（遗传学专业论文）酿酒酵母高得率菌株的构建及发酵工艺优化的研究.pdf

浙江大学硕士毕业论文 摘要 本文从二倍体酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v y s y a e ) 菌株c 1 出发，利用 随机孢子分析得到了单倍体c 1 - 系列菌株鹊株并进行了发酵效率测定。根据本 实验室获得的最优原生质体截备条件，以e 卜2 5 、c l 一8 8 、c l 一8 4 、e 卜1 4 、c l 一1 8 、 c 卜7 4 、c l - 5 9 七个高发酵效率单倍体菌株进行自身原生质体融合和筛选，获得 了7 个融合子c 2 c 8 ，经形态观察、细胞大小测量和d n a 含量测定，初步断定 它们是二倍体融合子。对这些菌株进行耐高渗压酒精发酵能力的测定分析，发现 c 7 、c 8 的酒精发酵能力明显高于对照菌株c 1 。3 34 c 发酵温度，小麦糖化醪糖度 2 4 0 b x 的条件下进行边糖化边发酵，c 7 、c 8 经过7 2 h 的无氧发酵后酒精度达 1 1 5 ( v v ) ，糖转化率达9 6 ，这比对照菌株c l ( 酒精度为1 1 o ( v v ) ，糖转 化率8 7 ) 有更高的产酒精能力。此外，又对c l 、c 7 、c 8 进行了酵母种子连续 多次使用发酵实验，通过优化确定了2 0 0 b x 、2 5 0 b x 糖浓度小麦糖化液，p h 6 0 ， 温度3 3 。c 的发酵条件，经1 0 批三角瓶和中空纤维膜超滤系统耦合生物反应器的 高密度酵母高浓度酒精发酵试验，结果表明连续多次发酵中酵母细胞产酒精能力 比较稳定，能够循环使用发酵。 实验结果显示：筛选到的二倍体菌株c 7 、c 8 菌株与亲株c 1 相比在耐高渗压 能力、耐酸能力及耐酒精能力等方面有较大幅度提高，并且随着核倍性的增加有 增强的趋势，而且它们都适应连续多次使用酵母工艺。 关键词：酿酒酵母育种原生质体融合发酵效率高产酒率耐高渗压 连续发酵超滤系统 浙江大学硕士毕业论文 c o n s t r u c t i o no fh i g he t h a n o l 。y i e l d i n gy e a s ts t r a i n s a n dt h eo p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o np r o c e s s a b s t r a c t h a p l o i ds t r a i n sc 1 2 5 ，e l 一8 8 ，c 1 8 4 ，c 1 一1 4 ，c l 1 9 ，c l 一7 4 ，c 1 5 9w e r e o b t a i n e df r o m 5 盆c c h a r o l z y c e sc e r e v i s f a es t r a i nc 1b yt h eo p t i m u m s p o r u l a t i o nc o n d i t i o n s ，a n df e r m e n t a t i o na c t i v i t yo ft h e mw a sa n a l y z e d a f t e rp r o t o p l a s tf u s i o na n ds t e pb ys t e ps c r e e n i n gp r o c e s s ，s e v e nd i p l o i d f u s i o n ss t r a i n sw e r es e l e c t e de v e n t u a l l y a f t e rf e r m e n t a t i o na c t i v i t yo f t h e s ef u s i o n sw a sa n a l y z e d ，t h er e s u l ts u g g e s t e dt h a to s m o p h i l i ct r a i t s a n de t h a n o 卜p r o d u c i n gc a p a b i l i t i e so fc 7 ，c 8w e r eb e t t e rt h a nc 1 a f t e r s e v e n t y - t w oh o u r sf e r m e n t a t i o ni nt h es a c c h a r i l i e dw h e a ts t a r c hm e d i u m c o n t a i n i n g2 4 0 b xs u g a ra t3 3 6 c ，t h ea l c o h o ld e g r e eo ft h ef e r m e n t e dm a s h r e a c h e d 儿5 ( v v ) a n dt h ec o n v e r s i o nr a t ew a s9 6 b e s i d e s ，w ea c q u i r e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ( 2 0 。