（细胞生物学专业论文）atugae4反义基因转化烟草和拟南芥及对细胞粘连性的影响.pdf

摘要 月芒吲尉反义基因转化烟草和拟南芥及对细 胞粘连性的影响 硕士研究生 专业 指导教师 童超 细胞生物学 张兴国研究员 摘要 植物单细胞悬浮系可以提供大量的遗传背景和生理状态一致的单细胞，因而在进行细胞 生物学研究、突变细胞株筛选、大规模细胞培养、基冈功能分析和遗传工程等方面具有重要 应用价值。但是，由于植物细胞间的相且粘连作川难以消除，至今尚未能获得植物单细胞悬 浮培养系。在生长的植物细胞中，细胞晕主要由纤维素、半纤维素和果胶以及少量的结构蛋 白组成：其中，果胶对植物细胞粘连起眶要作用。果胶是由u d p ? 卜乳糖醛酸 ( u d p d g a l a c t 啪n i ca c i d ，即u d p 乇a 认) 构成的同质高分子或与其他单糖构成的杂合高分子。 在植物中，u d p - 、f 乳糖醛酸由u d p 一葡糖醛酸筹向异构酶( u d p g l c a4 唧i m e r 镐e ，即u g a e ) 催化u d p 一葡萄糖醛酸( u d p 心d g l u c u r o n i ca c i d ，即u d p g l c a ) 而合成。因此，若能够抑制u d p 葡糖醛酸筹向异构酶基冈在植物中的表达，则可能抑制果胶的生物合成，减少细胞问的粘连 性，为获得植物单细胞系创造有利条件。 本论文自拟南芥中克隆了彳f ( ，g 4 明基因的家族保守序列，构建成反义基因表达载体。经 农杆菌介导，分别对烟草和拟南芥进行了转化，获得了4 株烟草再生植株和大量拟南芥的愈伤 组织，以期构建的彳f 驮纠尉反义基因在转基闪植株中表达，产生与该基因的转录，k 物互补的 反义1 1 1 】 矾a 片段，从而抑制该基因及其整个家族基冈的表达，达到抑制果胶生物合成，降低细 胞间粘连性的目的。主要研究结果包括以r 卜儿个方面： 1 4 亡矧尉基因反义表达载体的构建 利用胁i 槐ci 酶切克隆载体p m d u g a e 4 和表达载体p v h s p 7 0 b g u s ，分别回收 彳f 明钏尉基因片段和p v h s p 7 0 b g u s 质粒大片段，并连接，得到含有h s p 7 0 b r 已4 f 伙钥b 1 n o s 反义基因表达盒的表达载体p v 7 0 b r u g a e 4 。该反义基因表达载体经p c r 、限制性内切酶酶切 鉴定正确无误后导入农杆菌e h a l 0 5 ，用于遗传转化。 2 4 亡蚓髟反义基因转化烟草和拟南芥 经农杆菌介导，将彳f 伙魏尉反义基闪分别转化烟草和拟南芥。获得4 株具有卡那霉素抗性 的烟草植株和人量具有矗那霉素抗性的拟南芥愈伤组织。p c r 检测结果显示，均能检测到 么f ( ，g 一酎基冈的目标条带，而非转化植株呈阴性，初步证明外源基因已整合到烟草和拟南芥 两南人学硕十学位论文 的基因组中。具有卡那霉素抗性的烟草植株的根组织和拟南芥愈伤组织在3 9 5 姗的光激发下， 能在荧光显微镜下检测到绿色荧光，证实觎p 基因及与之连锁的h s p 7 0 b r e ，( ，g 4 酮反义基因 已分别整合进了烟草和拟南芥核基冈组。 3 月亡吲臼反义基因在转基因烟草中的功能分析 烟草转化后，再生难，为数不多的分化芽大都发育为畸形苗，仅获得四株转基因烟草植 株，3 7 下热激3 6 小时无形态异常，推测彳f u g 爿毋反义基冈抑制了烟草的果胶合成，引起细 胞壁合成障碍并使转基冈烟草在发育过程中致死或畸形，而形成完整再生植株的可能是因为 转入了多拷贝基因，产生了共抑制效麻，大人减弱了反义l 喇a 的干扰作用。 4 4 亡矧影反义基因在转基因拟南芥愈伤组织中的功能分析 将经遗传转化再生的愈伤组织与对照在3 7 热激3 6 小时后在1 0 4 0 倍显微镜下观察拟南 芥愈伤组织边缘的细胞聚集情况。结果显示，与末转化外植体分化的愈伤组织相比，转化外 植体分化的具有卡那霉素抗性的愈伤组织比较疏松，有单细胞和小细胞团出现，证明么f ( ，g 爿融 反义基因在拟南芥中的表达能减弱细胞间粘连性。 关键词：月t 吲目反义基因；烟草；拟南芥；细胞粘连性 a b s t r a c t t r a n s f o r m a t i o no f1 0 b a c c oa n d a r a b i d o p s i s w i t h4 f 删剧a n t i s e n s eg e n ea n di t se f f e c t o nt h ei n t e r c e l l u l a ra d h e s i o n c a n d i d a t e 7 i o n gc h a o m a j o r c e l lb i 0 1 0 9 y a d v i s o r z h a n gx i n g g u o ( c o l l e g eo fh o r t i c u l t l ea n dl a n d s c a p ea r c h i t e c t u r e ， s o u t h w e s t u n i v e r s i 吼c h o n g q i n