（植物学专业论文）喜树幼苗在干旱胁迫下诱导蛋白和关键酶研究.pdf

摘哇 摘要 喜树( ( a m p t o t h e c aa c u m i n a t a ) 为中国特自树种。本论文利用生理生态学方法及功 能蛋白质组学技术研究了喜树幼苗在丁早胁迫卜的蛋白质动态及其对下旱逆境的分子生 念适应机理。本文以1 5 p e g s o o o 模拟干旱胁迫条件，研究了不同处理时阳j 下喜树幼苗 相对含水量、气孔导度等等生理指标的变化，采用双向电泳与肽质量指纹图谱方法并结 合n 端测序鉴定和分析了部分功能蛋白质的动态。 本文研究结果表明：喜树幼苗能够忍刑短时l 日j 的1 5 p e g 8 0 0 0 干旱胁迫，但生理严 重紊乱，在1 0 p e g s o o o 干早胁迫下，喜树碱含量表达上升具有重要的应用意义。喜树 幼苗在蛋白质水平上对f 旱逆境的生态适应机制包括两个方面，首先是一些干旱诱导蛋 白如胚胎发育后期丰富蛋白( l a t ee m b r y oa b u n d a n tp r o t e i nl e a ) 4 印热激蛋白( h e a t s h o c kp r o t e i nh s p ) 表达量提高，对了：叶肉细胞保持必要的水分和正常的生理代谢功能有 重要意义，g t p 水解酶与r u b i s c o 活化酶对维持喜树幼苗f 常的代谢有着重要的作用。 其次是1 ，5 一二核酮糖羧化酶力口氡酶大亚基( r u b i s c ol s u ) 以及微管蛋白( t u b l i n ) 等通 过降解，避免了变性蛋白的自毒作用，有助于提高叶肉细胞水势或抑制气孔丌放，从而 起到保持水分、适应干旱逆境的作用。 关键词喜树干旱胁迫生态适应分子机制 a b s t r a c t c a m p t o t h e c aa c u m i n a t ai sat r e eu n i q u et oc h i n a t h em o l e c u l a re c o l o g yo f d r o u g h t s t r e s st oc a m p t o t h e c aa c u m i n a t as e e d l i n g sw i t ht h et h e o r ya n dm e t h o do ff u n e t i o n a l p r o t e o m i c sw a ss y s t e m a t i c a l l ys t u d i e d t h ep h y s i o l o g i c a li n d e x e sc o r r e l a t i v et od r o u g h t t o l e r a n c ew e r es t u d i e di nt h el a b o r a t o r y a n dt h ee x p r e s s i o no ft o t a lp r o t e i n sw e r ea l s od e t e c t e d i nt h es t u d y w es i m u l a t e dd r o u g h ts t r e s sw i t h15 p e g 8 0 0 0 。a n du s e d2 - d e ，p m s f ，a n dn t e r m i n a la n a l y s i st oi d e n t i f 3a n da n a l y z et h ed y n a m i cs t a t eo fs o n i cf u n c t i o n a ip r o t e i n s s p r a y i n gc a n l p t o t h e c i n ( c p t ) a sam i c r o t u b u l ed e p o l y m e r i z a t i o na g e n c y w es t u d i e dt h es t o m a m o v e m e n to fc a m p t o t h e c aa c u m i n a t as e e d l i n g su n d e rd r o u g h ts t r e s sc o n d i t i o n s c a m p t o t h e c aa c u m i n a t as e e d l i n g sc o u l dt o l e r a t e15 p e g 8 0 0 0s i m u l a t e dd r o u g h ts t r e s s d u r i n gs h o r tt i m eb u tt h ep h y s i o l o g yw a ss e v e r ed i s t u r b a n c e c p tc o n t e n tw a sa s c e n du n d e r 10 p e g s o o od r o u g h ts t r e s sc o n d i