n 连接糖链的结构分 析中提供了重要的信息。 由于糖蛋白的肽链上可能含有多个具有该结构的a s n ，因此一个糖蛋白 可能具有多个潜在的糖基化位点，而具有g i c n a c 2 m a r l 9 g l c 3 核心结构的糖链 要经过一系列的剪切和修饰加工成熟，因此同一个糖基化位点上也可以含有 多种不同结构的糖链。因此一种糖蛋白可能存在多个糖基化位点、同一个糖 基化位点上具有多种糖链，n 连接糖基化的这一复杂性特点使得其分析对任 何一种分析手段都是一个挑战。 哺乳动物体内存在的n 连接糖链主要是由六种单糖组成，即乙酰氨基葡 萄糖( g i c n a c ) 、甘露糖( m a n ) 、半乳糖( g a l ) 、乙酰氨基半乳糖( g a l n a c ) 、岩 藻糖( f l l c ) 和唾液酸( n e u a c ) ，其结构见图1 2 所示。 第一章n 连接蛋白质稽基化分析进展3 骨蛰 甘露糖 半乳糖岩藻糖 唾液酸乙酰氨基葡萄糖 乙酰氨基半乳塘 图1 2 组成哺乳动物体内n 硅接糖链的六种主要单糖的结构 f i g u r ei - 2s 仃u c t u r c so f t h es i xm o n o s a c c h a r i d c sc o m p o s i t i n gt h en - g l y c a n si nv i v o m a m m a l 1 2 2n 连接糖链的分类 根据n 连接糖链的性质以及在高尔基体内糖基转移酶将寡糖连接在核 心五糖上的位置，n - 连接的糖链可以分为三类，即高甘露糖型、复杂型和杂 合型。在内质网内连接在肽链上的糖链经葡萄糖苷水解酶和甘露糖苷酶剪切 以及在高尔基体内甘露糖转移酶将甘露糖连接在核心结构上得到的糖链或者 逃过修饰的糖链为高甘露糖型的糖链，该类型糖链的组成一般为 m a n s g g l c n a c 2 ：糖链中含有n 乙酰氨基乳糖即g a l p l - 3 4 g i c n a c 结构的糖 链为复杂型糖链，这类糖链的特征是具有不同的天线结构，在进行生物合成 时以将o l c n a c 连接在核心五糖的两个甘露糖上开始的。在哺乳动物中是这 些天线结构一般会再连接8 g a l 基而延长或者依次连接o l c n a c 和g a l 而出现 l a c n a c ( l a c ，乳糖) 的重复结构。但是1 3 - c , a l n a c 很少连接在o l c n a c 上 面得到g a l n a c b 1 - 4 g i c n a c 的结构：杂合型的糖链中五糖核心中的两个甘露 糖上既连接有甘露糖又连接有乙酰氨基已糖。此外五糖核心中的1 3 - m a n 也具 4n - 连接蛋白质糖基化分析用微流控芯片平台和方法研究 有一个连接g i c n a c 的位点，在4 位上连接有g i c n a c 的 ；- m a n 被称为二分 支结构的糖基。而且a f u c 也可以连接在核心的g i c n a c 上进一步加强了糖 链结构的多样性。复杂型糖链的生物合成还可以通过帽化( c a p p i n g ) 反应来 完成，在哺乳动物中帽化反应主要是岩藻糖化和唾液酸化，与骨架糖链的连 接方式为b 连接不同，在帽化反应中糖基一般是以a 方式连接的。图1 - 3 为 典型的高甘露糖型、杂合型和复杂型的糖链结构图。 。 。l 、 n a l 4 ：岫1 一。