g4 0 0 7 15 ，c h i n a ) a bs t r a c t t h es i i l g l ec e ns u s p e 必i o nc u l t u r eo fp l 柚tc o u l dp r o 、，i d es 印a r a t ec e l l si i lt l l es 锄e 咎m e t i c b a c k g r 0 啪d 锄dp h y s i o l o g i c a ls t a t e t h e r e f o r e ，i th 弱g r e a tv a l u ei nn l e 陀a r c ho fc e l lb i o l o g y ， m u t a t e dc e l ls 锄i ns c r e e i l i n g ，m 舔sc e l l c u l t 嘶n g ，如n c t i o n a lg e n e s 孤a l y s i s i i l g 锄dg e n e t i c e n g i n e e r i n g h o ，e v 越t h ei n t e r e l l u l a ra d h e s i o ni sv e 巧d i 蕊c u l tt oe l i i l l i n a t e ，w ec 孤n o to b t a i nt l l es i i l g l e c e no fp l 锄ta tt h i sp o i n t h lt i l e 鲫 ，i n gp l a n tc e l l s ，w a l li sm a i n l ym a d eu po fc e l l u l o s e ， h e i i l i c e l l u l o s e ，p e c t i i l 锄df e ws h l l c t u r ep m t e i 璐u d p 僻d g a l a c t u r o n i ca c i di st 1 1 em a i np r e c u r s o r f o rp l 锄t 锄db a c t e r i as y i l t l l e s i z i n gp o l y s a c c h 撕d ec o r 印。鹏n to fc e l ls u m c e t h e r e b y m ee i l z y l l l e w l l i c hp a n i c i p a t e si nm ep r o c e s so fa c t i v a t i n gg a l am y p l a ya ni n 甲o r t a n tr o l ei n 咒g u l a t i n g 1 e b i o s ) ，n t l l e s i so fp e c t i n u d p g l c a4 - e p i m e r a s e ，n 锄e l yu g a ei st h ek e ye n z ) ，i n ew h i c hc a t a l y z e s u d p * d g l u c u r o n i ca c i d ( u d p g l c a ) t r a n s f 0 肌t ou d p 心d - g a l a c n l 枷i ca c i d ( u d p g a l a ) s 0 ， i f 、怫c 锄f i n daw a yt oc 伽们ln l ee x p r e s s i o no fu d p g l c a4 一印i m e r 弱eg 伽ei i lt l l ep l a m ，i ti s p o s s i b l et oi i l l l i b i tt l l eb i o s y n t l l e s i so f p e c t i n 锄de l 砌n a t et h em e r c e l l u l a ra d h e s i o n t l l i ss t i l d yu s e d 也ec o n s e e ds e q u e n c eo f 彳f 删eg 饥e 触l i l y w h i c hw 笛c 1 0 n e d 丘锄 彳f 明钳点海t oc o n s 乜u c t 卸t i s e n s eg e e x p r e s s i o nv e c t o r ，a i l d 岫s f o m 圮di ti n t 0a 酉0 b a c t e i i 啪v i a 疗e e z e m a wm e m o d a n e r 咖s f o n l l e dt o b a c c oa n d 疵b i d o p s i sm e d i ab ya 伊o b a c t e 打u m ，w e o b 谢n c d4t r a j l s g e n i ct o b a c c op l 锄t s 锄da1 0 to f 嘲b i d 叩s i sc a l l u s w eh 叩et h e 姐t i s e l l s e e x p r e s s i o