t i o nt h a th a si m p o r t a n ta p p l i c a t i o np u r p o f l t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fc a m p t o t h e c aa c u m i n a t as e e d l i n g sa d a p t e dt o d r o u g h ts t r e s so nt h el e v e lo fp r o t e i ni n c l u d e dt w oa s p e c t s ，f i r s t l y ，s o m ed r o u g h t i n d u c e d p r o t e i n si n c r e a s e de x p r e s s i o ns u c ha st h el a t ee m b r y oa b u n d a n tp r o t e i n ( l e ap r o t e i n ) a n d h e a ts h o c kp r o t e i n ( h s p ) ，w h i c hw e r es i g n i f i c a n tf o rm a i n t a i n e dm e s o p h y l lc e l lw a t e ra n d n o r m a lm e t a b o l i s m g t p a s ea n dr u b i s c oa c t i v a s eh a di m p o r t a n tf t m c a t i o no nm e t a b o l i s mo f 6 2 1 m p t o t h e c aa c u m i n a t as e e d l i n g s s e c o n d l y ，r u b i s c ol s ua n dt u b u l i nw e r ed e g r a d e df o r a v o i d i n gs e l f - p o i s o n o u sd e n a t u r e dp r o t e i n i tc o u l dc o n t r i b u t et oe n h a n c em e s o p h y l lc e l lw a t e r p o t e n t i a la n di n h i b i tt h es t o m ao p e ns o a st ok e e pw a t e r a n da d a p tt od r o u g h ts t r e s s k e y w o r d sc a m p t o t h e c aa e u m i n a t a ；d r o u g h ts t r e s s ；e c o l o g i c a la d a p t a t i o n ；m o l e c u l a r m e c h a n i s m 绪论 1 1 引言 1 1 1 植物的水分平衡 1 绪论 从全球来看，水是森林和农业生产的主要限制因素之一。树木的生长受水分限制。 即便是在土壤水分充足的情况下，水分亏缺也常常会发生，影响到光合作用、物质的运 输、蛋白质的合成和细胞的伸长等生理过程。树木中所有活的功能细胞必须维持相对 含水量在7 5 以上以便保持膨压。树木的水分状念决定了根的吸收和叶片蒸腾的形态 上的关系，例如根系发育好或叶面积指数高的分配对策i l j 。诸如气孔控制等抗旱性机制 通常涉及到树木的地理分布，这主要是由于水分对于树木幼苗的生长和生存具有重要作 用。 植物的水分平衡决定于两个方面，即水分的吸收和散失。影响浚过程的因素较多， 其中最主要的就是土壤含水量。据此，水分胁迫( w a t e rs t r e s s ) 可分为干旱胁迫和淹涝 胁迫。由于干旱胁追较淹涝胁迫更加广泛，也获得更多的重视，水分胁迫通常特指干旱 胁迫( d r o u g h t s t r e s s ) ，有时也用水分亏缺( w a t e rd e f i c i t ) 来表示同一意义。吸收入植物 体的水分可以通过吐水、蒸腾作用和根系提水散失到其生活空洲。植物散失水分只有小 部分是以吐水( g u t t a t i o n ) 方式进行的，绝大部分是以蒸腾作用进行的。水分以气念形 式通过植物体表面向大气中扩散的过程称为蒸腾作用( t r a n s p i r a t i o n ) 。根掘蒸腾的部 位，又分为皮孔蒸腾( 1 e n t i c u l a rt r a n s p i r a t i o n ) ( 约占全部蒸腾量的0 1 ) 和叶片蒸腾， 叶片蒸腾也有两种，即角质层蒸腾( c u t i c u l a rt r a n s p i r a t i o n ) 和气孔蒸腾( s t o m a t a t r a n s p i r a t i o n ) ，幼嫩叶片或潮湿条件下成长的叶片，角质层蒸腾可达蒸腾总量的l 3 到 i 2 ，一般成熟叶片的角质层蒸腾仅占总蒸腾量的5 l o 。