b x 、2 5 0 b xs u g a r ，p h 6 0 ，3 3 ) o fc o n t i n u o u s f e r m e n t a t i o n w h i c hw e r ep e r f o r m e db yt h el 9 ( 3 4 ) o r t h o g o n a ld e s i g n e x p e r i m e n t c o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o no fc 1 ，c 7 ，c 8w a sc a r r i e d o u tb yu s i n g c e l lr e c y c l es y s t e mi nt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s t h er e s u l to fc o n t i n u o u s f e r m e n t a t i o ns u g g e s t e dt h a tt h ee t h a n o l p r o d u c i n gc a p a b i l i t i e sa n dt h e v i a b “i t yo fe e l lw a ss t a b i l e a sf a ra st h es e l e c t e ds t r a i n s ( c 7 ，c 8 ) w e r ec o n c e r n e d ，t h et r a i t so f e t h a n o l - t 0 1 e r a n e e ，b e i n go s m o p h i l i ca n dp r o d u c i n ge t h a n o lw e t eb e t t e r t h a nc 】，t h ea n a l y s i sa l s os h o w e dt h a tt h e s ea b i l i t i e se n h a n c e db yt h e n u c l e a rm u l t i p l o i d yi n c r e a s i n g k e yw o r d ：s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e , b r e e d i n g ，p r o t o p l a s tf u s i o n f e r m e n t a t i v ee f f e c t i o n ，o s m o p h i l i ct r a i t s ，c o n t i n u o u s f e r m e n t a t i o n ，e e l lr e c y c l es y s t e m 4 浙江大学硕士毕业论文 前言 酒精，化学名为乙酵，分子式为c h 。o h ，属于一种分子结构简单的醇类，是 以玉米、小麦、薯类或糖蜜等材料为原料，经发酵和蒸馏而制成。作为一种无色 透明的液体，酒精具有很强的挥发性和刺激性气味，极易燃烧成c o s 和心0 ，同时 放出大量的热量。化学性质上，酒精十分活拨，可与水、醇类、乙醚、苯、甘油 等有机溶剂混合，也可与多种金属盐类、碳氢化合物、脂肪酸等起化学反应，是 许多化工产品如乙酸、乙醛、丁醇和乙烯的生产原料。 在国计民生中，酒精工业占有重要的位置，在医药、化工、食品、农业及国 防工业都有广泛的应用。酒精在世界上不仅可作为饮料，还是一种绿色燃料，更 是一种战略物资，世界上2 3 的酒精被用作燃料( 黄宇彤，2 0 0 1 ) 。虽然燃料工 业和有机化工工业仍然以矿物原料( 石油和天然气) 作为主要原料，但就目前全世 界的石油消耗速度以及可开发的原油储量来计算，到2 l 世纪中期时石油资源的供 应将会逐渐萎缩。自2 0 世纪7 0 年代发生石油危机以来，人们目益关注可再生资源 的利用，2 0 世纪9 0 年代，人们认识到酒精是最具发展潜力的替代品，将酒精进一 步脱水再加上适量汽油后可以制成变性燃料酒精。燃料酒精为液态燃料和化工原 料提供了一种有充足选择余地的新能源，因此采用农作物原料发酵生产无水酒精 全部或部分替代汽油应用前景广阔。 发展燃料酒精这项技术在国外已十分成熟。燃料酒精在美国、巴西等国家已 成功地使用了多年，产量位居前2 位的国家是巴西和美国。美国和西方的一些国 家已经普遍使用添加了酒精的汽油。用发酵法生产的燃料酒精，具有和矿物燃料 相似的燃烧性能。但其生产原料来源于生物物质，属于可再生原料。此外，酒精 燃烧过程所排放的一氧化碳和含硫气体的量均低于汽油燃烧时的排放量，所产生 的二氧化碳和作为原料的生物量生长历消耗的二氧化碳的数量基本持平，这对减 少大气污染及控制“温室效应”有重要意义，因此，燃料酒精被称作“清洁燃料”。 我们国家酒精在燃料方面的应用尚未形成规模。