（水产品加工及贮藏工程专业论文）不同海参多糖的分离纯化及生化性质分析.pdf

不同海参多糖的分离纯化及生化性质分析 不同海参多糖的分离纯化及生化性质分析 摘要 海参( s e ac u c u m b e r ) 是我国一种传统的名贵滋补品，体内富含多种生物活 性物质，具有较高的食用及药用价值。在我国，人们对于海参及海参制品的需求 随生活水平的提高而日益增加。海参多糖是海参体内最重要的生物活性物质之 一，具有抗凝血、抗血栓、降血脂和抑肿瘤等多种活性。海参多糖主要由海参硫 酸软骨素( s c c h s ) 和海参岩藻聚糖硫酸酯( s c f u c ) 2 种多糖组成。本论文 以9 种不同种类和不同生长海域的海参为研究对象，对其体壁中的s c c h s 和 s c f u c 进行了系统的生化性质分析，为海参种类的鉴别、海参品质的评价以及 海参制品质量标准的建立，提供了理论基础和科学依据，具有重要的理论意义和 应用价值。主要内容包括以下几个部分： 1 采用温和的酶提取法获得了9 种海参粗多糖，通过d e a e 5 2 离子交换层 析进分级纯化出s c c h s 和s c f u c2 种组分，由高效凝胶过滤色谱法和醋酸纤 维薄膜电泳法进行了纯度鉴定。s c c h s 的分子量为1 2 4 9 21 5 3 万，s c f u c 分 子量在7 0 万以上。比较而言，温带海域海参富含s c c h s ，热带亚热带海域的 海参富含s c f u c ，而寒带海域海参2 种组分的比值介于前两者之间。 2 采用柱前衍生h p l c 法和离子色谱法分别对s c c h s 和s c f u c 进行了单 糖组成分析、硫酸基含量测定。建立了三氟乙酸水解一离子色谱( i c ) 测定海参 多糖中硫酸根的方法。s c c h s 的组成单糖在种类上为类硫酸软骨素的特征，主 要由葡萄糖醛酸( g l c u a ) 、氨基半乳糖( g l a n ) 和岩藻糖( f u c ) 构成，它们之 间的摩尔比呈现一定的种间差异。s c f u c 的单糖组成则以岩藻糖为主。 海参粗多糖的硫酸基( s 0 4 2 - ) 含量为2 3 6 1 3 1 0 3 ，s c c h s 和s c - f u c 的s 0 4 2 。含量分别为2 7 5 2 一3 2 6 6 、2 3 4 2 2 9 3 1 。s c ? c h s 的硫酸基含量高 于同种海参的s c f u c 。 单糖组成分析和硫酸基含量的准确测定对于质量评价标准的建立、海参多糖 的活性研究具有重要意义。 3 以s c c h s 为重点研究对象，对s c c h s 和s c f u c 进行了i r 和1 hn m r 不同海参多糖的分离纯化及生化性质分析 分析。 由瓜初步分析s c c h s 岩藻糖支链上硫酸基取代，不同s c c h s 的红外吸 收具有一定的特征差异。红外光谱操作简便、费用低廉，可以作为海参s c c h s 初步分析鉴定的方法。 经1 hn m r 分析，根据s c c h s 硫酸酯化岩藻糖支链上异头氢信号和不同海参 的生长海域特征，可以将岩藻糖支链上硫酸基取代归纳为4 种类型：1 ) 寒带海域 海参：以2 ，4 一d io s 0 3 、3 , 4 d io s 0 3 双取代为主，含部分4 o s 0 3 取代；2 ) 温带海 域海参：以2 ，4 d io s 0 3 取代为主，含部分4 o s 0 3 取代；3 ) 热带亚热带海域海参： 只含有2 ，4 d io s 0 3 取代，或以2 ，4 d io s 0 3 取代和4 o s 0 3 取代为主，含部分非硫酸 酯化的岩藻糖；4 ) 亚热带热带海域的s a n d f i s h 的硫酸软骨素岩藻糖上硫酸基取代 类似于温带海域海参，但4 o s 0 3 取代更多。 以1 hn m r 分析确定s c c h s 中硫酸酯化岩藻糖支链上硫酸基的取代类型，为 s c c h s 的构效关系研究提供了重要的科学依据。 4 建立了市售不同海参制品中海参多糖含量的h p l c 澳f 定方法。该方法以岩 藻糖单糖转化系数为媒介，经p m p h p l c 澳j j 定不同海参制品中海参多糖的含量。 该方法具有准确、灵敏的特点，可应用于多种海参制品中总多糖含量的测定，并 为海参质量标准的建立提供了基础方法。 关键词：海参硫酸软骨素；化学组成；岩藻糖支链；硫酸基：差异 2 不同海参多糖的分离纯化及生化性质分析 一 一 一 r ls oia tio n p u ritic a tio na n dc h a r a c t eriz a tio no t dif f e r e n tkin d so fs e ac u c u m b e rp oiy s a c c h a rid e s a b s t r a c t s e ac u c u m b e ri sat r a d i t i o n a lc o s t f u lt o n i cf o o di n c h i n a ，w h i c h c o n t a i n s m u l t i k i n d so fb i