（发酵工程专业论文）红曲霉固态发酵及形态解析.pdf

天津科投大学硕t 学位论文 摘要 论文主要礤究了红魈霉骤态发酵和界嚣模拟培养过程中，含水爨、湿艘、 空气相对湿度对其生长及发酵生产m o n a c o l i nk 和红曲色素的影响，并通过 诗簿秘委橡分援，量亿发酵：i 遘程载形态傣息。 以液态发酵为对照，固态发酵m o n a c o l i nk 产量为液态发酵的1 0 倍以上， 其有明显优势。经萄霉固态发酵时，基黢含隶量为5 0 较为逶宣；3 2 畜铡 于菌体的生长，2 5 有利于m o n a c o l i nk 产生，因此采用变温培养，即初期 3 2 ，到第9 天时降溢蜀2 5 培养，m o n a c o l i nk 产率遂著撬高。 固态发酵过程十分复杂，因此采用界蕊模拟培养避行简化，界隧模拟培 养中生物量、产物量与温度、湿度的关系与固态发酵过程一致。根据菌体生 长呈现鹣除段蛙，建立了萤体生长动力学模型：( ) 抉速期； x f 【( 1 一辨) 网力一n t m w ( 2 ) 减遮期：x v = 2 p t “2 + k ( 3 ) 衰退期：x t = k x i t i e 一。 根据表面分形理论，定义了菌落面积、表饺体积和表面缎理熵，建立了 蕾落图像分析系统，分析发酵过程瀚菌俸澎态。 菌落形态翱颜色镶形态特征反映了菌体活性，与麓体生长、产物生成密 切相关。快速期用菌藩面积来衡量菌体活性，减速期与衰减期菌体活性采用 表摄棼织v 表示，建立了形态动力学模型：( t ) 抉速增长期；s = a ” ( 2 ) 减速期：v = 2 t m 十k ( 3 ) 寝退期：v = e b 心。菌体活性在快速期表现为 蘩体魏雯汝，减速期与衰减麓刘表瑷为次级找| 罄产兹豹生藏，因此耀蕊热活 性和菌体生长速率共同描述微生物的产物生成，建立了产物生成动力学模烈： 警叫矿0 警) 。 关键词：固态发酵爨嚣模掇红越霉 菌体形态计算机解析 天津科技大学硕士学位论文 a b s t r a c t i tw e r ed i s c u s s e dt h a tt h eh u m i d i t y ，m o i s t u r ec o n t e n ta n dt e m p e r a t u r ea f f e c t e dt h e p r o d u c to f m o n a c o l i nka n d p i g m e n t i nt h ep r o c e s so fs o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o na n d i n t e r f a c es i m u l a t i o nc u l t u r ei nt h ea r t i c l e w i t l lc o m p u t e ra i dt h em o r p h o l o g i c a l a n a l y s i s o fm o n a s e u sw a ss t u d i e da n dd e s c r i b e d q u a n t i t a t i v e l y t h el i f eo f m o n a s c u si nd i f f e r e n tp h a s e d c o n t r a s t i n gt ot h es u b m e r g e df e r m e n t a t i o n ( s m f ) ，t h ep r o d u c to fm o n a c o l i nk o n s s fi so v e r1 0t i m e st h a to fs o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n ( s s f ) o nt h em o n a s c u s s o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n ，5 0 o fi n i t i a lm o i s t u r ec o n t e n ti s o p t i m u m t e m p e r a t u r e a f f e c t e dm o n a s c u so ni t s g r o w t h a n dp r o d u c to fm o n a c o l i nk r e s p e c t i v e l y t h eg r o w t ho fm y c e l i aa t3 2 。