为此，中国政府正大力推进 燃料酒精研究计划的进行，2 0 0 1 年我国已经将“大力发展燃料酒精”产业列入“十 五”计划当中，并在国民经济和社会发展第十个五年计划纲要中做了明确的 要求。国务院已批准在东北、中原等粮食基地建设几个十万吨以上的无水酒精生 产基地，并在交通运输行业中推广使用燃料酒精。生产和使用燃料酒精在一定程 浙江大学硕士毕业论文 度上不但缓解了石油供求矛盾，而且扩大了玉米、小麦等原材料消费市场，带动 农业生产和增加农民收入。另外，燃料酒精的使用还有效降低了汽车尾气中有害 气体的排放，改善了环境和空气质量( 章克昌，2 0 0 0 ) 。 目前，发酵生产工业酒精的菌种主要以酵母菌为主。通过糖酵解途径，酵母 菌将葡萄糖高效转化为乙醇和二氧化碳，生产的酒精占理论产量的9 0 一9 5 ( 章 名春，1 9 8 4 ；周德庆，1 9 9 3 ) 。酵母菌的种类很多，酒精工业生产上常用的酵母 菌属于真菌门( e u m y c o t a ) ，子囊菌纲( a s c o m y c e t e s ) 、半子囊菌亚纲 ( h e m i a s c o m y c e t e s ) 、酵母目( e n d o m y c e t a l e s ) ，酵母科( s a c c h a r o m y c e t a c e a e ) 。 大多数用于酒精发酵的酵母菌都属于酵母属( s a c c h a r o m y c e t a c e ) 的酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v f s i a 曲、卡尔斯伯酵母( s a c c h a r o m y c e sc a r l s b e r g e n s i s ) 、 清酒酵母( s a c c h a r o m y c e ss a k e ) 及其变种。工业上常用的酒精发酵菌株有k 字酵 母、南阳1 3 0 0 酵母、南阳1 3 0 8 酵母、拉斯2 号、拉斯1 2 号、古巴i 和古巴1 1 等等， 均属于酿酒酵母。酒精生产中对酵母菌菌株的生理特性有一定的要求：( i ) 发酵 力强而且迅速，有较强的酒化酶；( 2 ) 繁殖速度快，有较强的增殖能力；( 3 ) 耐酒 精能力强，能在较高浓度的酒精发酵醪中发酵；( 4 ) 耐高温性能好，能在较高温 度下发酵；( 5 ) 抵抗杂菌能力强；( 6 ) 耐酸能力强；( 7 ) 生产性能稳定，变异性小， 发酵时产生泡沫少。 酵母菌能利用的原料有限，因此寻找可以利用更多原料的菌株是酒精发酵研 究的一个发展方向。目前可利用的原料主要有三类：( 1 ) 糖质原料，包括甜菜、甘 蔗、瓜千、糖蜜、乳清和甜高梁等等。( 2 ) 淀粉原料，包括玉米、小麦、木薯、 马铃薯等等。( 3 ) 纤维素和半纤维素产品，包括甘蔗渣、农作物废料、林产品等 等( 章克昌，1 9 9 5 ) 。各国根据本国的实际情况选用不同的原料来进行发酵，如 在巴西主要利用甘蔗汁和废糖蜜生产酒精，而在美国则更多的是采用玉米为原 料，目前我国主要用玉米、小麦比较普遍。 在酵母菌代谢生成酒精过程中，研究人员对何种条件下酵母菌能最大产量地 形成酒精以及在高浓度酒精中酵母菌的耐受性等问题极为关注。在酒精发酵过程 中，发酵醪中的酒精逐步积累，当发酵液中酒精浓度高达1 0 1 1 ( v v ) 时， 酵母菌发酵生产酒精的能力便受到抑制，因为过高的酒精浓度会抑制细胞的生 长、存活和发酵( b o u r r e trb ，1 9 8 9 ) 。此外，酒精工业生产中总想提高发酵 浙江大学硕士毕业论文 醪盼初始糖浓度，这样可以提高生产效率，这就要求生产用酵母在发酵前期耐高 渗透压，在发酵后期耐高酒精度，同时还应有较快的发酵速度。 纵观国内外文献，提高酒精得率不外乎探索新发酵工艺和选育高产酒精酵 母，培育出酒精产量高并能耐受高浓度酒精的新菌株。长期以来，耐高温高产菌 株的选育主要集中于从自然界或已知能产酒精的酵母中分离筛选或将从自然界 分离得到的菌株经高温驯化、诱变处理后再从中筛选。随着基因工程技术的不断 成熟，采用基因工程技术构建高产酒率酿酒酵母菌株的研究报道也屡见不鲜。这 种工程菌的出现，可简化发酵工艺和设备，减少能耗，运用前景十分广泛。自 1 9 7 7 年s i p i c z k i 与f e r e n e z y 首次实现酵母菌原生质体融合以来( s i p i c z k iml ， 1 9 7 7 ) 该技术已经成为一项重要的育种技术。原生质体融合技术是指两种不同的 亲株酶法去壁后得到的原生质体，置于高渗溶液中，在一定融合剂的促融作用下 使两者相互凝集并发生细胞之间的融合，经细胞质的完全融合，直至基因组的交 换重组，产生众多的重组子，从中筛选出目的重组子。与其他育种技术相比，其 具有杂交频率较高、受接合型的限制较小和遗传物质更为完整，并且存在着两株 以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性等优点，提高菌株产量和品质的潜力 较大( 魏运平，2 0 0 3 ) 。