o a c t i v ec o m p o n e n t s i ti sw e l lk n o w nt h a th o l o t h u r i a n sa r eo fh a v e m g hn u t r i t i o na n dp h a r m i cv a l u e s i no u rc o u n t r y , t h ed e m a n df o rs e ac u c u m b e ra n d s e ac u c u m b e r p r o d u c t s i s i n c r e a s i n g w i t l lt h e l i v i n g s t a n d a r d i m p r o v i n g p o l y s a c c h a r i d e s i so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tb i o a c t i v ec o m p o s i t i o ni ns e ac u c u m b e r , i t h a sb e e np r o v e dt oe x h i b i tv a r i o u sb i o l o g i c a la c t i v i t i e s ，i n c l u d i n ga n t i - c o a g u l a t i o n ， a n t i - t h r o m b o s i s ，r e d u c eb l o o df a ta n dt u m o rs u p p r e s s i o na c t i v i t y t h e r ew e r em a i n l y t w ok i n d so fs e ac u c u m b e rp o l y s a c c h a r i d e s ，s e ac u c u m b e rc h o n d r o i t i ns u l f a t e ( s c - c h s ) a n ds e ac u c u m b e rf u c o i d a n ( s c - f u c ) w em a d eas y s t e m i cs t u d yo nt h e b i o c h e m i c a la n a l y s i so ft h es c - c h sa n ds c - f u cf r o mt h eb o d yw a l lo f9k i n d so f s e ac u c u m b e r s ，w h i c hh a v ed i f f e r e n tt y p e so ri nd i f f e r e n tg r o w t hm a r i t i m es p a c e t h e r e s u l t sw o u l dp r o v i d et h e o r e t i c a lb a s i sf o r t h ei d e n t i f i c a t i o no fd i f f e r e m tt y p e so fs e a c u c u m b e r s ，a l s of o rq u a l i t ya s s e s s m e n to fs e ac u c u m b e rp r o d u c t s t h ep a p e rm a i n l y i n c l u d e st h ef o l l o w i n gf o u rp a r t s ： 1 c r u d ep o l y s a c c h a r i d e sw e r ep r e p a r e db ym i l de n z y m a t i ce x t r a c t i o nf r o m9k i n d s o fs e ac u c u m b e r s t w op o l y s a c c h a r i d e s ，s c - c h sa n ds c - f u c ，w e r ei s o l a t e da f t e r d e a e 5 2 i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y t h ep u r i t y w a sd e t e r m i n e d b y h i g h p e r f o r m a n c eg e l f i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ( h p s e c ) a n dc e l l u l o s ea c e t a t e m e m b r a n e e l e c t r o p h o r e s i s s c f u c h a v eam o l e c u l a r w e i g h t m o r et h a n 7 0 0 