nv e c t o rw i l le x p r e s si nt h et r a | 1 s f o 珊e dp l 托t s ，p r o d u c ea i l t i s e l l s er n a6 a g m e n t st 0p a i r u pw i t l li i l 】刚ao f 彳f 伙剐鲋，孤dt h e ni n h i b i tt h ee x p r e s s i o no f 彳，( ，g 爿尉锄de v e n 廿l e 、h o l eg e i l e f h i i l i ly t h em a j o rr e s e a r c ha c h i e v 涨ma sf o l l o w i n g ： 西南大学硕十学位论文 1 c o n s t r u c t i o no fa n t i s e n s e 爿f ，鲥e 4g e n ee x p r e s s i o nv e c t o r d i g e s t e dc l o n ev e c t o rp m d u g a e 4a n dp v h s p 7 0 b g u sb y 劢口ia 1 1 d 勋ci ，m e nc o l l e c t e d 彳f 删尉如g i n e n ta n d b i gf h g m e n to fp v - h s p 7 0 b g u sp l a s m i d l i g a s e dt h e 嘶缸g m e n t s ，t h e l l w eg o tm e 锄t i s e l l s ee x p r e s s i o nv e c t o rp v 一7 0 b u g a e 4w h i c hc 伽俩璐ah s p 7 0 b - 刚f u 酬e 孤t i s e n s eg e l l ee x p r e s s i o nb o x t h ep c ra n l p l i f i c a t i o n 锄de n z y m ed i g e s t i o n 觚a l y s i si n d i c a t e d t h a tm ee ) 【p r e s s i v e c t o rc o n t a i n st 1 1 e e x p e c t e d 缸l 舯e n t t h e nw en 铷 1 s f o m 舱di t i i l t 0 彳g r d 施c 幼锄me h a 10 5b y 能e t h a wm e m o df o rn l ef o l l o w i n gs t 叩so fg e l l e 仃a i i l s 矗釉t i o n 2 a n t i s e n s e 彳f ，( 翮芷g e n et r a n s f b r m e dt o b a c c oa n da r a b i d o p s i s w bt r a n s f 0 舢i c da m i s e n s e 彳f 【，g 彳五4g e i l ei n t o1 o b a c c o 孤da r a b i d 叩s i sr e s p e c 缸v e l y ，锄d o b t a 妇d4 呦s g 锄i ct o b a c c 0p l 锄t s 锄da1 0 to fa 豫b i d o p s i sc a l l u s 1 1 h e 伽g e tb 觚dc 锄b ef o u n d i nt h ep c rp r o d u c t so ft r a n s g e n i ct o b a c c oa n da m b i d o p s i st h r o u g he l e c t r o p h o r e s i s ，b u tc a nn o tb e f o u n di i ln l en o n 一咖s g e n i cp l 锄t s ，t 1 1 i sp h e n o m e n o ni i l d i c a t e st h a tt l l ef o r e i 印g c n eh a sb e e i l i n t e g r a t e di n t 0 舀m o m e so ft o b a c c o 锄d 嘲b i d 叩s i s i nt h er o o t so ft o b a c c o 锄dc a l l u so f 椭b i d o p s i s w h i c hh a v ek 柚锄y c i nr e s i s t 柚c ec a i lb ef o u i l dg r e e nf l u o r e s c e n c ew h e i la c t i v a t e db y3 9 5 n m l i 曲t ， i t p r o v e sg f pg e n ea n dc o n c a t e l l a t eh s p 7 0 b 一佗4 f ( g 上锄t i s e n s eg e n eh a v ei i l