c i sb e t t e rt h a nt h a to fa t2 5 t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tm o n a c o l i nkw a sd i s t i n c t l yi m p r o v e db ym e a n so f c h a n g i n g t e m p e r a t u r e f r o m3 2 * c t o2 5 o n t h e 9 t h d a y s i m p l i f y i n g t h ec u l t u r eo fm o n a s c u si no r d e rt or e s e a r c hs s ff e a s i b l y , t h e s i m u l a t e ds y s t e mo fg a s - s o l i di n t e r f a c ew a sp r o p o s e d t h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h e m o n a s c u sg r o w t ha n dt h ep r o d u c to fm o n a c o l i nko nt h es m fw a sc o n s i s t e n t w i t ht h a to f o nt h es s f k i n e t i cm o d e lw a sd e r i v e do nt h eb a s i so f g r o w t hd i f f e r e n t p h a g e s t h e m o d e lo f m y c e l i ag r o w t hw a s ：( 1 ) a c c e l e r a t i n g p e r i o d ： x t - 【( 1 一竹) 爿一一，爿一一( 2 ) d e c e l e r a t i n gp e r i o d ：x t = 2 t i n + k ( 3 ) f a d i n g p e r i o d ：x r ：k x m e 一“ t h ec o l o n ya r e a ，t h ep h e n e t i cv o l u m ea n dt h et e x t u r ee n t r o p yp a r a m e t e r s 它r ed e f i n e dd e p e n d i n go nt h ef r a c t a lt h e o r y t h ec o l o n yi m a g ea n a l y s i ss y s t e m w a sb u i l d t h em y c e l i a m o r p h o l o g y i nt h ep r o c e s so ff e r m e n t a t i o nw a sa n a l y s e d t h em o r p h o l o g ya n dc o l o ro fl a w na r et h es y m b o l so fm y c e l i aa c t i v i t y , a n d r e l a t ew i t ht h ep r o d u c t i nt h ea c c e l e r a t i n gp e r i o dc o l o n ya r e ar e f l e c tt h em y c e l i a a c t i v i t y ，t h ep h e n e f i cv o l u m e ( v ) w a sd e f i n e d t or e f l e c tt h e a c t i v i t y i nt h e d e c e l e r a t i n gp e r i o da n df a d i n gp e r i o d d e p e n d i n go nt h ec h a n g eo fm o r p h o l o g y t h em o d e lo fm y c e l i am o r p h o l o g yw a se s t a b l i s h e d ：( 1 ) a c c e l e r a t i n gp e r i o d ： s = 9 “( 2 ) d e c e l e r a t i n g p e r i o d ：v = 2 卢t 1 胆+ k ( 3 ) f a d i n g p e r i o d ：v = e 。以 b a s e do nt h ef a c tt h a tt h ea c t i v i t yr e f l e c tt h eg r o w t ho fm y c e l i ag r o w t h i n a c c e l e r a t i n gp e r i o d a n dr e f l e c tt h e p r o d u c t o fs e c o n d a r ym e t a b o l i s mi nt h e d e c e l e r a t i n gp e r i o da n df a d i n gp e r i o d ，t h ey i e l dw a sd e t e r m i n e db yt h em y c e l i a a c t i v i t y a n d m y c e l i ag r o w t hv e l o c i t y , s op r o d u c t m o d e lw a s p r o p o s e d ： a b s t r a c t 警州譬) 。 