因此，气孔蒸腾是植物散失 水分的主要形式。 气孔运动是保卫细胞内膨压改变的结果，保卫细胞吸水膨胀时气孔张开，失水缩小 时气孔关闭。有三种学说来解释保卫细胞的水势变化：淀粉糖转化学说( s t a r c h s u g a r c o n v e r s i o nt h e o r y ) ，保卫细胞光合作用导致c 0 2 浓度下降，p h 值升高，而在高p h 环境 中，淀粉磷酸化酶催化淀粉转化为葡萄糖1 p ，从而引起水势下降，保卫细胞吸水膨 胀；没有光合作用时，由于呼吸积累c 0 2 和h 2 c 0 3 ，p h 降低，淀粉磷酸化酶促使糖转 化为淀粉，水势升高，保卫细胞失水收缩，气孔关闭。无机离子吸收学说( i n o r g a n i c i o nu p t a k et h e o r y ) ，光合作用产生的a t p 提供了k + 进入保卫细胞的必要能量，k + 进入保 卫细胞导致水势下降，气孔张开。苹果酸生成学说( m a l a t ep r o d u c t i o nt h e o r y ) ，光合 作用引起c 0 2 浓度降低、p h 上升，剩下的c 0 2 大部分转变为碳酸氢赫( h c 0 3 ) ，在磷 酸烯醇式丙酮酸( p e p ) 羧化酶作用下，h c 0 3 与p e p 结合形成草酰乙酸，进而还原为 苹果酸，苹果酸产生h + ，a t p 使h + 一k + 交换泵丌动，k + 进入保卫细胞，水势下降，气孔 张丌。 东北林业人学坝i 。学位论文 上述3 个学说均有定的科学依据，也都在气孔丌关中起到调节作用，但是，由于 保卫细胞中淀粉与糖的转化非常缓慢，而且有的植物保卫细胞中没有淀粉，因此，在气 孔丌关中起到决定性作用的应该是k 1 。无机离子吸收学说和苹果酸学浼并不矛盾，都 强调k + 的作用。同时，气孔丌天还与脱落酸( a b a ) 有关，特别是当植物缺水时，叶 片组织a b a 浓度升高，气孔关阳1 。 1 1 2 干旱胁迫及其对植物的伤害 地球上一二分之一多的陆地是干旱和半干旱地区1 2j ，干旱是许多环境中经常发生的事 情，所以许多多年生植物已经形成各自不同的适应机制来对付水分胁迫。植物可以通过 最大量地吸收水分来避免_ t 旱胁迫( 如发育成深根系来吸取地下水) 或将水分丧失减小 到最低程度( 例如，气孔关闭、叶片变小) 。有些植物忍耐水分胁迫是通过渗透调节或 渗透保护性物质的积累p j 。 不同的水分亏缺程度对植物生长发育的影响不同。h s i a o 将中生植物按水分饱和亏 缺1 0 以下、1 0 一1 4 和1 4 以上划分出轻度、中度和严重三个水分胁迫级别，按土壤 最大持水量划分为对照、轻度、中度、重度胁迫等四个级别，其土壤含水量分别为：对 照7 5 8 0 ，轻度胁迫5 5 6 0 ，中度胁迫4 0 4 5 及重度胁迫3 0 3 5 。如 果以叶片水势划分，供水良好的植物，叶水势( 1 l f w ) 在0 一0 4 m p a ，压力势( v p ) 在 1 2 0 8 m p a 之间，相对含水量r w c 9 5 ：轻度亏缺时，l l r w 一0 4 - 0 8 m p a ，1 l r p = o 8 0 4 m p a ，相对含水量 9 0 ；中度亏缺时， 1 l r w 一0 8 1 2 m p a ， 1 l r p = o 4 0 0 m p a ，相对含水 = 9 0 8 0 ；重度亏缺时，1 i f w = 1 2 - 1 8 m p a ，1 l r p = 0 ，相对 含水量 9 8 ，来自于森林生态学教 育部重点实验室，东北林业大学) 用喜树碱高效液相流动相定容到5 0 m l ，分别耿l m l ， 2 m l ，4 m l ，8 m l ，1 0 m l 至1 0 m l 容量瓶用流动相定溶至刻度，各取l m l 在1 2 0 0 0 r p m2 0 离心1 0 m i n ，取上清液在h p l c 中重复进样3 次，取3 次迸样的喜树碱的峰面积平均值 与喜树碱含量做图，得到标准曲线。标准曲线如图2 1 。 喜树叶片中喜树碱含量的测定，将不同处理的喜树叶片在7 0 烘干4 8 h ，用研钵与 研棒研磨成均匀的粉术，称取o 殛a 右，用7 5 酒精溶解到1 0 m l 容量瓶中，超声3 0 m i n ，再定容到刻度。取提取液1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，取e 清1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ， 取上清液进样，每次进样1 0ul ，重复进样3 次，取平均值。 2 4 结果分析 y = 3 8 3 1 4 8 1 29 6 3 0 x + 4 0 1 8 0 1 9 6 0 0 r 。