t e g r a t e di n t 0 g e n o m e so ft o b a c c o 觚d 积b i d 叩s i s 3 a n a l y s i so ft h ef i l n c t i o no fa n t i s e n s e4 f i 【 6 0 重1 1 彳g e n ei nt r a n s g e n e t i ct o b a c c o h a “n gb e e i l 仃觚s f 0 肌e d ，昀n s g e l l e t i ct o b a c c oi sh a r dt 0r e g e n e m t e ，m o s to fr e g e n e m t i v eb u d s d e v e l 叩da sm i s s h a p e ns e e d l i n g s ，w e0 n l yo b t a i n e d4t r a n s g e l l i cp l a n t s h e a ta c t i v a t ei n3 7 f o r3 6 h o u r s ，n 0s h a p ec h 孤g e w eh y p o t h e s i z e 彳f ，g 4 斟摊i s e n s eg e i l ei i l l l i b i t e dp e c t i i ls y i l t l l e s i si n t o b a c c oa i l db r o u 曲th a l l d i c 印o fw a l ls y n l e s i s ，t l l e i ll e dt o b a c c od e a d0 rl i l i s s h 印e 1 1 m u l t i c o p yo f 彳，伙剐厨锄t i s e l l s eg e n e1 1 1 i g l l tb e 妇n s f 0 册e di n t om e 缸锄s g e n i ct c i b a c c op l 锄t s ，c o i n h j b i t i o n e f 五巴c td e c r e a s e st h ei n “施r e n c ee f 诧c to fa n t i s e n s er na 4 a n a l y s i so f t h ef u n c t j o no f 粕t j s 蛐始彳f 伙现鲋g 锄ei nc a i l u so ft r 卸s g e n e t i ca 朋b i d 叩s i s h e a ta c t i v a t eb o t l l 也m s f 0 册e dc a l l u sa n dw i l dt y p ec a l l u so f 撒b i ( 1 叩s i si n3 7 f o r3 6h o u r s ， 锄dn l e nw eo b s e r v e dt 1 1 e e d g eo fa m b i d o p s i sc a l l u s 、，i a alo 4 01 1 1 i c m s c o p e ，i ts h o w e dm a t c o m p a r e dt on o n - 位m s g e n i ca r a b i d o p s i s ，c a l l u s 丘o m 协a n s f - o 肌e de x p l a m sa r em o r ei n c o m p a c t ，锄d s o m es i n g l ec e l l s 孤dc e l lc l u s t e l l s 印p e a r e d i tp r o v e st l l a t e x p r e s s i o i lo f 锄t i s e n s e 彳f u ( 谢点_ g e n e c a i le l i l l 】【i i l a t ei n t e r c e l l u i a ra d l l e s i o ni i l 砸b i d o p s i s 量沁0 冈r o i d s ：彳，( z i 王搿a n t i s e n s eg 明e ；t o b a c c o ；a r a b i d o p s i s ；i n 也e r c e u l a ra d h e s i o n i v 缩略词表 缩略词表 7 = = = _ = = _ - - _ 鼍_ _ - - 一_ 缩略词 英文全称中文名称 a n l p i c i l i i l b a 6 - 1 ) e n z y l a d e i l i m b p b a s e p a i r c b c e f o t a x i m e c 1 a b c e t y l 仃i m e t l l y l a m i n 0 i l i u mb r o m i d e i l d h 2 0 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r d n l l p d e o x ”u c l e