我国早在1 9 9 0 年将产酒率高但不耐热的酵母与耐热但产 酒率低的酵母菌株进行种间或属间的原生质体融合( 方霭祺，1 9 9 0 ) ，选育既耐 热又具有高产酒精的融合子从而得到几株耐高温、高产酒精的菌株。我们实验室， 经过长期高渗压高酒精浓度戮化、诱变育种和原生质体融合相结合的方法( 曾云 中a ，1 9 9 2 ) ，成功地选育到一株耐高渗压高产酒精酵母菌株c 1 ，它耐高糖浓度 产高浓度酒精的能力明显优于普通菌株，并在生产上推广应用。本文从c 1 菌株 出发，通过产孢分离得到一批单倍体菌株，并进行了单倍体核倍性融合株的构建， 获得了耐酸能力，耐酒精能力以及耐高渗透压能力有较大幅度提高的二倍体融合 株c 7 、c 8 。 传统的酒精发酵工艺主要是采用间歇式发酵，即边糖化，边发酵( 双边发酵) ， 其发酵周期很长，酒精生产强度低( 管斌a ，1 9 9 7 ) 。近年来，酒精发酵工艺研 究有相当的发展，酒精连续发酵法和固态发酵工艺已日益引起人们的重视。在连 续发酵工艺方面，研究者在固定化酵母发酵，真空发酵法，熔剂萃取法，薄膜分 离法和菌种循环法进行大量研究，但这些方法主要还处在实验阶段，还无法满足 7 浙江大学硕士毕业论文 大规模生产要求，发酵过程中，菌种活性难以维持长期生产，菌种对不利环境的 适应性弱，易造成酵母活性退化，而且半开放系统难于避免污染，糖不能彻底耗 尽，这导致糖转化率比较低，生产成本很高( 吕欣，2 0 0 3 ) 。本文针对现有发酵 工艺的缺点首先对培养条件进行了优化找出了最佳培养条件，然后探讨了在连续 多次无氧三角瓶发酵中酵母的生存发酵能力，并运用安玛西亚公司中空纤维膜超 滤系统过滤发酵液保持高细胞浓度进行发酵罐上连续高密度高产率发酵试验( b gp a r k ，1 9 9 9 ) ，希望获得一种生产上能够长期应用的高效简化发酵工艺，从而 减少成本，提高酒精产量。 浙江大学硕士毕业论文 1 菌株 材料与方法 本文所用的菌种都为s a c c h a r o m y c e sc e r e v f s f a e ，其菌株见表l 。 表l 用于实验的菌株 2 培养基 2 1 完全培养基( y e p d ) 1 酵母提取物 2 2 预产孢培养基( p s m ) 0 2 5 酵母提取物 p h 6 0 2 3 产孢培养基( s p m ) 1 k a c 2 葡萄糖2 蛋白胨 2 葡萄糖 2 5 m g lz n s 0 4 7 h , o ( 张晋，2 0 0 0 ) 5 0 2 0 0 m g lz n 7 h 2 0 0 1 k 也p o 。0 - 0 1 葡萄糖 p h6 0 2 4 甘油培养基( 夏淑兰，1 9 9 8 ) 3 甘油0 0 1 酵母膏 0 5 4 ( n h ；) 2 s o , 0 0 1 n a c l 0 1 k h 。p 0 。p h5 0 2 5 完全高渗培养基( y e p d s ) y e p d + o 7m o l lk c l 2 6 一级种子培养基 9 5 0 2 0 0 址g l 肌醇 0 - 0 1 酵母膏 0 0 5 m g s o 。7 1 - 1 2 0 0 0 1 c a c 2 浙江大学硕士毕业论文 t 2 0b x 小麦糖化醪0 5 筠硫酸铵 0 0 5 磷酸二氢钾0 0 0 5 硫酸镁 2 7 二级种子培养基 1 4 。b x t j 、麦糖化醪0 5 硫酸铵 0 0 5 磷酸二氢钾o 0 0 5 硫酸镁 2 8 小麦糖化液发酵培养基 1 8 2 5 。b x 、麦糖化醪p h 6 0 2 9 基本培养基：( m m ) ( 曾云中b ，1 9 9 2 ) 0 3 ( n h ；) ：s 0 40 0 7 m g s o d 7 h 。0 0 0 4 9 6c a ( n 。1 ) ：0 1 k h , p o , 2 葡糖糖0 2 泛酸 0 2m g i n l 吡多醇0 0 0 2m g m l 生物素 2 1 0 上罐浓缩培养基：3 0 。b x ( 小麦糖化液+ 葡萄糖) ， 分别灭菌，用时混合，加适量消化剂。 0 5 n a c l p h 6 0 0 5 n a c l p i t 6 0 0 ，0 5 n a c l 0 0 1 k 2 l j p o , 0 + 2 m g m l 硫胺素 p t j 6 0 0 1 ( n t 。) 。s o ，分别配制 2 1 1 上罐起始发酵培养基：1 0 。b x 小麦糖化液，2 酵母提取物，2 蛋白胨，加适 量消化剂。 ( 以上培养基加1 5 的琼脂粉即为固体培养基，在0 8 0 9k g c m z 压力条件 下高压蒸汽灭菌2 0m i n 后用于制备斜面和平板。) 3 试剂 3 10 8 5 氯化钠溶液( 生理盐水) ( 0 8 o 。