k d ，c o m p a r i n gw i t hs c c h so fam o l e c u l a rw e i g h to f12 4 9 k d - 2 15 3 k d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h et e m p e r a t es e ac u c u m b e ri sr i c hi ns c c h s ，t r o p i c a la n d s u b t r o p i c a ls e ac u c u m b e ri s r i c hi ns c f u c ，a n dt h o s el i v ei nf r i g i dw a t e r sw a s a m o n g t h e m 2 m o n o s a c c h a r i d e sc o m p o s i t i o no fs c c h sa n ds c f u cw e r ea n a l y z e db y 3 不同海参多糖的分离纯化及生化性质分析 p r e - c o l u m n d e r i v a t i z a t i o n h p l ca n ds u l f a t ec o n t e n tw a sd e t e r m i n e db yi o n c h r o m a t o g r a p h yr e s p e c t i v e l y t h em o n o s a c c h a r i d e sc o m p o s i t i o no ft h es c c h sw e r e s i m i l a rt ot h a to fc h o n d r o i t i ns u l f a t e ，m a i n l y 谢t l ln e a r l ys a m em o l a rr a t i oo f g l u c u r o n i ca c i d ( g i c u a ) ，g a l a c t o s a m i n e ( g l a n ) ，b u t 诵t l ll a r g e a m o u n to ff u c o s e f l u e ) t h em o l a rr a t i oo fm o n o s a c c h a r i d e so ft h es c c h ss _ h o w sd i f f e r e n c e sa m o n g t h e9s p e c i e so fs e ac u c u m b e r s f u c o s ei st h eo n l ym a i nm o n o s a c c h a r i d ei nt h e s c f u c c r u d es e ac u c u m b e rp o l y s a c c h a r i d e sh a sas u l f a t ec o n t e n to f2 3 6 1 - 31 0 3 ，a n d t h es u l f a t ec o n t e n to fs c c h sa n dt h es c f u cw e r e2 7 5 2 3 2 6 6 a n d 2 3 4 2 - 2 9 31 r e s p e c t i v e l y ，n l es c - c h s sh a v eh i g h e rs u l f a t ec o n t e n tt h a nt h e s c - f u c s 、析t l lt h es a m es e ac u c u m b e rs p e c i e s m o n o s a c c h a r i d e sc o m p o s i t i o na n a l y s i sa n dt h es u l f a t ec o n t e n td e t e r m i n a t i o nw e r e o fg r e a ti m p o r t a n c ef o rt h ee s t a b l i s h m e n to ft h eq u a l i t ye v a l u a t i o nc r i t e r i ao fd i f f e r e n t k i n d so fs e ac u c u m b e r s ，a sw e l la sl u t h e rr e s e a r c ho nt h eb i o a c t i v i t yo fs e ac u c u m b e r p o l y s a c c h a r i d e s 3 i ra n d1 hn 保a n a l y s i so fs c c h sa n ds c f u c s u l f a t es u b s t i t u t i o n so n b r a n c h e df u c o s e o ft h es c