= 0 9 9 0 9 000 3 00 6 0 0 901 2 点树碱含, i m g m i 幽2 - i 喜树碱标准曲线 f i g2 - 1s t a n d a r dc u r v eo f c p t 2 4 1p e g 模拟干旱条件对喜树幼苗生理代谢的影响 p e g 8 0 0 0 水溶液模拟二f 早对喜树幼苗叶片净光合速率有显著影响( 图2 2 ) 。根系在 培养液中的喜树幼苗净光合速率在一天内以9 ：o o 一1 2 ：0 0 净光合速率最高，1 2 ：o o 以 后开始下降。而不同浓度p e g 8 0 0 0 水溶液处理均导致喜树幼苗净光合速率迅速下降，其 中，5 p e g 8 0 0 0 水溶液处理时净光合速率仍为f 值，并在复水后光合能力迅速提高，复 水4 h 后净光合速率能够恢复到对照水平：1 0 和1 5 p e g 8 0 0 0 溶液处理均使喜树幼苗的 净光合速率下降至负值，即光合速率 呼吸速率，在复水后也有一定程度的恢复，但 1 5 p e g 8 0 0 0 水溶液处理在复水6 h 后仍为负值。因此，从净光合速率指标分析， 1 5 p e g 8 0 0 0 水溶液对喜树幼苗生理影响最严重，且不会导致喜树幼苗在非常短的时间内 死亡。 o 嚣淼 东 e 林业人学坝l j 学位论文 十o 4 ”1 i i i g f l 0 0 址川j ( 一8 ( jro ，m i + “川i 处州j ( ) q ，il i l ；n 0 0 0fr r 。i t m 幽2 - 2 不同p e g 模拟干旱胁迫r 誊树幼苗n l 片净光合速率的变化 f i g2 - 2e f f e c to fd i f f e r e n tp e gs i m u l a t ed r o u g h tc h a n g e sl nt h en e tp h o t o s y n t h e t i cr a t eo fc a m p t o t h e c a a c u m i n a t as e e d l i n g s 气孔导度能够显示出于旱胁迫下气孔的丌放程度。p e g 8 0 0 0 水溶液处理明显抑制了 喜树幼苗叶片的气孔丌放( 图2 3 ) 。对照处理在9 ：0 0 左右气孔导度明显提高，这是其 净光台速率上升的主要原因之。5 和1 0 p e g 8 0 0 0 水溶液处理均诱导了气孔关闭，复 水后气孔逐渐开放，1 0 p e g 8 0 0 0 水溶液处理的气孔导度更低。但是，1 5 p e g 8 0 0 0 水溶 液处理表现出不同的特征，即气孔导度下降趋势不明显，复水后打丌趋势也不明显，这 表明，该干旱胁迫强度导致喜树幼苗叶片失去了气孔调节能力。 十5 p e g 8 0 0 0 处州5 p e g 8 0 0 0t r e a l n o n 7 ：2 69 ：1 31 l ：2 1i 3 ：2 l1 5 ：171 7 ：2 41 9 ：0 8 时n ut l i n e ( h ) 幽2 - 3 不同p e g 模拟干旱聃迫f 喜树幼曲叶片气孔导度的变化 f i g2 - 3 e f f e c to f d i f f e r e n tp e gs i m u l a t ed r o u g h t c h a n g e si nt h es t o m a t a lc o n d u c t a n c eo f c a m p t o t h e c a a c u m i n a t as e e d l i n g s 胞问c 0 2 浓度的变化有助于分析光合能力的主要限制因素。不同p e g 8 0 0 0 水溶液处 理下，胞问c 0 2 浓度变化规律不同( 图2 - 4 ) 。对照处理在9 ：o o 时胞问c 0 2 浓度最 高，而此时气孔导度、净光合速度也最高，此后气孔导度下降。5 p e g 8 0 0 0 水溶液处理 n ui i? 2 i j ，。i：】【；三 =：苎；【j_i儿|：，斗爿仁爿蠹 们 叽 0 0 0 0 o 0 0 o 0 0 一。，!一。曼 2 喜树幼苗对十早胁迫的生理生态响向 与对照处理相似，胞i b jc 0 2 浓度相对较高，而气孔导度显著低于对照，这说明光合限制 因素的主要原因是非气孔限制。l o p e g 8 0 0 0 水溶液处理体系中，胞侧c 0 2 浓度在上升 后并没有因复水向对照水平恢复，这是由于喜树幼苗在该胁强下呼吸速率更高导致的。 1 5 p e g 8 0 0 0 水溶液处理体系中，胞问c 0 2 浓度持续上升，即使在复水后也在升高，表 明该浓度处理导致喜树幼苗u + 片发生更强烈的呼吸作用，喜树幼苗仍然能够通过代谢调 节应对干旱逆境胁迫。 7 0 0 + j p e g 8 。0 0 处州5 p e g 8 0 0 0 t 。e a t 。