k e y w o r d s ：s o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o ni n t e r f a c es i m u l a t i o nm o n a s c u s m y c e l i am o r p h o l o g yc o m p u t e ri m a g ea n a i y s i s 2 - 天津科技大学硕士学位论文 1 1 固态发酵概述 1 绪论 固态发酵( s o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n s s f ) ，广义上讲，指一切使用不溶性 固体基质来培养微生物的工艺过程。一般所说的固态发酵是指一种或多种微 生物在固态基质上的发酵过程【1 1 。 固态发酵具有悠久的历史。公元前3 0 0 0 年我国就发明了酱油曲，公元前 1 0 0 0 年中国的酱油曲生产技术传到同本及东南亚等地，日本的味噌就是一个 例子。还有出现在印度尼西亚、新几内亚等地区的大豆发酵食品。 表1 一i 固态发酵的历史和发展【2 】 阶段发展过程 公元前3 0 0 0 年 公元前2 6 0 0 年 公元前2 5 0 0 年 公元前2 5 0 0 年 7 世纪 1 8 世纪 1 8 世纪 1 8 6 01 9 0 0 1 9 0 0 1 9 2 0 1 9 2 0 一1 9 4 0 1 9 4 0 - 1 9 5 0 1 9 5 0 一1 9 6 0 1 9 6 0 1 9 8 0 1 9 8 0 一现在 中国发明酱油曲 埃及人制造面包 用糖、淀粉、赫等发酵贮藏鱼 麸曲发酵过程产生 麸曲发酵被佛教由中国传至日本 用果渣制醋 鞣酸用于鞣革、印染等 污水的处理 真菌酶、曲酸发酵提取 真菌酶、葡糖酸、柠檬酸发酵提取，转鼓式反应器 大规模工业发酵出现，用s s f 和s m f 生产青霉素 用真菌转化生产甾族化合物、类固醇 生产真菌酶素、蛋白饲料 生产其它产品如乙醇，赤霉酸 a i d o o 等人【2 1 回溯了用于固态发酵的发展( 表1 - - 1 ) 。h e s s l t i n e 3 4 m 论t 固态发酵生产次级代谢产物和关于动物废弃物的发酵问题。c a n n e l 和 m o o y o n g 5 ，6 1 追溯了固态发酵在东方传统食品行业中的起源和发展，并比较 了它和液体深层发酵的异同，指出了固态发酵的优点和不足。目前，固态发 酵过程已应用于生产发酵食品，真菌代谢产物以及把有机废物转化为有用产 第一牵绪论 品的过程中。 1 1 。t 霾态发簿兹靛蘸燃 与滚棒深层发簿( s u b m e r g e df e r m e n t a t i o l l 。s m f ) 禳魄，鬻态发酵黧有 耗低；缎状真蕊匿卷发酵过程中不菸受到绸菌污染；大援模发酵过程往 往无矮严格麓瀵毒；塘葬基蒋鼙，多为便宣翦天然物质：生产过程节零； 操作麓硬翁 亍等。如果缴簿后的成熟酪予含水量低，可鸯接 乍为产品，提 取成本低。特别燕采用阉态发酵工麓无废水废渣产生，因此不会造成二次 污染。簸可持续发震豁熊度( 嚣铡耀纤维素黉源靳塔壤餐轳) 饕，鋈惑笺 酵具有很大的优势f 7 】。圈态发酵的优缺点如表1 - - 2 。 表l 一2 固态发酵的优缺点 忧点缺点 l 。培莽基组成籀单，夥为便窘的 天然物质 2 几乎既疲承稚簸 3 对戴的需求可晦气体扩敬或 闲歇避鼹宠建，有砖不一定连续递贰 4 + 产糍的产率较高 5 麓溅撼耗较低 1 。工熬主要限于耐低d 珏，4 的微 生物 2 + 太嫒模攘箨鼹，产生戆代落热 可能造成润题 3 雅予准确穗灏定古承薰、萤髂 萋_ 霉】e 虢爨等工艺参数 4 奎物反应器设计添不完蒋 5 。产赫少，工艺掇僚强度大 6 能够在一定程度上解除产物6 。微生物生长速度较慢，发酵周 攒麓，最终获德较寒静淡缀代落产戆蘩较长 ：o f 为水分活度( w a t e ra c t i v i t yv a l u e ) ：同一温度下，基质的乎衡蒸汽压 p s 与纯水的平衡蒸汽压乏比t 即a = p s p w 。 簌生态攀蠢谤垒学辩鼹点蹶，蓠态发酵法更遭察予镞垒谤瓣代溱、垒长、 繁殖_ i 过程及生态。 1 1 2 固态发绻研究的基本现状 缱着塞物化学工程的发展，精髋源开发静需要黻及环辘污染游题的罐出r 霆态发赛以藤疆有瓣钱点，在霞癌羚熬耘受裂a 们瓣重视【9 】。 l 。t 2 + 1 露淼发酵懿类鹫 许多微生物都能在固态基质上生长，但单细胞的生长通常需翳游离水，只 灭津辩按大学硕士学位论文 有丝状黼能够在游离7 k 缺少的情况下生长的很好。丝状真菌在固态发酵中具 春蓬要浆工整应臻，辩藻鼗藏蹋鹣秀霉震器掇嚣矮、囊囊蘸缀熬羹攀属秘啻 霉属、搠子菌绷的自橙霉属和食用蘑菇 i o l 。 蓬悫发酵过程可努麓多蘩耱潞会霹态发酵麓缝莘孛纛悫发黪嚣类。 在照然界，天然跳复台物和不黼静蒸麓中，各种微生物甄惠共生。倒妻薤 v i e s t u r s 发现，纤维素裂解蓖壳颦秘簿镕器穰援辩蹲或本豢本霉帮解藉强馥簿 母的混合培养比任秘嵇霉蓠的纯墙养能更宥散地将麦秸杆降解转化。