t 蝴佛 础 高甘露糖 杂合型 复杂型 图l - 3 高甘露糖型、杂合型和复杂型糖链 f i g u r ei - 3h i g h - m a n n o s e ，h y b r i da n dc o m p l e x n l i n k e dg l y c a n s 1 3n 连接糖基化的分析策略 如前已叙及，鉴于蛋白质糖基化的复杂性，目前还没有一个统一、通用 的分析策略进行其研究。目前蛋白质糖基化的研究主要有两种分析策略：一 种是在蛋白质组学研究的基础上提出来的以二维凝胶电泳为基础的分析策 略；另外一种是糖组学研究本身提出来的以凝集素亲和色谱为基础的分析策 第一章n 一连接蛋白质糖基化分析进展5 略：另外还有一些基于其它机理的分析策略。下面就这些分析策略作一简单 的阐述。 1 3 1 以二维凝胶电泳为基础的分析策略 随着上个世纪人类基因组计划的完成，蛋白质组的研究成为生命科学研 究的新热点。针对某些细胞活动过程中蛋白质的变化或者是在生理变化中某 些蛋白质表达的变化成为蛋白质组研究的焦点。但实际上在组织或者细胞中 蛋白质的这些变化并不是基因表达的变化而是蛋白质后修饰的变化。因此蛋 白质后修饰的分析是进行蛋白质组学研究的一个重要领域。目前蛋白质组的 分析主要包括以下几个步骤：从组织或者细胞中提取的蛋白；将蛋白质进行 二维凝胶电泳、原位蛋白酶水解：水解产物用基于基体辅助激光解吸离子化 质谱检测得到肽谱【4 7 】或者用纳米电喷雾质谱，质谱 8 ，9 】、液相色谱质谱质 谱 1 0 1 2 得到肽的二级质谱图；得到的数据进行数据库检索，进行蛋白质的 分析。 蛋白质的糖基化是最重要的蛋白质翻译后加工过程之一，蛋白质糖基化 的研究成为蛋白质组学研究不可缺少的一个领域。因此基于蛋白质组的研究， 提出了以凝胶电泳为基础的蛋白质糖基化的分析策略 1 3 1 。这种分析策略认 为目前凝胶电泳是蛋白质分析中最普遍应用的分离技术，而蛋白质糖基化的 分析应当基于此分离技术。因为传统的蛋白质糖基化的分析需要比较纯的糖 蛋白，以避免其他杂质或者糖复合物对糖基化分析干扰；同时由于蛋白质的 糖基化因细胞或者组织种类的不同而不同，因此用重组蛋白质可能不能反映 出体内蛋白质糖基化的特点；用一些色谱技术进行塘蛋白的纯化会引起样品 的丢失；因此凝胶电泳是进行糖蛋白分离纯化的最佳选择。基于凝胶电泳的 蛋白质糖基化分析策略的整个过程如图1 4 所示。 对氨基酸序列已知的糖蛋白，其糖链结构的分析过程是该糖蛋白经肼解 或者糖肽酶( p n ( 3 a s ef ) 酶解将糖链从该糖蛋白上释放下来，收集得到糖 链用质谱或者是荧光标记后用液楣色谱分离检测，可以得到糖链的种类和分 子量的信息。糖链的序列可以用外切糖苷酶酶解与质谱或者液相色谱结合起 6 n 一连接蛋白质糖基化分析用微流控芯片平台和方法研究 纯化的糖蛋白 肼解il p n g a s e f 酶解 收集，抽取糖链 器il 质谱高效液相色谱li “” 糖链的确定 s d s p a g e 感兴趣的条带 胶上原位p n g a s ef 酶解 蛋白 胶上胰蛋白酶的原位酶解 抽取肽 二工二 质谱 外切糖苷酶进行糖链序列确定糖基化位ll 经数据库检索 点确定l确定蛋白质 图1 4 以凝胶电泳为基础的n 连接蛋白质糖基化的分析策略 f i g u r e1 - 4g e le l e c 拄o p h o r e s i sb a s e ds t r a t e g yf o rn - g l y e o s y l a t i o n 来进行分析。