e ” + 1 0 p e g 8 0 0 0 处州1 0 p e g s 0 0 0t r e a t m e n t 7 ：2 69 ：1 31 1 ：2 113 ：2 11 5 ：1 71 72 41 9 ：0 8 h j 州t i m e ( h ) 图2 4 不同p e g 模拟干旱r 胁迫喜树幼茸叶片胞问c 0 2 浓度的变化 f i g2 - 4e f f e c to f d i f f e r e n tp e gs i m u l a t ed r o u g h tc h a n g e si nt h ei n t e r m a lc 0 2 c o n c e n t r a t i o no f c a m p t o t h e c aa c u m i n a t as e e d l i n g s p e g 8 0 0 0 水溶液模拟干旱胁迫对喜树幼苗叶片蒸腾速率的影响与对气孔导度的影响 基本相似( 图2 5 ) 。本文不再赘述。 + 5 p e g 8 0 0 0 处删5 p e g 8 0 0 0t r 驰t m e n t + 1 0 p e g 8 0 0 0 处州1 0 p e g s 0 0 0t r e a t m e n 7 ：2 69 ：1 31 1 ：2 l1 3 ：2 1 1 5 ：1 7l7 ：2 41 9 ：0 8 时i it i m e ( h ) 幽2 - 5 不同p e g 模拟干旱卜胁迫喜树幼苗州片蒸腾速率的变化 f i g2 - 5e f f e c to f d i f f e r e n tp e g s i m u l a t ed r o u g h tc h a n g e si nt h et r a n s p i r a t i o nr a t eo f c a m p t o t h e c a a c u m i n a t as e e d l i n g s 0 o 0 0 0 0 0 0 o o 0 0 oi一ioe一口自1)|co：iocco 占o；三。；l|莓蛏言呈宣写 8 6 4 2 1 8 6 4 2 o l ； o o o o 一，e皂z t | l ： 暑lo=置s毒#。嗣娶一霉 2 4 2 不同干旱胁迫强度下喜树幼苗叶片相对含水量的变化 光合、呼吸以及气孔导度等指标对了二观察生理紊乱程度非常重要，但对于喜树幼苗 干旱伤害状况并不直观。目d # ，在水分生理生态学研究中多采用相对含水量( r e l a t i v e w a t e r c o n t e n t ，r w c ) 确定干旱胁强。本实验未进行复水处理。 在对照处理中，叶片相对含水量在2 4 h 内表现出昼夜波动性，即白天低于夜问，特 别是在1 0 ：0 0 左右明显较低，这是由于9 ：0 0 左右较高的蒸腾速率导致水分大量丧 失。夜问在2 ：o o 时r w c 达到最高值，这由于气孔关闭，蒸腾降低。 9 0+ 刊照c o n l l - 0 1 - 一1 0 p e 6 8 0 0 0 处胛1 0 p e g 8 0 0 0t r e a t m o n l 毋踟 = = 7 0 三 ：6 ( ) 5 0 ； 4 0 三3 0 ； = 2 0 0 0 妒+ 母a 一夺p p 母粤妒母p 拶妒争妒芦芦p 时t i m e i h ) 幽2 - 61 0 p e g 模拟千早胁迫对喜树幼茸叶片相对含水鼙的影响 f i g2 - 6 e f f e c to f1o p e gs i m u l a l ed r o u g h tc h a n g e si nt h er e l a t i v ew a t e rc o n t e n lo fc a m p t o t h e c a a c u m i n a t us e e d l i n g s l o 和1 5 p e g 8 0 0 0 水溶液对喜树幼苗叶片相对含水量的影响相似( 图2 - 6 ，2 - 7 ) ， 它们均导致相对含水量下降，这种效果在1 5 p e g 8 0 0 0 水溶液处理2 h 后即表现出与对照 的明显区别，而在1 0 p e g 处理时则在5 h 后表达出差异。显然，1 5 p e g 8 0 0 0 溶液处理 町以更有效地在短时问内导致喜树幼苗水分丧失。 2 拜树幼苗对十旱胁迫的生理生态响应 9 0 8 0 三7 0 三 i6 0 。 i5 0 g4 0 m ：3 0 笔 = 2 0 配 l o 0 + 埘雕c o n tf 0 1 - 一15 p e g s 0 0 0 处删1 5 p e g 8 0 0 0t r e a t m p n t 80 08 ：3 09 ：0 09 ：3 0 0 ：0 0l l ：0 0 1 2 ：0 0 1 3 ：0 0 1 4 ：0 0 1 6 ：0 02 0 ：0 0 h l i i i jt j l i e ( h ) 幽2 7l5 p e g 模拟干旱胁迫对喜树幼苗叶片相对含水蛄的影响 f i g2 - 7e f f e c to fi5 p e gs i m u l a t ed r o u g h tc h a n g e si nt h er e l a t i v ew a t e rc o n t e n to fc a m p t o t h e c a a c u m i n a t as e e d l i n g s 2 4 3 不同干旱胁迫强度下喜树幼苗喜树碱含量的变化 一些逆境冈素能够引起喜树碱含量的变化，如水浴热激处理导致喜树碱含量迅速上 升【3 7 j 。