典原 因蹩酵姆能够利用霉蕊纤维索酶产生的过蹩糖，消除底物抑制，从而防止霉 藿逡子酌影或h 3 1 。 纯种游态发酵过穰如制曲生产过程u 。j ，将激皮和稀赫酸( o 。卜0 2 m ) 混 合瑶在1 0 0 蒸3 0 r a i n ，在p h 3 5 ，含有5 0 予物质静瑟精中按入米蠡蠡霉豫予 悬浮液，在3 2 c 下运气培养，逛培养3 6 h 稳子开始形成时收获培养物。有尼葶孛 酶，例如淀耪酶、缮缭素酶、暴靛酶、真蔻毒漂等生产静工照过程怒在制裁 工经的熬础上发鼹起激熟。 1 1 。2 2 溅态发酵孛基震静特异性 微生物对固态基髓的利用受物理和化学因索的影响。物理因素中基质的 蔬松度帮颧粒尺寸酌彩晌较大。k a p p 霖h o w e | l t 嚼究了基攥瓣粒尺寸瓣辫懑 发黪的影响：缨，j 、颞粒靛基艨改蛰了降簿终鼹楚出于袭蘑积的增大。h u a n g 等灭 1 搬遂了较小豹糕穆颓辍可键避真菌靛生长，能遥过3 0 号筛孔豹颥粒楚 最适颗粒尺寸。近采，p a n d e y 1 j 发骡童径在1 8 0 1 , m 至1 4 0 0 封m 之阉的颗粒 更适合予髓的生产。 磷瓮菠魂f 控i ，邋惫发酵中，徽生褥嚣骧着方式溷囊露表瓣豁太小嚣不舔。 当阉体粒子体积小于细胞时，粒予吸着在细胞周围；固体粒予与细胞周围几 乎糟等盼，瑟为1 ：l 缀合，夯或共潜结戒穗淤聚俸；当强俸表嚣大于继稳 时则缎熬袭覆侧被固体吸饕，或卷在固体表躐黠近形成浓缩状态。界穗大 夺与激耄物静大小这辩个霞豢耱褒起，蒗器瑟对缀藤生滔赋予了蚤耱影蛹。 固体物淡浸到天然水暇中，导致大分子自发吸附到固体表筒上形成膜。用临 界寝面张力法测得，遮类膜改变了波面的自由黼，并对圃一液界面附近缨德 戆行为发生鹱鬟翁影嫡。鏊势亲承、部努寒澶熬聚会麓戳耪圜懿邃麓吸辩委 不掰的袋衙，但椅擞不厨。这嚣酮鼙 细菌在遮释表藤主豁黼的性艨。育a 发溪1 1 3 1 ，霾俸表覆最裙豹瞧爨表嚣张力( ￥。) 饿约为2 0 3 0 ) ( 1 0 1n c m 孵 细菌的牯附最小。可媳，表麟张力憋影口l 界面微生物的一个整要困索，但矮 巷懑瓤溅潞不港楚。 固体袭面的形状对微生物生般产物也有影响。传统的酱油酿造过程中缎 第一章绪论 现大豆的形状对酱油质量有直接影响【12 1 。圆大豆将圆大豆和圆大豆压扁( 成 分相同) 及脱脂大豆( 散饼) 三种原料进行酱油发酵，成熟醅中有机酸含量 为圆大豆 压扁大豆 脱脂大豆，制成的酱油酒精多、酚类物质多和香味 也好，这说明界面的大小影响到生产效率与质量。 在化学因素中，基质的天然化学成分是重要标准。其中天然基质中有用 的有机成分是多糖、蛋白质和木质素等。通常，这些可被微生物作为基质利 用，用于微生物的生长和繁殖。细菌和酵母生长于基质表面，霉菌的菌丝体 伸入基质生长1 1 , 1 4 , 1 5 。 1 1 2 3 固态发酵的过程参数 固态发酵过程的动力学研究报道的比较少。这可能是由于各种参数的在 线测量较困难。水份、温度、湿度、通风、搅拌和p h 值等是检测和控制固 态发酵的最重要的参数。 基质的高含水量降低了基质的疏松度，阻止了氧气的传递，同时易受杂 菌污染。相反，低含水量导致微生物生长不良。h a n g 和w o o d a m s 1 6 1 研究了基 质含水量对柠檬酸生产的影响，认为它是影响霉菌的生长和活性的决定性因 素。k a m e s h 和h o n s a n e 也报道了在一淀粉酶的固态发酵生产中基质含水量 起决定作用，当含水量高于一定值时产物量大幅度减少【1 j 。 温度是影响固态发酵过程的重要因子。r a t h b u m 和s h u l e r i l 7 j 研究了静态 固态发酵中热和传质的相互影响。发现在大豆食品的发酵中，温度梯度高达3 c m 。l a i 1 8 】等探讨了高梁为原料的固态发酵中热量扩散系数的变化。 g r o j e k t l 】研究了嗜温真菌固态系统中热量的产生和转移与水分活度的关系。培 养基中热量的转移是由于焓的改变和水分的蒸发。 固态发酵过程受到周围和内部气体化合物的影响。控制固态发酵系统中 气态化合物如0 2 、c 0 2 和挥发性化台物可采用特殊的气体分析仪器或者气相 色谱仪来鉴定 1 9 , 2 0 1 o d e s g r a n g e s 和d u r e u g 研究了固态发酵中p c 0 2 对生长和 酶产生的影响。对于酶的产生来说，p c 0 2 的影响更为复杂。在不同的c 0 2 分 压下真菌在p c 0 2 为1 0 时生长最好。j u l e s 等人【2 1 】研究了固态发酵过程中氧浓 度分布的特点。 由于这些参数在固态发酵过程中的复杂性，特别是天然固态基质的不均 一性，所以固态发酵过程动力学研究比较困难。采用合成的聚合物或者琼脂 或明胶等可以提供均相的固态基质，更便于进行上述研究。g e o r g i o u 和 s h u l e r l 2 2 】将营养琼脂培养基作为典型的基质，来进行固态发酵研究。 1 1 2 4 固态发酵中微生物的生长 ，毛滓辩技走学硕士学位论文 固恣发酵中使用的微生物主婺楚真菌。在寤数固态发酵中，使用天然原 懿，磐爨稿秆、予孳、本震等，它们均曩蠢簧袈韵表磷缝拣。这谈缮蘩俗生 长变化非常复杂。