从凝胶电泳上分离得到的目标糖蛋白的分析包括两个过程，即 糖链结构的分析和糖基化为点的分析。首先对目标糖蛋白进行原位p n c r a s e f 酶解和糖链抽取后，按照相同的步骤进行糖链结构的分析。剩下的肽链部分 进行蛋白酶水解、质谱检测得到蛋白质肽谱，数据库搜索进行蛋白质的确定： 同时根据用p n g a s e f 释放糖链时蛋白质肽链上连接由糖链的天门冬酰胺 ( a s n ) 变为天冬胺酸( a s p ) ，即在质谱图上表现为肽的分子量有0 9 8 7 3 原 子质量单位( a i n u ) 的偏差进行糖基化位点的确定。 1 3 2 以凝集素亲和色谱为基础的分析策略 糖组学是上个世纪继基因组学、蛋白质组学之后提出的第三个关于生物 第一章n 一连接蛋白质糖基化分析进展 7 大分子组学的新概念【1 4 】。糖组学是研究整个组织或者细胞中糖链的结构和 功能。基于糖的复杂性以及糖蛋白在生命过程中的重要意义，目前糖组学的 研究主要集中于糖蛋白的研究，因此还提出了糖蛋白组学这一概念 ( g l y c o p r o t e o m i c s ) 。 图1 - 5 以凝集素亲和色谱为基础的n 连接蛋白质糖基化分析策略 f i g u r e1 - 5l e c t i na f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y b a s e ds t r a t e g yf o r n g l y c o s y l a t i o na n a l y s i s 凝集素是自然界中广泛存在的一大类非免疫来源、无糖酶活性、多价的 糖类结合蛋白【1 5 】。由于凝集素能识别细胞表面的糖蛋白或者糖脂上糖链的 8 n - 连接蛋白质糖基化分析用微流控芯片平台和方法研究 结构，它已经成为蛋白质与糖相互作用一种典型的配体。糖与凝集素之间的 结合常数在1 0 2 到1 0 6m 。1 之间，与糖与其相应抗体之间的结合常数1 0 8 m 4 相比较要小得多。这一点在对糖或者糖蛋白的分离纯化中有重要的意义。如 果用糖的抗体进行纯化，则要使用比较极端的条件将糖或者糖蛋白解吸下来， 对糖或者糖蛋白的活性可能会有影响。由于糖与凝集素之问的相互作用比较 弱，在对糖蛋白纯化时进行洗脱步骤是只需要比较温和的条件，可以保证其 生物活性。 以凝集素亲和色谱( 1 e c t i na f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y , l a c ) 为基础的蛋白质 糖基化分析是在糖组学研究中提出来的【1 6 ，1 7 。糖组学认为目前糖组的研 究应集中予糖蛋白的分析。整个分祈策略的过程如图1 5 所示，共包括三部 分，即l a c 、多维高效液相色谱以及前沿亲和层析来进行糖蛋白的氨基酸序 列、表达基因以及糖基化分析( 如图1 5 所示) 。用多种凝集素亲和柱捕获细 胞或者组织提取液中糖蛋白，收集得到的糖蛋白经过蛋白酶水解得到肽与糖 肽的混合物。糖蛋白的蛋白酶水解产物经过里相应的凝集素亲和柱，糖肽被 捕获，水解产物中的肽流出l a c 柱后用二维高效液相色谱和二级质谱联用进 行糖蛋白的氨基酸序列进行确定；利用蛋白质组学的研究方法确定表达该糖 蛋白的基因。l a c 捕获得到的糖肽在含有0 1 8 水中进行p n g a s ef 水解。在 糖链释放下来的过程中，肽链中的a s h 会变为a s p ( o ”) ，用质谱对得到肽 段的氨基酸序列进行分析，以确定糖基化位点。