o s i d e p h o s p h a t e d n a d e o x 州b o n u c l e i ca c i d e b e t h i d i u mb r o m i d e e d l r a e t h y l e n e d i a m i m i n e t e 缸彻c e t i ca c i d gg 姗 h h o u r 口1 g l s 叩r o p y lp d l t h i o g a l a c t o p y m l l o s i d e k b l o b 弱e p a i r k 锄k a n 锄y c i i l l b l u r i a b e r a 1 1 ii m d i u m m i n m i n u t e m r n a m s n a a n 盯i i o d p c r p v p m e s s e n g e rr i b o n u c l e i c i d m r 醛h i g e & s k 0 0 9m e d i 啪 供n a p h t h a l e n ea c e t i ca c i d n e o m y c i n ep h o s p h 0 仃卸s 允r a s ei i o p t i c a ld e 璐n y p o l ”n e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y v i n y r r i l i d o n e 氨苄青霉素 6 苄基腺嘌呤 碱基对 羧苄青霉素 十六烷基三乙基溴化铵 双蒸水 脱氧核苷三磷酸 脱氧核糖核酸 溴乙锭 乙二胺四乙酸 克 小时 异丙基肛d - ：硫代半乳糖酸 千碱基对 卡那霉素 l b 培养基 分钟 信使l 冰a m s 培养基 q 萘乙酸 新霉素磷酸转移酶i i 光密度 聚合酶链式反应 聚乙烯毗咯烷酮 硒 鼬锄m p i c i n利福平 4 9 西南人学硕十学位论文 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加 了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同 仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 、 ，、 学位论文作者：营芬舌 签字日期：d 前年翻芗日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：财不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文储鲐膏秀 锄始枷 签字日期：删年多月弓日签字日期：纵乃汐年6 月弓日 第1 章文献综述 第1 章文献综述 1 1 反义r n a 概述 1 1 1 反义r n a 及反义基因的概念 反义i 斟a ( a n t i s e n l 斟a ，a r n a ) 是与细胞内转录的m r n a 互补的单链r n a 分子，其长 度一般不到2 0 0 个核苷酸，它导入靶细胞后，形成双链r n a ，从而抑制基冈表达，可达到调控 基网表达的目的。通常把转录产生反义r n a 的基冈称为反义基因，它与转录产生靶l 酬a 的基因 是反义的。参与基因表达调控的反义r n a 首先在原核生物中被发现，第一个证实的反义r n a 是在人肠杆菌ec d 疗的c o l e l 质粒中【l l ，随后的研究表明，在病毒和细菌中普遍存在利用反义 r n a 调控基因表达活性的现象。1 9 8 6 年w i i l i 锄s 【2 1 发现真核生物中也存在天然的反义砌、a ，以 后不断有报道称在大麦、玉米、水稻以及人和其他动物中都发现有大然反义r n a 存在。直到 1 9 8 4 年，i z a i l t 和w e i n t r 硼b 等【3 1 首次用重组d n a 技术设计和制备出反义h s v t k m r n a 的表达载 体，注入细胞后观察到它明显抑制了t k 酶的活性之后，对利用反义r n a 技术抑制真核细胞基 因的表达的研究日趋成熟。 1 1 2 反义r n a 在原核细胞中的作用 ( 1 ) 在d n a 复制水平上的控制 在大肠杆菌的质粒c o l e l 的复制中，复制起始时，距起始位点5 5 5 b p 处转录一段引物 砌、i a + ( 正义i 淤a ) ，r n a 正义链促使c o l e l 的复制原点处双螺旋d n a 解旋，继而与d n a 模板结 合，引导d n a 多聚酶在r n a 正义链的3 端接上脱氧核苷酸合成新的d n a 子链【4 1 。但是很快在起 始位点4 4 b p 处，以另一d n a 为模板，转录一段长约1 0 0 个核苷酸的反义r n a ，与r n a 正义链的 5 末端互补结合，使其构型改变，从而阻碍了r n a 正义链与d n a 模板结合，i 矾a 正义链不再 起到引物的作用，质粒d n a 的复制终止川。 ( 2 ) 在转录水平上的控制 如反义i 斟a 对大肠杆菌c a m p 受体蛋白基因( c r p ) 转录的调控。