c h sw e r e p r e l i m i n a r ya n a l y s i s e db y i r c e r t a i n c h a r a c t e r i s t i cd i f f e r e n c e se x i s t e da m o n gd i f f e r e n ts c c h so ni n f r a r e da b s o r p t i o n a s as i m p l e ，i n e x p e n s i v em e t h o d ，f t - i rc o u l db eu s e da st h ei n i t i a lt o o lo ns c - c h s a n a l y s i s 1 hn m r a n a l y s i so fa n o m e rh y d r o g e ns i g n a l so f s u l f a t ef u c o s ci ns c c h s sl i v i n g i i ld i f f e r e n tw a t e rc o n d i t i o n ss h o w st h a t s u l f a t es u b s t i t u t i o n so nb r a n c h e df u c o s eo f s c c h sf r o ms e ac u c u m b e r sc o u l db es p l i t t e di n t o4t y p e s ：1 ) s e ac u c u m b e rl i v ei n f r i g i dz o n e ：m a i n l y2 , 4 - d i0 s 0 3a n d3 , 4 - d i0 s 0 3d i s u b s t i t u t e d ，a l s o 谢t l lm i n o r 4 - 0 s 0 3s u b s t i t u t i o n ；2 ) t e m p e r a t es e ac u c u m b e r ：m a i n l y2 , 4 一d io s 0 3 ，a l s ow i t h p a r t i a l l y4 - 0 s 0 3s u b s t i t u t e ；3 ) s e ac u c u m b e r sl i v ei nt r o p i c a la n ds u b t r o p i c a lw a t e r s h a v e2t y p e so fs u b s t i t u t i o n ：o n ei so n l y2 ，4 一d i0 s 0 3s u b s t i t u t i o n ，t h eo t h e ri sm a i n l y 2 , 4 一d i0 s 0 3a n d4 - 0 s 0 3 ，、7 i r i t hm i n o rn o n s u l f a t e d ；4 ) s a n d f i s h ( h o l o t h u r i as c a b r a j a e g e r ) f r o ms u b t r o p i c a la n dt r o p i c a lw a t e r sh a sas i m i l a rs u l f a t es u b s t i t u t i o ns t y l eo n b r a n c h e df u c o s eo fs c - c h st ot h a to ft h et e m p e r a t es e ac u c u m b e r s ，b u t 埘t hm o r e 4 不同海参多糖的分离纯化及生化性质分析 4 一o s 0 3s u b s t i t u t i o n s u l f a t es u b s t i t u t i o n ss t y l e so ns u l f a t e db r a n c h e df u c o s eo fs c - c h s ，w h i c h a s c e r t a i n e db y1 hn m r ，c o u l dp r o v i d e di m p o r t a n tp r o v e sf o rt h es t u d yo nt h e s t r u c t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i po fs c c h s 4 t h eh p l cm e t h o dt od e t e r m i n es e ac u c u m b e rp o l y s a c c h a r i d e sc o n t e n ti n d i f f e r e n tc o m m e r c i a ls e ac u c u m b e rp r o d u c t sw a se s t a b l i s h e d