同时用化学或者酶解得方法 将糖链从糖蛋白上释放下来，其结构分析通过三种技术得到的三组数据进行 定义，即用前沿亲和层析得到的糖链和一组凝集素结合常数、用时间飞行质 谱得到的糖链的分子量以及用多维高效液相色谱得到的以葡萄糖单位表示的 糖链的化学结构。以此分析策略，h i r a b a y a s h i 等人【1 8 】进行了线虫糖蛋白组 学的研究。 1 3 3 其他的分析策略 从以上的两种分析策略来看，蛋白质糖基化的分析包括两个方面：第一， 蛋白质糖基化位点的分析，即对糖肽的分析；第二，蛋白质上糖链结构的分 第一章n 一连接蛋白质糖基化分析进展 9 析。因此不管哪一种分析策略均是以糖肽或者肽和糖链为分析单元。但在许 多实际情况中，如在某些疾病发生时，细胞表面或者是体液中的某些糖蛋白 中糖链的结构发生了变化，并以此糖蛋白作为该疾病的标记物进行疾病诊断 时，只需要知道这些糖链是否发生变化即可，这时也可以以糖蛋白的糖形为 分析对象 1 9 ，2 0 1 。以整个蛋自为分析对象，用凝集素亲和色谱、毛细管电泳 或者其他的一些分离手段对糖形分布进行监测，以获得糖链结构变化的信息。 这些方法会节省许多分析过程和分析时间。 1 4 n 连接糖基化的现代分析技术 1 4 1 高效液相色谱 高效液相色谱或者高效液相色谱质谱( ，质谱) 为糖链或者糖肽结构分析 提供了高灵敏的分析手段。关于质谱在糖基化分析中的应用会在以后的章节 中进行叙述。本节主要对液相色谱在糖基化分析中的应用进行叙述。 1 4 1 1 糖链的高效液相色谱分析 从糖蛋白上释放下来的糖链一般要经醛醇化、全甲基化、或者还原端标 记后进行液相色谱分析。一般来讲，用于寡糖及其衍生物分析的主要有反相、 正相和石墨液相色谱。 1 4 1 1 1 反相液相色谱 由于糖链的亲水性比较强，在c 1 8 柱上基本上没有保留，因此在糖链的 反相液相色谱分析前需要对其进行疏水基团的衍生。多种标记物应用于糖链 的衍生，其中最常用的是带有还原氨基标记物 2 1 1 。实际上很多标记物不仅 仅是增j n t 糖链的疏水性，同时也引进了一些紫外吸收基团或者荧光基团， 可以同时进行光学检测。如2 氨基吡啶对糖链的荧光标记用于包括反相液相 色谱在内的糖链的二维或者三维液相色谱分析中的荧光检测【2 2 - 2 6 】。近年来 也出现了各种用于反相液相色谱质谱对糖蛋白中糖链分析的标记物。 1 0 n 一连接蛋白质糖基化分析用微流控芯片平台和方法研究 p e r r c a u l t 等人( 2 7 ，2 s j 则提出用于n - 连接糖链的标记物 l - p h e n y l - 3 一m e t h y l 一5 - p y r a z o l o n e ( p m p )和p h c n y l h y d r a z i n e ；用 2 - a m i n o 一5 - b r o m o p y r i d i n e 标记糖链链在反相- 液相色谱质谱中则可以用于区 分糖链的离子碎片中b 和y 离子碎片【2 9 】。除了用这些标记物与糖链的还原 端反应外，糖链的全甲基化也是增加糖链的疏水性进行反相液相色谱质谱分 析的一种方法 3 0 ，3 1 。而且在全甲基化后的糖链在进行串联质谱分析时可以 比较清楚地得到糖链的连接、分支结构的信息。 随着液相色谱的发展，目前出现了纳米或者微米的反相液相色谱用于糖 蛋白的糖链的分析 3 2 】。与传统的液相色谱相比，这些微型化的高效液相色 谱为糖链的分析提供了更高的分辨率和更高的灵敏度。 