这可能是环境胁迫改变了细胞内环境特别是p h 值，从而引起喜树碱代谢途径中 某些关键酶活性提高或增加了底物浓度或降低了产物反馈抑制的结果，具体机制目前并 不清楚。 在对照处理中发现，喜树碱浓度也存在昼夜周期性变化，在1 0 ：o o 、2 3 ：0 0 和7 ：0 0 较高，这与祖元刚等的研究结果有一定相似性f j ，但峰值时间不同，而本文中1 0 p e g 和1 5 p e g 处理在不同时问进行，其规律性也有类似差异，因此，这可能是研究所选用 的材料年龄不同导致的。1 0 p e g 8 0 0 0 模拟干旱使喜树碱平均水平高于对照( 图2 8 ) ， 特别是在1 3 ：0 0 和1 7 ：0 0 时，喜树碱浓度比对照在相应时间提高了1 6 2 倍和2 1 6 倍，与处理丌始相i ：i ：n 分别提高了1 4 6 倍和1 4 5 倍。但是，1 5 p e g 8 0 0 0 的处理体系却 导致喜树碱平均水平低于对照处理。 东北林业凡学懒i j 学位论史 + 对州c n 叭r oj 一1 0 i i i ( ；m m o 处押i 0 1 i ! l ；m f f mh 1l m 洲 “i ，hi i i：( 1 1 ii 【：( i ox ：i io ：n 7 ：f 1 9 j ! i ( 1r j2 d ( il ：i l o： ：jo ：i7 ：( j 时一jim r , ( h ) 幽2 - 81 0 p e g 模拟f 旱胁迫对喜树幼苗n i 片喜树碱含苗的影响 f i g2 - 8e f f e c to f1o p e gs i m u l a t ed r o u g h tc h a n g e si nt h ec p t c o n t e n to f c a m p t o t h e c aa c u m i n a t a s e e d l i n g s。 0 2 5+ 刈麒c o n t l 。l+ 1 5 p e g s 0 0 0 处州 i5 p e g 8 0 0 0t r e a t l e i l t 8 ：0 08 ：3 0 9 ：0 09 ：3 01 0 ：0 0 ii ：0 01 2 ：0 01 3 ：0 0 1 4 ：0 01 6 ：o o2 0 ：0 0 时i b jt i m e ( h ) 幽2 - 91 5 p e g 模拟干旱胁迫对喜树幼苗叶片喜树碱含鼙的影响 f i g2 - 9 e f f e c to fl5 p e gs i m u l a t ed r o u g h tc h a n g e si nt h ec p tc o n t e n to f c a m p t o t h e c aa c u m i n a t a s e e d l i n g s 2 5 小结 综上所述，1 5 p e g 水溶液导致喜树幼苗生理紊乱，净光合速率显著下降，气孔调 节能力受到影响，但仍然能够通过代谢调节应对干旱逆境。因此，在本论文中，主要以 1 5 p e g 处理研究喜树的抗旱分子机理，并结合1 0 p e g 处理进行。 3 冉树幼苗抗旱疆导生 j 对十旱胁迫的生态适应 3 喜树幼苗抗旱诱导蛋白对干旱胁迫的生态适应 3 1 材料和方法 3 1 1 试验材料 试验材料与第2 章相同。 3 1 2 干旱胁迫处理方法 我们采用1 5 p e g8 0 0 0 溶液作为干旱胁迫的处理浓度。在1 5 p e g8 0 0 0 溶液条 件下，喜树幼苗在5 h 之后萎蔫，叶片相对含水量下降，在8 h 之后，叶片相对含水量下 降到5 0 以下。依据叶片相对含水量的动态变化，我们确定幼苗处理时问为1 2 h 。 喜树幼苗干旱处理方法为，将喜树幼苗从珍珠岩中小心取出，沈去根部附着的珍珠 岩，用滤纸将根部吸干，放入到1 5 p e g8 0 0 0 溶液中，同时丌始记时。在o h ，0 5 h ， 1 h ，2 h ，3 h ，5 h ，1 2 h 取样，迅速放入液氮中冷冻，7 0 冰箱中备用。 3 1 3 主要实验试剂和设备 3 1 3 1 试剂 三氯乙酸( t c a ) ，p h a r m a l y t ep h3 - 1 0 ，磷酸，乙酸，丙酮，乙醇，甲醇，d t t ， s d s ，过硫酸铵，t e m e d ，硫脲( t h i o u r e a ) ，尿素( u r e a ) ，e d t a ，甘氨酸 ( g l y s i n e ，丙烯酰胺( a c r y l a m i d e ) ，甲二叉丙烯酰胺( b i s a c r y l a m i d e ) ，t r i s b a s e ，甘 油( g l y c e r 0 1 ) ，考马斯亮蓝( c o o m a s s i eg 2 5 0 ) ，考马斯亮蓝( c o o m a s s i er 2 5 0 ) ， c h a p s ，p m s f ，b s a ，c a p s 等等。 