9k g c m 2 压力下高压蒸汽灭菌2 0r a i n ) 3 2 柠檬酸一磷酸缓冲液( c p b ) ( 杨景山，1 9 9 0 ) 0 1m o l l 柠檬酸 0 2r m l ln a 2 h p 0 l ( 0 8 0 9 k g c m 2 压力下高压蒸汽灭菌2 0m i n ) 3 3 高渗柠檬酸一磷酸缓冲液( k c l + c p b ) ( 李建武，1 9 9 4 ) c p b + 0 7m o l lk c l 1 0 浙江大学硕士毕业论文 ( o 8 o 9 k g c m 2 压力下高压蒸汽灭菌2 0m jn ) 3 4 蜗牛酶 使用前用高渗c p b 缓冲液配制，0 4 5um 滤膜抽滤灭菌 3 5 无菌水( 0 8 o 9 k g c m 2 压力下高压蒸汽灭菌2 0m i n ) 3 60 o l 0 1 mb 一巯基乙醇( b i j e ) 缓冲液( 高渗c p b 配制，p h6 0 ) ，内含 5 0m m o l le d t a n a 2 3 7 脱壁预处理试剂( d w p g ) 0 0 8m o l lt r i s h c lp h9 3 ，0 5m o l le d t ap h9 0 ，0 0 0 2m o l lb m e 3 80 4m o l lc a c l 2 ( 0 8 0 9 k g c m 2 压力下高压蒸汽灭菌2 0m i n ) 3 9 0 7m o l lk c l ( o 8 0 9 k g c m 2 压力下高压蒸汽灭菌2 0m i n ) 3 1 03 5 p e g ( m w = 4 0 0 0 ) 使用前用高渗c p b 配制，内含0 0 1m o l lc a c l 。，用o 4 5 l am 滤膜抽滤灭菌 3 “小麦( 山东) ，面粉( 杭州东南面粉厂) 3 1 2 磷酸缓冲液 0 1 m o l l ，p h7 0 ，n a 2 h p o , ( o 8 0 9 k g c m 2 压力高压蒸汽灭菌2 0m i n ) 3 1 35 0m m o l lt r i s - h c l ( p h7 4 ) ，2 0m m o l le d t a 缓冲液 ( 0 8 o 9 k g c m 2 压力下高压蒸汽灭菌2 0m i n ) 3 1 4 斐林试剂 甲液：称取3 5 克硫酸铜，0 0 5 克次甲基蓝，用水溶解并稀释至1 0 0 0 毫升。 乙液：称取1 1 7 克酒石酸钾钠，1 2 6 4 克氢氧化钠，9 4 克亚铁氰化钾，用水 溶解并稀释至1 0 0 0 毫升。 3 1 50 1 标准葡萄糖溶液 准确称取1 克无水葡萄糖( 预先于1 0 0 1 0 5 烘干) ，用蒸馏水溶解，加5 毫升浓盐酸，用水定容至1 0 0 0 毫升。 3 1 6 = 苯胺反应试剂 a 液：1 0 0m l 冰乙酸中依次加入1 0g 二苯胺和l om l 高氯酸，低温避光保存； 浙江大学硕士毕业论文 b 液：1 6 乙醛溶液 测定时分别取2 0 0m la 液和0 i m lb 液，混匀即可使用 3 1 7 液化酶7 0 0 0 0u n i t m l ，华润集团 3 1 8 糖化酶1 0 0 0 0 0u n i t m l ，华润集团 3 1 91m o l l 山梨醇( o 8 0 9i g c m 2 压力下高压蒸汽灭菌2 0m i n ) 3 2 0t e 缓冲液 1 0m m o l lt r i s - h c l ，1m m o l le d t a ，p h7 4 ( 0 8 o 9 k g c m 2 压力下高压蒸汽灭菌2 0m i n ) 3 2 l2 0 s d s ( 0 8 o 9 k g c m 2 压力下高压蒸汽灭菌2 0m i n ) 3 2 25m o l l 醋酸钾( 0 8 o 9 e g c m 2 压力下高压蒸汽灭菌2 0m i n ) 3 2 33m o l l 醋酸钠( o 8 0 9 k g c m 2 压力下高压蒸汽灭菌2 0m i n ) 3 2 4 异丙醇 4 主要设备与器材 4 1 台式离心机，t g l - 1 6 c ，上海安亨科学仪器厂 4 2 糖液计，o 1 0 ，i 0 2 0 ，浙江余姚芝林玻璃仪器厂 4 3 酒精计，o i 0 ，1 0 2 0 ，浙江余姚仪表 4 4l e n g g u a n g 一7 2 2 分光光度计，上海精密科学仪器有限公司 4 5 电热恒温水槽，d k - 8 b ，上海精宏实验设备有限公司 4 6 落地恒温振荡器，l i z 一9 3 1 1 k 、h z 一2 0 1 0 k ，太仓实验仪器厂 4 7 电热压力蒸汽灭菌器，z d x 一3 5 b i ，上海申安医疗器械厂 4 8 发酵罐，k l f - 2 0 0 0 型，总容量3 7 l ，b i o e n g i n e e r i n ga gd e s i g na n d m a n u f a c t u r eo fm i c r o b i o l o g i e a lp l a n t sc h8 6 3 8 w a l ds w i t z e r l a n d 4 9 电子天平，m e t t l e rp m 4 6 0 4 1 0 显微镜，x s j l 4 1 1 血球计数板，x b k - 2 5 ，上海医用光学仪器厂 4 1 2 中空超滤系统，l m m 内径，5 0 0 k d 孔径，9 4 c m 2 膜面积，安玛西亚公司 浙江丈学硕士毕业论文 5 糖化醪制作方法( 双酶法) 将小麦：面粉= l ：9 混合物和p h 6 0 的水按照l ：3 的料水比搅拌均匀，浸泡 3 0m i n 。