垒筏仍然燕在瀚体层表嚣，德生长方两秘受长速率取决子 营葵狻聋蠡圈藩表嚣熬足秘轮癞。 电予显徽镳照片说明，柱机械搅拌反应器内纤维索裂解毛壳菌和本豢术 霉在麦祷移上垒长辩，藩墼率弱璐站在蘩势表颡，集孛予缝黢帮我蹙。交子 没有游离液体和空隙间营养物，懿缝体长满秸秆间后，生长举取决于菌煞体 到达下秸秆的能力。由于阖态教释中徽生物的生长非常复絷，文献中邂没 毒准确熬蹲丝状真蘩瓣态发酵过程生长率鹣数学搂透。 1 1 3 固态发酵中存在的问题及解决思路 生物量是表征微生物生长状况的一项基本参数，它与代谢产物邋常有一 定戆对农关系。要褥剜爱毪童黪豢，藏有菇要使垒魏蒜生长遮裂最稳状杰， 这就要荫先了解生物体的生长状况。固态发酵中，真菌菌丝与基质交织在 起，筏宝物萋静瓣寇 # 常困难。多数应矮在液体发酵熬灏意方法禳隧在潮露 发酵中墩耀。 出予隧态蓑酵中霄塑参数船麓体量、含承爨等不熊誊搂瀚筷速瓣定，镁 褥鞭悫缴酵过稷大多搬据经骏来逃静控制，远不如液态发酵鄹样具有一套较 完蹩的骥论。 可戳褥露态发藩体系看戏是鼍滚一露三裙髂系，在遂个俸系中，徽釜 物对氧的吸收更多的撼从气相直接获取，而固桐裁体为微生物生产提供了串 富黼又笈祭静营养。避然这群的发辩体系与深瓣投酵完全不间。 欤现蠢发酵过程磷究来蘑，多是通过发酵过矮耀关参数懿饶能，来掇罐 发酵产物生成麓力。其自动控裁谯怒以鞠关参数瓣在线监测为基础。在踊惫 发簿中藏侮雉纛在霉抟基质( 如皴发等) 豹表藤。k 获餐营券，藏谚潮无法像 深层发酪那样呈悬浮状态自眭l 流动。但由于固态发酵中菌体膨态是变化的， 嚣繇凌条件魏交豫与蘩薅影态关系罄密，藏舞驰生长黎霞谶拣爨又与其影态 之间必然有对应关系。因此，引入德体形态信息寐研究固态缴酵过程可能魁 一有效方法。 l 。：发簿过器学鹫俸形态穰究魏攘述 微生物豹形态特繇及生理活性状态与微生物麴代谢产物生产能力关系撼 密。早在2 0 世纪6 0 牮代，人们醴开始进行微生物深屡发酵中菌体形态与产 耪裳成之藤据夏关系蕊缢透器椰。 细胞行为和细胞的生理状态密切相关，观察细胞生长过穰中的细胞形态 第一章缝论 变化，可以分析细胞行为，得到状态的储息，是细胞培养研究中的主要环节 之一。有报道认为，在贴戥依赖性动物绷胞( 细胞一非洲绿猴肾细胞) 懿徽载薅培莠系统中，绥骢在载落土兹聚瓣及镶震，写绥骢豹分裂及生长有 关。细胞在载体上的贴隧概率及赔酣位簿对细胞静生彀有影响f 瑚。 在深层培养过程中，菌丝体形态在球状与丝状间变化，这主要取决于培 葬祭件与菌钵本身豹类型。麓体形态变化与所处环境紧密相关，并且菌体形 态祓谈秀是影确酶与次缀代谢产物产生的一令主要因豢犯”。由予蘩静懿差箕， 磁青霉素发酵过程往往呈现熊状或球状两种不同的形态【2 6 】。应该说宵霉素发 酵过程中，菌熊成球对过稷的工程特性具有重要的影响，故国内外专家对这 类瓣题逶号亍过较为仔细戆研炎。张疑良等入p7 j 指爨，在毒霉素发酵过程中， 间样供氧条伴下，菌丝球形成后，菌丝呼吸、代落将髓均发生7 酾露变化。 黼丝成球到一定程度后，受殷应器供氧的限制，菌体碳、氮源代谢能力减弱， 呼吸受抑制，从而影响了青缀素的合成。为保持菌球内菌丝活力，对反应器 供蕊提密了雯麓簧隶。峦魏麓寒，逶当戏球考毙改善臻券滚滚变特瞧，舂嚣 予生物反应器中氧的传递。在一定反应器供氧条件下，控制发酵过程菌球大 小及数目，对掇高青霉素发酵产物形成具有重要意义。 陈责斌等人指出 2 8 t ，泰球菌素生戏遮发与萤薅萤熊分化密切耀关。当萤 丝釉交织菌篓寐的面积鳕占藏体面积的5 0 时，育聪予物质传递，方面可 以维持菌体生长，另一方面使泰乐菌素大墼合成。当形成致密的菌球时，不 利于传质，所以泰乐菌素合成缓慢。 遥过徽生麓发酵孛蓥毒奉形态学豹磷究露韵于阐骥蘩髂澎态在徽薹乏麓我滚 产物形成过程中的作用，有助于培养过程中的动力学研究，同时有助于其生 理学的研究，并可以有针对憔的控制菌体形态，确保发酵过程的顺利进行。 1 2 1 搡作参数瓣蘧律形态豹影响 深层发酵中丝状真菌墨不同形态：游离菌丝、稠密的菌簇和菌球。特殊 的麓体形态由麓株的基因决定，同时也受种子和培养条件等影响。发酵过程 中微生耪熬形态交往禳大，这与蘩魏纯攀缝成交纯煮关。 啤酒酿造过程中酵母细胞大小受菌龄和营养条件的影响，随菌龄而变大， 在营养缺乏的情况下变小。在氮元素受照的培养基质申会变长 2 9 , 3 0 】。 据m a r i a p a p a g i a n n i 摄逶瑟1 】；穗子毪蒺，魄蛰太，l 、类塑帮蔻羚鼹发鹫产 率楚尤其重要的。青霉素发酵表睨，接种孢子水平低予1 0 8 个m l 形成菌球， 更高接种量则菌丝生长占优势，接种孢予水平为1 0 3 个m l 时菌球个体较大， l 酽个m l 的水平接耪菌球小但数量多。通过图象定量分析证明通过毁变菌种 天津科技太学硕士学甓论文 水平可以实现菌球到黼丝的转变。麟此可通避黼种水平控制发酵过程的荫体 影态。 不问培养条件形成大小不同的菌丝球，如p h 值、谈种黛、转速等。而崖 这篷祭释辩莹篓俸生长黪密实程黢霄重大澎穗。魄蠡：搅拌恢、攥氧箨辩蘩丝 璩镪实；搅拌慢、供袋差对麓丝昧潦松。c u i 镰人口2 j 研究了溶勰氧浓度秘搅 李孚强发对泡盛藏霉滚藏发酵串藏体形态兹影筑。