p m p h p l cw a su s e d t od e t e r m i n es e ac u c u m b e rp o l y s a c c h a r i d e sc o n t e n ti nd i f f e r e n tp r o d u c t s ，w i t hf u c o s e c o n v e r s i o nc o e f f i c i e n ta sm e d i a t h i sm e t h o dw a sa c c u r a t ea n ds e n s i t i v e ，c o u l db e a p p l i e dt od e t e r m i n a t i o no ft h et o t a lp o l y s a c c h a r i d ec o n t e n to fav a r i e t yo fs e a c u c u m b e rp r o d u c t ，a n dh e l pt oe s t a b l i s ht h eq u a l i t ys t a n d a r d so fs e ac u c u m b e r p r o d u c t s k e yw o r d s ：s e ac u c u m b e rc h o n d r o i t i ns u i f a t e ：c h e m i c a ic o m p o s i t i o n ： f u c o s eb r a n c h e d c h ain ：s uif a t e ：dif f e r e n c e 不同海参多糖的分离纯化及生化性质分析 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特曼l , j ) j z l 以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得其他教育机构的学位或证书 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 一期叶 香辅k 酶i b 导师签字： 签字日 ( 挽3 月厂e t 不同海参多糖的分离纯化及生化性质分析 o 1 海参资源概述 o 前言 海参( s e ac u c u m b e r , h o l o t h u r i a n s ) 归属棘皮动物门( e c h i n o d e r m a t a ) ，是海 参纲( h o l o t h u r o i d e a ) 动物的泛称1 1 1 ，具有较高的食用及药用价值。 海参自古以来被认为是一种名贵的滋补食品和药材，位列“海味八珍 之首。 海参在6 亿多年前的前寒武纪就已经存在。直至三国时期，才有正式的文献记载， 吴国莹的临海水土异物志有“土肉如小儿臂大，长五寸，中有腹，无口目， 有三十足，炙食”，其中“土肉 即指海参。明万历年问谢肇制著五杂俎中 关于海参的记载为：海参在辽东海滨有之，其性温补，故日海参。海参不仅是一 道名贵的佳肴，而且还是珍贵滋补食品和药材，近年来研究发现，其具有降血脂、 降血糖、抗癌、提高免疫力和抗衰老等多种生理活性。 海参分布于世界各海区，全世界共有11 0 0 多种海参，其中约4 0 种可供食用。 o 1 1 海参的种类【2 】 海参的分类主要依据触手和管足等外部形态，及骨片的显微形态特征。海参 骨片较稳定，有显著的种属特异性，因而被用作海参种属鉴定的主要依据。海参 纲下设3 亚纲、6 目、2 4 科。根据触手的形状，管足和呼吸树的有无分为6 个目： 枝手目( d e n d r o c h i r o t i d a ) 、指手目( d a c t y l o c h i r o t i d a ) 、楣手目( a s p i d o c h i r o t i d a ) 、 平足目( e l a s i p o d i d a ) 、芋参目( m o l p a d i i d a ) 和无足目( a p o d i d a ) 。 o 1 2 海参资源在世界和我国的分布 ( 1 ) 海参资源的世界分布情况1 3 s 】 全世界有记录的海参种数约1 0 0 0 多种，分布于全球各大洋，主要在热带区和 温带区，绝大多数进行底栖生活。印度洋一西太平洋是世界上海参种类最多、资 源量最大的区域，而在大西洋乃至南极洲海域也生活着诸多海参种群，个别参种 的资源量很可观。 热带区海参资源呈多种性，多分布在太平洋热带区和印度洋，种类以印度一 7 不同海参多糖的分离纯化及生化性质分析 西太平洋区为最。其食用海参多分布于珊瑚礁内，楣手目的几大型种属如海参属、 白尼参属、刺参属和辐肛参属等是其中常见的海参。热带区海参资源不仅种类多， 而且资源量大，占世界海参产量的8 6 。 温带海区海参资源呈单一性，多分布于太平洋东西两岸的温带区，其中东岸 以美国刺参( p a r a s t i c h o p u sc a l i f o r n i c s ) 为主，西岸以刺参 j a p a n i c u s ) 为主。