高温蒸煮，使淀粉初步糊化，当温度升至5 0 6 0 。c 时每克淀粉加l o 个 单位液化酶。继续蒸煮至1 0 0 后，加压闷煮l 小时使淀粉完全糊化。冷却至 9 5 时加液化酶1 5u g 淀粉，彻底液化。冷却至6 0 时加糖化酶3 0 0 u g 淀 粉，并在5 5 水浴条件下糖化1 8 2 4 小时，两层纱布过滤得滤液即小麦糖化 液。 6 还原糖测定 准确吸取斐林氏甲、乙液各5 毫升，置于1 5 0 毫升三角瓶中，加水2 0 m l ， 加检液和标准葡萄糖溶液接近终点，混匀后，簧于有石棉网的电炉上加热至沸， 并保持沸腾2 m i n ，然后立即加入o 5 次甲基蓝溶液2 滴( 此时应呈蓝色，若为 红色，即示加入检液过量，应重新滴定) ，于沸腾状态下，在l m i n 内徐徐滴入标 准葡萄糖溶液，并不断轻微摇动，直至检液蓝色消失呈现红色时为终点，全部滴 定操作应在3 m i n 内完成，计算检液还原糖浓度。( 胡嗣明，1 9 8 7 ) 7 单倍体的获得与鉴定 将菌株接种于y e p d 固体斜面2 8 c 活化两次，转接至y e p d 液体培养基中，培养 1 8 h ，收集菌体，用无菌水洗两次，再接种于预产孢培养基2 5 。c 培养l o h ，转接适 当的产孢培养基，培养5 7 天镜检观察。收集c 1 菌株在产孢培养基上的产物，用 无菌水水洗后，悬浮于0 0 1m o l lt r i s ( p h 为8 0 ) 溶液中，使之浓度约为 1 0 9 c e l l m l 。加入最终浓度为2 的蜗牛酶，在含有0 o l m o l l b 一巯基乙醇条件 下，于3 7 。c 缓慢振荡1 6h ，然后将所得的细胞离心，并悬浮在0 o l m o l lt r i s 溶液中，适当稀释后，涂布于y e p d 平板。在其倒置盖上放入含有乙醚的滤纸，置 于充满乙醚的密闭容器中，室温下静置1 5m i n ，重复上述操作。取出平板，除去 滤纸，打开倒置盖，以除去残留的乙醚，然后将处理好的平板放置于2 5 c 下培养 2 4h ，挑出小菌落移至y e p d 斜面上，适当温度培养2 天，再将这些菌落接入甘油 培养基去除呼吸缺陷型菌株，据表2 确认单倍体，并与标准单倍体y 3 0 、y 2 9 进行 接合实验以确定其交配型，测定细胞大小，并按下列公式计算其体积。( 张冬妮， 浙江大学硕士毕业论文 1 9 9 4 ；张晋，2 0 0 0 , s h e r m a nf ，1 9 9 6 ) 公式l ： v = 1 6 j i a b 2 或v - l 6 j i c 3 ( 其中：v = 细胞体积，a = 细胞长轴，b = 细胞短轴，c = 细胞直径) 表2酵母单倍体与二倍体的区别 8 单倍体发酵力的测定及发酵效率的计算 将待测菌株于y e p d 斜面活化两次，接入l o m l 一级种子液，3 0 c 试管培养2 0 小时至对数期，全部接入9 0 m l2 0 0 b x 的小麦糖化液发酵培养基，3 3 培养至7 2 小时，每隔1 2 小时测c 0 ：失重。由于理论上1 克葡萄糖的量可产生0 4 9 克c 如，发酵 效率的计算按公式。 发酵效率= 7 2 h 后c 倪失重量( 培养基中葡萄糖的量0 4 9 ) 1 0 0 9 原生质体制各、融合及融合株的检出 将菌株在y e p d 斜面上3 0 c 活化两次，接入2 0 m ly e p d 液体培养基上，3 0 振荡培养至对数期，取7 m l 菌液3 0 0 0r m i n 离心5m i n ，无菌水洗两次，柠檬 酸一磷酸( c p b ) 缓冲液洗一次，加含有0 o l m o l lb 一巯基乙醇的c p 8 缓冲液l m l ， 2 8 预处理3 0 m i n ，4 0 0 0 r m i n 离心4 m i n ，弃上清液，加入2 8 预温的2 蜗牛 酶3 m l ，2 8 ，振荡培养l h 。镜检9 0 以上的细胞形成原生质体后，3 0 0 0 r m i n 离心，用0 7 m o l lk c l 的c p b 缓冲液洗两次，离心收集原生质体。将所制备的 原生质体用0 4 m o l lc a c l 。洗两次，0 7 m o l lk c l 洗一次，再加入等体积的 3 5 p e g 融合试剂，3 0 水浴4 5 m i n 。用内含0 7 m o l lk c l 的c p b 缓冲液离心洗 涤两次，取适量稀释涂布于高渗培养基y p d s 平板，2 8 c 培养3 5 天。将直径明 显大于周围菌落的单菌落接种于y p d s 斜面2 8 。c 培养，每隔2 4h 转接一次，以 1 4 浙江大学硕士毕业论文 促进核融合，经1 0 代以上传代后，测其d n a 含量和细胞大小( 参见单倍体细胞 大小测定) ，以确定融合株。