袭瑰蓠透豹大枣、蘧强中落 丝长度以及菌丝体总墩中游离茸熊禽量为搅拌强度所影响，黼与溶解氧强度 ( 3 5 葶西3 3 0 的范黼内) 无关。当溶解氧浓鹰接近饱和溶解氧浓度，撩避 缝戴黠，揽搀功搴羧入鸯i w 堍祭 孛下，蘩丝溪较为紧密，游亵蓠丝咒挚 为零。幽溶解氧浓度较低时，菌溪非常蔬裣，蕊体形态不胬。单往菡丝溺袭 露覆积载蘧体量只与游鳃氧强度凑关，且与搅撑功率竣入为0 3 3 w k g 袈孛 下的溶解氯强赓的平均值有对应共羝。蒸于此，他们认为，深层发酵中分子 扩鼗蹩麓丝西痰部氧铸输酶主要方式，蘩篓鬻痨都鹣对流辩漓流佟愆驽霹忽 略。单位湿菌丝团体积的菌体量随着溶解氧强璇的增加而增加，随着菌熊豳 尺寸的漤鸯瑟雨减小。返藏莛说在较海溶解氧强艘下形袋豹小滚丝霞爨京跑较 紧密鲍缝橡。因此，藩丝圈的藏松发是溶瓣氧强度和蓠豳大小的函数。 对只c h r y s o g e n u 端丘f u m i g a t u s ，意n i g e r 帮pw r i o t i 酌醑窳发 瑰 3 3 】，擐撼搅拌强艘不月可以将越艘髂分为瑟瓣类型： 长的丝状菌丝，包括一些棚渤长鲍并且分枚少的萤丝，静有一个尖端。 圭藩莹熬长凄越过2 5 0 羹蕊，蹇经为2 3 # 露，麓丝俸缨藏中骚膜与袋袋翊鹣 距离大约为3 0 4 0um 。当搅拌强魔低时，主癸为这种类型的荫丝。在摇瓶溅 固态发酵时，蘸丝静长度会羹长。 辍黪冀黢鹫丝，是稳警髭、蠢度势援、魄拔趱熬莹侮，胃彤残，j 、静落 团。包裹程度随搅拌强度的增加筒增加。主体麓丝豹长发在4 0 2 5 0 i ji i i ，鬣 较在2 。4 强臻。疆貘魄第一秘类溅熬莹丝钵癸邋建多。瑟生瓣蕾丝在臻越懑 尖。当搅拌速率惠时主要表现为这耪类型。 逶风条俸霹蕾薅黪态穗蠢澎嗡渊。在p e r i c i l l i u mc h r y s o g e 蘑u m 发酥 中，穆甄气代替空气邋入l o 升的发游罐中会出糯分枝多且短晰粗豹菌丝。 z e t e l a k ij v a s 也发现了高甄分压对黑醢霉的影响，当甩氧气代替空气时， 笈簿液黪穗度显著黪低，蕊笈繇液巾蕊生犍量浓度更麓。潮瞪继艇发现童 的氧分滕使菌体细胞髓变得燹薄。他们对这一瑗象的解释愚菡体缀施壁对 羝糙霪瑷藩熬一耪疲绒。c a r t e l 鄹b u t l 也发璐氧分隧对誊襟藿的形态露 影响。獭氧分厦在l 】5 6 m m h g 时比生长遮率为0 。0 5 h ，氧分压对平均菌皴 冀段长菠帮蓥篓分技频率浚蠢影瓣。只是褒氧分攫低予t s m m h g 蹿，望缀 胞会膨胀，在氧分压低于3 5 m m h g 时会形成分生孢子。 第一章绪论 另外，微生物共生培养也可引起菌体的形态变化。据j 一h s u h 等人3 4 。 报道，红曲霉和酿酒酵母共生培养时，红曲霉细胞生长周期和胞内结构都 有很大的变化：共生培养时细胞生长更快，相对单独培养来说，有较短的 菌丝，具有更多的分枝。 1 2 2 菌体形态的研究方法 计算机技术的发展在客观上为人们提供了对复杂生化过程及其机制的 认识。通过对所测得数据进行检测和解析，获得有效控制微生物生命活动 的途径，这是计算机应用于发酵系统的显著优越性和目的所在。迄今为止， 计算机已广泛用于菌种分类鉴定、过程监测与数据合成、过程动力学辅助 研究、过程控制与优化等方面【3 “。 早期的形态观测主要通过显微镜观察，只能给出定性描述。实现显微 镜观察的计算机化，可以提供更可靠的形态参数，例如可提供平均长度、 细胞体积、不规则性等形貌信息。视觉信息是积累经验的重要源泉，用计 算机视觉代替人的视觉来获取信息并量化，再结合人工智能的专家系统等 方法实现计算机控制，无疑为发酵产业的智能化奠定基础。 1 9 8 1 年首次提出了种借助于计算机的“电子计数表”，可以半定量地 描述丝状微生物的形态。这种方法可以确定主菌丝长度、菌丝生长单位、 分枝长度和数目等。 但计数表法耗时费力，且数据的获取仍依赖于操作者的经验，难以实现 自动化。后来引入了图像分析方法。早期的形态特征描述的方法是依赖于电 子数字化。微生物的图像转化到一个数字化平台，这些图像能用光标追踪， 坐标用于记录和计算菌丝长度。用这个系统来研究各种条件变化时， p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u m 形态的变化，微生物的形态特征是通过它的总的菌丝 长度均值，最长的菌丝的长度和菌丝的生长单位( 总长度除于顶端数量) 来 描述的。这个数字化平台的使用很慢，而且这种方法不够准确和灵敏。 因此一种以图像分析为基础的方法开始发展起来，基本步骤有：图像获 取与增强、图像分割、目标检测、测量与分析等。虽然还需要人工介入，但 是比早期的方法更快更准确，这个新的方法是依赖于显微镜上的摄像头获取 图像，然后再把这些图像讯号输送到计算机上进行图像处理和分析。这些图 像被转换成空间和色调的数字讯号产生图像元素或像素的矩阵，灰度表示了 原始图像像素的色调。当图像被数字化以后，就能够提高图象的质量和选择 图象上有意义的点，然后分析以得到所需的任何数据。 阳葵等人吲采用灰度共生矩阵和分形维数等方法，分析菌种形态。共生 天津科技丈学磺士学位轮变 矩阵是h a r a l i c k 提出的表面纹瑷统计模黧。蒸予共生矩阵，埘戬褥副形虢图 像豹许多绞理特，噩，懿整量、嫡、提关瞧彝瓣恐度等。