温 带产区主要有亚洲的中国、日本和朝鲜半岛，北美的加拿大及美国。 ( 2 ) 我国海参资源的分布情况 我国的海参资源丰富，共有各种海参约1 4 0 多种，可食用海参约2 0 种，其 中有1 0 种具有较高的商品价值。它们分别隶属于3 个目，4 个科1 4 1 。然而，我 国食用海参资源种类分布不均匀的特点非常明显，即在我国北方海域只有一种食 用海参刺参( a p o s t i c h o p u s a p o n i c u s ) ，而在南方海域，约产有十几种食用海参。 0 2 海参的食用及产品加工现状 国内海参产品主要有海参鲜品、海参干品、海参深加工产品。海参加工是新 兴行业，发展迅速。但是在国内市场和行业内，缺乏海参产品相关质量及技术标 准。目前我国的海参加工，起点相对较低，主要表现在：l 、企业规模不大，技 术设备落后；2 、员工素质普遍偏低，有专业知识的员工数量较少；3 、加工产品 单一、产品附加值低，与日益发展的消费需求，差距较大。 在我国，传统的海参干制方法易导致海参体内水溶性和热敏性活性物质的损 失，并需要长时间水发。水发海参主要集中在大型的水产批发市场，品种主要有： 仿刺参、黄玉参、白石参、梅花参等，大多是一些较低档次的海参。水发海参在 胀发过程中又会造成风味物质大量流失，且由于对水发产品的监管力度不够，水 发海参的质量存在一些问题，如不法商人在向其中添加盐、泥沙或一些有害化学 物质，从而带来严重的食品安全隐患，导致水发海参的市场日益萎缩。 0 3 海参的活性成分概述 据我国养生古籍记载，海参有补肾益精、壮阳疗痿、补血、养胎、利小便等 作用。本草纲目拾遗描述海参有“生百脉血，治体息痢 的功效。 体壁是海参主要的食用和药用部位，基本成分为上皮组织和真皮结缔组织， 8 不同海参多糖的分离纯化及生化性质分析 真皮结缔组织的细胞间隙充填着胶原纤维成分、蛋白聚糖以及糖蛋白等无定型间 质。海参中含量较高的生物活性成分主要是海参酸性多糖、海参皂苷和胶原蛋白 等，此外，海参中还富含脂质、维生素以及锌、铁、钙、硒、碘等微量元素，营 养全面，胆固醇含量低，是一种名贵的滋补佳品【5 1 。 o 4 海参多糖的研究 海参多糖主要存在于海参体壁中，废弃内脏及海参性腺中也有部分存在。研 究发现，存在于海参体壁的多糖主要分两类【铺j ：一类为海参糖胺聚糖或粘多糖 ( h o l o t h u r i a ng l y e o s a m i n o g l y c a n ，h g a g ) ，是由d - n 一乙酰氨基半乳糖、d 一葡萄糖 醛酸和l 岩藻糖组成的分支杂多糖；另一类为海参岩藻多糖( h o l o t h u r i a nf u c a n ， h f ) ，是由l 岩藻糖所构成的直链多糖。本文分别称之为海参硫酸软骨素( s e a c u c u m b e rc h o n d r o i t i ns u f a t e ，s c c h s ) 和海参岩藻聚糖硫酸酯( s e ac u c u m b e r f u c a n ，s c f u c ) 。虽然二者的组成糖基不同，但糖链上都有部分羟基发生硫酸 酯化，并且硫酸酯基类多糖含量均在3 2 左右，两种海参多糖的特殊结构，均为 海参所特有。海参多糖存在着硫酸化程度的不一致性、显微结构和分子量的不均 匀性以及残基数量的多变性等特点，造成了海参多糖纯化和结构分析的复杂性， 其中尤其是s c c h s 结构较s c f u c 更为复杂，鉴于s c c h s 结构的特殊性，本 文较多地集中于s c c h s 相关部分的研究。 0 4 1 海参多糖的提取和分级纯化 海参多糖以糖肽键与蛋白链相连，通过非共价键形成具有空间构象的大分子 聚集体。提取分离的首要问题，是在多糖不被显著降解的条件下去除所结合的蛋 白，即不仅需要破坏蛋白多糖聚集体间的次级键，还要降解核心蛋白链，以破坏 多糖链与蛋白质的共价结合，从而释放出多糖链，以便提取分离1 9 i 。 目前常采用的提取方法主要有碱提取法与酶解法。前者基于蛋白多糖中的糖 肽键对碱的不稳定性，操作简便，但碱处理后易发生w a l d e n 转化或形成3 ，6 一内醚 衍生物而发生脱硫现象，因而其应用受到限制；酶解法是较理想的提取方法，即 在不改变多糖链结构的前提下，以蛋白酶进行水解。此法对于糖链的释放十分有 效。为了使蛋白质水解充分，也可采用两种以上的蛋白酶以加强水解效果。如韩 9 不同海参多糖的分离纯化及生化性质分析 慧敏等采用匀浆后，胃、胰蛋白酶降解蛋白质的方法提取海参多糖，取得良好效 果【l 们。此外，v i e i r a 等采用半胱氨酸和e d t a 辅助木瓜蛋白酶酶解法，用以提取 海参l g r i s e a 中的多糖1 1 1 1 ，给海参多糖的有效提取提供了良好的方法借鉴。 多糖的分离主要采用沉淀法，近来应用比较多的是离子交换色谱、凝胶色谱 层析等方法i l 引。常用的沉淀剂有乙醇、季胺盐和醋酸钾，其中乙醇价格相对低 廉，应用也最为广泛。向多糖的钙盐、钠盐或钾盐溶液中加入乙醇到不同浓度， 使多糖颗粒水化膜被破坏，溶液电离常数降低，不同组分多糖就会以盐的形式分 级沉淀而分离【1 3 15 1 。