p v d f 膜 3 1 3 2 主要溶液 1 提取缓冲液：8 mu r e a ，2 mt h i u r e a ，2 ( n ) c h a p s ，1 ( w ) d t t ( d i t h i o t h r e i t o ) ，2 5 ( v v ) p h a r m a l y t ep h 3 1 0 ，l m me d t a 。用时加入p m s f ( 终浓 度为l m m ) 。 2 样品溶涨液：8 mu r e a ，o 5 ( w ，v ) c h a p s ，1 5 m md t t ，o 5 ( v v ) i p g b u f f e r 。 31 5 m o l lt r i s h c i ，p h 8 8 ：准确称量3 6 3 9t r i s 加入1 5 0 m l 双蒸水， 8 8 ，定容到2 0 0 m l ，4 保存。 4l m o l lt r i s h c l ，p h 6 8 ：准确称量1 2 1 9t r i s 加入加入8 0 m l 双蒸水 6 8 ，定容到1 0 0 m l ，4 c 保存。 用h c i 调p h 到 用h c i 调p h 到 5 丙烯酰股储液：准确称量2 9 1 9 丙烯酰胺( a c r y l a m i d e ) 和o 9 9 甲叉双丙烯酰胺( b i s a c r y l a m i d e ) ，用双蒸水定容到1 0 0 m l ，真空过0 4 5 p , m 膜，棕色瓶4 c 保存。 东北林业人学坝i 学位论义 6 1 0 过硫酸铵( s i g m a ) ：称取o 1 9 过硫酸铵，j j n x 1 m l 双蒸水中，混匀使之完全溶 解，垓溶液为现用现配。 7 1 0 s d s ( _ 二烷基磺酸钠，s i g m a ) ：称取1 0 9s d s ，加入双蒸水定容全1 0 0 m l ，室 温可放置数月。 8 t e m e d ( s i g m a ) ：4 保存。 9 澳酚蓝( p h a r m a c i ab i o t e c h ) 1 0b m d f o r d 储存液：1 0 0 m l9 5 乙醇，2 0 0 m l8 8 磷酸，考马斯亮蓝g 2 5 03 5 0 m g ，室 温保存。 11b r a d f o r d 工作液：耿1 5 m lb r a d f o r d 储存液，加入9 5 乙醇7 5 m l ，8 8 磷酸1 5 m l ， 双蒸水2 1 2 5 m l 。室温保存。 1 22 上样缓冲液：1 t o o lt r i s h c l ( p h 6 8 ) 1 2 5 m l ，1 0 s d s2 m l ，甘油2 m l ，溴酚蓝 2 0 m g ，d t t0 , 3 1 9 ，定容剑】0 m l 。分装成2 0 0 9 l 的小包装，储存于- 2 0 。c 冰箱中。 1 3 平衡缓冲液：取1 5 t o o lt r i s h c l ( p h 8 8 ) 1 6 7 5 m l ，u r e a1 8 0 2 9 ，甘油1 7 2 5 m l ，s d s 1 9 ，用双蒸水定容到5 0 m l 。分装成小离心管内2 0 保存。用时每1 0 m l 加入 0 1 9 d t t 或o 4 9 碘乙酰胺。 1 4 电泳缓冲液：i r i sb a s eo 0 2 5 m ，g l y c i n e ( 甘氨酸) 0 1 9 2 m ，s d so 1 ( w v ) 。 1 5 琼脂糖封顶液：0 5 9 琼脂粉定容至1 0 0 m l 的电泳缓冲液中，加入适量的溴酚蓝，加 热使琼脂糖完全溶解，4 保存。 1 6 脱色液：1 0 ( v v ) 乙醇，1 0 ( v v ) 乙酸。用双蒸水配制。 1 7t c a 丙酮溶液：1 0 ( m v ) t c a 丙酮，加入o 0 7 d t t ，一2 0 0 c 保存。 1 88 0 丙酮溶液：8 0 丙酮加入0 0 7 d t t ，一2 0 保存。 1 9c a p s 电印迹缓冲液：1 0 m m o l lc a p s ，1 0 甲醇，用双蒸水配制。 3 1 3 3 实验设备 h o f e rs e 6 0 0 冷却式垂直电泳系统，e s p 6 0 1 电源，u m a x 2 1 0 0 x l 专业扫描仪，i m a g e m a s t e r2 - d 分析软件( p l a t i u m5 0 ) ，m u l t i t e m p l i i 恒温水浴，i p g p h o r 胶条槽，i p g p h o r 等电聚焦电泳仪，s i g m a3 k 3 0 型高速冷冻离心机，日本岛津v u 2 5 0 0 型紫外可见分光 光度计，u n i c 0 2 1 0 0 型可见分光光度计，干胶设备，微量移液器，混匀仪，t s 一脱色摇 床，半干电转槽等。 3 1 4 喜树叶片总蛋白质提取及定量 3 1 4 1 蛋白质提取 蛋白质双向电泳样品制各是很复杂的过程，不同样品需要不同样品提取方法，不同 实验需求也是需要不同的提取方法，没有种蛋白质样品制备方法能够广泛的适用于各 种样品。所以对于不同的样品要经过实验柬摸索出合适的蛋白质提取方案。 