1 4 1 1 2 正相液相色谱 正相色谱对糖链的分析是根据其亲水基团和正相介质上氨基的相互作用 进行的。正相色谱既可以作为糖链衍生物的二维色谱分析中的反相色谱后的 第二维【3 3 3 5 也可以对未标记的寡糖链进行直接分离分析。但是由于大部分 糖链本身不含有吸收或者发射基团，因此对未标记糖链的分析不能进行光学 检测。 同样也有报道将纳米或者微米正相液相色谱用于糖链的分析中【3 6 】。尽 管这些微型化的液相色谱与质谱的联用大大提高了灵敏度，但是由于这些色 谱柱的重复性与传统色谱柱要差，所以在实际中的应用并不多。 1 4 1 1 3 石墨液相色谱 石墨柱进行糖链的分析是根据其疏水作用进行的。因此糖链大多要进行 还原端的标记 3 7 4 0 。同时研究还发现石墨柱可以进行糖链的同分异构体的 分离。与反相柱相比，其洗脱液适用的p h 范围比较宽，固定相的物理化学 性质稳定。因此除了可以进行糖链及其衍生物的分析外也可以进行质谱前的 糖链的样品制备。 从以上叙述可以看到，液相色谱的各种分离形式各有优缺点，可以相互 第一章n 一连接蛋白质糖基化分析进展1 l 联用，优缺互补进行糖链的多维分离。而纳米或者微米色谱柱的出现，为糖 基化的分析提供了一种高灵敏度、高分辨率的、耗样量少的分析平台。 1 4 1 2 糖肽的高效液相色谱分析 糖基化的分析还包括糖基化位点的分析。用液相色谱质谱对糖基化位点 的分析可以对糖链释放后剩下的肽链进行分析或者直接对糖肽进行分析。由 于对糖肽中肽段的分析与普通蛋白中的氨基酸序列分析的过程相同，本文不 再赘述。下面就后种，即糖肽的分析进行叙述。 1 4 1 2 ，1 富集技术 糖肽是联系糖组学和基因组学的纽带，因此以糖肽为对象的蛋白质糖基 化分析具有重要意义。但是由于蛋白质糖基化的微观不均一性，糖肽在糖蛋 白的蛋白酶水解产物中的含量相对比较低，很难进行检测。因此一般在进行 其分析前要进行富集。 在h i r a b a y a s h i 等人提出来的分析策略中，用凝集素亲和柱将糖蛋白从组 织或细胞的提取液中富集起来，收集后进行蛋白酶水解，然后用同样的凝集 素柱将糖肽从水解混合物中分离、纯化【l7 ，4 l 】。得到的糖肽进行质谱分析， 另一部分进行肽糖酶( p n g a s ef ) 质谱分析确定糖基化位点。 z h a n g 等人 4 2 1 则提出了另一种相反的富集方法，即通过糖链将糖蛋白固 定在固体材料上、用蛋白酶水解糖蛋白、同位素标记糖肽、p n g a s ef 释放糖 肽上的肽，液相色谱质谱分析同位素标记的肽。这种方法是在氨基上引迸了 同位素标记，因此可以同时进行糖肽的半定量分析。 1 4 1 2 2 液相色谱分离 不论是正相色谱还是反相色谱均已应用到糖肽的分析。由于糖肽本身是 连接有糖链的肽，因此进行反相色谱分析时与普通肽相同 4 3 - 4 5 。与同样序 列的肽相比，糖肽的保留时间要短一点，而且在洗脱液中加入中性的低浓度 盐对糖肽的分离更有利【4 6 ，4 7 。用离子阱分析器得到糖肽的二级质谱图主要 1 2 n 一连接蛋白质糖基化分析用微流控芯片平台和方法研究 是糖链的碎片，要进行其肽的序列测定要进行三级质谱【4 8 】。 液相色谱尽管在几十年前已经应用在糖基化分析中，而且经过一系列的 过程如酶解、标记、富集可以进行糖基化的分析，但是发展新的糖基化的定 量分析方法依然是一个挑战。未来的目标应该是在肽与糖肽的混合物中完成 糖基化，即糖链结构和糖基化位点的定量分析。 