如沈鸣等以6 5 的乙醇分离糙海参多糖14 1 。 近年来，离子交换、凝胶过滤以及亲和色谱等各种色谱技术应用于多糖的分 级纯化【幡1 8 】。离子交换色谱的分离原理是根据离子特性的差异，以不同离子强度 的盐溶液洗脱而分离，其优点在于树脂本身可从溶液中吸附多糖，从而起到浓缩 作用。商品化的离子交换树脂尤其是多糖基离子交换树脂，已在多糖的分离中应 用，如c e l l u l o s ed e a e 5 2 、d e a e s e p h a d e x 、q f f s e p h a r o s e 等。 o 4 2 海参多糖化学组成分析 ( 1 ) 海参多糖的分析与化学检测 海参多糖测定的常见方法有【1 9 1 ：苯酚硫酸法、硫酸咔唑法和琼脂电泳扫描 法，即通过样品与对照品直接比较来测定海参多糖的含量，由于选择性不强或者 标准品难以获得而易出现各种问题。 次甲基蓝是一种异染性染料，能与负离子亲水胶体相作用，在浓度低时形成 可溶于水的异染变色配合物，从而导致染料从蓝色( k 戤：6 1 0 6 6 4 n m ) 至0 紫色 ( k 瓠：5 2 0 5 6 0 r i m ) 的变化。e w e 首次发现次甲基蓝能与卡拉胶作用产生不溶性沉 淀，g r a h a m 将其用以从多余的未反应的染料测定卡拉胶，s o e d j a k 成功用该方法 测定不同样品中卡拉胶的含量【2 0 1 。次甲基蓝和聚阴离子间的相互作用是可逆的， 且结合比率为1 ：1 ，因而可作为聚阴离子定量测定的简单方法。刘红英【2 l 】等以次 甲基蓝为显色剂建立了海带中岩藻聚糖硫酸酯含量的分光光度法。 ( 2 ) 海参多糖的单糖组成分析 传统的单糖组成分析方法为化学法和气相色谱法1 2 2 - 2 3 1 ，即先用酸、碱或酶将 多糖分解成中性单糖、碱性单糖和酸性单糖，后分别采用不同的分光光度法对不 1 0 不同海参多糖的分离纯化及生化性质分析 同性质的单糖进行检测。该类方法繁琐、灵敏度低，干扰因素多，结果的准确性 不好。 9 。q 扫辱 图0 - 1还原耱的p m p 衍生反应原理 f i g 0 - 1 r e a c t i o ne l e m e n t so fp m pw i t hr e d u c i n gs u g a r 鉴于单糖物质的光学性质较差，采用色谱或电泳方法对其进行测定时，、可用 紫外或荧光试剂进行衍生，以改善其光学活性，提高检测的灵敏度2 4 。2 7 】。h o n d a 首次将具有强紫外吸收的1 苯基3 甲基5 吡唑啉酮( p m p ) 应用于还原糖的衍生 ( 图0 - 1 ) ，发现p m p 能与还原糖在温和条件下反应，不需酸催化，不会引起酸基脱 落，产物也无立体异构体，并在2 4 5 n m 处有强吸收2 8 1 。 d j s t r y d o m 运用p m p 衍生法成功分离了1 1 种单糖2 9 1 ( 图0 2 ) ，并研究了流 动相p h 值对单糖分离效果的影响( 图0 3 ) 。7 种中性单糖和2 种氨基糖的峰形标 准，分离效果很好( 图0 2 ) 。中性和酸性单糖的保留时间随流动相p h 值的升高 而缩短，而2 种碱性单糖则变化不大( 图0 3 ) 。 0 51 0 5 二麓 ( a ) 图o 2 l1 种常见单糖的液相色谱分析 f i g 0 - 2 h p l ca n a l y s i so f1 1k i n d so fc o m m o nm o n o s a c c h a r i d e s 不同海参多糖的分离纯化及生化性质分析 图0 - 3 流动相p h 值对单糖分离的影响 f i g 0 - 3p hv a l u e si n f l u e n c eo nm o n o s a c c h a r i d e ss e p a r a t i o n f u 和o n e i l l 使用p m p 衍生法简捷准确地完成了寡糖、糖蛋白和唾液酸的单 糖组成分析3 0 1 ，其过程见图o 4 。 熨黜 w 胃搴缸写h - n d ，c f b n 蜘s 醯k 蛐 l i 翻嚏嘣皇州嘶哪i 件柳i n 供卸u 伸3 l 1 0 1 u - - _ 曲峭c 科叶口蝴 图0 - 4 寡糖和糖蛋白单糖组成分析流程 f i g 0 - 4 p r o c e s so fm o n o s a c c h a r i d ec o m p o s i t i o na n a l y s i si no l i g o s a c c h a r i d ea n dg l y c o p r o t e i n 衍生化单糖在高效液相色谱上的分离效果良好，以下为单糖标准品和唾液酸 标准品的分离图谱( 图o 一5a ，b ) 。 1 2 不同海参多糖的分离纯化及生化性质分析 o _ o - 棚1 1 ( a )( b ) 图0 5 单糖标准品( a ) 和唾液酸标准品( b ) 液相色谱分离图 f i g 0 - 5 h p l cs e p a r a t i o no fm o n o s a c c h a r i d es t a n d a r d s ( a ) a n ds i a l i ca c i ds t a n d a r d s ) p m p h p l c 对单糖组成的分析在国内也得到了广泛应用。