( 文铁桥，1 9 9 9 ；左小明，1 9 9 1 ：张晋，2 0 0 0 ) 1 0 细胞总d n a 含量测定 接种细胞于2 5m l 的y e p d 液体培养基中，2 8 静置培养1 3 小时至对数生长 期，取2 m l 培养液5 0 0 0r p m 离心3m i n ，弃上清液；将细胞悬浮于i m l1m o l l 的山梨醇缓冲液中，加2m 11 5 的蜗牛酶，3 7 水浴保温3 0m i n ，5 0 0 0r p m 离心3m i n ，弃上清液；悬浮细胞于im l 的t e 缓冲液( 1 0m m o l lt r i s h c i ，l m m o l le d t a ，p h7 4 ) ，加入o 0 5m l 的2 0 s o s ，充分混匀，6 5 水浴保温 2 0m i n ，再加入1m l5m o l l 的醋酸钾，混匀冰镇3 0m i n ；i 0 0 0 0r p m 离心5m i n ， 将上清液转移至洁净的小管，加入1 5m l 的异丙醇，处理至少5m i n ；室温离 心，倒掉上清液，将沉淀风干2 0 3 0m i n ；将d n a 悬浮于0 5m l 的t e 缓冲液 中；加入o 1m l 的醋酸钠和o 5m 1 的异丙醇，混匀，室温离心，弃上清液；加 入0 3m 1 的r n a s e ，3 7 保温3 0m i n ，加入等体积的异丙醇，慢慢振荡，离心， 将沉淀悬浮于o 5m 1 的t e 缓冲液中备用。采用二苯胺显色法，取lm ld n a 溶 液，加入2 ( n l 新鲜配制的无色二苯胺试剂( 用之前i 0 0m l 溶液加2m li 6 的 乙醛溶液) ，混合后6 0 水浴保温6 0m i n ，直至混合溶液反应成蓝色，冷却后 于5 9 5d e n 波长处用7 2 2 型紫外分光光度计测定0 d 值( 以d n a 标准溶液为对照 作d n a 标准曲线) ，计算待测菌株的d n a 含量。( 张劲松，2 0 0 4 ；f a n g j e n ，1 9 9 2 ) 1i 融合菌株产酒率及葡萄糖转化能力的测定 i i i 产酒能力测定 将待测菌株经过斜面传代培养验证稳定性后，筛选产酒率高的菌株接种到种 子培养基上培养，当细胞数目达到1 1 0 9 c e l l m l 时候即对数生长期时，按照 发酵培养基体积的1 0 的接种量接到小麦糖化醪培养基中，静置培养，当细胞 数目达到( 1 2 ) x i 0 8 c e l l m l 的时候，将纱布换成发酵栓发酵7 2 小时，期 间每隔1 2 h 称重一次，记下减轻的重量，求出c o , 失重量。称量1 0 0m l 发酵后 的培养液，加水至2 0 0t n l 蒸馏出1 0 0m l 的酒精，酒精计测量出酒精度( v v ) ， 在通过酒精生产分析检验附表查出质量百分比浓度( g l o o m l ) 浙江大学硕士毕业论文 1 1 2 转化效率按照以下公式计算 本文中提及的转化率计算都是以c 倪失重量为依据。 葡萄糖转化率( ) = 实际c o , 失重量理论c o 。失重量1 0 0 理论c 0 ：失重= ( 接种量糖度+ 发酵培养基量x 糖度) 0 4 9 ( g ) 实际c o , 失重= 营养生长阶段c o , 失重量+ 发酵阶段c o 。失重量( g ) 产酒率( ) = 酒精度( g l o o m l ) x 发酵液体积( m 1 ) ( 接种量糖度+ 发酵培莽基量x 糖度) o 。5 1 1 2 培养基优化及连续多次使用酵母发酵工艺研究 1 2 i 最佳培养条件正交试验 按l 。( 3 4 ) 正交表进行起始糖浓度、其他营养物质y p d ( 1 酵母提取物、2 蛋 白胨、0 5 n a c i ) 、p h 、发酵温度4 因子3 水平正交试验，每组重复3 瓶。发酵 培养基装量2 2 5 m l ，接种2 5 m l ，装发酵栓静置无氧发酵7 2 h ，记录实验结果。正 交试验后对葡萄糖和小麦糖化液两种糖源进行比较，进一步确定最佳发酵条件。 1 2 2 连续多次使用酵母发酵工艺研究 1 2 2 l 三角瓶连续多次使用酵母发酵试验 以小麦糖化液为培养基，低温保藏菌株斜面活化后再通过级二级种子培养 基活化，以发酵条件优化获得的最佳培养条件进行酒精发酵，2 5 0 m l 三角瓶发酵 培养基装量1 5 0 m l ，接种量1 0 ，装发酵栓静置无氧发酵，7 2 h 后倒出发酵清液 1 5 0 m l 测酒精度、表观糖度、还原糖、p h ，并用相同发酵培养基补回原体积继续 静置无氧培养，连续发酵1 0 批观察酵母发酵活力和糖转化率。 1 2 2 2 发酵罐连续多次使用酵母发酵试验 根据摇瓶发酵获得的结果，运用安玛西亚中空纤维膜超滤系统对酒精发酵工 浙江大学硕士毕业论文 艺进行研究，在每次发酵至终点时，用中空纤维膜超滤系统过滤出发酵液，在菌 液浓缩至一定浓度时补新鲜培养基( 以补料后细胞浓度达到2n1 0 8 c e l l m l 为 准) 。在给予一定通氧和营养物质的活化后，进行无氧酒精发酵，重复本次实验 1 0 批，测定酒精度，考察酵母的循环利用情况及其活力恢复能力，在保持一定 的发酵率和发酵时间的情况下，考察连续多次使用酵母发酵的可能性。 发酵罐参数控制：低温保藏菌株通过斜面、一级二级种子培养基活化。发酵 培养基为上罐起始培养基与浓缩补料培养基，p h 5 5 6 0 ，温度3 3 。