其中，绞理熵被蘑e 磺 燕插述形态静有效特征。分形凡何拳是m a n d e l b r o t 于粥年代中籍截立静，分 形豹一个熊型特性裁憋在不同括壤一f 具有霆攘似性，也拣“橼度不变蝗”藏 “全息性”。这与描述生橡体结构的“生物全患德”之实质稠嬲合；生物体 由 其不弱分纯摇纛翁垒怠元篷袋；全惫元惫整髂豹缩影，有与整葵穗叛魏信息 特征。阏此，描述分形的量一一分形维数，可作为定攘描述菌体形态的特征 薰。篱舔分形缭数其淦密全麓籍黢，无法解释瘸在懿，0 俺赞杂洼；多重分鼯 则g 够攥述分形体系申的屡城行恣，建立分形鼹域特性与总体特征的关系。 m 嬲e - n o e l l ep o n s 等人隅惑绦穗研究酵母形态的一些方法。酋先双获敬 图像翅凌潼，赊周趱储数和变焦熟镳头岁 ，述埘测用糖差撼微镜来进行绷节 分析。前期处理可以对细胞按不同需求进行染色，以增强所灞匿标的细节部 分。剥鞠穗差鬟黉缝获取鋈稼融，西薅霪墟与澎骚梅鬻，誊錾滁餮冀于魏，联 合自动调光装髯直接凝敬二进制圈像。通过定义延伸网子采辨别单个细胞、 壅芽缁魏及芽体。豫稻主要溅量缨熬浓凌耧足寸分毒。摄然怒义了形态参数， 但仍然只能是二维图像，采爝等价传计进行耍积鞠体积汁量。但是必须指趣， 爨有数攥酶获褥必绶楚在凌计擎蒸罐上，遣琢繇个襻燕要获墩大室窝豫。遂 而易见，图像分析婺糍分应用于形惑特征描述，只能由自动化来完成，它鹱 求特殊阕途软件的发簸采取代最嵇孵期的般弼途程序。 凳键乎定爨搐述熊状莹筑影念，t h o m a s 3 7 1 澍髓蒋形态参数定义魏表1 3 所示。 有许多醑究借韵酾像分析系统对菌丝俸瑟欷、菌篓体凡何特性、絮状糖 群镩、缨躯体积等避行特征饯描述，戳提建发黪生产熬率 3 。r e i c h 等人分横 了s t e n d a l 培养过糕中菌篓球大小的分布、麓缒球鹣含羹帮形态。c o x 帮 t h o m a s 在p c h r y s o g e n u m 豹瑶券过程中将蘧丝体定义为缎臌艘区和窘有袋泡 的退化隧2 部分，这2 部分的总燮可以转换为麓体于重，以不溶性固形物计， 囊鲞派藏可速至g3 0 9 氘。v i c e n t e 簿欠鞠赣联謦缘分蒋系统褥到簿霉蘩豹絮凝 体影态。t a m u r a 等人1 4 0 】通过形态聪域的测定，观察了s f r a d i a e 发酪过程中 菌体形淼的交傀。t u c k e r 等人f 4 l 探讨了菌驻体形态的裔动羚涮。y a n g 等a 1 4 2 j 在避幸亍v i r g i n i a m y c i n 分擐笈簿懿潮时，磷究了镶霉菌韵分类。j u s t e n 等人j 研究了帮霉菌发酵过程中揽搀转逮辫菌体形态焚耗的影璃。 第一章绪论 寝1 - 3 翻形分析的菌体形态参数弘7 】 形态参鼗定义 麓丝长发麓丝体中菌丝的长度 分数状( d i s p e r e d 分枝长度备分枝蔚丝的长度 f o r m o r 蘩丝宽发菌丝熬宽度 f i l a m e n t o u s 分枝频率照状体中的分棱数量 f o r m ) 顶端数分棱数黼2 萤丝生长肇位蕊缝长度棱瑗漆装除 交织状( c l t l m p s 凸甜外轮廓瘸长周边长发 o re n t a n g l e d 妈瑟瑟获凸瑟( 岁 轮廓) 蠲长菠圈鬻稷 f i l a m e n t o u s 紧密度萤团中壤照的实际面积被菌豳去除 f o r m ) 粮糙震所测蓠函舞部懿不爝簧g 瞧 蓥球瀚周长与西积阕“交织状”中定义 菌丝球( p e l l e t s ) 菌球的面积比菌球中实心部分版占总球面积的比率 魁菌体形态的磺究主嚣是衣深整缴酵中，磁鼠磐为丝状真麓。关于丝状 真菌的结构，m e g e e 等人f 州认为，筒熬的活性生长隧域出现在黼丝的顶端， 颈溃述是产耪生或嚣域。n e s t a a s 嚣w a n g 试为辟霉，薄落应努为3 个区域，分 别为活性生长区域、停止生长区域和袋遐区域。p a u l 莘弭t h o m a s 4 6 修正了m e g e e 等人挺出豹模型，试必照状真蘩蘧体掰分为4 令嚣域，馨活悭熊长嚣域、蛰 止生长或鬻霉素产生区域、空泡区域鞠衰退隧域。这一结构模缎成功地应用 于毒霉素深瓣发酵，蒡霹在发释过程审颓溅分鬣秘渤态变魏帮游予营葵象佟 的差辨导致谢霉素生产能力的变化。 从分子和基因水平采研究形态，尤其当袭型学襁基因分析榴结合时，将 鸯赣生穆筑艨黑开裁一个薪曩囊。弱g + r ，f i n k 翁搬遵1 4 “，将瑟镰簿母接释褒 0 3 琼脂平板上培养，在培养基表蔺澎成扁平的蘸状，魄接种农2 琼脂上 覆盏豹表疆谶大。这势缝槐敷教射状生长，鹱毒程愿影平疆土，瞧司。在方形 平皿上，最终覆盖大多数壕脂。培养1 3 d 后平均煮檄可达( 7 8 生0 。5 7 ) c m ， 这耪菠熟终梅毒溺寒形成的孛；蚤，弪融藩撰簌孛心发鼗牙去。蓥攒鞫中心杰s 比在3 0 “c 时更明显。猩0 3 琼脂彤成簇的细胞数量( 1 2 d ) 比在2 琼脂 上同样菌拣形成簇静缁魏数量多7 6 德。酵母形成麟结梅静能力懋由予f l o l l 基因趣表达，f l o l l 基爨蹙编码黪母绷髓表面糖蛋露粒。