杨兴斌等以p m p 衍生法分析当归多糖的单糖组成，完成了甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿 拉伯糖和岩藻糖6 种中性单糖以及葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸2 种酸性单糖的分离及 测定【3 l 】。林雪等就将此检测技术运用于芦荟多糖的单糖组成分析，完成了3 种常 见芦荟的单糖组成种类及摩尔比分析1 3 2 】；井泽良等运用该衍生法分析了葡萄链 格孢寡聚糖和葡萄灰霉寡聚糖中的果糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖5 种单糖 3 3 1 ；周斌等将其应用于烟草中糖的测定，成功地分离出7 种常见单糖，并 进行了甘露糖和葡萄糖的定量测赳3 4 】；盛文静建立了p m p 柱前衍生h p l c 法 测定海参粗多糖中单糖组成的方法，为本文进行相关组分的单糖组成提供了重要 的方法借鉴。 应用p m p 柱前衍生高效液相色谱法对多糖进行单糖组成分析，操作简便，灵 敏度高，重复性好，是测定单糖组成的一种好方法。 ( 3 ) 海参多糖中硫酸基含量的测定 对天然硫酸多糖及经人工磺化得到的半合成硫酸多糖的研究发现，多糖羟基 的硫酸酯化是决定硫酸多糖生物活性的重要因素，因为羟基的硫酸酯化，不仅增 加了多糖的溶解性，t 更为重要的是，它改变了多糖的构象【3 6 。7 】。在已有报道的硫 酸多糖，如肝素、硫酸右旋糖酐等的抗凝活性均取决于硫酸根的含量，其他如香 菇多糖等在经过硫酸酯化后，产生了原来所不具备的抗h i v 病毒活性。因此，硫 酸多糖中硫酸根含量的测定是硫酸多糖构效关系研究的一个重要方面 3 8 - 3 9 。 对于粘多糖中的硫酸基，通常采用明胶氯化钡法和玫红酸钠法，这些方法 不同海参多糖的分离纯化及生化性质分析 灵敏度不理想，操作繁琐，实验误差较大l 州1 1 。另外还有：比浊法、比重法、电 导率法、滴定法和4 一氯4 一联苯胺一分光光度法。电泳法也可用于糖胺聚糖中o 和 n 一硫酸酯基的测定，主要是根据电泳迁移率与硫酸基组成比例来进行分析，定量 分析的准确度和重现性不佳。 海参多糖富含硫酸基，不同种类海参来源的多糖之间硫酸基的含量相互接 近。国内外相关研究多采用传统的明胶b a c l 2 法和灰化的前处理方式，杂质干扰 严重，实验误差较大，精确性、灵敏度都不理想。 离子色谱( i c ) 是7 0 年代发展起来的一种新的液相色谱方法，可用于亲水阴阳 离子的测定。由于淋洗液中含有一定量与树脂的离子电荷相反的平衡离子，这种 平衡离子与树脂以离子对的形式处于平衡状态，保持体系的离子电荷平衡。随着 样品离子与平衡离子的交换，当样品离子与树脂上的离子成对时，样品离子由于 库仑力( 亲合力) 会有一个暂时的停留。不同样品离子与树脂固定相电荷之间的亲 合力不同，因此在柱中移动速度也不同。样品中离子保留时间与离子价数及离子 半径有关，与样品数量无关，在线性分配等温线的条件下，获得的色谱检测信号曲 线是对称的正态分布函数形式的色谱峰。待测样品在洗脱液中的浓度与检测器的 响应信号( 峰面积或峰高) 成正比。其测定浓度范围为“g l m g l 级，线性范围大。 离子色谱在几分钟内即可完成单个样品i ：卢s 0 4 2 含量的分析1 4 2 】，并且重复性好，精 密度和准确度高。 离子色谱法用以分析水样和化学制品中硫酸根的研究已有较多的报道【4 3 卅】， 其应用于脂质体和多糖中硫酸基含量的测定也逐渐广泛。张丽萍等进行了灰化的 前处理方式和离子色谱法测定高山红景天多糖硫酸酯中硫酸根含量的研究【4 5 】： 马心英利用离子色谱测定海带硫酸多糖中硫酸根的含量m 】。 离子色谱法具有准确、简便、重复性好等优点，该法由于经过离子交换柱的 分离作用，有效地消除了干扰，且操作简单，精确度和灵敏度都很高，是一种测定 硫酸多糖硫酸根含量的理想方法。此外，对于硫酸多糖的前处理是关系硫酸基含 量测定准确性的重要环节，灰化方法易引入干扰离子，强酸水解则容易导致对离 子交换柱的损害和交换效果的影响，因此，选择一种合适的样品前处理方法对有 效利用离子色谱准确定量多糖硫酸基至关重要。 1 4 不同海参多糖的分离纯化及生化性质分析 0 4 3 海参多糖的结构分析 多糖结构的分析测定是研究其构效关系的基础。糖链一级结构包括分子量、 糖基组成及组成单糖的摩尔比例、单糖构型、单糖连接次序、异头构型、取代基 情况、糖链与非糖链的连接等。分子量、单糖组成分析、单糖摩尔比和硫酸基含 量分析已经前文介绍。 ( 1 ) 测定方法概述 水解法：包括完全酸水解、部分酸水解、乙酰解和甲醇解等。完全酸水解是 将多糖用硫酸或盐酸等强酸在8 0 1 0 0 温度下水解，采用纸色谱、薄层色谱、气 相色谱、高效液相色谱等对其进行分析。 多糖裂解酶法：分为外切酶和内切酶法。外切酶主要针对糖链的非还原端单 糖及其糖苷键的构型，其消化产物用气相、液相色谱、纸色谱等可分