1 4 2 凝集素亲和色谱 凝集素亲和色谱是属于液相色谱的范畴，但是由于凝集素在糖生物学中 的重要地位，使得其在进行糖组的研究特别是糖蛋白的研究中往往作为一个 独立的分析手段进行研究。由于糖链结构比较复杂，而每种凝集素只能和某 神或者某些糖链结构进行特异性的结合。为了全面她分析糖链的结构，需要 将不同种凝集素亲和色谱柱连接起来使用，出现了系列凝集素亲和色谱 ( s e r i a ll e c t i na f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y , s l a c ) 。在s l a c 中糖链或者是糖蛋白 经过一系列的凝集素柱后根据和同一凝集素的结合能力以及和不同凝集素的 结合能力分为不同的组份。s l a c 除了可以从复杂的组织或者细胞提取液中 纯化糖蛋白外以及从糖蛋白的蛋自酶水解产物中提取糖肚进行糖基化分析外 f 1 6 】，还可以对纯的糖蛋白的糖形进行分离分析1 2 0 。正如前面提到的在一些 疾病发生时，某些糖蛋白上的糖链结构会发生变化。这种糖链结构的变化如 果按照糖链结构分析策略的步骤需要将糖链释放下来进行一系列的分析，过 程繁琐、耗时长、成本高。而用s l a c 则可以根据糖形与这些凝集素结合能 力的变化来判断糖链结构的变化。s l a c 的这一特点使得科学家致力于研究 用改技术进行疾病诊断 1 9 ，2 0 ，4 9 5 1 。但是对于疾病诊断中的实际样品分 析，传统的s l a c 需要的样品量比较大、耗时比较长，很难进行推广。 最近几年出现了一些关于l a c 微型化的报道。b e d a i r 等报道了在毛细管 内原位聚合制备整体柱，将凝集素固定在整体柱材料上用于糖蛋白浓缩和分 离【5 2 】。与传统的l a c 相比较，微型化的l a c 具有快速分析、耗样量少的 特点，可能会对l a c 在疾病诊断中的应用有所帮助。总之，由于凝集素有重 要的生物学意义，不仅在分离分析中具有广泛的应用，目前已经有人提出把 第一章n _ 连接蛋白质糖基化分析进展1 3 凝集素作为一门科学进行研究。常见的n 连接糖链分析是可按其结构的选择 合适的凝集素进行分析。 1 4 3 毛细管电泳 1 4 3 1 毛细管电泳对糖形以及寡糖的分离 毛细管电泳在蛋白质糖基化研究中的应用主要表现在对糖蛋白的糖形分 布的分析【5 3 ，5 4 】和对从糖蛋白上释放下来的寡糖链的分析 5 5 1 。毛细管电泳 对糖形分离的进展主要表现在对分离缓冲液系统或者毛细管修饰的优化上 面。因此进展不是很大，目兹已经很少报道。毛细管电泳虽然是寡糖分离的 比较好的选择，但是由于寡糖不带有吸收或者发射基团，而毛细管电泳和质 谱的联用不是很普遍，因此要对寡糖进行紫外或者荧光标记进行光学检测。 用于糖链的紫外或者荧光标记的标记物有氨基吡啶、2 - 氨基苯甲酸、3 氨基 苯甲酸、3 甲基- l - 苯基2 吡唑喹啉酮、8 氨基萘- l ，3 ，6 三磺酸、8 氨基芘1 ，3 ，6 三磺酸、2 氨基呀啶酮。详细的关于毛细管电泳对寡糖的分析可以参考相关 的文献综述 5 6 1 。 1 4 3 2 毛细管电泳质谱 由于本身使用的分离缓冲液和流速的不匹配，毛细管电泳电喷雾质谱的 联用目前依然是一个挑战。因此在蛋白质糖基化的分析上的应用不多。基体 辅助激光解吸离子化时间飞行质谱( m a l d i - t o f - m s ) 具有高灵敏度( f m o l 水平) 、高的准确度、可以进行结构分析( p s d 或者q t o f ) 等特点，已经 应用到糖蛋白的分析 5 7 1 。