c ，搅拌速 度3 0 0 r m i n ，进行无通气发酵，每隔2 h 取样，进行细胞计数、算出芽率( 出芽 细胞数总细胞数) 、测还原糖、酒精度，观察细胞形态，测定生长动力学曲线。 塑垩查兰堡圭兰些堡奎 一、单倍体的获得及分析 结果 1 单倍体的获得以及形态大小特征 利用产孢培养基进行产孢培养，获得c 1 的单倍体8 8 株，进行了细胞的大小 测定以及形态的观察，并将所得的单倍体分别与标准接合型的单倍体菌株进行接 合实验，观察是否有哑铃型细胞的产生以确定其接合型。结果见表3 。 表3部分单倍体菌株的形态大小及特征 菌产孢培细胞直径细胞体积出芽核倍 株养基( m )( 1 t m 3 )情况性 浙江大学硕士毕业论文 2 单倍体发酵力的测定及发酵效率的计算 将二倍体菌株c 1 和c 卜系列单倍体进行了3 3 发酵力的测定，测定c 0 2 失 重并通过公式计算各菌株的发酵效率，见表4 。 菌株 c 1 c i 一1 3 c l 一2 7 c 1 7 6 c l 一5 6 c i 一2 5 c l 一5 9 c 1 8 8 c l 一4 7 c 1 1 4 c l 一3 5 c l 一6 8 c 1 8 4 c 1 5 3 c 1 1 9 c l 一2 c 1 7 4 表4 各单倍体发酵效率比较 _ _ _ _ - _ - _ - _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 一 3 3 c o z 实际产量( g )发酵效率 7 5 2 7 2 5 6 1 5 7 4 8 6 8 9 7 5 1 7 6 2 7 5 2 6 6 2 7 。5 3 6 1 7 7 3 7 7 5 4 7 5 0 7 5 3 6 9 5 7 5 8 8 4 2 6 8 2 2 0 9 6 6 9 7 3 8 4 8 1 7 8 1 2 8 5 1 5 8 6 3 9 8 5 ，2 6 7 5 0 1 8 5 3 7 6 9 9 5 8 3 5 6 8 5 4 9 8 5 0 3 8 5 3 7 7 8 8 0 8 5 9 4 1 9 浙江大学硕士毕业论文 二、原生质体的铡备、融合及融合株的检出 i 原生质体的制各 根据正交实验表明对原生质体形成与再生的影响力从大到小的顺序为：蜗牛 酶处理时间 细胞菌龄 蜗牛酶浓度 d w p g ( 内含有跳e 的脱壁预处理剂) ，所以选 择最佳组合制备原生质体的条件： 菌龄为1 3 小时、d w p g 浓度为0 1m o l l 、蜗 牛酶浓度为1 5 、酶处理时间为6 0m i n 。( 张劲松，2 0 0 4 ) 2 融合子的鉴定及筛选 利用上述的最佳制备方法制备原生质体，用3 5 的p e g 对c 卜2 5 、c 卜8 8 、 c 卜8 4 、c 卜1 4 、c 卜1 9 、c 卜7 4 、c 卜5 9 单倍体进行自身原生质体融合，从埘高 渗培养基上将菌落直径明显大于其他菌落的菌落细胞挑取出来，作为初步筛选出 来的融合子。融合予的筛选首先通过挑取大菌落，选取细胞体积明显大于其它菌 落细胞以及亲本单倍体，显微镜下观察n - - - 倍体细胞卵型，细胞比较大而且分散， 一个细胞只有一个芽，初步获得融合株c 2 、c 3 、c 4 、c 5 、c 6 、c 7 、c 8 。 2 1 细胞体积以及d n a 含量测定 测定上述融合株细胞大小以及d n a 含量，将它们和亲本对照比较推测得到核 倍性，结果如表5 所示。从表中可以看出我们得到的c 2 c 8 融合株都为二倍体， 这跟亲本株c l 是一样的。 表5 融合株细胞大小及d 含量 3 融合子的发酵力实验 将上面筛选出的融合株经过一级二级种子培养基活化，在3 3 小麦糖化醪 中边糖化边发酵，糖度为2 4 0 b x 左右。每1 2 h 测c o ：失重，7 2 h 后停止发酵测酒 精度，还原糖，p h ，算转化率，重复两批，结果取平均值，见表6 。 从表中可以看到融合株发酵效率都有提高，尤其e 7 、e 8 两菌株转化率提高 很多，达到9 6 左右。相同发酵条件下产生酒精度也提高很大，从1 1 0 ( v v ) 提高到1 1 4 ( v v ) ，p h 值比较稳定，不象其它菌株那样降的比较低，这说明它 们在耐酒精能力、耐酸能力、耐高糖浓度能力都有增强。初步判断得到了两株优 予出发菌株的耐高渗压高产酒精酵母菌株，并在后面的发酵工艺研究中更进一步 验证c 7 、c 8 的发酵能力和稳定性。 2 1 渐江大学硕士毕业论文 c 1 c 6 c 7 c 8 - 。3 0 4 0 2 5 - 0 2 5 0 2 0 4 0 2 5 0 2 5 0 5 9 一o 6 5 一o 6 9 0 6 9 0 8 9 0 8 9 0 5 9 0 6 9 o 2 82 3 6 63 6 8 0 2 4 2 3 5 l3 6 8 0 3 22 3 8 93 5 8 o 3 12 3 7 83 5 7 0 2 82 3 5 63 6 1 0 3 12 3 6 9 3 6 3 0 3 82 3 5 33 5 8 0 3 62 3 3 83 5 8 0