蛋白质样品提取程序如图4 1 所示： 3 1 4 2 蛋白质的定量 本论文采用b r a d f o r d 法，该方法具有快速、简便、灵敏度高的优点，b r a d f o r d 法参 照汪家政编写的蛋白质技术手册口。方法如下：准确称取5 0 m g 牛血清白蛋白溶于 3 冉f i j 幼苗抗旱i 秀导盐由对十旱卧迪的生态适j * 5 m l 容量瓶中，配制成1 0 m g m l 的标准溶液。分别取1 0 m g m l 标准溶液各0 ，1 2 ， 4 ，6 ，8 ，1 0 1 a l ，加入3 m lb r a d f o r d 溶液，混匀，放置3 - 5 m i n 。在5 9 5 n m 处测定吸光 值。以牛血清白蛋白( b s a ) 的浓度为横坐标，以吸光值( a b s ) 为纵坐标柬绘制标准 曲线( 图3 2 ) 。 厂 1 0 2 9 喜树叶片 i l i 用液氮研磨，迅速转入到1 5 m l 离心管中 | l 加入预冷的i m l1 0 t c a 丙酮溶液， l震荡，于2 0 冰箱中放置l h b1 5 分钟 弃上清，沉淀中加入预冷的1 0 t c a 丙酮溶液， 使沉淀悬浮，混匀，于2 0 。c 冰箱中放置1 h j4 ，3 4 0 0 0 0 r p m 离。i i , l 弃上清，沉淀中加入预冷的8 0 丙酮溶液，使沉 淀悬浮，混匀，于2 0 冰箱中放置1 h f，r p m 离心1 ，4 c 3 4 0 0 0 弃上清，沉淀中加入预冷的8 0 丙酮溶液，使沉 淀悬浮，混匀，于2 0 冰箱中放置1 h 弃上清，沉淀真空冷冻干燥成粉末状 在冷冻干粉中加入3 0 0ul 提取缓冲液， 混匀，在室温放置3 0 分钟 分钟 分钟 4 c ，3 4 0 0 0 r p m 离心1 5 分钟 幽3 - i 喜树幼占州片蛋白质提取料序 f i g3 - 1p r o t o c o lo f f u l lp r o t e i ne x t m c t e d f r o m l e a v e so f c a m p t o t h e c a a c u m i n a t a 0 幽3 - 2 标准生向( b s a ) 浓度标准曲线 f i g3 - 2s t a n d a r dc u r v eo fs t a n d a r dp r o t e i n ( b s a ) o 3 1 5 喜树叶片蛋白质的s d s 聚丙烯酰胺凝胶( s d s - p a g e ) 电泳 3 1 5 1 聚丙烯酰胺凝胶的灌制和电泳 本论文所用的聚丙烯酰胺凝胶灌制采用郭尧君编制蛋白质电泳技术手册的配 方，分离胶浓度为1 0 ，堆积胶浓度为4 “”。 按照s e 6 0 0 冷却式垂直电泳系统使用说明书来制作灌胶模具，本实验采用1 m m 的 s p a c e ，最终凝胶厚度为 m m 。先灌制l o 的分离胶( 分离胶配方见郭尧君编制蛋白 质电泳技术手册) ，在凝胶上覆盖水或水饱和正丁醇，当分离胶凝固时，用双蒸水冲洗 掉覆盖的正丁醇和没有凝固的丙烯酰脓。吸去分离胶上面水分。灌制4 堆积胶( 分离胶 配方见郭尧君编制蛋白质电泳技术手册) ，插梳子，插梳子时要注意避免产生气泡， 插梳子时可以将梳子倾斜插入可减少气泡产生。当堆积胶凝固时，拔出梳子，用双蒸水 冲洗上样孔，将没有凝固丙烯酰胶冲沈掉。 每个样品孔上样量为2 5 9 9 ，上样体积为2 5 9 l ，样品不足体积用上样缓冲液补至 2 5 p , 1 ，用蛋白分子量标准进行分子量标定。上样后立即进行电泳，本实验采用恒定电流 的方法进行电泳，最初电流为1 6 m a 块，当溴酚蓝前沿到达堆积胶与分离胶交界处时升 高电流至3 2m a 块，直至溴酚蓝前沿到分离胶的底部时停止电泳。 3 1 5 2 聚丙烯酰胺凝胶的染色和脱色以及数字化 将电泳结束凝胶放入到染色液中染色2 h ，再将凝胶放入到脱色液中，在此过程中不 断更换脱色液，直至凝胶背景为无色时。 脱色后凝胶用台式凝皎扫描仪( i m a g e s c a n n e rp o w e r l o o k1 1 ，u m a x ) 进行数字化处 理。扫描的参数为：分辨率3 0 0 d p i ，色彩为2 5 6 灰阶。 应用l a b w o r k3 0 对数字化凝胶图象进行分析，对凝胶上泳道和蛋白条带分子量进 行自动和手动分析，根据蛋白分子量来确定蛋白条带的表观分子量，对每个条带的蛋白 质进行定量分析等。 叭m吼卫吼m加 3 喜利幼苗抗旱诱甘生 j 对十早胁迫的生态适脚 3 1 6 喜树叶片蛋白质的双向电泳 根据s d s p a g e 电泳结果，选择差异带明显处理样品进行双向电泳的分析，本实验 选择0 ，o 5 h ，3 h ，5 h 样i 铬分别用p h 3 1 0 的胶条进行双向电泳。 3 1 6 1 第一向等点聚焦电泳 本实验第一向使用a m e r s l m mi p g o p h o r 进行，采用p h 3 1 0 的胶条，上样量为 1 2 5 i _ t g ，样品用样品溶涨液f 配方见上) 稀释到2 5 0 1 t l ，等点聚焦运行的程序如下： 第一步：3 0 v 】2 h 第