由于毛细管电泳在进行糖或者糖复合物分离的优 势，即生物中性条件的水溶液，将毛细管电泳和m a l d i t o f m s 联用蛋白 质的糖基化分析提供一种有力的分析手段。基于毛细管电泳分离的重现性好 进行分离组分的收集，由于毛细管电泳分析的样品量与m a l d i - t o f m s 的 样品量相匹配，将收集到的组分用m a l d i t o f m s 进行分析给出糖基化的 信息1 5 8 ，5 9 1 。 1 4 n 连接蛋白质糖基化分析用微流控芯片平台和方法研究 1 4 3 3 亲和毛细管电泳 由于毛细管电泳的分离系统为水体系，因此还有种毛细管电泳的分离 模式在蛋白质糖基化中应用比较多，那就是亲和毛细管电泳。亲和毛细管电 泳进行糖蛋白的分析主要表现为一些药物重组糖蛋白与其配体之间相互作用 的研究 6 0 1 ，这种研究旨在进行重组蛋白的药效和其糖链分布的关系。还有 就是利用凝集素作为配体添加在分离缓冲液中进行糖形的分离，除了可以提 高毛细管电泳对糖形的分离效率外还可以研究糖链与凝集素的相互作用。 1 4 4 微流控芯片 在过去的十几年中，各种微芯片技术，特别是在样品消耗量的减少、高 通量分析、高的分离效率以及各种分析功能单元集成等方面大大促进了微流 控芯片技术的发展 6 1 6 5 1 。虽然从微流控芯片一开始出现，科学家们就试图 将其引入糖的分析 6 6 1 ，但是发展至今，糖的分析特别是蛋白质糖基化的分 析从中受益不多。从最初进行单糖的分离，到后来芯片与履谱联用进行糖复 合物的分析。真正做的工作并不多这主要归结于两个原因，第一目前分析 化学界和生物学界关心的焦点依然是基因组学和蛋白质组学的研究，因此对 糖或者糖复合物的研究不多；另外一个原因是由于糖的复杂性，即使是传统 的分析方法在糖的分析中的表现不足，作为一种新的分析平台，微流控芯片 在糖的分析串表现也不多。尽管鲡此，科学家对微漉控芯片在糖的分析特别 是糖基化分析中作了一些尝试。 1 4 4 1 芯片电泳 最初微流控芯片的工作是将毛细管电泳上的工作转移到芯片平台上的， 因此一开始微流控芯片上糖的分析是对一些简单的单耱或者是寡糖的分析。 尽管微流控芯片相对毛细管电泳有很多的优点如分析速度快、通量高等，并 且在基因组以及蛋白质组研究中有广泛的应用，但是由于糖分析中的诸多限 制如很多寡糖为中性并且无吸收或者发色光基团等，使得微流控芯片上糖的 第一章n 一连接蛋白质糖基化分析进展1 5 分离分析处于起始阶段。最初各种糖的检测方法如示差检测、电化学检测、 紫外检测【6 7 】以及激光诱导荧光检铡 6 8 】都在微流控芯片电泳对糖的分离分 析中有所应用【6 9 】。但是微流控芯片电泳对寡糖的分离并没有应用到蛋白质 糖基化的分析中，这是由于微流控芯片电泳基本上都是与光学检测连在一起 的，很难给出糖链结构的信息。但是由于可以在微流控芯片的通道内进行一 些反应，也就是说微流控芯片的电泳过程可以作为一个动态的反应过程。利 用这一点，f u j i i 等人利用糖基转移酶在微流控芯片电泳过程中将半乳糖连接 在乙酰氨基葡萄糖上得到氨基乳糖【7 0 】。这种过程可能会在研究蛋白质糖基 化的机理以及结构是有所启发。 1 4 4 2 微流控芯片，质谱 当代生物质谱的发展在很大程度上归功于电喷雾电离( e s i ) 和基体辅 助激光解析电离( m a l d i ) 这两种软电离技术的应用。在微流控分析系统中， 所用到的质谱检测器也主要以这两种类型为主。