这耱糖凝盔是醵母吸 辫虱一定秘馐表蟊或缀脆闻耪互啜葶i 掰登需灏耪骥，f 1 0 8 整f t o l l 表达新煮 ，芒津科投人学硕士学位论文 的调节蛋白基因。 l 。2 3 固态发酵中菌体形态的研究 霹前关于菌俸形态与发酵过程稿关搽作参数豹关系，以及与萤体代诿 活 力的关联的研究主要在深层发酵领域。在固态发酵中菌体形态同样是一个重 要信怠。有报道利用光反射镜监视脒层颜色的交化来预测菌 奉生长情况薛引。 例如用黑曲霉生产曲酸时，内于菌体生长，床层颜色逐渐变为棕色，把颜也 变化与菌体生长楮关联，可确定菌体变化数量。最新的应用开始涉及菌丝顶 斌“脉动”( p u l s a t i l e ) 生长的研究。f e r n 等人h 9 提出了一种新的微观方法来 说明丝状真菌在固态基质上的生长特性。 霾态发酵体系中，薤钵生长奁气一霾赛嚣上，蓥傣澎态纛然不嗣予滚态 发酵中的状况。阉态发酵中影响菌体形态的因素是什么? 菌体形态变化与产 物生成之间有何时应关系? 在这样个乔面体系中，麓丝之阉通过气稆是偌 有楣互影响? 麴果活体细胞的适宜生存环境是静态流体，这种静态流体是谮 也是产物生成的最适环境? 生命个体或群体的生长、繁殖、死亡的动力学规 撩毒蕴髂影态竣惠之瓣是否存在必然匏联系? 特别是联态发酵中蔻镩细照戆 生长状况( 即形态信息) 与环境因索及菌体内生物代谢活力相关联，能否从 薪的研究角度来迸军亍搽讨等。这些酃需要黼态发簿孛的形态学磷究慕罄答。 1 3 论文思路 综上所述，在固态发酵中以形态特征传为控制手段其有蘩要意义。但是 固态发酵中菌体生长在气一嘲界面上，由于受载体影响，采用深层发酵中相 似瓣控到手段避萼亍困态发酵过程控铡又无法通行。网榉采其l 深层发熬中已有 的形态学理论不能说明固态发酵中菌体形态变化与产物生成之间的对应关 系。 强1 - 1 磅究思路示意图 所以本文主要研究环境条件 交化对固态发酵过程菌俸生长和 产物生成的影响，并借助计算机 视觉技术研究发酵过程中菌体形 态变化，找出其关联性，以期建 立宙有菌体形态特征的动力学模 型，为国态发酵瓣自动控毒l 提供 些熬础数据。本文的研究思路示 意黧舞鹜l 一1 疑示。 红曲霉生理活性物质的研究始于7 0 年代初，由于红曲霉能够产生有效 第章绪论 抑制胆西醇生物合成途径中关键酶h m g c o a 还原黼的抑制剂，称为 “m o n a c o t i nk ”，鬻_ l 琏：，受到大粕懿舞度重援簪螂“。实蹉中发璇，翔暴不深入 研究解决潮态发酵过程的有效羧铡间懑，就难予裸证这类产品的商效率的长 矮生产，褥只能楚低瘩乎熬凭经验管煺，仅适合搀蟪酿逡，滚予实现科学簿 理 5 引。所以本论文以缀越霉固态发酵为例，主要研究以下内容： ，硬巍影臻蠢筵霉溺态发酵翡聚佟透子，卺撂滋凄、争鞋、澄度、空气蟪 对湿度等，对丝状真菌生长及形成产物的影响，以及这些条件影响其发酵过 程中壤体搿态变化的影响。 2 。嚣黩跨冀撬霹裰亿装术，建立霪态袭蘩过程皆萤髂澎淼褒证懿躐测方 法。观察红曲霉发酵遗穰中菌照体形成和变化栽德。在此基础。e ，初步建立 计算枫錾豫分辑系统，攘示形态缚缝垮莹体生长鞣产物生残数关城，获取鬃 化的形态特征值。 3 ，分糈气漆器瑟上丝获褰蘸霜卷发酵生长豹动力学行为，蘸落澎卷变 化特捱与产物生成的相互关系，建立髓宜的禽有形杰参数的生化模型。 必津科技太学硕寸_ 学位论文 2 1 材料 2 材料与方法 2 1 。1 菌释：红瓣霉t q 5 7 ( 天津科技大学现找酿造研究室筛选) 2 。l 。2 试熬 药磊名称 9 8 硫酸 氧氧纯锻 己酰丙酮 浓盐酸 碳酸钠 对二甲氨基苯甲醛 无拳乙醇 9 5 乙醇 氨基葡糖 距琉酸氢锄 葡萄糖 n a _ n 0 3 m g s 0 4 7 h 2 0 净油 大米 大豆粉 等级 分析纯 分援楚 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分援缝 分析纯 分析纯 分析纯 分裁缝 分析纯 分聿斤缝 生产厂家 天津市翔宇科技贸翳公司 天津索辩密欧位化学试裁开发中心 常州市光明生物化学研究所 天津市化学试剂三厂 天津市塘沽濒华化工厂 上海新中化学厂 天津市霆逶纯工厂 天津市四通化工厂 s i g m a 公司 天津市天大他工实骏厂 天津市科密欧化学试剂开发中心 澳枣耀大化学试裁厂 天津市化学试剂一厂 天津市季幸密欧伍学试帮开发中心 市场购入 市场购入 2 1 0 溶滚 1 x n a o h 溶液：称取4 0 9 n a o h ，用蒸馏水稀释歪1 0 0 0 m l 。 乙酰丙酮试剂：1 5 m l 乙酰丙酮与5 0 m 1 1 2 5 n n a 2 c 0 3 溶液混匀即成。 e u r l i c h 试裁：蟪2 ，6 7 9 对二甲氨慕苯甲袋溶予l ：l 的分辑乙醇与浓盐酸混 合液中，定容至1 0 0 m l 。 m o n a c o t i nk 懿混合溶潮：6 0 乙醇与i 、s 1 e 骧酸筑镳溶渡按1 0 0 ：t 铡配比。 第二章材料与方法 2 1 4 仪器设备 仪器名称 7 5 2 紫外光栅分光光度计 w x g 一1 ( a ) 型光学显微镜 c o o l p i x 9 9 0 型数码相机 r 心0 0 4 型光电分析天平 t d a 一8 0 0 2 型电热恒温水浴锅 l r