当c a m p 过量存在时，c r p 能激活反义r n a 转录，这种反义i 斟a 与c r p 基冈转录生成的m i 矾a 的5 端序列互补结合，形成 特异的二级结构，空间构型改变迫使r n a 多聚酶脱离d n a 模板，停止转录。另外，反义l 矾a 分子中将带有质子化的胞嘧啶碱基插入到能被其识别的一段双螺旋d n a 区段中，形成局部的 三螺旋d n a 结构，这种异常的结构不能被r n a 多聚酶所识别，转录作用被阻止【5 】o ( 3 ) 在翻译水平上的控制 许多原核生物m r n a 分子5 端距离转泽起始密码a u g 约3 1 1 个碱基处富含嘌呤序列，这 是核糖体中1 6 s r i a 分子3 端所识别和结合部位，核糖体与此部分结合，启动转译作用。某些 两南人学硕+ 学位论文 反义r n a 分子具有与1 6 s r r n a 3 端相类似的序列，可与1 6 s r 】卧j a 竞争l n 】烈a5 端的结合部位， 抑制转译兹窟始。还鸯一类反义心a 与翱应酶剜烈a 分子蔗义烈a ) 静编码区姻结合，使 删刚a 分子无法与核糖体结合，阻碍转译的进行。 。3 反义r 黻在真核生物细胞中的作耀 ( 1 ) 影响真核m r n a 前体的拼接 绝大多数真核生物基因中禽有内含予，它们在转录磊的拼接过程中被切除，备段编码序 列按次序连接成为i n 】刚a 。现融发现一些真核的反义i 矾a 分子直接影响拼接过程。在体外试 骏中，反义瓣a 分子瓣人3 珠虽囊翔r n a 篱体分子的拼接有明显戆接制作用，摔割的程度与爱 义r n a 的序列长度、浓度、作用位置相关。发现只有在i i l 】 喇a 前体刚徽提取的瞬间就加入反 义r n a 才有抑制效应，这可能楚因为反义r n a 跨越拼接位点与潮 斟a 翦体局部结合，及时阻 业了拼接的进行。还发现某些小分子反义r n a 与真核m r n a 前体中内含予5 端拼接僚点互补结 合，这种结合促进了删刚a 对其所含的内含子的加i ：剪除。 ( 2 ) 影响i l l 】刚a 的转移 真核畿物臻r n a 翁体在细胞核中转录形成后，经过加_ 成潮专n a ，再转运至细胞质中被转 译。发现某些反义r n a 可与囊核m r n a 分子的5 镯结合，阻张这种转移的发生，从而影响相应 基阕的表达。 ( 3 ) 影响真核州 矾a 分子的修饰 绝大多数真核撒烈a 分子的5 ，端碱基经过加帽爱戍，如甲基化，3 糍加尾，接上弦l y a 尾 巴。经加帽和加尾修饰的真核m r n a 能抗r n a 酶的降解作用，延长分子寿命。在鸡胚肌组织中 发现p o l y u r n a 能与鹏肌球蛋向重链1 1 1 1 琳a 的p o l y a 部分互补结合，致使这种l l l 】州a 的转译受 阻。小鼠的湖状红细胞l 扣也发现存p o l y u 反义r n a ，v o l l o c l l 推测这类反义昀p o l y u r n a 在细胞璇 巾形成，它们可能以正常的1 1 1 嘲a 的p o l y a 尾巴为梭板，在r n a 聚合酶的作用下形成的。还有 入谈为反义烈a 会激活烈a 酶鞭，磷众酶鹣专性降解蹦a 6 烈a 杂合双镳中戆r n a ，造成转录 过程中，尚未从d n a 模板上剥离r 来的l t l 】烈a 链被降解。 1 4 反义r 辩磊技术 反义r n a 技术是借助基因重组技术，搬据碱基互补原理，用人工合成残生物体合成的特定 赋a 片段( 蠛其巅二学修饰物) 抑制或封闭基因表达懿技术。l 豁懿l 鞫w e 遗瞒毽b 等3 构建了零k 基圜 的反义r n a 系统，并在小鼠细胞内证明了反义r n a 对t k 基因专一性抑制作朋后，人们利用转 化、显微洼射及电转化等方法分别将羚源反义烈a 导入植物秘魂物细胞，并发现其在真核细胞 中的抑制作用。目前，利用该技术已能选择性地封阻或改变任意特定基因的活性f 吼。反义r n a 技术已经成为反义r n a 研究的个重要方瓶。 2 第1 章文献综述 1 1 5 反义r n a 技术的作用 ( 1 ) 能抑制给定的任何一个基因。 ( 2 ) 能在不需分离、鉴定基因产物的情况卜揭示该基因的功能。 ( 3 ) 干扰那些并不翻译成蛋白质r n a 的功能。 ( 4 ) 作为分析克隆基因的功能的一个方法m 。 1 1 6 反义r n a 的获得 反义r n a 既可采用重组技术获得，也可在实验室人j ：合成。导入反义r n a 的方法有2 种：一 种是插入法，通过c d l 畸a 文库路线构建反义l 斟a 基冈，通过载体将其插入到受体染色体上，并 随受体基因的表达而表达。另一种是注射法，即将反义r n a 直接注射到受体细胞内，干扰m r n a 的翻泽过程，从而起到短时间的抑制作用。这一方法对那些不能获得稳定转化的，或是启动 子不能有效表达的细胞系统尤为适合。 ( 1 ) 表达载体的构建 利用基冈重组技术，在适宜的启动子和转录终止子间插入一段靶基因，构成人t 反义r n a 基冈表达载体，当它引入细胞时将合成反义i 冰a 。