由于微流控芯片上液体流速 予纳米电喷雾接口相匹配，电喷雾离子化接口在微流控芯片的质谱检测中应 用最广泛。电喷雾质谱与芯片的接口主要有两种途径：一是借用毛细管电泳 与e s i 质谱的接口模式，在芯片出口处外接一段毛细管作为喷嘴或者将液流 从芯片上引入一个外连接的e s i 接口；二是直接在芯片通道末端加工出尖锐 的喷嘴结构。微流控芯片质谱主要应用在蛋白质组的研究中，在糖分析中的 应用并不多。其中能进行到蛋白质糖基化分析的工作就更少了。我们实验室 将微流控芯片电泳与质谱联接起来进行糖肽的分离和检测( 见本论文第五 章) 。另外c h e l i u s 等人【7 l 】以微流控芯片为离子阱质谱的电喷雾离子源进行 牛胰核糖核酸酶b ( r n a s eb ) 糖基化位点的检测。以r n a s eb 糖肽为分析 单元，利用离子阱质谱可以做多级质谱的特点，用此平台不仅可以得到糖肽 上的糖链的组成可序列信息( m s 2 图谱) ，还可以根据m s 3 甚至m s 4 的图谱 得到连接有糖链的肽的碎片离子的图谱，从而进行糖基化位点的检测。该方 法的缺点是微流控芯片只能作为一个质谱的离子源，而芯片的分离功能或者 其他的一些功能如样品处理等没有得到充分的利用。 1 6n 一连接蛋白质糖基化分析用微流控芯片平台和方法研究 1 4 4 3 集成化微流控芯片 前已提及凝集素亲和色谱不仅可以从生物样品中将糖蛋白亲和捕获，而 且可以根据糖蛋白中糖链与凝集素结合能力的不同进行其组成的判断【1 7 】或 者在一些疾病发时糖键结构的变化1 2 0 。以微流控芯片为基础的凝集素亲和 色谱与传统的凝集素亲和色谱相比，则具有耗样量低、分析速度快的特点。 m a o 7 2 等人利用芯片通道内以整体材料为载体固定的豌豆凝集素，对三种卵 中的糖蛋白，火鸡卵白蛋白、鸡卵白蛋白和卵粘蛋白进行以电渗为驱动力的 凝集素亲和色谱，利用不同浓度的半抗原单糖( 甲基甘露糖) 洗脱，成功将 三种糖蛋白根据其带有糖链的结构不同而分为不同的组分。 1 4 5 质谱 目前在蛋白质糖基化研究中遇到的主要问题是样品量少、样品复杂、化 学修饰等问题。但是随着现代化分析技术的发展，蛋白质糖基化分析的研究 有了很大的进展。质谱与其它现代化分离技术的联用已经成为糖基化分析的 有力工具。与传统的分析技术相比，质谱具有耗样量少、灵敏度高等特点。 快原子轰击质谱( f a s ta t o mb o m b a r d m e n t m a s ss p e c l 口o m e t r y , f a b m s ) 在寡糖 分析中广泛应用，不仅能给出寡糖的分子量，还可以提供寡糖的序列以及分 支结构信息 7 3 7 5 】。目前两种主要商品化的软离子化技术，电喷雾质谱 ( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n m a s ss p e c t r o m e t r y , e s i m s ) 和基体辅助激光解吸离子 化质谱( m a t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y , m a u ) i m s ) 有逐渐代替f a b 的趋势。m a l d i m s 和糖苷水解酶以及离子 源后裂解( p o s ts o l l r c ed e c a y ) 或者四级杆时间飞行结合起来可以进行糖链结 构的快速分析【7 5 7 8 】。电喷雾离子源和碰撞诱导解离( c o l l i s