构建表达载体的具体步骤如图卜l f 6 】所示， 分离信使r n a ( 步骤1 ) 作为合成互补d n a 链的模板( 步骤2 ) ，以d n a 链( 步骤3 ) 作为有义d n a 链 的模板，生成双链d n a ( 步骤4 ) 用内切酶在近启动子区切开质粒( 步骤5 ) 。将双链d n a 拼接 入质粒，形成表达载体( 步骤7 ) ，当启动子开始转录时，表达载体将合成原来信使r n a 拷贝， 再用内切酶从表达裁体上切下所加入的d n a ( 步骤8 ) ，并以反向插入裁体( 步骤9 ) ，转录时表 达载体将合成反义r n a 。 2347 8 图1 1 构建反义r n a 表达载体的步骤 f i 9 1 1 ：t h es t e p so fc o n s t r u c t i o fa n t i s e n s e 戤峨e x p r e s s i v e c t o r ( 2 ) 利用q p 复制酶技术扩增 3 西南人学硕十学位论文 利用q 届噬菌体的m d v i 变体( 具有i 斟a 复制酶的识别和起始序列) 作为载体，用r n a s e t l 将其6 3 ( g ) 和6 4 ( u ) 之间切开，插入外源r n a 片段组成重组i 斟a 分子。将m d v i 的c d d a 与 质粒p b r 3 2 2 组成重组体可以在体外扩增任意长度的r n a 分子。该技术可以在体外高效地拷贝 r n a 分子序列。 ( 3 ) 体外人j ：合成 即直接通过核酸合成仪来合成。化学合成反义r n a 的优点是可以随意设计序列，缺点是 价格比较昂贵，一般只适用于合成比较小的r n a 分子。 1 1 7 反义r n a 技术在植物上的应用 ( 1 ) 果实成熟的控制 随着基因工程技术的迅速发展和对番茄、苹果、香蕉、菠菜等果蔬成熟及软化机理的深入 研究，通过基冈丁程的方法直接生产耐储藏果蔬成为可能。促进果实成熟和器官衰老是乙烯 作为植物激素最重要的生理作用。在成熟果实中，a c c 氧化酶( a c o ) 和a c c 合成酶( a c s ) 的活 性明显提高，导致乙烯含量急剧上升和果实成熟。乙烯合成的增加是a c o 和a c s 的基因表达 的结果。所以在对这两种酶基因克隆成功的基础上，利用反义i 酬a 技术能抑制编码这两个酶 的基因表达，能够达到延缓果实成熟，延长保质期的目的。利用反义l 州a 技术抑制酶活力已 有许多成功的例子，其中最为成功的就是延缓成熟和软化的反义l a 转基冈番茄。1 9 9 0 年， h a i i l i l t o n 等【8 j 首次构建了a c c 氧化酶反义r n a 转基因番茄，在纯合的转基闪裔茄果实中，乙烯 的合成被抑制了9 7 ，从而使果实的成熟延迟，储藏期延长，转基因番茄的| 片衰老也被延缓。 随后o e l l e r 等【9 j 利用a c c 合成酶的反义r n a 抑制乙烯产生，也得剑了类似的结果，转基因植株 的番茄果实中乙烯的产生受到严重抑制，高达9 9 5 ，果实不出现呼吸跃变，同时抑制了叶绿 素降解和番茄红素合成，果实不能自然成熟和变红、变软，必须外施乙烯处理后才能使转基 因番茄恢复正常成熟。陆春贵等【1 0 1 用a c c 合成酶反义基因转化番茄，转基因植株的果实成熟 受到严重抑制，果实中的乙烯仅为止常植株的2 5 3 0 ，果实在室温下贮藏期长达1 个月。 熊爱生等【1 1 】报道，从番茄晶种“强力米寿”克隆全长的a c o 基因及a c s 基冈片段和完成测序后， 将两基因片段串联，构成全长为1 8 3 7 b p 的融合基因。将该融合基因以反义的方向插入植物双 元载p y p x l 4 5 中番茄果实表达特异启动子下游，获得a c c 氧化酶基因和a c c 合成酶基因融合 的植物叔元载体p d 姒c c 。以子叶和下胚轴为外植体，利用根癌农杆菌进行基因转化，转基因 番茄果实在当代表现明显耐贮特点。经过4 代的耐贮和果实农艺性状的综合选择，获得了2 个 表现良好的株系d r 2 1 和d r 2 2 ，两株系果实乙烯释放量显著下降，是未转基因材料的9 5 ，番 茄的贮存期在5 0 天以上。目前，有关利用反义基因技术培育耐储藏果蔬的研究正在继续进行， 并已扩大到了香蕉、苹果、草莓、梨、芒果、甜瓜、桃、西瓜等植物。反义l 矾a 技术所用的 目的基因还包括与细胞壁降解、果实软化有关的多聚半乳糖醛酸酶( p g ) 、纤维素酶和果胶甲酯 4 第l 章文献综述 酶( p e ) 基因。反义p g 转基冈番茄还具有更强的抗机械损伤和真菌侵染能力，且有更高的果酱 产率。t i e m a n l l 2 1 发现，利用反义r n a 技术可降低转基因番茄中p e 活性，增加果实中同形物的 含量。 ( 2 ) 在植物抗病性方面 在早期的抗病毒实验中，通过将反义的病毒外壳蛋白( c p ) 基因导入植物，并未使植物的抗 病性得到显著增强。这可能是因为c p 基因在植物病毒侵染后期高频率地表达，使得转基因植 物所产生的反义r n a 不足以对其完全抑制。冈此，以后人多通过与病毒生命活动密切相关的 基因的反义i a 的表达来提高植物的抗病性。1 9 9 1 年，d a 等首次报道了反义l a 抑制d n a 病毒的实验结果。发现表达g e 曲i v i m s 组_ 罨茄金黄花叶病毒( 1 g m v ) 的彳三珀勺反义基冈，转化 株有效地抑制了t g m v 的复制。如y a i l g 等人将r d v ( r i c ed w a r fv i n l s ，水稻矮缩病毒) 的核酶基 因反向构建丁载体中，转化水稻。结果发现，在转化植株中，虽然病毒的侵染性没有降低，但 其所表现的感病性状比对照明显减轻，进一步的检测表明，i m v 在转化植株中的复制受到了显 著的抑制。利用反义r n a 技术，开展植物抗病摹冈f ：程的研究，具有很人的优势。一是因为反 义l 斟a 与病毒r n a 的作用，并不要求1 0 0 的碱摹配对，所以这种缓冲作用间接地降低了病毒 发生变异的频率，有利于长期的病毒防治，这是采用其他方法难以达到的；二是某些病毒含有 一些高度保守序列，可以形成多种反义r n a ，为植物的j “谱抗病毒基因工程研究提供了理论依 据：三是反义l 冰a 片段可以设计合成，使其不具有任何内在的生物活性，这对于大规模释放入 环境中的物质来说是很重要的，具有一定的安伞性。而h ，反义i 斟a 技术的运用，可以从打断 植物防御反应路径入手，破坏信号传导通路，使植物不但对病毒、病原菌产生抗性，而且还 能对某些逆境产生抗性。 ( 3 ) 雄性不育的控制 利用反义r n a 进行植物雄性不育及其育性恢复的研究也得到了较人的进展。线粒体呼吸 链复合物色是一个由多弧基组成的酶，这些基分别由细胞器和核基因组编码，向马铃薯中导 入反义的n a d h 结合亚基基因，可使花粉的发育受到干扰，导致雄性不育【1 3 】。v 锄d e rm e e r 等 首先报道了在矮牵牛属中，类黄酮在花粉发育中起重要作用，渊苯基苯乙烯酮合成酶) 是类 黄酮合成的关键酶。a 越因的反义r n a 抑制了a 巧基因的表达，使类黄酮的合成受阻，导致 植株雄性不育。在马铃薯和烟草中，d 尼基冈的过度表达，导致了雄性不育。s c h m u l l i n g 等【1 4 l 应用反义l 斟a 技术获得了含有反义，d 趾基因的转基因烟草植株，其与含阳z c 基冈的植株杂交后 得到的杂交种子的雄性育性得到了恢复。 ( 5 ) 在植物其它方面的戍用 反义r n a 技术操作简单，准确高效，因此受到植物研究工作者的普遍关注。目前利用反 义r n a 技术，还在改变花卉颜色，调控植物淀粉合成途径，控制油料植物种子中脂肪酸合成， 5 两南人学硕十学位论文 增加植物对除草剂的抗性，转基因植物中标记基冈及选择标记的封闭，改变植物中淀粉的含 量等许多方面，也取得了可喜的成就巧】。 1 1 8 反义r n a 在动物及人类疾病治疗中上的应用 ( 1 ) 对病毒基因的调控作用 反义r n a 技术的应用为治疗病毒及反转录病毒性疾病开辟了新道路。利用反义r n a 能与 特定的r n a 病毒作用，直接抑制这些病毒的复制，从而阻断r n a 病毒的繁殖，达到治疗病毒 性疾病的目的。根据反义r n a 在作用于1 1 1 】f 州a 转译起始区或重要蛋白编码区的原理，不仅可 以化学合成和克隆猪瘟病毒反义c d n a 片段，而且还研究证实了猪瘟病毒基冈反义r n a 能抑制 猪温病毒基因的表达【1 6 】。裘慕缓等1 7 1 通过对小鼠腹水瘤病毒( s r s v ) 的研究，利用互补于s r s v 病毒基因组的t i a 引物区的反义r n a 成功地抑制该病毒的作用。有关艾滋病的研究，在细胞 水平上，反义r n a 抑制胙，基因的表达已经取得十分明显的效果，抑制效率基本上在5 0 以 上。总之用逆转录病毒系统，可有效地把目的基冈转入肿瘤细胞中，抑制肿瘤的生长，为基 因治疗由病毒引起的肿瘤病提供了一个可能的途径。 ( 2 ) 反义l 斟a 对癌基因表达的抑制作用 一些肿瘤的发生与癌基冈的激活及抑癌基因的失活有关。然而，当这些基因发生突变或移 位后表达过度或失活，就会造成信号通路的紊乱，影响细胞的正常生命过程，而引起肿瘤。 多年来，学者们致力于反义核酸抑制癌基冈的表达来研究对肿瘤生物学特性的影响，己取得 可喜的实验结果。船基因是重要的原癌基冈族，人类1 0 2 0 的肿瘤，与删原癌基因突变 为活化的癌基因( 即力4 ，嬲基冈) 有关。杨基伟等将构建的活化癌基因刀4 一，_ 嬲c d n a 的正、反 义重组体，分别按不同的次序先后转染到细胞内，结果证明了反义重组体可有效抑制原癌基 冈的转化。关钧等人【拇1 首次利用反义r n a 技术构建了o d c ( 鸟氨酸脱羧酶) 反义i 矾a 真核表达 质粒，以此转染人肺鳞癌细胞，证明了外源o d c 反义i 斟a 可特异关闭c 基因的表达，使转 染细胞生长受到明显抑制，致癌性明显减弱。曹江等【2 0 构建了对人肠癌细胞恶性表型的抑制 作用乃3 基因( 人肿瘤细胞中的抑癌基因) 的反义l 斟a 表达载体p 砌! p 9 p 5 3 ( a s ) ，并将其导入经 免疫组化验证明具有内源性突变型彤珀勺人肠癌细胞s w l1 6 中。结果证明肠癌细胞内源性突变 型彤珀勺表达被彤3 反义r n a 抑制后，细胞增殖速度显著下降，细胞显示出向正常方向逆转的 现象。此研究不仅证实了突变型彤3 确实具有导致细胞癌变的潜能，而且也为利用乃3 进行基 因治疗